Header Page of 166 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************ HUỲNH CHẤN KHÔN NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY TIÊU (Piper nigrum L.) TẠI THỊ XÃ BÀ RỊA THUỘC TỈNH BÀ RỊA – VŨNG TÀU BẰNG KỸ THUẬT RAPD LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 Footer Page of 166 Header Page of 166 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************ NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY TIÊU (Piper nigrum L.) TẠI THỊ XÃ BÀ RỊA THUỘC TỈNH BÀ RỊA – VŨNG TÀU BẰNG KỸ THUẬT RAPD LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hướng dẫn: TS TRẦN THỊ DUNG Sinh viên thực hiện: HUỲNH CHẤN KHÔN CN LƢU PHÚC LỢI Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 Footer Page of 166 Header Page of 166 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY  STUDYING GENETIC DIVERSITY OF THE PEPPER (Piper nigrum L.) AT BA RIA TOWN, BA RIA – VUNG TAU PROVINCE BY RAPD-PCR GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor TRẦN THỊ DUNG, PhD LƢU PHÚC LỢI Student HUỲNH CHẤN KHÔN TERM: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 Footer Page of 166 Header Page of 166 LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh tạo điều kiện cho suốt thời gian học tập - Các thầy cô Bộ môn Công Nghệ Sinh Học thầy cô trực tiếp giảng dạy suốt bốn năm qua - TS Trần Thị Dung CN Lƣu Phúc Lợi tận tình hƣớng dẫn động viên thời gian thực đề tài tốt nghiệp - CN Huỳnh Kim Hƣng quan tâm giúp đỡ suốt thời gian phòng thí nghiệm anh chị thuộc Trung tâm phân tích thí nghiệm Hóa Sinh - Đại học Nông Lâm Tp HCM - PGS.TS Nguyễn Thị Lang, cô Trịnh Thị Lũy – Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long dẫn kinh nghiệm quý báu - Cô Phạm Thị Chín anh Vinh, anh Tình, anh Tâm, anh Lai – Trung Tâm Khuyến Nông Và Giống Nông Nghiệp tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu tận tình hƣớng dẫn suốt thời gian thu mẫu - Toàn thể lớp CNSH28 thân yêu hỗ trợ, giúp đỡ động viên suốt thời gian làm đề tài Thành kính ghi ơn ba mẹ ngƣời thân gia đình tạo điều kiện động viên suốt trình học tập trƣờng Tháng 08 năm 2006, Huỳnh Chấn Khôn Footer Page of 166 iii Header Page of 166 TÓM TẮT HUỲNH CHẤN KHÔN, Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 “NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY TIÊU (Piper nigrum L.) TẠI THỊ XÃ BÀ RỊA TỈNH BÀ RỊA – VŨNG TÀU BẰNG KỸ THUẬT RAPD” Hội đồng hƣớng dẫn: TS TRẦN THỊ DUNG CN LƢU PHÚC LỢI Cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) mặt hàng xuất tiếng Việt Nam Hiện trạng trồng tiêu Việt Nam gặp phải số hạn chế cần đƣợc khắc phục Trong số đó, quan trọng khâu giống, giống trồng lâu đời, chƣa đƣợc phục tráng tuyển chọn Vì trƣớc hết cần phải tiến hành khảo sát tính đa dạng di truyền giống tiêu, sở thực có hiệu việc nhân tạo giống cho suất cao chất lƣợng tiêu tốt, đồng thời xây dựng định hƣớng kiểm tra, quản lý bảo vệ nguồn gen giống trồng sẵn có nƣớc nhƣ du nhập từ nƣớc Những kết đạt đƣợc: - Về kiểu hình: Các giống tiêu thị xã Bà Rịa có khác biệt hình thái lá, yếu tố cấu thành suất suất.Tuy nhiên, giống Vĩnh Linh Ấn Độ đọt tím, giống Phú Quốc sẻ nhỏ có hình thái giống - Về quy trình ly trích DNA: Kết cho thấy quy trình cho kết tốt ly trích DNA tổng số từ tiêu - Về phản ứng RAPD: Qua thử nghiệm 19 primer có primer cho sản phẩm hầu hết 11 giống tiêu Kết bƣớc đầu cho thấy primer OPA 10, AL 08, OPD 05 có băng đa hình thị giúp nhận diện giống tiêu sẻ, Ấn Độ đọt trắng, Paniyur – Karimunda - Về phân nhóm di truyền: Các giống tiêu khảo sát có đa dạng cao mặt di truyền mức tƣơng đồng gen biến thiên từ 0,34 đến 0,97 Trong đó, mức tƣơng đồng gen cao hai giống Ấn Độ đọt tím Ấn Độ dài (0,97) thấp hai giống Kamunda Ấn Độ dài (0,34) Footer Page of 166 iv Header Page of 166 - Qua kết trên, bƣớc đầu khẳng định hiệu kỹ thuật RAPD nghiên cứu sinh học phân tử Đặc biệt công tác đánh giá độ đa dạng di truyền quần thể trồng, loại trừ nhận định dựa cảm tính, tính trạng hình thái Footer Page of 166 v Header Page of 166 MỤC LỤC Trang tựa i Lời cảm ơn iii Tóm tắt iv Mục lục vi Danh sách bảng ix Danh sách hình biểu đồ x Danh sách chữ viết tắt xi PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vần đề 1.2 Mục tiêu yêu cầu 1.2.1 Mục tiêu 1.2.2 Yêu cầu PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Một số khái niệm đa dạng sinh học 2.1.1 Đa dạng sinh học 2.1.2 Đa dạng di truyền 2.2.3 Ý nghĩa việc nghiên cứu bảo vệ đa dạng di truyền 2.2 Giới thiệu chung tiêu 2.2.1 Nguồn gốc tiêu 2.2.2 Công dụng tiêu 2.2.3 Đặc điểm hình thái tiêu 2.2.4 Yêu cầu sinh thái 2.2.5 Giống tiêu Việt Nam 2.2.6 Tình hình sản xuất tiêu thụ tiêu giới nƣớc 10 2.2.6.1 Thế giới 10 2.2.6.2 Trong nƣớc 11 2.3 Một số phƣơng pháp nghiên cứu đa dạng di truyền 11 2.3.1 Phƣơng pháp sử dụng thị hình thái 11 2.3.2 Phƣơng pháp sử dụng thị isozyme 12 2.3.3 Phƣơng pháp dùng thị phân tử 12 Footer Page of 166 vi Header Page of 166 2.4 Các kỹ thuật cần thiết tách chiết DNA thực vật 13 2.4.1 Phƣơng pháp tách chiết DNA 13 2.4.2 Phƣơng pháp định tính định lƣợng DNA 14 2.5 Phản ứng PCR (Polymerase chain reaction) 15 2.5.1 Nguyên tắc 15 2.5.2 Thành phần phản ứng PCR 16 2.6 Một số thị phân tử thƣờng dùng nghiên cứu đa dạng sinh học 17 2.6.1 Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 17 2.6.2 Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 18 2.6.3 Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 19 2.6.4 Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeat) 21 2.7 Cây phát sinh loài 21 2.7.1 Một số thuật ngữ 22 2.7.2 Những cách vẽ phát sinh loài 22 2.7.3 Các phƣơng pháp chủ yếu tạo phát sinh loài 22 2.8 Một số nghiên cứu tiêu giới Việt Nam 23 2.8.1 Thế giới 23 2.8.2 Việt Nam 23 PHẦN NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 3.1 Nội dung 25 3.2 Thời gian đại điểm thực đề tài 25 3.3 Vật liệu 25 3.3.1 Giống tiêu 25 3.3.2 Hóa chất cần thiết 26 3.4 Phƣơng pháp 28 3.4.1 Nội dung 1: Điều tra giống tiêu đƣợc trồng thị xã Bà Rịa 28 3.4.2 Nội dung 2: Thực phản ứng RAPD để đánh giá độ đa dạng di truyền quần thể tiêu thị xã Bà Rịa 29 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 4.1 Kết điều tra giống tiêu thị xã Bà Rịa 37 4.1.1 Các giống tiêu mức độ phổ biến chúng thị xã Bà Rịa 37 4.1.2 Đặc điểm giống tiêu thị xã Bà Rịa 38 Footer Page of 166 vii Header Page of 166 4.2 Kết phản ứng RAPD 43 4.2.1 Kết khảo sát quy trình tách chiết DNA 43 4.2.2 Kết tối ƣu hóa thành phần RAPD 46 4.2.3 Đánh giá độ đa dạng di truyền giống tiêu thị xã Bà Rịa 48 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55 5.1.Kết luận 55 5.2.Đề nghị 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PHỤ LỤC Footer Page of 166 viii Header Page 10 of 166 DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 2.1: Một số đặc điểm khác tiêu lớn tiêu nhỏ Bảng 2.2: Sản lƣợng xuất số nƣớc năm 2003 10 Bảng 3.1: Danh sách giống tiêu sử dụng nghiên cứu 25 Bảng 3.2: Danh sách primer sử dụng nghiên cứu 27 Bảng 3.3: So sánh khác ba quy trình tách chiết khảo sát 31 Bảng 3.4: Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng số chu kỳ đến sản phẩm RAPD 33 Bảng 3.5: Thành phần phản ứng RAPD dùng thí nghiệm 2.1 33 Bảng 3.6: Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng nồng độ primer đến sản phẩm RAPD 34 Bảng 3.7: Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng nồng độ Mg2+ đến sản phẩm RAPD 34 Bảng 3.8: Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng nồng độ Taq đến sản phẩm RAPD 34 Bảng 3.9: Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng nồng độ DNA mẫu đến sản phẩm RAPD 35 Bảng 4.1 Các giống tiêu đƣợc trồng thị xã Bà Rịa 37 Bảng 4.2: So sánh đặc trƣng giống tiêu 38 Bảng 4.3: So sánh số tiêu cấu thành suất suất giống tiêu 39 Bảng 4.4 Tỷ lệ mẫu DNA tổng số tinh ly trích theo quy trình khảo sát 44 Bảng 4.5 Hàm lƣợng DNA tổng số ly trích theo ba quy trình khảo sát 45 Bảng 4.6 Nồng độ tối ƣu thành phần phản ứng RAPD 49 Bảng 4.7 Số băng khuếch đại băng đa hình số primer 49 Bảng 4.8 Hệ số đồng dạng di truyền 11 giống tiêu 52 Footer Page 10 of 166 ix 49 Header Page 61 of 166 Sau khảo sát thành phần phản ứng RAPD, đƣa thành phần phản ứng tối ƣu Bảng 4.6 Nồng độ tối ƣu thành phần phản ứng RAPD 4.2.3 Thành phần Nồng độ PCR buffer 1X dNTPs 0,2 mM Primer M Mg2+ mM Taq polymerase 0,75 U DNA mẫu 50 ng Nƣớc cất thêm vào cho đủ 25 l Đánh giá độ đa dạng di truyền giống tiêu thị xã Bà Rịa Sau tiến hành tối ƣu thành phần phản ứng RAPD, thực phản ứng RAPD mẫu DNA giống tiêu thu thập đƣợc thị xã Bà Rịa Chúng nhận thấy, tổng số 19 primer sử dụng có primer cho sản phẩm RAPD, primer lại không cho sản phẩm tất giống cho sản phẩm hai giống Bảng 4.7 Số băng khuếch đại băng đa hình số primer Primer Số băng khuếch đại Số băng đa hình RAPD 10 OPA 10 10 AL 08 OPD 05  Primer RAPD Trong số primer cho sản phẩm RAPD primer RAPD primer cho sản phẩm tất 11 giống tiêu khảo sát Số băng đa hình ghi nhận đƣợc primer Băng đa hình có kích thƣớc khoảng 700bp thấy xuất giống tiêu Ấn Độ đọt trắng, Ấn Độ dài, Paniyur – Ấn Độ bầu Footer Page 61 of 166 50 Header Page 62 of 166 ( L 10 11 Hình 4.10 Sản phẩm khuếch đại RAPD với primer RAPD L: thang chuẩn ; thứ tự giếng (1 – 11): Ấn Độ đọt trắng, Ấn Độ dài, Paniyur – 1, Kuchin, Phú Quốc, Ấn Độ bầu, Karimunda, Ấn Độ đọt tím, Vĩnh Linh, sẻ nhỏ, sẻ lớn  Primer OPA 10 Kết khảo sát primer OPA 10 cho thấy có 10 băng khuếch đại, số đó, có băng đa hình Tuy nhiên, primer OPA 10 không cho sản phẩm giống tiêu Ấn Độ đọt trắng, Ấn Độ dài, Kuchin Ấn Độ đọt tím Ở hai giống tiêu sẻ lớn sẻ nhỏ đồng thời xuất băng đa hình (hình 4.12) Có thể băng đa hình thị đặc trƣng cho hai giống tiêu sẻ Tuy nhiên, giới hạn đề tài, chƣa xác định đƣợc kích thƣớc băng Ngoài ra, giống Paniyur – có xuất băng đa hình kích thƣớc khoảng 350bp Đây thị đặc trƣng cho giống tiêu (L Hình 4.11 Sản phẩm khuếch đại RAPD với primer OPA 10 L : thang chuẩn ; giếng – 8: Ấn Độ đọt trắng, Paniyur – 1, Ấn Độ bầu, Phú Quốc, Karimunda, Vĩnh Linh, sẻ nhỏ, sẻ lớn Footer Page 62 of 166 51 Header Page 63 of 166  Primer AL 08 Kết khảo sát primer AL 08 cho thấy primer cho sản phẩm khuếch đại giống tiêu : Ấn Độ đọt trắng, Phú Quốc, Ấn Độ bầu, Karimunda sẻ lớn với tổng số băng khuếch đại 6, số băng đa hình Duy giống tiêu Ấn Độ đọt trắng có xuất băng đa hình kích thƣớc khoảng 1500bp Vì vậy, xem băng thị để nhận biết giống tiêu Ấn Độ đọt trắng  Primer OPD 05 Kết khảo sát primer OPD 05 cho thấy primer cho sản phẩm khuếch đại giống tiêu: Paniyur – 1, Kuchin, Phú Quốc Karimunda Số băng thu đƣợc primer (chỉ có băng) số băng đa hình có Băng đa hình có kích thƣớc khoảng 1100bp xuất giống tiêu Karimunda ( (a)L 10 11 (b)L 10 11 Hình 4.12 Sản phẩm RAPD primer OPD 05 (a) AL 08 (b) L: thang chuẩn, giếng – 11: Ấn Độ đọt trắng, Ấn Độ dài, Paniyur – 1, Kuchin, Phú Quốc, Ấn Độ bầu, Karimunda, Ấn Độ đọt tím, Vĩnh Linh, sẻ nhỏ, sẻ lớn  Phân tích số liệu phần mềm NTSYS Từ kết RAPD thu đƣợc gel điện di, mã hóa thành dạng nhị phân đƣa vào phân tích phần mềm NTSYS Footer Page 63 of 166 52 Header Page 64 of 166 Bảng 4.8 Hệ số đồng dạng di truyền 11 giống tiêu Adtr Adtr 1.00 LD 0.76 P1 0.55 ADB 0.55 Kuchin 0.53 PQ 0.76 Kari 0.42 tim 0.74 VL 0.74 SN 0.58 SL 0.50 LD P1 1.00 0.74 0.79 0.50 0.63 0.34 0.97 0.87 0.71 0.53 1.00 0.79 0.66 0.47 0.45 0.71 0.71 0.61 0.53 ADB Kuchin PQ Kari tim VL SN SL 1.00 0.66 0.47 0.45 0.82 0.71 0.61 0.58 1.00 0.50 0.66 0.71 0.82 0.74 1.00 0.37 0.47 0.42 0.39 1.00 0.89 0.74 0.55 1.00 0.79 0.50 1.00 0.71 1.00 1.00 0.50 0.42 0.47 0.47 0.37 0.66 Kết cho thấy mức tƣơng đồng gen cao hai giống Ấn Độ đọt tím Ấn Độ dài (0,97) chứng tỏ hai giống có nguồn gốc đứng gần phát sinh loài Mức tƣơng đồng gen thấp hai giống Karimunda Ấn Độ dài chứng tỏ hai giống đứng xa phát sinh loài Adtr LD tim VL P1 ADB PQ SN SL Kuchin Kari Kuchin 0.42 0.56 0.70 Coefficient 0.84 0.97 Hình 4.13 Cây phân nhóm di truyền dựa vào kết RAPD Sơ đồ phát sinh loài cho thấy, giống tiêu khảo sát chia thành nhóm với mức tƣơng đồng gen biến thiên từ 0,34 đến 0,97 Điều cho thấy giống tiêu khảo sát có đa dạng cao mặt di truyền Footer Page 64 of 166 Header Page 65 of 166 53 Nhóm gồm giống Karimunda, nhóm bao gồm giống lại Trong đó, mức tƣơng đồng gen nhóm nhóm 0,42 Kết cho thấy giống Karimunda có khác biệt xa mặt di truyền so với giống khác Điều có lẽ giống Karimunda có nguồn gốc Ấn Độ (cùng nguồn gốc với số giống tiêu nhóm 2) nhƣng theo nhƣ thông tin thu thập đƣợc lại giống tiêu (các giống Ấn Độ nhóm giống tiêu lai) đƣợc du nhập vào Việt Nam năm gần Nhóm phân thành nhóm nhỏ: nhánh 2A giống tiêu Kuchin nhánh 2B gồm giống tiêu lại Mức tƣơng đồng gen nhóm 2A 2B khoảng 0,52 Mức tƣơng đồng thấp chứng tỏ giống tiêu Kuchin giống tiêu nhánh 2B có nguồn gốc khác Điều với thực tế điều tra, Kuchin giống tiêu đƣợc du nhập từ Mã Lai Nhánh 2B đƣợc phân thành nhánh: nhánh 2B1 bao gồm giống sẻ nhỏ, sẻ lớn, Phú Quốc nhánh 2B2 bao gồm giống Ấn Độ đọt trắng, Ấn Độ dài, Ấn Độ đọt tím, Vĩnh Linh, Paniyur – 1, Ấn Độ bầu Trong đó, mức tƣơng đồng gen nhánh 2B1 2B2 khoảng 0,61 Ở nhánh 2B1 nhận thấy mức tƣơng đồng di truyền cao giống tiêu sẻ nhỏ với tiêu Phú Quốc (0,8) theo thông tin thu thập đƣợc hai giống có nguồn gốc khác Giống tiêu Phú Quốc có nguồn gốc từ Campuchia giống tiêu sẻ lớn sẻ nhỏ có nguồn gốc địa phƣơng Sự bất hợp lý sai sót trình thu mẫu sai lầm nông dân việc gọi tên giống Nhánh 2B2 bao gồm phần lớn giống tiêu Ấn Độ Nhánh đƣợc phân thành nhánh nhỏ: nhánh 2B2a gồm giống tiêu Ấn Độ đọt trắng nhánh 2B2b gồm giống tiêu Ấn Độ dài, Ấn Độ đọt tím, Vĩnh Linh, Paniyur – 1, Ấn Độ bầu Vì bao gồm hầu hết giống tiêu có nguồn gốc Ấn Độ nên mức tƣơng đồng gen nhánh nhỏ 2B2a 2B2b cao (0,68) Nhánh 2B2b lại đƣợc phân thành nhánh: nhánh thứ bao gồm giống tiêu Paniyur – Ấn Độ bầu, nhánh thứ hai bao gồm giống tiêu Ấn Độ dài, Ấn Độ tím Vĩnh Linh Theo nhƣ thông tin thu thập đƣợc giống Vĩnh Linh có nguồn gốc từ Indonesia nhƣng lại đứng gần với giống tiêu Ấn Độ phát sinh loài với mức tƣơng đồng gen cao (0,9) Khi so hình thái bên giống tiêu Footer Page 65 of 166 Header Page 66 of 166 54 Vĩnh Linh có hình thái giống với giống tiêu Ấn Độ đọt tím, điều dẫn đến sai sót trình thu mẫu Tóm lại, qua kết phát sinh loài hình cho thấy giống tiêu đƣợc trồng thị xã Bà Rịa có mức độ đa dạng cao mặt di truyền Qua số liệu điều tra kết phát sinh loài, bƣớc đầu đề xuất vật liệu lai cho công tác chọn tạo giống ví dụ nhƣ hai giống tiêu Ấn Độ đọt tím giống Kuchin hai giống có suất cao nhƣng lại khác biệt mặt di truyền, vật liệu tốt cho việc lai tạo giống có chất lƣợng tốt Footer Page 66 of 166 Header Page 67 of 166 55 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết thu đƣợc, đƣa số kết luận sau:  Về kết điều tra giống tiêu Hiện có 11 giống tiêu đƣợc trồng thị xã Bà Rịa Các giống tiêu Ấn Độ đọt tím, Kuchin, Ấn Độ dài, Vĩnh Linh giống cho suất cao, giống tiêu thuộc nhóm tiêu sẻ, Phú Quốc giống cho suất thấp Nhìn chung, giống tiêu có khác biệt hình thái lá, yếu tố cấu thành suất Tuy nhiên, giống tiêu Vĩnh Linh giống Ấn Độ đọt tím, giống Phú Quốc giống sẻ nhỏ có nhiều đặc điểm hình thái giống  Về quy trình ly trích DNA Quy trình cho kết tốt ly trích DNA tổng số từ tiêu DNA thu đƣợc bị gãy hàm lƣợng cao qua lần biến tính protein phenol/chloroform (1:1)  Về phản ứng RAPD Chỉ có primer RAPD 6, OPA 10, AL 08, OPD 05 tổng số 19 primer cho sản phẩm khuếch đại hầu hết giống tiêu Kết bƣớc đầu cho thấy primer OPA 10, AL 08, OPD 05 có băng đa hình thị giúp nhận diện giống tiêu sẻ, Ấn Độ đọt trắng, Paniyur – Karimunda  Về phân nhóm di truyền Các giống tiêu khảo sát có đa dạng cao mặt di truyền với mức tƣơng đồng gen biến thiên từ 0,34 đến 0,97 Trong đó, mức tƣơng đồng gen cao hai giống Ấn Độ đọt tím Ấn Độ dài (0,97) thấp hai giống Karimunda Ấn Độ dài 5.2 Đề nghị o Tiếp tục khảo sát thêm nhiều primer nhiều mẫu để có kết xác Từ đó, tìm thị liên kết với tính trạng tốt giống o Kết hợp phân nhóm di truyền dựa vào kết RAPD với việc phân nhóm di truyền dựa vào liệu kiểu hình để có nhận định xác độ tin cậy cao công tác tuyển chọn lai tạo giống Footer Page 67 of 166 56 Header Page 68 of 166 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Bộ Nông nghiệp phát triển nông thôn, 2004 Báo cáo ngành hàng quý I/04 : Mặt hàng hạt tiêu Hà Nội, trang Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2004 Di truyền phân tử Nhà xuất Nông Nghiệp Tp Hồ Chí Minh Hồ Bích Liên, 2002 Xây dựng phƣơng pháp chẩn đoán bắp chuyển gen nghiên cứu trạng sản phẩm bắp chuyển gen nhập vào Việt Nam Khóa luận tốt nghiệp kỹ sƣ nông học, Đại học Nông Lâm, TP Hồ Chí Minh Hoàng Thị Bích Thủy, 2004 Khảo sát đa hình giống dứa Cayenne dựa kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymophic DNA) Khóa luận tốt nghiệp Cử Nhân Công Nghệ Sinh Học, Đại học Khoa học Tự Nhiên TP Hồ Chí Minh Lê Thị Thanh Tuyền, 2005 Nghiên cứu đa dạng nguồn gen dứa Cayenne marker phân tử Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Công Nghệ Sinh Học, Đại học Nông Lâm, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam Mai Xuân Liễu, 2003 Điều tra giống kỹ thuật canh tác tiêu (Piper nigrum L.) huyện Tân Thành tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Nông học, Đại học Nông Lâm, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam Nguyễn Nghĩa Thìn, 2005 Đa dạng sinh học tài nguyên di truyền thực vật Nhà xuất ĐHQG Hà Nội Nguyễn Thị Lang, 1999 Những phương pháp nghiên cứu Công Nghệ Sinh Học Nhà xuất Nông Nghiệp, Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Ngọc Thắm, 2005 Khảo sát suất hồ tiêu bị bệnh virus huyện Châu Đức tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Nông học, Đại học Nông Lâm, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam 10 Nhiều tác giả, 2004 Cây gia vị, đặc điểm kỹ thuật gieo trồng Nhà xuất Thanh Hóa 11 Phạm Thị Chín, Nguyễn Xuân Vinh, 2005 Tuyển chọn giống tiêu tốt tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu 12 Phạm Văn Bình, 2005 Đánh giá sơ mức độ đa dạng di truyền quần thể điều (Acanardium occidentale L.) đƣợc trồng tỉnh Ninh Thuận kỹ thuật Footer Page 68 of 166 Header Page 69 of 166 57 RAPD AFLP Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Công Nghệ Sinh Học, Đại học Nông Lâm, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam 13 Phan Gia Tân, 2001 Kỹ thuật thâm canh tiêu Tài liệu tập huấn, Đại học Nông Lâm, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam 14 Phan Hữu Trinh, Trần Thị Mai, Vũ Đình Thắng Bùi Đắc Tuấn, 1987 Kỹ thuật trồng tiêu Nhà xuất nông nghiệp 15 Tôn Nữ Tuấn Nam, Trần Kim Loang, 2001 Kỹ thuật trồng chăm sóc hồ tiêu Tài liệu tập huấn, Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Lâm Nghiệp Tây Nguyên, Dak Lak 16 Trần Văn Hòa, 2001 101 câu hỏi thường gặp sản xuất nông nghiệp – Tập Nhà xuất Trẻ TIẾNG NƢỚC NGOÀI 17 John M S Bartlett, David Stirling, 2002 Methods in Molecular Biology Vol 226: PCR protocols, 2nd edition Humana press Inc., Totowa, NJ 18 K Johnson George, G Ganga, R Sandeep Varma, B Sasikumar, K V Saji, 2004 Identification of hydrids in black pepper (Piper nigrum L.) using male parent – specific RAPD markers Current science, Vol 88, No 19 Kurt Weising, Hilde nybom, Kirsten Woff, Wieland Meyer, 1995 DNA fingerprinting in plants and fingi CRC press, Inc 20 M J McPherson, S G Moller, 2000 PCR The Cromwell press, UK 21 Singth RK, SN Kakar, 1977 Control on individual trait means during index selection Proc Thrid Congr SABRAO (Canberra), d): 22 – 25 22 T Pradeepkumar, J.L Karihaloo, Sunil Archak and Ambika Baldev, 2003 Analysis of genetic diversity in Piper nigrum L using RAPD markers Genetic Resources And Crop Evolution 50: 469 – 475 Kluwer Academic Publishers, Netherlands Footer Page 69 of 166 Header Page 70 of 166 58 TRANG WEB 23 http://www.wwfindochina.org/news/spamtechrep/Chien%20luoc%20%20English%20chuan%20_13-4-04_.pdf 24 http://vietnamnet.vn/kinhte/thitruong/2006/02/538912/ 25 http://www.agroviet.gov.vn/BaocaoNH/Q3/Hattieu3.asp 26 http://www.agroviet.gov.vn/engine.asp?page=1&tu=giống%20tiêu&m=99&opt=all&dk=and &datefrom=&dateto=&lr=&kieu=0&num=10&layID=106116 27 http://www.vneconomy.com.vn/vie/article_to_print.php?id=050217095817 28 http://www.indianspices.com/html/s1930pac.htm Footer Page 70 of 166 59 Header Page 71 of 166 PHỤ LỤC Sự khác biệt hình thái giống tiêu Footer Page 71 of 166 60 Header Page 72 of 166 Quy trình Quy trình Mẫu Tỷ lệ OD260/OD280 OD260 OD280 Lƣợng DNA 10 11 12 13 14 15 Mean 1.756722 1.715766 1.710408 1.522363 2.345865 2.09649 2.05111 1.9398 1.905104 2.066649 1.943333 1.781846 1.802458 1.947248 1.888244 0.91404 0.21526 0.71897 0.33935 0.4505 0.3207 0.410099 0.8481 1.3254 2.3938 1.6317 0.99582 0.87403 0.80988 0.54321 0.52031 0.12546 0.42035 0.22291 0.19204 0.15297 0.19994 0.43721 0.69571 1.1583 0.83964 0.55887 0.48491 0.41591 0.28768 387.6196 90.23294 300.9061 133.2036 214.2301 146.6511 185.9739 376.0593 583.221 1088.712 724.0689 425.1776 375.1973 359.6869 238.1143 393.87 10 11 12 13 14 15 Mean 1.386965 1.525349 1.701231 1.461896 1.701028 1.432653 1.498756 1.706098 1.859305 1.891878 1.797555 2.044013 1.900373 2.084683 1.859305 0.60842 1.3118 0.29171 0.32745 0.32277 0.55064 0.36733 0.38191 0.24937 0.48801 0.9927 0.30233 0.2907 0.22919 0.24937 0.43867 0.86 0.17147 0.22399 0.18975 0.38435 0.24509 0.22385 0.13412 0.25795 0.55225 0.14791 0.15297 0.10994 0.13412 224.77498 515.5222 121.75639 125.32965 134.71233 207.98656 142.81817 159.63539 108.57053 214.09629 425.5983 136.91797 127.7811 104.58211 108.57053 190.5768 Quy trình Footer Page 72 of 166 61 Header Page 73 of 166 Quy trình Mẫu Tỷ lệ OD260/OD280 OD260 OD280 Lƣợng DNA 10 11 12 13 14 15 Mean 2.28309 2.135097 1.859305 1.706098 1.75955 1.751335 1.900373 2.044013 2.041153 2.186371 1.949894 2.135097 1.859305 1.891878 1.939316 0.16033 0.18728 0.24937 0.38191 0.30171 0.84297 0.2907 0.30233 0.21526 0.40907 0.16033 0.18728 0.24937 0.48801 0.26237 0.070225 0.087715 0.13412 0.22385 0.17147 0.48133 0.15297 0.14791 0.10546 0.1871 0.082225 0.087715 0.13412 0.25795 0.13529 75.56657 86.22172 108.5705 159.6354 128.0464 356.9493 127.7811 136.918 97.43294 189.949 71.24657 86.22172 108.5705 214.0963 116.3263 Quy trình Footer Page 73 of 166 62 Header Page 74 of 166 MẪU PHIẾU ĐIỀU TRA NÔNG DÂN Ngày điều tra Họ tên chủ vƣờn: Nơi chốn: Ấp: Xã, phƣờng: Huyện: Tổng diện tích canh tác: (ha) Số cây:……………… Các giống tiêu trồng số đặc điểm chúng STT Tên giống Dài Rộng (cm) (cm) Gân Mép Màu sắc Dạng STT Tên giống Chiều dài gié (cm) Đƣờng kính (mm) P 1000 hạt (g) Số hạt/gié Số gié/m2 Năng suất (kg/nọc) Kháng bệnh Sinh trƣởng STT Tên Dây lƣơn (số giống tháng sau trồng) Dây thân Năng suất vụ ( số tháng đầu sau trồng) (kg/trụ) Năng suất trung bình (sau năm trồng, kg/trụ) Ngày……… tháng…… năm 2006 Ngƣời điều tra Footer Page 74 of 166 63 Header Page 75 of 166 DANH SÁCH CÁC HỘ NÔNG DÂN ĐIỀU TRA Họ tên Nguyễn Xuân Vinh Phạm Thị Chín Nguyễn Duy Khánh Nguyễn Thị Ánh Ngọc Trần Văn Lai Trần Thị Thiên Hƣơng Phạm Văn Ngà Nguyễn Văn Hùng Lê Minh Tâm Lê Thị Em Phạm Văn Hai Phạm Văn Ba Nguyễn Thị Hƣơng Biện Lan Thanh Đinh Viết Quốc Nam Võ Thị Lũy Nguyễn Thị Thanh Minh Phan Văn Ba Phạm Văn Sơn Nguyễn Sinh Trƣờng Lê Văn Cầu Nguyễn Văn Chái Huỳnh Văn Tiêm Lê Quang Cảnh Nguyễn Đình Khoa Footer Page 75 of 166 Họ tên Nguyễn Văn Ba Lê Thị Bảy Phạm Thị Bé Em Trần Thị Oanh Đặng Thu Liên Đinh Văn Trung Hồ Sỹ Trí Võ Thành Chung Mai Thanh Liêm Bùi Thanh Ngọc Trịnh Văn Hai Nguyễn Văn Thanh Huỳnh Thị Hoa Lý Ngọc Minh Võ Hữu Tình Nguyễn Thị Nhàn Mạch Thị Bé Mạch Thị Ánh Nguyễn Khắc Thú Trần Văn Triều Lê Hữu Ngọ Võ Thị Tốt Nguyễn Văn Thuật Đỗ Văn Đức Nguyễn Nhƣ Cảm ... “NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY TIÊU (Piper nigrum L.) TẠI THỊ XÃ BÀ RỊA TỈNH BÀ RỊA – VŨNG TÀU BẰNG KỸ THUẬT RAPD Hội đồng hƣớng dẫn: TS TRẦN THỊ DUNG CN LƢU PHÚC LỢI Cây hồ tiêu (Piper nigrum. .. CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************ NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY TIÊU (Piper nigrum L.) TẠI THỊ XÃ BÀ RỊA THUỘC TỈNH BÀ RỊA – VŨNG TÀU BẰNG KỸ THUẬT RAPD LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ... di truyền tiêu (Piper nigrum L.) thị xã Bà Rịa thuộc tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu kỹ thuật RAPD Hy vọng kết đề tài đóng góp phần định vào tiền đề công tác chọn tạo giống tiêu Bà Rịa – Vũng Tàu nói riêng