Nghiên cứu hoạt tính sinh học và thành phần hóa học từ cây cổ yếm lá bóng (Gynostemma Laxum (Wall.) Cogn] của Việt Nam
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT PHẠM THỊ NINH N N G G H H I I Ê Ê N N C C Ứ Ứ U U H H O O Ạ Ạ T T T T Í Í N N H H S S I I N N H H H H Ọ Ọ C C V V À À T T H H À À N N H H P P H H Ầ Ầ N N H H Ó Ó A A H H Ọ Ọ C C T T Ừ Ừ C C Â Â Y Y C C Ổ Ổ Y Y Ế Ế M M L L Á Á B B Ó Ó N N G G [ [ G G Y Y N N O O S S T T E E M M M M A A L L A A X X U U M M (WALL.) COGN.] C C Ủ Ủ A A V V I I Ệ Ệ T T N N A A M M Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 60. 42. 01. 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học GS. TSKH. TRẦN VĂN SUNG Hà nội, năm 2013 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong luận văn là trung thực, được đồng tác giả cho phép sử dụng và chưa từng được công bố trong bất kỳ một công trình nào khác. Tác giả luận văn Phạm Thị Ninh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CẢM ƠN Luận án này được thực hiện tại Phòng Tổng hợp Hữu cơ, Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt nam Với lòng biết ơn sâu sắc tôi xin chân thành cảm ơn GS.TSKH. Trần Văn Sung, người thầy đã trực tiếp tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm việc. Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ khoa học Phòng Tổng hợp Hữu cơ – Viện Hoá học – Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi cũng xin được cảm ơn các cán bộ phòng Hóa sinh ứng dụng, phòng phổ IR, phổ NMR và phổ khối MS – Viện Hoá học đã thực hiện thử hoạt tính và đo các loại phổ giúp tôi. Xin được cảm ơn sự nhiệt tình giảng dạy của quý thầy cô giáo trong suốt quá trình học tập. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến những người thân trong gia đình và bạn bè đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tác giả luận văn Phạm Thị Ninh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỤC LỤC Trang 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 2 3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 2 4. Phƣơng pháp nghiên cứu 2 4.1. Các phƣơng pháp nghiên cứu lý thuyết 2 4.2. Các phƣơng pháp nghiên cứu thực nghiệm 3 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3 6. Bố cục của luận văn 3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 4 1. Họ Cucurbitaceae và chi Gynostemma 4 1.1 Họ Cucurbitaceae 4 1.2 Chi Gynostemma 4 1.3 . Cổ yếm lá bóng 4 1.3.1. Tên gọi 5 1.3.2. Môi trƣờng sống 5 1.3.3. Tính vị và tác dụng 5 2. Hoạt tính sinh học của cây cổ yếm lá bóng 7 3. Thành phần hóa học 8 3.1. Các carotenoid 8 3.2. Các polysaccharid 9 3.3. Các sterol 9 3.4. Các flavonoid 10 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 3.5. Các saponin 11 CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1. XỬ LÝ MẪU THỰC VẬT VÀ CÁC PHƢƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC 19 2.1.1.Mẫu thực vật 19 2.1.2. Các phƣơng pháp sắc ký để phân lập chất 20 2.1.3. Các phƣơng pháp xác định cấu trúc hóa học 20 2.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH 20 2.2.1. Thử hoạt tính chống oxy hóa 20 2.2.2. Thử hoạt tính chống ung thƣ 21 2.2.3. Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 21 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM 22 3.1. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP 22 3.1.1. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu 22 3.1.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 23 3.2 CHIẾT TÁCH VÀ TINH CHẾ CÁC CHẤT TỪ CÂY CỔ YẾM LÁ BÓNG GYNOSTEMMMA LAXUM (WALL.) COGN 27 3.2.1. Xử lý mẫu thực vật 27 3.2.2. Chiết tách các chất từ dịch chiết etyl acetat 28 3.2.3. Chiết tách các chất từ dịch chiết n-BuOH 30 3.3. THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 32 3.3.1.Thử hoạt tính chống oxy hóa 32 3.3.2. Thử hoạt tính gây độc tế bào 32 3.3.3. Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 33 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ CHƢƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 4.1. Giới thiệu 34 4.2. Kết quả thử hoạt tính sinh học 34 4.2.1. Hoạt tính chống oxy hóa 34 4.2.2. Hoạt tính gây độc tế bào 35 4.2.3. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 36 4.3. Xác định cấu trúc của các chất phân lập đƣợc 37 4.3.1. chất 43 (GCLB17): quercetin 37 4.3.2.Chất 44 (GCL14.2): ombuim 46 4.3.3.Chất 45 (GCLB.3N): ombuosid 53 4.3.4.Chất 46 (GCL2.2): 4,7- dimethoxy kaempferol 61 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 74 - KẾT LUẬN 74 - TÀI LIỆU THAM KHẢO 76 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN br : Broad (NMR) d : Doublet (NMR) δ : Độ chuyển dịch hoá học (NMR) DEPT : Distortionless enhancement by polarisation transfer DMSO : Dimethyl sulfoxide D 2 O : Nƣớc đã đƣợc đơteri hoá EI : Electronic impact EtOAc : Ethyl acetate FT : Fourier transform HMBC : Heteronuclear multiple bond correlation HMQC : Heteronuclear multiple quantum coherence COSY : Correlation Spectroscopy IR : Infrared J : Hằng số tƣơng tác (NMR) m : Multiplet (NMR) Me : Methyl MeOH : Methanol MS : Mass spectrometry NMR : Nuclear magnetic resonance ppm : Parts per million Rf : Retention factor s : Singlet (NMR) t : Triplet (NMR) UV : Ultraviolet dd: double of double IC 50 : The half maximal inhibitory concentration LD 50 : Lathal dose 50% HPLC: High performance liquid chromatography Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LDL: Low density lipoprotein VLDL: Very low density lipoprotein HDL: High density lipoprotein G. Gynostemma Ara: α -L-arabinopyranosyl Rha: α -L-rhamnopyranosyl Glu: β-D-glucopyranosyl Xyl: β-D-xylopyranosyl Lyx: β-L-lyxopyranosyl SKBM: sắc ký bản mỏng DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu bảng Tên bảng Trang 4.1 Kết quả thử hoạt tính kháng oxy hóa 33 4.2 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào 34 4.3 Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 36 4.4 Số liệu phổ 1 H và 13 C-NMRcủa chất 43; 44; 45 và 46 38 4.5 Các chất phân lập từ cây Cổ yếm lá bóng 72 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC HÌNH Số hiệu hình Tên hình Trang 1.1 Ảnh một số loài thuộc chi Gynostemma 6 2.1 Ảnh Gynostemma laxum (Wall.) Cogn. thu hái ở Hoà Bình 18 3.2.2 Sơ đồ chiết mẫu và tách chất từ dịch chiết EtOAc của cây cổ yếm lá bóng 28 3.2.3 Sơ đồ chiết mẫu và tách chất từ dịch chiết EtOAc của cây cổ yếm lá bóng 30 4.1 Phổ IR của chất 43 41 4.2 Phổ 1 H-NMR của chất 43 42 4.3 Phổ 1 H-NMR của chất 43 (giãn rộng) 43 4.4 Phổ 13 C-NMR của chất 43 44 4.5 Phổ DEPT và 13 C-NMR của chất 43 45 4.6 Phổ 1 H-NMR của chất 44 47 4.7 Phổ 1 H-NMR của chất 44 (giãn rộng) 48 4.8 Phổ 13 C-NMR của chất 44 49 4.9 Phổ 13 C-NMR của chất 44 (giãn rộng) 50 4.10 Phổ DEPT và 13 C-NMR của chất 44 51 4.11 Phổ MS của chất 44 52 4.12 Phổ 1 H-NMR của chất 45 54 4.13 Phổ 1 H-NMR của chất 45 (giãn rộng) 55 4.14 Phổ 1 H-NMR của chất 45 (giãn rộng) 56 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 4.15 Phổ 13 C-NMR của chất 45 57 4.16 Phổ 13 C-NMR của chất 45 58 4.17 Phổ 13 C-NMR của chất 45 59 4.18 Phổ DEPT và 13 C-NMR của chất 45 60 4.19 Phổ 1 H-NMR của chất 46 62 4.20 Phổ 1 H-NMR của chất 46 (giãn rộng) 63 4.21 Phổ 13 C-NMR của chất 46 64 4.22 Phổ 13 C-NMR của chất 46 65 4.23 Phổ DEPT và 13 C-NMR của chất 46 66 4.24 Phổ HSQC của chất 46 67 4.25 Phổ HSQC của chất 46 68 4.26 Phổ HMBC của chất 46 69 4.27 Phổ HMBC của chất 46 70 4.28 Phổ HMBC của chất 46 (giãn rộng) 71 [...]... định các thành phần hóa học chính từ cây cổ yếm lá bóng 2 Mục tiêu nghiên cứu - Nghiên cứu hoạt tính sinh học và thành phần hóa học của cổ yếm lá bóng (Gynostemma laxum) của Việt Nam 3 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu - Các dịch chiết của mẫu cây Cổ yếm lá bóng ở Việt Nam trong các dung môi có độ phân cực khác nhau - Thử hoạt tính sinh học của các dịch chiết - - Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất... dụng Cổ yếm lá bóng làm thuốc do đó đề tài: Nghiên cứu hoạt tính sinh học và thành phần hóa học từ cây Cổ yếm lá bóng [Gynostemma laxum (Wall.) Cogn.] của Việt Nam ” đƣợc thực hiện với các nội dung chính sau: - Tạo dịch chiết bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau - Thử hoạt tính sinh học của các dịch chiết - Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các chất từ dịch chiết - Xác định các thành phần. .. dùng Cổ yếm lá bóng Giảo cổ lam 3 lá (Gynostemma laxum) Giảo cổ lam 5 lá Ngũ diệp sâm (Gynostemma pentaphyllum) Hình 1 Hình ảnh hai loài thuộc chi Gynostemma ở Việt Nam 2 Hoạt tính sinh học của cây Giảo cổ lam [7, 9, 11, 14, 22, 24, 26-28, 31] Hoạt tính sinh học của cây giảo cổ lam chủ yếu là do thành phần saponin, vì vậy, saponin đã trở thành đối tƣợng của rất nhiều những nghiên cứu về giảo cổ lam... pentaphyllum (giảo cổ lam năm lá, ngũ diệp sâm) 1.3 Cổ yếm lá bóng [1-10] 5 1.3.1 Tên gọi Giảo cổ lam ba lá hay Cổ yếm lá bóng có tên khoa học là Gynostemma laxum (Wall.) Cogn thuộc họ Bí (Cucurbitaceae) 1.3.2 Môi trường sống Cổ yếm lá bóng là một loài cây thảo có thân mảnh, leo nhờ tua cuốn đơn ở nách lá Cây đực và cây cái riêng biệt Lá kép hình chân vịt Cổ yếm lá bóng (giảo cổ lam ba lá) mọc tự nhiên... đƣợc 4 Phƣơng pháp nghiên cứu 4.1 Các phƣơng pháp nghiên cứu lý thuyết - Xử lý mẫu: nguyên liệu gồm thân, lá cây Cổ yếm lá bóng đƣợc thu tại Hòa Bình vào tháng 6 năm 2011, đƣợc rửa sạch, sấy khô và đem xay nhỏ - , hexan, etyl 3 - Phƣơng pháp nghiên cứu: Các phƣơng pháp chiết, tách xác định thành phần hóa học, tác dụng sinh học, ứng dụng của một số cây thuộc chi Gynostemma trong nƣớc và trên thế giới... đuợc nhóm nghiên cứu của Phạm Thanh Kỳ phát hiện lần đầu tiên vào năm 1997 Từ đó cho tới nay, nhiều nghiên cứu trên loài dƣợc liệu này đã đƣợc tiến hành, làm sáng tỏ thành phần hoá học, tác dụng dƣợc lý và từ đó, đƣa vào khai thác và sử dụng nguồn dƣợc liệu quý hiếm này phục vụ chăm sóc sức khoẻ cộng đồng Trong số 2 loài còn lại, Gynostemma laxum (Wall.) Cogn (hay còn gọi là cây Cổ yếm lá bóng) là dƣợc... chúng tôi thực hiện thử hoạt tính sinh học của các dịch chiết từ cây Cổ yếm lá bóng tại Phòng Hóa sinh ứng dụng- Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam ● Phương pháp chiết mẫu thực vật Mẫu thực vật thƣờng đƣợc chiết theo hai cách: - Cách thứ nhất: Chiết mẫu với dung môi là MeOH hay EtOH ở nhiệt độ thƣờng hoặc có thể tăng nhiệt độ Thực hiện chiết mẫu lặp lại từ 3 đến 4 lần Dịch chiết... nhƣ Giảo cổ lam, với tác dụng điều trị viêm khí quản mạn tính, viêm gan truyền nhiễm, viêm thận, loét dạ dày hành tá tràng, phong thấp và đau nhức khớp, bệnh về tim, béo phì, điều trị chức năng thần kinh Tuy nhiên, cho tới nay, ở Việt Nam chƣa có nhiều nghiên cứu về hoạt tính sinh học và thành phần hoá học, tác dụng dƣợc lý cũng nhƣ độc tính của loài này 2 Nhằm mục tiêu góp phần tạo cơ sở khoa học cho... thực vật, thành phần hoá học, ứng dụng của một số cây thuộc chi Gynostemma 4.2 Các phƣơng pháp nghiên cứu thực nghiệm (1D NMR): 1H-NMR, 13 - (2D NMR): COSY, NOESY và các phƣơng pháp khá 5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Gynostemma sẽ đóng góp vào kho tàng các hợp chất thiên nhiên của Việt Nam và thế giới hiệu quả và bền vững 6 Bố cục luận văn Luận văn gồm có 78 trang trong đó có 5 bảng và 28... LC/MSD Agilent của Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam - Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H - NMR, 13 C - NMR đo trên máy Bruker Avance–500 MHz, chất nội chuẩn là TMS cho 1H - NMR và tín hiệu dung môi (DMSO, D2O) cho 13C - NMR của Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 22 - Phổ hồng ngoại (FT - IR) đo dƣới dạng viên nén KBr trên trên máy quang phổ IMPACT 410 của hãng . nghiên cứu - Nghiên cứu hoạt tính sinh học và thành phần hóa học của cổ yếm lá bóng (Gynostemma laxum) của Việt Nam. 3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu - Các dịch chiết của mẫu cây Cổ yếm lá bóng. tính của loài này. 2 Nhằm mục tiêu góp phần tạo cơ sở khoa học cho việc sử dụng Cổ yếm lá bóng làm thuốc do đó đề tài: Nghiên cứu hoạt tính sinh học và thành phần hóa học từ cây Cổ yếm. Thử hoạt tính sinh học của các dịch chiết. - Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các chất từ dịch chiết. - Xác định các thành phần hóa học chính từ cây cổ yếm lá bóng. 2. Mục tiêu nghiên