BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY DƯƠNG SAN HÔ (EUPHORBIA TITHYMALOIDES L.) Người hướng dẫn : TS Cầm Thị Ính Sinh viên thực hiên : Trần Thị Hằng Nga Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khóa học : 2011 - 2015 HÀ NỘI- 2015 Viện Đại học Mở Hà Nội Lời Cảm Ơn Sau ngày tháng thực tập Viện Hoá học hợp chất thiên nhiên, với hướng dẫn bảo tận tình anh chị giúp đỡ bạn bè, hoàn thành khoá luận tốt nghiệp với đề tài “ Nghiên cứu thành phần hoá học hoạt tính sinh học dương san hô (EUPHORBIA TITHYMALOIDES L.)” Có kết nghiên cứu , trước hết xin trân trọng cảm ơn GS.TS Phạm Quốc Long – Viện trưởng Viện Hoá học hợp chất thiên - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện cho tham gia thực tập Viện Tôi xin gửi lời tri ân sâu sắc tới TS Cầm Thị Ính – cán phòng Hoá sinh hữu cơ, người thầy tạo điều kiện, tận tình hướng dẫn truyền đạt kiến thức quý báu giúp hoàn thành khoá luận Đồng thời xin gửi lời cảm ơn chân thành tới anh chị đồng nghiệp phòng Hoá sinh hữu động viên giúp đỡ có đóng góp quý báu cho suốt trình thực đề tài Viện Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy cô giáo công tác Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội quan tâm, tạo điều kiện giúp đỡ suốt trình học tập trường Cuối xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, người thân , bạn bè bên cạnh chia sẻ, động viên, giúp đỡ suốt trình học tập hoàn thành khoá luận Hà Nội, ngày 19 tháng 05 năm 2015 Sinh viên Trần Thị Hằng Nga Trần Thị Hằng Nga – K18 1104 Viện Đại học Mở Hà Nội Mục Lục Trang Danh mục hình A Danh mục bảng B Danh mục chữ viết tắt C MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Chi Euphorbia 1.2 Các loài thuộc chi Đại kích (Euphorbia) có Việt Nam 1.3 Những nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học 10 số loài thuộc chi Euphorbia Việt Nam 1.4 Cây thuốc giấu Euphorbia tithymaloides L CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 21 2.1 Vật liệu nghiên cứu 21 2.2 Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học 21 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học 21 2.3 Thực nghiệm nghiên cứu 22 2.3.1 Xử lý nguyên liệu 22 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học 22 2.3.3 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học 25 Trần Thị Hằng Nga – K18 1104 Viện Đại học Mở Hà Nội 2.3.3.1 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng 25 vi sinh vật kiểm định CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Điều chế phần cặn chiết từ thuốc giấu 28 3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 29 3.2.1 Thử định tính phần cặn chiết 29 3.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học phần 30 cặn chiết dicloroform 3.3 Kết nghiên cứu hoạt tính sinh học 39 3.3.1 Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 39 3.3.2 Kết xác định hoạt tính gây độc tế bào 40 3.3.2.1 Kết xác đinh hoạt tính gây độc tế bào 41 cặn chiết etanol tổng (ET-E) 3.3.2.2 Kết xác định hoạt tính gây độc tế bào 42 hợp chất D.7.5.6 KẾT LUẬN 44 Kiến Nghị 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC 50 Trần Thị Hằng Nga – K18 1104 Danh mục hình Trang Hình 1.1: Hình ảnh số loài thuộc chi Euphorbia ( chi Đại kích) Hình 1.2: Một số hợp chất phân lập từ loài thuộc chi 16 Đại kích Hình 1.3: Cây thuốc giấu Euphorbia tithymaloides L 17 Hình 1.4: Một số hợp chất phân lập từ E tithymaloides 19 Hình 2.1: Một số hình ảnh thực nghiệm 27 Hình 3.1: Sơ đồ quy trình điều chế cặn chiết từ loài 28 E tithymaloides Hình 3.2: Sơ đồ phân lập hợp chất từ cặn chiết dicloroform 31 Hình 3.3: Phổ 1H-NMR 2B3 32 Hình 3.4: Phổ 13C-NMR 2B3 32 Hình 3.5: Phổ 1H-NMR 3C21 34 Hình 3.6: Phổ 13C- NMR 3C21 35 Hình 3.7: Phổ 1H- NMR D 7.5.6 37 Hình 3.8: Phổ 13C- NMR DEPT D 7.5.6 37 Hình 3.9: Phổ HSQC D.7.5.6 38 Hình 3.10: Phổ HMBC D.7.5.6 39 Trần Thị Hằng Nga – K18 1104 Page A Danh mục bảng Trang Bảng 1.1: Các loài thuộc chi Đại kích (Euphorbia) tìm thấy Việt Nam Bảng 1.2: Một số loài thuộc chi Đại kích sử dụng y học cổ truyền Bảng 3.1: Định tính lớp chất cặn chiết 29 Bảng 3.2: Dữ liệu phổ 2B3 33 Bảng 3.3: Dữ liệu phổ NMR 3C21 35 Bảng 3.4: Dữ liệu phổ D 7.5.6 38 Bảng 3.5: Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 40 Bảng 3.6: Kết xác định hoạt tính gây độc tế bào dòng 41 tế bào ung thư KB, LU-1, Hep G2 Bảng 3.7: Kết xác định hoạt tính gây độc tế bào 42 dòng tế bào ung thư KB, RD, LU-1, Hep G2 D.7.5.6 Trần Thị Hằng Nga – K18 1104 Page B Danh mục chữ viết tắt Viết tắt H-NMR 13 C-NMR DEPT CC MS KB LU-I HepG2 DMSO MTT HSQC HMBC UV Tiếng Anh Proton Nuclear Magnetic Spectroscopy Cacbon-13 Nuclear magnetic Resonance Spectroscopy Distortionless Enhancenment by Polarisation Transfer Column Chromatography Mass Spectrometry Heptonema carcinoma Dimethyl sulfoxide 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5Diphenyltetrazolium Bromide Heteronuclear single quantum coherence spectroscopy Heteronuclear Multiple Bond connectivity Ultraviolet Trần Thị Hằng Nga – K18 1104 Tiếng Việt Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon13 Phổ DEPT Sắc ký cột Khối phổ Dòng tế bào ung thư biểu mô Dòng tế bào ung thư phổi Dòng tế bào ung thư gan Phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều HSQC Phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều HMBC Phổ tử ngoại Page C MỞ ĐẦU Thảm thực vật Việt Nam đa dạng, phong phú với khoảng 3200 loài, có nhiều loài sử dụng làm thuốc để chữa bệnh bệnh nên tạo thành vốn quý Y học cổ truyền Hiện nay, việc sử dụng thảo mộc làm thuốc nói chung dựa vào kinh nghiệm sử dụng dân gian nên dẫn đến tình trạng hiệu tích cực mong muốn Tìm hiểu loài thảo mộc dựa kinh nghiệm dân gian kết hợp với phương pháp nghiên cứu khoa học nghiên cứu thành phần hóa học, nghiên cứu hoạt tính sinh học, … góp phần nâng cao giá trị loài này, giải thích kinh nghiệm sử dụng cỏ cổ truyền dân gian, đồng thời hiểu rõ nghiên cứu hóa học hợp chất thiên nhiên, góp phần đại hóa công tác nghiên cứu Hóa -Y-Sinh phục vụ sức khỏe cộng đồng, phát triển nâng cao giá trị sống Chi Đại kích (Euphorbia) chi lớn thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), chúng mọc rải rác khắp nước ta, nhiều loài chi thường sử dụng dân gian Tìm hiểu loài chi Euphorbia sử dụng dân gian nhận thấy loài Euphorbia tithymaloides sử dụng để trị nhiều bệnh khác nên sâu vào tìm hiểu, nghiên cứu thành phần hóa học số hoạt tính sinh học loài Euphorbia tithymaloides, có tên tiếng Việt thuốc giấu Luận án thực hỗ trợ đề tài cấp Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, mã số: VAST04.10/14-15 Trần Thị Hằng Nga – K18 1104 Page PHẦN I: TỔNG QUAN 1.1 Chi Euphorbia [2, 4, 5] Chi Euphorbia tiếng Việt gọi chi Đại kích (trước gọi chi Pedilanthus) thuộc họ Thầu dầu (họ Euphorbiaceae - họ lớn thực vật có hoa bao gồm 240 chi khoảng 6.000 loài) Phần lớn chúng thân thảo, mọc khu vực nhiệt đới tồn loại bụi thân gỗ Một số loài chứa nhiều nước (tương tự loại xương rồng) Họ phân bố chủ yếu khu vực nhiệt đới cận nhiệt đới châu Phi châu Mỹ, nhiên thấy vùng ôn đới: với phần lớn loài tập trung khu vực Indo-Malaya sau khu vực nhiệt đới châu Mỹ Tại khu vực nhiệt đới châu Phi có nhiều loài, giống, thứ, không đa dạng hai khu vực kể Tuy nhiên, chi Euphorbia có nhiều loài khu vực không nhiệt đới, chẳng hạn khu vực Địa Trung Hải, Trung Đông, miền nam Châu Phi hay miền nam Hoa Kỳ Các loài chi gọi spurges, theo tiếng Anh Pháp cổ spurges có nghĩa “sạch” bắt nguồn từ loài chi có tác dụng tẩy, làm Bác sĩ Euphorbus tìm thấy loài xương rồng (Euphorbia) có tác dụng nhuận tràng mạnh Các loài thuộc chi Euphhorbia có hình dáng khác Lá mọc so le (hiếm mọc đối), với kèm Hình dạng chủ yếu đơn, có loài có phức, chủ yếu loại dạng chân vịt, không thấy dạng lông chim Các kèm bị suy thoái thành gai, lông tơ hay tuyến nhỏ Hoa đối xứng xuyên tâm (tỏa tia) thường đơn tính, với hoa đực hoa thường Có đa dạng lớn cấu trúc hoa, chúng gốc hay khác gốc Các nhị hoa (cơ quan đực) từ tới 10 (hoặc nhiều hơn) Hoa loại bầu, có nghĩa với bầu nhụy lớn Hoa có nhiều màu sắc khác vàng, đỏ, hồng, Trần Thị Hằng Nga – K18 1104 Page Các loài chi Đại kích (Euphorbia) có nhiều hình dạng kích cỡ dạng bụi, cối, bóng, che phủ mặt đất Thân mọng nước, số loài có gai, chứa mủ nhựa trắng, gây độc, dị ứng Đặc trưng loài chi thân có chứa nhựa mủ 1.2 Các loài thuộc chi Đại kích (Euphorbia) có Việt Nam [2, 4, 5] Theo tác giả Võ Văn Chi, Phạm Hoàng Hộ Đỗ Tất Lợi Việt Nam, chi Đại kích (Euphorbia) có mặt 36 loài Danh sách loài thuộc chi tìm thấy Việt Nam trình bày bảng 1.1 Bảng 1.1: Các loài thuộc chi Đại kích (Euphorbia) tìm thấy Việt Nam TT Các loài thuộc chi Euphorbia Tên tiếng Việt Phân bố E antiquorum L E arenarioides Gagn E atoto Forst f Đại kích biển, Thường gặp bãi thuốc dòi, bọ cát ven biển khắp nước ta mắm, bơ nước E bacciformis Croiz Cò xo E bracteatus (Jacq.) - Thường trồng làm cảnh E calcaratus (Schl.) Croiz - Thường trồng làm cảnh E capillaris Gagnep E chrysocoma Lesv & Đại kích tóc vàng, Van cỏ sữa long vàng Vùng đất lầy, Sapa E coudercii Gagnep Đại kích Coudere, cỏ sữa mộc nhẵn Mọc vùng rừng thưa Đại kích sóng Rừng thay 10 E cristata Heyne ex Trần Thị Hằng Nga – K18 1104 Xương rồng ông, Mọc hoang thường xương rồng ba cạnh, trồng khắp nơi làm bá vương tiên cảnh - - Miền Nam Đại kích chỉ, cỏ sữa rừng còi Rừng thay Page 26 Scudiero D A., Shoemaker R H., Paull K D., Monks A., TierneS y Nofziger, T H., Currens M J., Seniff D., Boyd M R., (1988), “Evaluation of a soluble Tetrazolium/Formazan assay for cell growth and drug sensivity in culture using human and other tumor cell lines”, Cancer Res., Sep1; 48, p 4827-4833 27 Shi H M., Long B S., Cui X M., Min Z D (2005), “A new bisabolane sesquiterpenoid from Euphorbia chrysocoma”, J Asian Nat Prod Res., Dec, (6), p 857-860 28 Shoemaker R H., Scudiero D A., Suasville E A (2002), “Application of highthroughput, molecular – targeted screening to anticancer drug discovery”, Curr Top Med Chem., 2(3), p 229-246 29 Toume K., Nakazawa T., Hoque T., Ohtsuki T., Arai M A., Koyano T., Kowithayakorn T., Ishibashi M (2012), “Cycloartane triterpenes and ingol diterpenes isolated from Euphorbia neriifolia in a screening program for death-receptor expression-enhancing activity”, Planta Med., Aug, 78 (12), p 1370-1377 30 Vander Bergher D A., Vlietlinck A J (1991), Methods in Plant BiochemistryAcademic Press London, Vol 6, p 47-69 31 Vidotti G J., Zimmermann A., Sarragiotto M H., Nakamura C V., Dias Filho B.P (2006), “Antimicrobial and phytochemical studies on Pedilanthus tithymaloides”, Fitoterapia., 77 (1), p 43-46 32 Wantana M., and Somyote S (2007), “Antimalarial and Antituberculous PolyO-acylated Jatrophane Diterpenoids from Pedilanthus tithymaloides”, J Nat Trần Thị Hằng Nga – K18 1104 Page 52 Prod, 70, p 1434-1438 33 Yamahara J., Kobayashi G., Matsuda H., Taiichi K., and Hojime F (1989), “The effect of scoparine, a coumarin derivative isolated from the chinese crude drug Artemisiae Capillaris Flos on the heart”, Chem Pharm Bull., 37, p 1297 1299 34 Yogesh Chaudhari, Manisha Badhe, Kumar Dr E P., Hardik Mody, Rashmi Kokardekar (2012), “An investigation of Antibacterial activity of Pedilanthus tithymaloides on Different Strains of Bacteria”, Int J Pharm Phytopharmacol Res, (6), p 385-386 35 Zhi-guo Yu, Qian Wang, Ke Li, Ying-qi Li, and Xiao-xia Gao (2007), “Determination and Phamacokonetics of 6,7 – Dimethoxycoumarin in Rat Plasma after Intragastric Administration of Different Decoctions of Yinchenhao Tang”, Journal of Chromatogrphic Science, September, 45(8), p 544-548 CD ROOM 36 Dictionary of Natural Products on CD, 1982-2005, Chapman & Hall, CCR press Trần Thị Hằng Nga – K18 1104 Page 53 Phụ Lục Hợp chất 2B3 3C21 D.7.5.6 Trần Thị Hằng Nga – K18 1104 Phổ Phổ H-NMR 2B3 Phổ 13C – NMR 2B3 Phổ 1H-NMR 3C21 Phổ 13C-NMR 3C21 Phổ DEPT 3C21 Phổ HSQC 3C21 Phổ HMBC 3C21 Phổ 1H- NMR D 7.5.6 Phổ 13C-NMR D.7.5.6 Phổ DEPT D.7.5.6 Phổ HSQC D.7.5.6 Phổ HMBC D.7.5.6 Trang I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII Page 54 Trần Thị Hằng Nga – K18 1104 Page i Phổ 1H-NMR 2B3 Trần Thị Hằng Nga – K18 1104 Page ii Phổ 13C – NMR 2B3 Trần Thị Hằng Nga – K18 1104 Page iii Phổ 1H-NMR 3C21 Trần Thị Hằng Nga – K18 1104 Page iv Phổ 13C-NMR 3C21 Phổ DEPT 3C21 Trần Thị Hằng Nga – K18 1104 Page v Phổ HSQC 3C21 Trần Thị Hằng Nga – K18 1104 Page vi Phổ HMBC 3C21 Trần Thị Hằng Nga – K18 1104 Page vii Phổ 1H- NMR D 7.5.6 Trần Thị Hằng Nga – K18 1104 Page viii Phổ 13C-NMR D.7.5.6 Trần Thị Hằng Nga – K18 1104 Page ix Phổ DEPT D.7.5.6 Trần Thị Hằng Nga – K18 1104 Page x Phổ HSQC D.7.5.6 Trần Thị Hằng Nga – K18 1104 Page xi Phổ HMBC D.7.5.6 Trần Thị Hằng Nga – K18 1104 Page xii [...]... (24β-methyl-9β-19-cycloanost-20-en3β-ol) Vỏ thân chứa cycloeucalenol và taraxasteryl axetat Vỏ thân khô và còn tươi còn có euphorginol (taraxer-14-6α-ol) và glut-5-en-3β-ol và cyclorat-23-en-3β-25-diol Trần Thị Hằng Nga – K18 1104 Page 15 Nhựa mủ cây có chứa diterpen tirucalicin 3,7,12-tri-O-acetyl-8-isovaleryl-ingol, các chất diterpen ester l dẫn xuất của các alcol ingenol, phorbol và resiniferonol, chất triterpen cycloeuphordenol... triacontan, jambulol, một chất phenolic, enphosterol, một phytosterol và phytosterolin, các acid hữu cơ (gallic, melissic, palmitic, oleic và linoleic), l- inositol và một alcaloid xanthorhamnin Các triterpen như: taraxerol, taraxeron, 24-methylen-cycloartenol, cycloartenol, euphobol hexacosonat, β-amyrin, 12 deoxy-4βhydroxyphorbol-13 dodecanoat-20 axetat, ingenol triaxetat Ester của taraxeron, α-amyrin và β-amyrin,... từ l và thân cây trị mụn cóc, bọ cạp đốt Ở Mỹ, người ta thường trồng cây này ở vùng hạn hán để giữ nước và dùng để cải tạo đất [1], [2], [4], [5] • Những nghiên cứu về thành phần hóa học loài E tithymaloides Những nghiên cứu trong và ngoài nước về thành phần hóa học của loài E tithymalodes - dương san hô, cây thuốc giấu - bằng phương pháp nhận biết thấy có các hợp chất ancol mạch dài, triterpen, flavonoid,... cồn của E tithymaloides có khả năng bao vây (thu dọn) các gốc tự do; bước đầu đánh giá xác nhận hoạt tính chống oxy hóa của các dịch chiết có được l bởi chúng có chứa các hợp chất phenolic và flavonoid [8], [21] PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Nguyên liệu nghiên cứu l thân loài Euphorbia tithymaloides L được thu hái vào tháng 1 năm 2014 tại Hà Nội Mẫu nguyên liệu... acetoxy- benzoyloxy-5β-hydroxy jatropha-6( 7), 3β-nicoti-noyloxy-5,13β,11,12β- 12-dien diepoxy jatropha-6( 7)- en Hình 1.4: Một số hợp chất đã được phân l p được từ E tithymalioides • Những nghiên cứu về hoạt tính sinh học loài E tithymaloides Ở trên thế giới, những nghiên cứu về hoạt tính sinh học của loài E tithymaloides khá nhiều, như từ dịch chiết cồn của loài này đã được đánh giá có hoạt tính kháng khuẩn,... K18 1104 Page 12 Năm 2008, các nhà khoa học ở Ấn độ nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính chống tiêu chảy của loài E indica (cỏ sữa Ấn) Kết quả l đã phân l p được các hợp chất 19henyl acetoxy ingol 3,8,12, triacetyl-7-phenyl axetate, campesterol, cycloart-25-ene-3β-ol, esculetin diaxetate, quercetin Các dịch chiết ete dầu hỏa, benzen, clorofom và ethanol của loài này có tác dụng chống tiêu chảy... Page 14 Phần trên mặt đất chứa các hợp chất β-carotene, vitamin C, cholesterol, chlorophyll A, chlorophyll B, cùng các hợp chất phenolic, tanin có hoạt chất chống oxi hóa như các hợp chất quercetrin, euphorbol, epitaraxerol, campesterol, carvacrol, sesquiterpen và acid salicylic Trong cành và l chứa hợp chất 5,7,4-trihydroxy flavon-7-glucoside Rễ chứa taraxerol, tirucallol Năm 2012, Hussain R và cộng... 1,3,4,6-tetra-Ogaloyl-β-D-glucose, 1,2,3,4,6-pentagaloyl-β-D-glucose, geraniin, terchebin, euphorbin A và B, 3,4-digaloylquinic acid Trong hoa tươi có acid elagic Các hợp chất flavanol glycosit phân l p từ loài cỏ sữa l l n E hirta cũng được ghi nhận có hoạt tính chống sốt rét [21] Theo từ điển hợp chất thiên nhiên (Dictionary of Natural Products Chapman & Hall) các hợp chất đã được phân l p từ loài này l các ellagitanin... dần l n-hexan, chloroform, ethylacetat Cất loại dung môi, thu được các phần cặn chiết tương ứng l ET2, ET3, ET4 Các phần cặn chiết ET1, ET2, ET3, ET4 được trích một phần đi thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định, phần cặn chiết còn l i được nghiên cứu thành phần hóa học 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học + Điểm nóng chảy được đo trên máy Kofler Micro – Hotstage và máy BOETIUS của. .. armyrin, betulin, olean và lupeol, chúng cũng có tác dụng kháng vi rút Sau đây l tổng hợp một số kết quả nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài trong chi Euphorbia thường được sử dụng trong y học cổ truyền ở nước ta * Euphorbia antiquorum L Thân loài E antiquorum chứa các hợp chất triterpenoid: taraxerol, taraxerone, friedelan-3α-ol, friedelan-3β-ol, epifriedelanol Còn có các