Header Page of 16 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Lại Phƣơng Liên NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN PHÂN ĐOẠN S7 CỦA CÁC CHỦNG VIRUS GÂY BỆNH LÚA LÙN SỌC ĐEN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2013 Footer Page of 16 Header Page of 16 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Lại Phƣơng Liên NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN PHÂN ĐOẠN S7 CỦA CÁC CHỦNG VIRUS GÂY BỆNH LÚA LÙN SỌC ĐEN Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Phạm Xuân Hội PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân Hà Nội – Năm 2013 Footer Page of 16 Header Page of 16 LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Phạm Xuân Hội PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân tận tình bảo, hƣớng dẫn, giúp đỡ suốt trình học tập nghiên cứu để hoàn thành luận văn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới ThS Nguyễn Duy Phƣơng, CN Nguyễn Hoàng Quang cán bộ, anh chị em Bộ môn Bệnh học Phân tử Thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp nhiệt tình hƣớng dẫn giúp đỡ nhiều thời gian thực tập Bộ môn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể thầy cô giáo môn Di truyền học, khoa Sinh học , trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội tạo điều kiện cho đƣợc học tập nghiên cứu môi trƣờng học tập khoa học, giúp cho có kiến thức bổ ích suốt năm học Cuối xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình bạn bè,những ngƣời đứng sau giúp đỡ tạo điều kiện để hoàn thành luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng 12 năm 2013 Học viên thực Lại Phƣơng Liên i Footer Page of 16 Header Page of 16 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BVTV Bảo vệ thực vật bp Base pair (Cặp bazơ) cDNA complementary (DNA bổ sung) ddNTP Dideoxyribonucleoside triphosphate DNA Axit deoxy ribonucleic dNTP Deoxynucleotidetriphosphates dsRNA Double stranded RNA (ARN sợi đôi) FDV Fiji disease virus (Virus bệnh Fiji) EDTA Axit Ethylenediaminetetra acetic ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay (xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) EtBr Ethidium Bromide IRRI International Rice Research Institute (Viện nghiên cứu lúa quốc tế) Kb Kilobase LB Môi trƣờng Luria Bertani LSĐPN Lùn sọc đen phƣơng Nam MRCV Mal de Río Cuarto virus (Virus Mal de Rio Cuarto) MRDV Maize rough dwarf virus (Virus lùn ngô) NLRV Nilaparvata lugens virus (Virus nilaparvata lugens) NN&PTNT Nông nghiệp phát triển nông thôn OD Optical Density (mật độ quang học) ORF Open reading frame (Khung đọc mở) OSDV Oat Sterile-Dwarf Virus (Virus lùn yến mạch) PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) RBSDV Rice black streaked dwarf virus (Virus lùn sọc đen) RGSV Rice grassy stunt virus (Virus lúa cỏ) RNA Axit ribonucleic RRSV Rice ragged stunt virus (Virus lùn xoắn lá) ii Footer Page of 16 Header Page of 16 RSV Rice stripe virus (Virus lúa sọc) RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp phiên mã ngƣợc) RTSV Rice tungro spherical virus (Virus Tungro hình cầu) RTBV Rice tungro bacilliform virus (Virus Tungro dạng thẳng) RDV Rice dwarf virus (Virus bệnh lúa lùn) RGDV Rice gall dwarf virus (Virus vết u lùn lúa) SRBSDV Southern rice black-streaked dwarf virus (Virus lùn sọc đen phƣơng Nam) TAE Tris base – Acetic - EDTA iii Footer Page of 16 Header Page of 16 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng Các cặp oligo nucleotide sử dụng nghiên cứu 22 Bảng Các biểu bệnh lùn sọc đen lúa 35 Bảng Kết sàng lọc mẫu bệnh phƣơng pháp Sandwich-ELISA 40 RT-PCR bƣớc Bảng Trình tự mồi đặc hiệu đƣợc thiết kế phục vụ cho phản ứng 42 So sánh mức đồng trình tự phân đoạn S7 phân lập 54 RT-PCR Bảng mẫu Việt Nam Trung Quốc iv Footer Page of 16 Header Page of 16 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình Cây lúa bị nhiễm bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam Hình Rầy lƣng trắng Sogatella furcifera truyền virus SRBSDV Hình Cấu trúc phân tử Fijivirus 11 Hình Tổ chức gen Fijivirus 11 Hình Cấu trúc hình đa diện kiểu icosahedral T=13 12 Hình Ảnh điện di 10 phân đoạn RNA sợi đôi virus SRBSDV 14 gel polyacrylamide 12,5% Hình Sự xuất protein P7-1 tế bào vector truyền bệnh 16 (rầy Sogatella furcifera) dƣới kính hiển vi điện tử Hình Xét nghiệm virus SRBSDV phƣơng pháp DOT-ELISA 17 Hình Vector nhân dòng pGEM-T số vị trí cắt 32 enzyme cắt giới hạn vector pGEM-T Hình 10 Triệu chứng số mẫu lúa thu thập tỉnh Việt Nam 37 Hình 11 Một số kết kiểm tra ELISA với mẫu thu thập tỉnh 38 Một phần kết điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR 39 Việt Nam Hình 12 bƣớc mẫu lúa Hình 13 Hình ảnh điện di genome SRBSDV phân lập từ 12 mẫu 40 Kết điện di phân đoạn S7 phân lập đƣợc SRBSDV 42 lúa Hình 14 gel agarose 1% (chủng Thái Bình-2) Hình 15 Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu phân 43 Kết điện di sản phẩm DNA tinh kit 45 đoạn S7 Hình 16 GenJETTM Gel Extraction gel agarose 1% Hình 17 Sơ đồ minh họa trình dòng hóa S7 vào vector pGEM-T 46 Hình 18 Kết biến nạp sản phẩm phản ứng gắn vào E.coli chủng 46 v Footer Page of 16 Header Page of 16 DH5α Hình 19 Kết điện di kiểm tra sản phẩm plasmid tinh gel 47 Kết điện di sản phẩm PCR từ plasmid tinh Sử dụng 48 agarose 1% Hình 20 cặp mồi S7-Fw/S7-Rv Hình 21 Kết điện di sản phẩm PCR từ plasmid tinh sử dụng 49 cặp mồi T7-Fw/SP6-Rv Hình 22 Kết điện di sản phẩm cắt giới hạn vector tái tổ hợp 50 pGEM-T/S7 enzyme EcoRI Hình 23 Một phần kết giải trình tự phân đoạn S7 virus 50 SRBSDV (mẫu Nghệ An) Hình 24 Trình tự amino acid suy diễn khung đọc mở nằm 51 phân đoạn S7 (mẫu Nghệ An) Hình 25 Một phần kết so sánh trình tự nucleotide phân đoạn S7 53 mẫu SRBSDV thu đƣợc Việt Nam giới Hình 26 Một phần kết so sánh trình tự amino acid phân đoạn S7 53 mẫu SRBSDV thu đƣợc Việt Nam giới Hình 27 Hai phả hệ dựa toàn trình tự S7 (A) trình tự gen P7-1 (B) vi Footer Page of 16 55 Header Page of 16 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÁC VIRUS HẠI LÚA Ở VIỆT NAM 1.1.1 Các virus gây bệnh lúa .3 1.1.2 Tình hình nghiên cứu virus hại lúa Việt Nam .3 1.2 BỆNH LÙN SỌC ĐEN PHƢƠNG NAM VÀ VIRUS SRBSDV .5 1.2.1 Giới thiệu chung bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam .5 1.2.1.1 Nguồn gốc phát sinh bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam 1.2.1.2 Diễn biến bệnh lúa lùn sọc đen Việt Nam 1.2.2 Đặc điểm bệnh học bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam 1.2.2.1.Dấu hiệu nhận biết 1.2.2.2 Vector truyền bệnh 1.2.3 Đặc điểm sinh học virus SRBSDV 10 1.2.3.1 Phân loại 10 1.2.3.2 Đặc điểm hình thái SRBSDV 12 1.2.3.3 Đặc điểm di truyền virus SRBSDV 12 1.2.3.4 Đặc điểm phân đoạn S7 khả tiến hóa SRBSDV 14 1.2.3.5 Chuẩn đoán virus SRBSDV .16 1.2.4 Tình hình nghiên cứu bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam virus SRBSDV Việt Nam 17 1.2.4.1 Các nghiên cứu xác định virus SRBSDV 17 1.2.4.2 Các nghiên cứu quy trình chẩn đoán virus SRBSDV 19 CHƢƠNG II - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 VẬT LIỆU .21 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 21 2.1.2 Hóa chất 21 2.1.3 Thiết bị 22 vii Footer Page of 16 Header Page 10 of 16 2.2 PHƢƠNG PHÁP 22 2.2.1 Thu mẫu .22 2.2.2 Xét nghiệm mẫu 22 2.2.2.1 Phƣơng thức ELISA gắn đặc hiệu - "Sandwich ELISA" 23 2.2.2.2 RT-PCR bƣớc .25 2.2.2.3 Điện di DNA gel agarose 1% 26 2.2.3 Tinh dsRNA SRBSDV cột CF-11 26 2.2.4 Tổng hợp cDNA từ dsRNA 28 2.2.4.1 Thiết kế cặp mồi 28 2.2.4.2 Tổng hợp cDNA sợi 28 2.2.4.3 Tổng hợp cDNA sợi đôi kĩ thuật PCR .29 2.2.4.4 Tinh sản phẩm PCR từ gel agarose kit Fermentas .30 2.2.5 Nhân dòng sản phẩm PCR kit pGEM®-T Easy Cloning .31 2.2.5.1 Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pGEM-T 31 2.2.5.2 Biến nạp DNA vào tế bảo khả biến E.colichủng DH5α 32 2.2.6 Tinh plasmid từ vi khuẩn E.coli kit GenJETTM Plasmid Miniprep 33 2.2.7 Cắt enzyme giới hạn .33 2.2.8 Giải trình tự nucleotide đoạn gen nhân dòng 34 2.2.9 Phân tích đa dạng di truyền phân đoạn S7 35 CHƢƠNG III – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .36 3.1 Thu thập bảo quản mẫu 36 3.2 Kết sàng lọc mẫu bệnh phƣơng pháp Sandwich-ELISA RT-PCR bƣớc 38 3.2.1 Kết xét nghiệm mẫu bệnh sử dụng phƣơng pháp Sandwich- ELISA 38 3.2.2 Sàng lọc mẫu bệnh phƣơng pháp RT-PCR bƣớc 39 3.3 Phân lập hệ gen mẫu SRBSDV 39 3.4 Phân lập phân đoạn S7 SRBSDV thu thập từ mẫu lúa bệnh 41 3.5 Nhân phân đoạn S7 phƣơng pháp RT-PCR .43 3.5.1 Thiết kế đoạn mồi đặc hiệu cho phản ứng RT-PCR phục vụ nhân phân đoạn S7 43 3.5.2 Nhân phân đoạn S7 phƣơng pháp RT-PCR 43 viii Footer Page 10 of 16 Header Page 65 ofVĂN 16 TỐT NGHIỆP LUẬN Lại Phương Liên – K20 Di truyền học Bảng 5: So sánh mức đồng trình tự phân đoạn S7 phân lập mẫu Việt Nam Trung Quốc 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 ID 0.95 0.95 0.95 0.95 0.94 0.95 0.97 0.94 0.94 0.94 0.94 0.94 0.95 0.95 0.95 0.95 0.94 0.94 0.94 0.95 ID 1.00 1.00 1.00 0.99 1.00 0.97 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 1.00 1.00 1.00 1.00 0.99 0.99 0.99 0.95 1.00 ID 1.00 1.00 1.00 0.99 0.97 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.95 1.00 1.00 ID 1.00 1.00 0.99 0.97 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.95 1.00 1.00 1.00 ID 1.00 0.99 0.97 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.94 0.99 1.00 1.00 1.00 ID 0.99 0.97 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.95 1.00 0.99 0.99 0.99 0.99 ID 0.97 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 1.00 1.00 0.99 1.00 0.99 0.99 0.99 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 ID 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.98 0.98 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.94 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.97 ID 1.00 0.99 1.00 0.99 1.00 1.00 0.99 1.00 0.99 0.99 0.99 10 0.94 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.97 1.00 ID 0.99 1.00 0.99 1.00 1.00 0.99 1.00 0.99 0.99 0.99 11 0.94 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.97 0.99 0.99 ID 0.99 0.99 1.00 1.00 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 12 0.94 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.97 1.00 1.00 0.99 ID 0.99 1.00 1.00 0.99 1.00 0.99 0.99 0.99 13 0.94 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.97 0.99 0.99 0.99 0.99 ID 1.00 1.00 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 14 0.95 1.00 0.99 0.99 0.99 0.99 1.00 0.98 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 ID 1.00 1.00 1.00 0.99 0.99 0.99 15 0.95 1.00 0.99 0.99 0.99 0.99 1.00 0.98 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 ID 1.00 1.00 0.99 0.99 0.99 16 0.95 1.00 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.97 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 1.00 1.00 ID 1.00 0.99 0.99 0.99 17 0.95 1.00 0.99 0.99 0.99 0.99 1.00 0.97 1.00 1.00 0.99 1.00 0.99 1.00 1.00 1.00 ID 0.99 0.99 0.99 18 0.94 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.97 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 ID 0.99 0.99 19 0.94 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.97 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 ID 0.99 20 0.94 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.97 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 ID (Huế-2), (SRBSDV-HM998850), (Lào Cai), (Ninh Bình-1), (Sơn La-1), (Nghệ An), (SRBSDV-HM585273), (Thái Bình-2), (SRBSDV-JQ692578), 10 (Nam Định), 11 (Ninh Bình-2), 12 (SRBSDV-JN388912), 13 (Huế-1), 14 (SRBSDV-EU784841), 15 (SRBSDV-FN563995), 16 (SRBSDV-HQ731498), 17 (SRBSDV-JQ034354), 18 (Quảng Trị1), 19 (Quảng Trị-2), 20 (Thái Bình-1) 54 Footer Page 65 of 16 Header LUẬN Page 66VĂN of 16 TỐT NGHIỆP Lại Phương Liên – K20 Di truyền học 3.9.2 Phân tích đặc điểm di truyền Vì nay, virus SRBSDV phát Việt Nam Trung Quốc nên phân tích mối quan hệ mẫu virus Việt Nam với mẫu virus Trung Quốc Hai phả ̣ đã đƣơ ̣c xây dƣ̣ng dƣ̣a toàn b ộ trình tự phân đoạn S7 gen mã hóa protein P7-1 12 mẫu virus Việt Nam nghiên cứu mẫu virus Trung Quốc sẵn có GenBank (Hình 27) NinhBinh-2 SRBSDV-JN388912 NamDinh SRBSDV-JQ692578 ThaiBinh-2 50 SRBSDV-FN563995 64 SRBSDV-EU784841 Hue-1 50 SRBSDV-HQ731498 SRBSDV-JQ034354 SonLa-1 NinhBinh-1 100 LaoCai NgheAn SRBSDV-HM998850 Hue-2 SRBSDV-HM585273 ThaiBinh-1 QuangTri-1 99 QuangTri-2 95 NinhBinh-2 SRBSDV-JN388912 NamDinh SRBSDV-JQ692578 ThaiBinh-2 71 SRBSDV-HQ731498 SRBSDV-FN563995 SRBSDV-EU784841 Hue-1 SRBSDV-JQ034354 SonLa-1 NinhBinh-1 95 LaoCai 71 NgheAn SRBSDV-HM998850 Hue-2 SRBSDV-HM585273 ThaiBinh-1 QuangTri-1 97 QuangTri-2 76 66 (A) (B) Hình 27: Hai phả hệ dựa toàn trình tự S7 (A) trình tự gen P7-1 (B) cho thấ y mố i quan ̣ của mẫu virus phân lập từ Viê ̣t Nam và Trung Qu ốc Cây xây dựng phương pháp MP (maximum parsimony) dùng phần mềm MEGA Các số nốt giá trị boostrap tính theo % (1000 lần lặp) chỉ trình bày giá trị > 50% Mẫu Việt Nam chỉ rõ chấm đen Thanh bar số thay nucleotide 55 Footer Page 66 of 16 Header LUẬN Page 67VĂN of 16 TỐT NGHIỆP Lại Phương Liên – K20 Di truyền học Phân tić h phả ̣ cho thấ y khó đánh giá m ối quan hệ phả hệ chúng mức độ đồng trình tự cao nhƣ trình bày Tuy nhiên, nhận thấy: (i) Quan hệ mẫu virus dựa toàn phân đoạn S7 tƣơng tự nhƣ dựa gen P7-1 (ii) Trên cây, có mẫu Việt Nam hình thành cụm rõ rệt với giá tri ̣thố ng kê boostrap rấ t cao (95 - 100 %) Cụm gồm mẫu Quảng Trị (Quảng Trị -, Quảng Trị -2) mẫu thu Thái Bình (Thái Bình-2) Cụm gồm mẫu thu miền Tây Bắc kể Nghệ An (Sơn La-1, Lào Cai, Ninh Bình -1 Nghệ An) (iii) Các mẫu lại không hình thành cụm phân biệt mà xuất rải rác thành nhánh với giá trị thống kê boostrap thấp (