ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - - LÊ THỊ SINH Tên đề tài: PHÁT HIỆN NHANH BỆNH GREENING TRÊN CÂY CÓ MÚI Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2012 – 2016 THÁI NGUYÊN - 2016 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - - LÊ THỊ SINH Tên đề tài: PHÁT HIỆN NHANH BỆNH GREENING TRÊN CÂY CÓ MÚI Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Lớp : K44 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2012 – 2016 Giảng viên : ThS Bùi Đình Lãm Khoa CNSH-CNTP, Trƣờng ĐH Nông Lâm Thái Nguyên THÁI NGUYÊN - 2016 i LỜI CẢM ƠN Đƣợc đồng ý Khoa CNSH - CNTP, trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên Em đƣợc thực tập phòng thí nghiệm Khoa CNSH – CNTP, trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên với đề tài: „„Phát nhanh bệnh greening có múi số tỉnh phía Bắc Việt Nam’’ để hoàn thành khóa luận nỗ lực thân em nhận đƣợc nhiều giúp đỡ Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa CNSH - CNTP, thầy cô giáo tận tình giảng dạy cho em suốt năm học Trƣớc hết em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa CNSH - CNTP, thầy cô giáo tận tình giảng dạy cho em suốt năm học vừa qua để em hoàn thành khóa luận Đặc biệt, em xin đƣợc bày tỏ lòng kính trọng, lòng biết ơn sâu sắc tới ThS Bùi Đình Lãm ngƣời tận tình hƣớng dẫn em suốt trình thực đề tài Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến KS Lã Văn Hiền dành nhiều thời gian quý báu trực tiếp hƣớng dẫn em thực nghiên cứu đề tài Cuối em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, ngƣời thân bạn bè quan tâm, ủng hộ động viên em suốt trình học tập nghiên cứu giúp em hoàn thành tốt khóa luận Do điều kiện thời gian có hạn nên đề tài khó tránh khỏi thiếu sót Kính mong thầy cô giáo bạn sinh viên đóng góp ý kiến xây dựng để đề tài em đƣợc hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn ! Thái Nguyên, ngày 20 tháng năm 2016 Sinh Viên Lê Thị Sinh ii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Các loài cam, quýt có ý nghĩa thực tiễn sản xuất Bảng 2.2: Tình hình sản xuất có múi châu lục giới giai đoạn 2011 - 2013 14 Bảng 2.3: Diện tích, suất sản lƣợng có múi giới giai đoạn 2005 – 20013 .16 Bảng 2.4: Tình hình sản xuất có múi nƣớc ta giai đoạn 2005 – 2013 .16 Bảng 2.5: Tình hình sản xuất cam, quýt vùng nƣớc ta năm 2009 .17 Bảng 3.1: Trình tự cặp mồi để phát tác nhân gây bệnh greening (Hung cs, 1999b), (Hung cs, 2004) [34], [35] 28 Bảng 3.2: Các trang thiết bị máy móc dùng thí nghiệm .29 Bảng 3.3: Bảng thu thập mẫu địa phƣơng 30 Bảng 3.4: Chu trình nhiệt phản ứng PCR .32 Bảng 4.1: Kết thu thập mẫu vật liệu .36 Bảng 4.2: Kết đánh giá mẫu cam sành tỉnh Hà Giang 38 Bảng 4.3: Kết đánh giá mẫu cam vinh Thái Nguyên 39 Bảng 4.4: Kết giám định bệnh vàng greening 42 iii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Rầy chổng cánh Diaphorina citri 19 Hình 2.2 Triệu trứng nhiễm bệnh vàng greening có múi 21 Hình 4.1 Mẫu có múi thu thập để giám định bệnh vàng greening 37 Hình 4.2 Kết tách chiết DNA tổng số 40 Hình 4.3 Điện di sản phẩm PCR mẫu giám định bệnh greening 41 Hình 4.4 Kết tinh mẫu cam .44 Hình 4.5 Kết giải trình tự gen sản phẩm PCR với mồi GR - F từ mẫu DNA tách từ cam Vinh (Xã Quyết Thắng – Thái Nguyên,tỉnh Thái Nguyên) 45 Hình 4.6 Kết giải trình tự gen sản phẩm PCR với mồi GR – F từ mẫu DNA tách từ cam sành (Quang Bình – Hà Giang) 45 Hình 4.7 Kết giải trình tự gen sản phẩm PCR với mồi GR – F từ mẫu DNA tách từ cam Vinh (Xã Vô Chanh, huyện Phú Lƣơng, Thái Nguyên, tỉnh Thái Nguyên) 45 Hình 4.8 Kết so sánh trình tự gen sản phẩm PCR BLAST với mồi GR - F từ mẫu DNA tách từ cam Vinh (Xã Quyết Thắng – Thái Nguyên,tỉnh Thái Nguyên) .46 Hình 4.9 Kết so sánh trình tự gen sản phẩm PCR BLAST với mồi GR - F từ mẫu DNA tách từ cam Sành (Quang Bình – Hà Giang) 47 Hình 4.10 Kết so sánh trình tự gen sản phẩm PCR BLAST với mồi GR - F từ mẫu DNA tách từ cam Vinh (Xã Vô Chanh, huyện Phú Lƣơng, Thái Nguyên, tỉnh Thái Nguyên) .47 iv DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT BVTV : Bảo vệ Thực vật Cs : Cộng CTAB : Cetyl trimethyl ammonium bromide DNA : Deoxyribonucleic Acid ĐC : Đối chứng dNTP : Deoxyribo-nucleotide triphosphate EDTA : Ethylene diamine tetraacetate FAO : Food and Agriculture Organization NN&PTNT : Nông nghiệp Phát triển Nông thôn PCR : Polymerase Chain Reaction RNA : Ribonucleic Acid v MỤC LỤC Trang Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Yêu cầu nghiên cứu 1.4 Mục tiêu nghiên cứu 1.5 Ý nghĩa đề tài 1.5.1 Ý nghĩa khoa học 1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn .3 Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan có múi .4 2.1.1 Nguồn gốc phân loại 2.1.1.1 Nguồn gốc 2.1.2 Đặc điểm sinh học có múi 2.1.3 Giá trị có múi .9 2.1.4 Yêu cầu sinh thái có múi 10 2.1.5 Một số sâu bệnh hại có múi .12 2.1.6 Tình hình sản xuất có múi 14 2.2 Bệnh vàng Greening có múi .18 2.2.1 Lịch sử bệnh .18 2.2.2 Nguyên nhân triệu chứng bệnh 18 2.2.3 Phƣơng pháp chẩn đoán bệnh vàng greening 21 2.2.4 Một số biện pháp phòng tránh 23 2.3 Tình hình nghiên cứu phát bệnh greening có múi 23 2.3.1 Các nghiên cứu phát bệnh giới 23 2.3.2 Các nghiên cứu phát bệnh Việt Nam 26 Phần 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 3.1 Vật liệu nghiên cứu 28 3.1.1 Vật liệu thực vật 28 3.1.2 Hóa chất dụng cụ thí nghiệm 28 vi 3.2 Phạm vi, địa điểm thời gian nghiên cứu 29 3.2.1 Phạm vi nghiên cứu 29 3.2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 29 3.3 Nội dung nghiên cứu 30 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 30 3.4.1 Phƣơng pháp thu thập mẫu vật liệu 30 3.4.2 Phƣơng pháp xác định biểu bệnh greening thông qua biểu bên 31 3.4.3 Phƣơng pháp phát bệnh greening có múi kỹ thuật PCR 31 3.4.4 Giải trình tự gene sản phẩm PCR .33 3.4.5 Phƣơng pháp sử lý số liệu .35 Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .36 4.1 Kết thu thập mẫu vật liệu 36 4.2 Kết xác định mức độ biểu bệnh .37 4.2.1 Kết xác định biểu bệnh thông qua triệu chứng bên 37 4.3 Kết giám định bệnh vàng greening kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu 40 4.3.1 Tách chiết DNA tổng số mẫu 40 4.3.2 Kết nhân đoạn gen 16s rDNA 40 4.4 Kết giải trình tự gen sản phẩm PCR từ mẫu bị bệnh greening 44 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .48 5.1 Kết luận 48 5.2 Kiến nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 I Tiếng Việt 50 II Tiếng Anh .52 III Tài liệu Internet 55 PHỤ LỤC Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cây ăn có múi (cam, quýt, chanh, bƣởi, v.v.) nhóm ăn quan trọng sản xuất nông nghiệp nƣớc ta Năm 2011, diện tích ăn có múi Việt Nam đạt 124.057 ha, diện tích trồng cam quýt chiếm tới 70.300 ha, bƣởi 45.000 chanh 18.000 (FAO, 2015) [52] Cây có múi loại trồng mang lại giá trị dinh dƣỡng, giá trị kinh tế cao Trong 100g thịt tƣơi có chứa 6-12% đƣờng, vitamin C từ 40-90 mg, Các acid hữu từ 0,4-1,2%, chất khoáng dầu thơm Sản phẩm có múi đƣợc sử dụng với nhiều mục đích khác nhƣ làm thực phẩm ăn hàng ngày, làm mứt, nƣớc giải khát Tinh dầu đƣợc cất từ vỏ quả, lá, hoa đƣợc dùng nhiều Công nghệ Thực phẩm Mỹ phẩm Vỏ dùng làm thuốc, hƣơng liệu (Đỗ Đình Đức, 1991) [7] Bệnh greening nguyên nhân ảnh hƣởng trực tiếp đến suất chất lƣợng (Lê Mai Nhất, 2014) [11] Bệnh lan truyền với tốc độ nhanh gây hại nghiêm trọng cho nhiều vùng trồng cam quýt giới Sản lƣợng bị giảm từ 30% đến 100% (Bassanezi R.B cs, 2005) [25] Ở Việt Nam, bệnh greening đƣợc ghi nhận gây hại ăn có múi từ năm 1960 Bệnh greening gây hại lớn vào năm 1970 1990 nông trƣờng trồng cam Mức độ thiệt hại bƣởi từ 17% – 25% cam quýt từ 54% – 70% (Vien N.V cs,2009) [50] Bệnh vàng greening bệnh hại quan trọng nhất, khốc liệt nhất, nguy hiểm nhất, nghiêm trọng nhất, hủy diệt tàn phá nặng nề nghề trồng ăn có múi giới (Su cs., 2012) [44] Đặc trƣng bệnh Greening có thời gian ủ bệnh dài, nên khó phát bệnh giai đoạn đầu thƣờng hay nhầm lẫn với bệnh khác nhƣ bị thiếu kẽm (Zn) (Lê Mai Nhất, 2014) [11] Đến bệnh biểu rõ ràng bệnh tàn phá nặng biện pháp chữa trị gần nhƣ vô nghĩa lúc này, nhiều biện pháp đƣợc thực nhƣng không mang lại hiệu Hơn nữa, vi khuẩn gây bệnh vàng đến xuất chủng mới, có độc tính nặng (Hung cs, 199a) [33].Chính vậy, việc phát nhanh bệnh greening giai đoạn đầu vô quan trọng việc phòng điều trị bệnh Ngày việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử cho phép chẩn đoán bệnh có múi mang lại hiệu cao với nhiều ƣu điểm nhƣ: độ nhạy cao, xác thời gian Có thể kể đến số kỹ thuật: PCR, real-time PCR, kỹ thuật lai phân tử, southern blot Kết thu đƣợc từ nghiên cứu chẩn đoán sinh học phân tử sở để sớm đƣa giải pháp phòng tránh Đến có nhiều nghiên cứu sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để phát bệnh greening có múi Xác định tác nhân gây bệnh vàng greening phƣơng pháp sinh học phân tử Phân lập vi khuẩn Candidatus Liberibacter asiaticus gây bệnh greening từ rầy chổng cánh kỹ thuật PCR (Hung cs, 199a) [33] Xuất phát từ thực tiễn nghiên cứu đó, tiến hành thực đề tài: „„Phát nhanh bệnh greening có múi số tỉnh phía Bắc Việt Nam’’ 1.2 Mục đích nghiên cứu Phát nhanh bệnh greening có múi kỹ thuật PCR 1.3 Yêu cầu nghiên cứu - Thu thập nguồn vật liệu số đối tƣợng có múi nhƣ: Cam, chanh, bƣởi, quýt số tỉnh miền Bắc Việt Nam - Xác định biểu bệnh greening mẫu vật liệu thu thập đƣợc - Giám định bệnh vàng greening có múi phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu - Giải trình tự gene sản phẩm PCR từ mẫu bị bệnh greening (từ 2-3 mẫu) 1.4 Mục tiêu nghiên cứu - Thu thập đƣợc mẫu vật liệu số đối tƣợng có múi nhƣ: Cam, chanh, quýt, bƣởi, địa phƣơng khác 42 bệnh greening giống sản phẩm tƣơi nhập vào Việt Nam Với kỹ thuật này, từ nhận mẫu phòng nghiệm công đoạn cuối 4-5 Đây kỹ thuật ngày đƣợc sử dụng rộng rãi chẩn đoán bệnh vàng greening để kiểm định giống trƣớc xuất vƣờn nhƣ xác định lây lan bệnh vƣờn môi giới truyền bệnh Bảng 4.4: Kết giám định bệnh vàng greening Địa điểm Mẫu Đƣờng Kết số chạy - Lá vàng lốm đốm - Lá vàng, gân xanh - Lá vàng, gân xanh - Lá vàng lốm đốm - Lá vàng, gân xanh - Lá vàng lốm đốm - Lá vàng, gân xanh 10 - Lá vàng, gân xanh Cam 11 - Lá vàng cục Sành 10 12 + Lá vàng, gân xanh 11 13 - Lá vàng, gân xanh 12 14 - Lá vàng, gân xanh 13 15 - Lá vàng, gân xanh 14 16 - Lá vàng cục 15 17 - Lá vàng, gân xanh 16ĐC 18 - Không có biểu Cam - Lá vàng cục Vinh + Lá vàng, gân xanh + Lá vàng, gân xanh Giống Xã Vĩ Thƣợng, huyện Quang Bình, tỉnh Hà Giang Triệu chứng Tỷ lệ nhiễm 1/16 (6.25%) 43 Mẫu Đƣờng Kết số chạy - Lá vàng lốm đốm Xã Quyết + Lá vàng, gân xanh 4/11 Thắng, - Lá vàng, gân xanh (36,4%) - Lá vàng lốm đốm 10 - Lá vàng, gân xanh 11 - Lá vàng, gân xanh 10 12 + Lá vàng, gân xanh 11ĐC 13 - Không có biểu 1ĐC - Không có biểu Địa điểm Giống Thái Triệu chứng Tỷ lệ nhiễm Nguyên,tỉnh Thái Nguyên Xã Vô Cam - Lá vàng, gân xanh Chanh, huện Vinh + Lá vàng, gân xanh - Lá vàng lốm đốm - Lá vàng lốm đốm - Lá vàng, gân xanh - Lá vàng lốm đốm 10 - Lá vàng, gân xanh 11 - Lá vàng, gân xanh 10 12 - Lá vàng, gân xanh 11 13 + Lá vàng, gân xanh 12 14 - Lá vàng, gân xanh 13 15 + Lá vàng, gân xanh 14 16 + Lá vàng, gân xanh Phú Lƣơng, Thái Nguyên, tỉnh Thái Nguyên 4/14 (28.57%) Chú thích:(+), Cây nhiễm bệnh greening; (-), Cây không nhiễm bệnh greening Các kết nghiên cứu đạt đƣợc có tƣơng đồng với kết công bố Hung cs (2004) [35] tác giả sử dụng mồi đặc hiệu nhân đoạn 16s rDNA 44 với khích thƣớc 226 bp để giám định bệnh vàng greening cam Đài Loan Ở hình 4.3A, 4.3B, 4.3C xuất băng sản phẩm PCR có kích thƣớc 226 bp nhƣ dự kiến Điều chứng tỏ mẫu thu thập cam Sành cam Vinh nghi vấn bị nhiễm bệnh vàng greening Tuy chƣa có đánh giá mức độ gây hại bệnh vàng greening có múi giám định, nhƣng kết thu đƣợc tiền đề để giám định bệnh greening trình sản xuất giống bệnh 4.4 Kết giải trình tự gen sản phẩm PCR từ mẫu bị bệnh greening  Kết tinh sản phẩm PCR Hình 4.4 Kết tinh mẫu cam Ghi chú: (1): mẫu DNA tách từ cam Vinh (Xã Quyết Thắng – Thái , (Nguyên,tỉnh Thái Nguyên), (2): mẫu DNA tách từ cam sành (Quang Bình – Hà Giang), (3): mẫu DNA tách từ cam Vinh (Xã Vô Chanh, huyện Phú Lƣơng, Thái Nguyên, tỉnh Thái Nguyên)  Kết nghiên cứu giải trình tự dựa mồi xuôi GR – F (5‟ - 3‟) đƣợc thể hình 4.5, 4.6,4.7 45 Hình 4.5 Kết giải trình tự gen sản phẩm PCR với mồi GR - F từ mẫu DNA tách từ cam Vinh (Xã Quyết Thắng, Thái Nguyên,tỉnh Thái Nguyên) Hình 4.6 Kết giải trình tự gen sản phẩm PCR với mồi GR – F từ mẫu DNA tách từ cam sành (Quang Bình – Hà Giang) Hình 4.7 Kết giải trình tự gen sản phẩm PCR với mồi GR – F từ mẫu DNA tách từ cam Vinh (Xã Vô Chanh, huyện Phú Lương, Thái Nguyên, tỉnh Thái Nguyên) 46 Kết giải trình tự gen thu đƣợc hình 4.5, 4.6 4.7 tiến hành phân tích BLAST NCBI, so sánh mức độ tƣơng đồng 99% đến 100% cho thấy chủng vi khuẩn gây bệnh greening cam Vinh (Xã Quyết Thắng – Thái Nguyên,tỉnh Thái Nguyên), cam Sành (Hà Giang) cam Vinh (Xã Vô Chanh, Phú Lƣơng, Thái Nguyên, tỉnhThái Nguyên) chủng vi khuẩn Candidatusloài Liberibacter asiaticus (Las) châu Á gây Kết kiểm tra PCR phù hợp với nghiên cứu trƣớc (Hung T.H et al., 1999, 2000; Hà Minh Trung et al., 2003; Lê Mai Nhất, 2014; Lê Mai Nhất et al., 2014) So với nghiên cứu trƣớc đây, nghiên cứu sử dụng kết giải trình tự gen phân tích phần mềm Blast NCBI để tăng cƣờng độ tin cậy xác định, làm rõ nguyên nhân gây bệnh greening số ăn có múi miền Bắc Từ kết giải trình tự gen thu đƣợc hình 4.5, 4.6 4.7 tiến hành so sánh BLAST NCBI, kết đƣợc thể hình 4.8, 4.9 4.10 Hình 4.8 Kết so sánh trình tự gen sản phẩm PCR BLAST với mồi GR - F từ mẫu DNA tách từ cam Vinh (Xã Quyết Thắng – Thái Nguyên,tỉnh Thái Nguyên) 47 Hình 4.9 Kết so sánh trình tự gen sản phẩm PCR BLAST với mồi GR F từ mẫu DNA tách từ cam Sành (Quang Bình – Hà Giang) Hình 4.10 Kết so sánh trình tự gen sản phẩm PCR BLAST với mồi GR F từ mẫu DNA tách từ cam Vinh (Xã Vô Chanh, huyện Phú Lương, Thái Nguyên, tỉnh Thái Nguyên) Từ kết hình 8, 4.9 4.10 cho thấy mức độ tƣơng đồng 99% đến 100% cho thấy chủng vi khuẩn gây bệnh greening cam Vinh (Xã Quyết Thắng Thái Nguyên,tỉnh Thái Nguyên) cam Sành (Hà Giang) cam Vinh (Xã Vô Chanh, huyện Phú Lƣơng, Thái Nguyên, tỉnh Thái Nguyên) chủng vi khuẩn Candidatus loài Liberibacter asiaticus (Las) châu Á gây 48 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu thu đƣợc, đề tài đƣa kết luận sau: Thu thập đƣợc mẫu vật liệu đối tƣợng có múi: cam Sành, cam Vinh Đánh giá đƣợc biểu bệnh greening đối tƣợng thông qua triệu chứng bên Kết tổng số 41 mẫu vật liệu thu đƣợc có 38/41 mẫu có biểu bệnh greening, 3/41 mẫu biểu bệnh Đã tiến hành giải phẫu mô thực vật mẫu vật liệu thu thập đƣợc (71 mẫu 64 mẫu có biểu hiện, mẫu khỏe) Kết cho thấy xuất đám sợi có sai khác với mẫu mô khỏe mạnh Kết giám định bệnh vàng greening kỹ thuật PCR thu đƣợc số kết nhƣ sau: Trong 16 mẫu cam sành Hà Giang giám định, kết PCR cho thấy có 1/16 mẫu có biểu dƣơng tính với bệnh greening (xuất băng có kích thƣớc 226 bp) Tƣơng tự, mẫu cam Vinh xã Quyết Thắng xã Vô Chanh, huyện Phú Lƣơng thành phố Thái Nguyên có số mẫu dƣơng tính với bệnh greening lần lƣợt 4/11 4/14 mẫu Kết giải trình tự gen đƣợc tiến hành phân tích BLAST NCBI, so sánh mức độ tƣơng đồng 99% đến 100% cho thấy chủng vi khuẩn gây bệnh greening cam Vinh (Xã Quyết Thắng, Thái Nguyên,tỉnh Thái Nguyên), cam Sành (Hà Giang) cam Vinh (Xã Vô Chanh, huyện Phú Lƣơng, Thái Nguyên, tỉnh Thái Nguyên) chủng vi khuẩn Candidatusloài Liberibacter asiaticus (Las) châu Á gây 49 5.2 Kiến nghị Từ kết giám định bệnh greening có múi nghiên cứu đƣa số kiến nghị nhƣ sau: Tiếp tục thu thập mẫu vật liệu đối tƣợng có múi địa phƣơng khác Tiếp tục phân tích PCR kỹ thuật sinh học phân tử khác để giám định bệnh vàng greening Tiếp tục tiến hành tinh sản phẩm PCR, đọc trình tự so sánh trình tự nucleotit thu đƣợc mẫu nhiễm bệnh vùng khác để định danh sác loài vi khuẩn gây bệnh vàng greening có múi Việt Nam Tiến hành hƣớng nghiên cứu để phòng trừ bệnh vàng greening phục vụ cho trình sản xuất giống bệnh 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tiếng Việt Phí Văn Ba (1976), Con đường trao đổi chất sinh học, Nxb Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Mạnh Chinh (2005), Sổ tay trồng ăn quả , Nxb Nông nghiệp Phạm Thị Chữ (1996) “Tuyển chọn, nhân giống bƣởi Phúc Trạch suất cao, phẩm chất tốt phục vụ xuất nội tiêu”, Tạp chí Khoa học công nghệ quản lý kinh tế, tháng 6/1996, trang 228-229 Đƣờng Hồng Dật (2003) Cam, chanh, quýt, bưởi kỹ thuật trồng, Nxb Lao động - xã hội Bùi Huy Đáp (1960), Cây ăn quả nhiệt đới, tập (1), Nxb Nông thôn Lê Đình Định (1990), “Tình hình dinh dƣỡng đất trồng cam chu kỳ số loại đất vùng Phủ Quỳ - Nghệ Tĩnh”, Một số kết quả nghiên cứu khoa học trạm thí nghiệm nhiệt đới Tây Hiếu 1960- 1990, Nxb Nông nghiệp Đỗ Đình Đức (1991), “Một số kết nghiên cứu tƣợng vân vàng cam, quýt miền Bắc Việt Nam”, Tạp chí Bảo vệ Thực vật, số 6, Tr 10-13 Vũ Công Hậu (1996), Trồng ăn Việt Nam Nhà xuất Nông nghiệp TP Hồ Chí Minh Trần Công Khánh (1981), Thực hành hình thái giải phẫu thực vật, Nxb Đại học Trung học chuyên nghiệp Hà Nội 10 Đinh Hải Lâm (2001) “Nghiên cứu tạo vật liệu bệnh bảo quản nguồn gene có múi in vitro số giống cam quýt địa phƣơng nhập nội”, Luận văn Thạc sỹ Nông nghiệp Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam 11 Lê Mai Nhất (2014), “Nghiên cứu bệnh vàng greening hại ăn có múi số tỉnh phía bắc Việt Nam đề xuất biện pháp phòng chống”, Luận án Tiến sỹ Nông nghiệp Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 51 12 Nguyễn Thị Minh Phƣơng (2007) Cây ăn đặc sản kỹ thuật trồng, Nxb nông nghiệp Hà Nội 13 Lê Đình Sơn (1993), “Phân tích để đạo bón phân cho cam”, Tạp chí Khoa học đất, (3), Nxb Nông nghiệp, trang 56 - 62 14 Phạm Thừa (1965), “Quy luật sinh trƣởng, phát triển cành Thu, Hè, Đông, Xuân Cam Sành Bố Hạ”, Tạp chí KHKTNN, (2), trang 35 - 40 15 Trần Thế Tục, Cao Anh Long, Hoàng Ngọc Thuận, Hoàng Thế Lƣ (1998), Giáo trình ăn quả, Nxb Nông nghiệp Hà Nội 16 Quyền Đình Thi, Nông Văn Hai (2008) Công nghệ Sinh học tập 2: Những ký thuật PCR ứng dụng phân tích DNA, Nxb Khoa học tự nhiên Công nghệ 17 Hà Minh Trung (2006), “ Hoàn thiện công ghệ sản xuất có múi đặc sản (cam, quýt, bƣởi) bệnh greening bệnh virus khác tỉnh phía bắc‟‟, Kỷ yếu hội nghị tổng kết khoa học công nghệ nông nghiệp 2001-2005, tr.190, Nxb Nông nghiệp 18 Hà Minh Trung, Ngô vĩnh viễn, Đỗ Thành Lâm (1995), “ Kết giám định kế hoạch phòng chống bệnh vàng cam quýt Đồng sông Cửu Long ” Tạp chí Nông nghiệp CNTP số 3, 1995, tr.95-97 19 Hà Minh Trung, Ngô Vĩnh Viễn, Vũ Đình Phú, Mai Thị Liên, Lê Mai Nhất, Nguyễn Bích Ngọc (2003), Bệnh greening nguyên nhân gây suy thoái vƣờn có múi giải pháp khắc phục, Kỷ yếu hội thảo khoa học quốc gia Bảo vệ Thực vật, Nxb Nông nghiệp, tr.1-12 20 Trung tâm làm vƣờn trồng trọt, Viện Bảo vệ Thực vật (2003), Hướng dẫn sử dụng dầu khoáng phòng trừ tổng hợp sâu bệnh hại ăn có múi Việt Nam, Nxb Nông nghiệp Hà Nội 21 Đào Thanh Vân, Trần Nhƣ Ý, Nguyễn Thế Huấn (2000) Giáo trình ăn quả, Đại học Nông lâm Thái Nguyên 22 Đỗ Năng Vịnh (2008), Cây ăn có múi-Công nghệ sinh học chọn tạo giống Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội 52 II Tiếng Anh 23 Aubert.B, Garnier.M, Cassin.J.C, Bertin.Y (1988), Citrus greening disease survey in East and West African countries South of Sahara, Proceeding of 10th conference of IOCV, IOCV, Riverside 1988, 231 – 237 24 Aubert, B (ed) (1987), Regional Workshop on citrus greening Huanglongbin disease, Review and Abstract FAO-UNDP, China.Dec.6-12/1987 25 Bassanezi R.B., Busato L.A., Bergamin Filho A., Amorim L., Gottwald T.R (2005), Spatial distribution of huanglongbing symptomatic trees in citrus groves in São Paulo, Brasil, Proceedings 2nd Inernational Citrus Canker and Huanglongbing Research Workshop, Florida Citrus Mutual, Orlando 2005, H-7 26 Bové.J.M, P Bonnet, M.Garnier and B Aubert (1980), Pennicilin and tetraciline treatment of greening disease affected citrus plants in the glasshouse and the bacterial nature of the procaryote associated with greening In proc th conf IOCV, IOCV, Riverside.tr.91-102 27 Bové.J.M, Garnier.M, Ahlawat.Y.S, Chakraborty.N.K, Varma.A (1993), Detection of the Asian strains of the greening BLO by DNA-DN‟ƣ\A hybridisation in Indian orchard trees and Malaysian Diaphorina citri psyllids, Proceedings of 12th Conference IOCV, IOCV, Riverside 1993, 258-263 28 Bové.J.M, Garnier.M (1984), Citrus greening and psylla vectors of the disease in the Arabian peninsula In Proc.9th Conf IOCV, IOCV, Riverside Tr 109-114 29 Bové.J.M Nguyen Minh Chau, Ha Minh Trung, Bourdeaut.J and Garier.M (1996), “Huanglongbing (greening) in Viet Nam Detection of Liberobacter asiaticum by DNA-Hybridization with probe in 2.6 and PCR Ampification of 16S Ribosomal DNA”, Thirteenth IOCV Conference, 1996-Procaryotes and blight, 258-266 53 30 Brlansky.R.H and Rogers.M.E (2007), “ Citrus Huanglongbing: Understanding the Vector-Pothogen Interaction for Disease Mangament”, Citrus Research and Education Center, University of Florida-IFAS 31 Garnier.M, Daniel.N and Bové.J.M (1984), An etiology of citrus greening diseases Ananals of Microbiology, tr.169-179 32 Halbert S.E., Manjunath K.L (2004), “Asian citrus psyllids (Sternorrhycha: Psyllidae) and greening disease of citrus: a literature review and assessment of risk in Florida”, Florida Entomologist 87: 330353 33 Hung.T.H, H.L Wu and H.J.Su (1999a), “Detection of fastidious bacteria causing citrus greening disease by nonradioactive DNA probes”, Ann Phytopathol Soc.Jpn.65:14-146 34 Hung.T.H, Wu.H.L and Su.H.J (1999b), “Development of a rapid method for the diagnosis of citrus greening disease usingthe polymerase chain reaction”, Journal of Phytopathology.147: 599-604 35 Hung.T.H, Hung.S.C, Chen.S.N, Hsu.M.H and Su.H.J (2004), “Detection by PCR of Candidatus Liberibacter asiaticus, the bacterium causing citrus of huanglongbin in vector psyllids: application to the study of vector-pathogen relationships”, Plant pathology.53:96-102 36 Huang.A.L (1987), Electronmicroscospical Studies on the Morpholohy and Population Dynamic of Fastidious Bacteria Causing Citrus Likubin, In H.J.Su (Advisor), ph.D Thesis NTU 148pp 37 Jagoueix S., Bové J.M., Garnier M (1996), “PCR detection of the two „Candidatus‟ liberobacter species associated with greening disease of citrus” Molecular Cellular Probes 10: 43-50 38 Jagoueix.S, Bové.J.M, Garnier.M (1997), “Comparison of the 16S/23S Ribosomal Intergenic Regions of “ Candidatus Liberobacter asiaticum” and “Candidatus Liberobacter africanum”, the two species associated with 54 citrus huanglongbing (greening) disease”, International Journal of Systematic Bacteriology.47:224-227 39 James C (2008) “Global status of commercialized biotech/ GM Crop‟‟, ISAAA Brief No, 37, International Service for the Acquisition of Agri- Biotech application, Ithaca, NY, USA 40 Kim.J.S, Sagaram.U.S, Burns.J.K, Li.J.L, and Wang.N (2008), “Response of SweetOrange (Citrus sinensis) to „Candidatus Liberibacter asiaticus‟ Infection: Microscopy and Microarray Analyses”, Phytopathology, 99:5057 41 Presley.D (1993), “Diseases of fruit crops‟‟, Dept of primary Industries, Queensdland 42 Su.H.J (2008), Production and Cultivation of virus-free citrus sapling for citrus Rehabilitation in Taiwan, Asia-pacific Consortium on Agricultural Biotechnology, New Delhi and Asia-pacific Association of Agricultural Research Institutions, Bangkok.P51 43 Su.H.J, Ting-Hseng Hung and Mei Chen Tsai (1993), Detection of the fastidious bacteria causing The Asia citrus greening by DNA probes, In Proc 12th Conf.IOCV, Riverside(Abs), 466 44 Su H.J., Feng Y.C., Hsin C and Hung T.H (2012) Current researches and Health management of Citrus Huanglongbing in 166 Taiwan, International Symposium on Epidemiology and disease management of citrus Huanglongbing disease for sustainable citrus production in the ASPAC Region, NTU, I-3, November – 10, 2012 45 Tanaka (1979), Edible plant collection, Tokyo, Japan 46 Tatineni.S, Sagaram.U.S, Gowda.S, Robertson.C.J, Dawson.W.O, Iwanami.T, Wang.N (2008), “In planta Distribution of „Candidatus Liberibacter asiaticus‟ as Revealed by Polymerase Chaine Reaction (PCR) and RealTime PCR”, Phytophatology, 85:592-598 55 47 Ngo Vinh Vien, Nguyen Thi Bich Ngoc (2009), Cultivation and health management of pathogen free citrus seeding in Northern Viet Nam, International Training Workshop on health management of pathogen-free citrus Orchard, SOFRI, Tien Giang – Viet Nam, 16-20th November, 2009 48 Walter Reuther et al (1989), The citrus industry Vol (2), Puplication of University of California, USA 49 Weiburg.W.G, Barns.S.M, Pelletier.D.A, Lane.D.J (1991), “16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study”, Journal of Bacteriology 173: 697-703 50 Vien N V and Ngo N T B (2009) Cultivation and health management of pathogen free citrus seeding Northern Vietnam, Internatioal Training Workshop on Health Management of Pathogen - free Citrus Orchard SOFRI , Tien Giang-Vietnam, 16 – 20 th Norvember, 2009 III Tài liệu Internet 51 Bộ Nông Nghiệp Phát Triển Nông Thôn (2014), Tổng diện tích ăn phân theo địa phương, Số liệu trồng trọt, http://www.mard.gov.vn 52 FAOSTAT (2015), Agricultural data, available from: http://faostat3.fao.org 53 "Automated DNA Sequencing Chemistry Guide."http://www.bioscienceresearch.co.nz/downloads/files/DNA_sequen cing/ABI_Seq_Ref_Guide.pdf PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH VỀ THU THẬP MẪU VẬT LIỆU VÀ GIÁM ĐỊNH BỆNH VÀNG LÁ GREENING A B C D Hình ảnh vƣờn thu mẫu A: Vƣờn cam Sành (huyện Quang Bình, tỉnh Hà Giang); B: Cây cam Sành (huyện Quang Bình, tỉnh Hà Giang); C: Cây cam Vinh (Quyết Thắng, Thái Nguyên); D: Cây Cam Vinh (Vô Chanh, Thái Nguyên) [...]... bệnh greening ở Việt Nam Kết quả trong 55 mẫu thu thập từ các chủng loại cây có múi khác nhau ở miền Bắc và miền Nam Việt Nam có tới 48/55 27 mẫu đƣợc phát hiện bằng lai Dot-blot và 47/55 mẫu cho kết quả PCR dƣơng tính khi sử dụng cặp mồi OI1 và OI2c với kích thƣớc sản phẩm 1160 bp (Bové và cs, 1996) [29] Mới đây nhất, trong một nghiên cứu về bệnh greening hại cây ăn quả có múi ở một số tỉnh phía bắc. .. loại quả cây có múi đã đƣợc sử dụng để phòng ngừa và chữa trị trong y học dân gian Ở nƣớc ta, nhân dân đã dùng cây ăn quả có múi để phòng và chữa trị một số bệnh từ lâu (Đƣờng Hồng Dật, 2003) [4] - Giá trị kinh tế: Cây ăn quả có múi là một trong những loại cây lâu năm, nhanh cho thu hoạch Một số loài có thể cho thu hoạch quả ở năm thứ 2 sau khi trồng Ở nƣớc ta, năng xuất trung bình của cam quýt ở thời... có múi (Hà Minh Trung, 2006) [17] 2.1.5.2 Một số côn trùng gây hại trên cây có múi Ngoài các bệnh hại chính, cây ăn quả có múi còn bị ảnh hƣởng và tàn phá bởi một số loài côn trùng dƣới đây: 14 - Sâu vẽ bùa: Phát triển quanh năm và gây hại trên tất cả các loài cây có múi Sâu hại lá non, đọt non ở các giai đoạn phát triển khác nhau của cây, làm mất khả năng quang hợp của lá - Sâu nhớt: Sâu nhớt gây hại... gây bệnh greening và đƣa ra các biện pháp quản lý dịch hại 2.3.1 Các nghiên cứu về phát hiện bệnh trên thế giới 24 Cho đến nay, bệnh greening đã lan rộng trên 50 quốc gia trên thế giới và đe dọa nghiêm trọng đến nguồn gen cây có múi ở các nƣớc châu Á Lin (1956) đã chứng minh bệnh có thể truyền đƣợc qua mắt ghép và đƣợc Bové và cs, 1984 khẳng định lại một lần nữa khi phát hiện các tác nhân gây bệnh. .. Trên quả xuất hiện những vết bệnh mọng, mềm và những vết bệnh phát triển nhanh thậm trí gây thối tới toàn bộ quả Bào tử nấm thƣờng lơ lửng trong không khí và xâm nhiễm qua vết thƣơng ở vỏ quả (Vũ Công Hậu, 1996) [8] - Ngoài ra, một số bệnh khác nhƣ: Bệnh sẹo, bệnh than, bệnh đốm đen, muội, thối cuống cũng là những bệnh hại nghiêm trọng trên ăn quả cây có múi (Hà Minh Trung, 2006) [17] 2.1.5.2 Một số. .. 2.2 Bệnh vàng lá Greening trên cây có múi 2.2.1 Lịch sử của bệnh Bệnh vàng lá greening là dịch hại nguy hiểm nhất trên cây có múi, bệnh do vi khuẩn Liberibacter asiaticus gây nên Bệnh làm giảm năng suất, chất lƣợng, tuổi thọ của cây và rất khó phòng trừ Bệnh đƣợc mô tả lần đầu tiên ở Trung Quốc năm 1929 với tên là Huanglongbing (Trung tâm làm vƣờn và trồng trọt, 2003) [20] Năm 1937 triệu chứng bệnh. .. ghép của cây mẹ sạch bệnh, tạo các nhà lƣới bảo quản vƣờn cây mẹ và vƣờn ƣơm hoặc tạo vƣờn ở các khu cách ly (Đinh Hải Lâm, 2001) [10] 2.3 Tình hình nghiên cứu về phát hiện bệnh greening trên cây có múi Kể từ khi đƣợc mô tả lần đầu tiên ở Trung Quốc vào năm 1929 (Trung tâm làm vƣờn và trông trọt, 2003) [20] cho đến nay đã có rất nhiều nghiên cứu đƣợc thực hiện trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam nhằm... giống cây có múi khác nhau đƣợc dùng để làm cây chỉ thị nhƣ quýt Ponkan, cam Liucheng, bƣởi Wentan và chanh Eureka Cho đến nay đã xác định đƣợc bốn chủng vi khuẩn gậy bệnh khác nhau: Chủng I: gây bệnh trên cam ngọt và quýt 23 Chủng II: có độ độc cao nên đã gây bệnh ở cả bốn giống cam, chanh, quýt, bƣởi Chủng III: chỉ gây hại ở mức trung bình nên chỉ biểu hiện ở cam ngọt, quýt và biểu hiện nhẹ trên bƣởi... đó lại tăng nhanh đến khi đạt kích thƣớc tối đa - Hạt: Tuỳ theo giống mà có sự khác nhau về kích thƣớc, số lƣợng màu sắc và phôi hạt Các loại quả thuộc cây có múi phần lớn là hạt đa phôi, riêng cây bƣởi là hạt đơn phôi (Vũ Công Hậu, 1996) [8] 2.1.3 Giá trị của cây có múi Sản phẩm của cây có múi là một trong những sản phẩm có giá trị đƣợc nhiều ngƣời ƣa chuộng và đƣợc sản xuất ở nhiều nƣớc trên thế giới...3 - Xác định các dạng triệu chứng bệnh vàng lá greening trên cây ăn quả có múi ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam - Khuyếch đại thành công đoạn DNA đích trong bộ gene của vi khuẩn gây bệnh vàng lá greening bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu - Giải trình tự gene của sản phẩm PCR (2-3 mẫu) từ mẫu lá bị bệnh greening và tiến hành phân tích BLAST trên NCBI, so sánh mức độ tƣơng đồng với ngân