Khúa lun tt nghip 2015 Viện đại học mở hà nội KHOA CễNG NGH SINH HC đ KHểA LUN TT NGHIP ti: BC U XY DNG QUI TRèNH NHUM NHIM SC TH T BO VI TO BIN SCHIZOCHYTRIUM MANGROVEI PQ6 Ngi hng dn : PGS.TS ng Dim Hng Sinh viờn thc hin : on Th H Thu Lp : KS.CNSH 11-04 Hà nội- 2015 on Th H Thu Lp: KS.CNSH 11-04 i Khúa lun tt nghip 2015 LI CM N Trong sut thi gian thc hin ti tt nghip va qua, em ó nhn c s hng dn, giỳp ht sc tn tỡnh ca Ban lónh o Vin Cụng ngh sinh hc v Ban giỏm hiu trng Vin i hc M Em xin gi li cm n sõu sc v lũng bit n ti PGS TS ng Dim Hng- Trng phũng Cụng ngh To, Vin Cụng ngh sinh hc ng thi em cng xin gi li cm n ti NCS Lu Th Tõm, hc viờn cao hc Hong Th Qunh v Phm Vn Nht nhng cỏn b trc tip hng dn em lm ti ny v th cỏc cỏn b ca phũng- nhng ngi ó giỳp , hng dn em lm thc nghim sut quỏ trỡnh thc tt nghip Em cng xin gi li cm n ti th ging viờn ca Khoa Cụng ngh Sinh hc- Vin i hc M ó dy d em sut quỏ trỡnh hc tp, giỳp em cú nhng kin thc c s cng nh chuyờn ngnh lm nn tng cho nghiờn cu v sau Cui cựng, em xin by t lũng bit n sõu sc vi gia ỡnh, bn bố ó luụn ng viờn, to mi iu kin giỳp em quỏ trỡnh hc va qua H Ni, ngy 22 thỏng nm 2015 on Th H Thu on Th H Thu Lp: KS.CNSH 11-04 ii Khúa lun tt nghip 2015 MC LC LI CM N i MC LC iii DANH MC CH VIT TT v DANH MC BNG vi DANH MC HèNH vii M U CHNG I: TNG QUAN TI LIU 1.1 GII THIU CHUNG V TO V VI TO 1.1.1 Khỏi nim chung v to, vi to bin 1.1.2 Phõn loi 1.1.3 Sinh sn, sinh dng ca to 1.1.4 Sinh trng ca to 1.1.5 Vai trũ ca vi to 1.2.1 Khỏi nim 12 1.2.2 Hỡnh thỏi v kớch thc 12 1.2.3 S lng nhim sc th 13 1.2.4 Cu trỳc ca nhim sc th 13 1.3 CHU K SNG CA T BO 16 1.3.1 Gian k 17 1.3.2 Phõn bo 18 1.4 S LC CC K THUT C DNG TRONG NGHIấN CU V NHIM SC TH 19 1.4.1 K thut splash 19 1.4.2 K thut squash 21 1.4.3 Tỡnh hỡnh nghiờn cu nhim sc th to 22 1.5 GII THIU CHUNG V VI TO BIN SCHIZOCHYTRIUM MANGROVEI PQ6 24 1.5.1 V trớ, phõn loi ca Schizochytrium 25 1.5.2 Tỡnh hỡnh nghiờn cu Schizochytrium 25 CHNG II: VT LIU V PHNG PHP 28 2.1 VT LIU V HểA CHT 28 on Th H Thu Lp: KS.CNSH 11-04 iii Khúa lun tt nghip 2015 2.1.1 Vt liu 28 2.1.2 Húa cht v thit b 28 2.2 PHNG PHP 29 2.2.1 Qui trỡnh c nh mu 29 2.2.2 Qui trỡnh nhc trng mu 30 2.2.3 Qui trỡnh nhum mu vi acetocarmine 1% 30 2.2.4 Qui trỡnh nhum mu vi giờmsa 4% 30 2.2.5 Qui trỡnh nhum mu vi thuc nhum DAPI 31 2.3 B TR TH NGHIM 32 2.3.1 Thớ nghim 1: Kho sỏt s ln nhc trng vi KCl 0,075 M 32 2.3.2 Thớ nghim 2: Kho sỏt iu kin ly tõm lờn kh nng v mng t bo to 32 2.3.3 Thớ nghim nhum NST vi cỏc loi thuc nhum 32 2.4 CH TIấU QUAN ST 32 2.5 X Lí S LIU 32 CHNG III: KT QU V THO LUN 33 3.1 NH HNG CA S LN NHC TRNG LấN KT QU NHUM T BO TO S MANGROVEI PQ6 33 3.2 NH HNG CA TC LY TM LấN KT QU NHUM T BO TO S MANGROVEI PQ6 34 3.3 NHUM NHIM SC TH TO S MANGROVEI PQ6 VI THUC NHUM ACETOCARMINE 1% 35 3.4 NHUM MU BNG THUC NHUM GIấMSA 4% 38 3.5 NHUM NHIM SC TH BNG THUC NHUM DAPI 39 3.6 MT S NGUYấN NHN NH HNG TI KT NHUM MU 40 KT LUN V KIN NGH 43 KT LUN 43 KIN NGH 43 TI LIU THAM KHO 44 TI LIU THAM KHO TING VIT 44 TI LIU THAM KHO TING ANH 44 TI LIU THAM KHO TRANG WEB 48 on Th H Thu Lp: KS.CNSH 11-04 iv Khúa lun tt nghip 2015 DANH MC CH VIT TT ADN: axớt dexyribonucleotide DHA: axớt docosahexaenoic DPA: axớt docopentaenoic EPA: axớt eicosapentaenoic NLSH: nhiờn liu sinh hc NST: nhim sc th PHA: phytohemagllutinin PUFAs: cỏc axớt bộo khụng bóo hũa a ni ụi ARN: axớt ribonucleotide SKK: sinh khụ TLK: trng lng khụ VTM: vitamin on Th H Thu Lp: KS.CNSH 11-04 v Khúa lun tt nghip 2015 DANH MC BNG Bng 1: S lng nhim sc th ca mt loi Bng 2: nh hng ca tc ly tõm lờn kt qu nhum mu on Th H Thu Lp: KS.CNSH 11-04 vi Khúa lun tt nghip 2015 DANH MC HèNH Hỡnh 1: Nm pha sinh trng ca to Hỡnh 2: Nhim sc th Hỡnh 3: Cu trỳc nhim sc th Hỡnh 4: Cu trỳc siờu vi ca nhim sc th Hỡnh 5: Chu k t bo Hỡnh 6: Khun lc chi Schizochytrium Hỡnh 7: Hỡnh nh t bo S mangrovei cỏc ln nhc trng khỏc Hỡnh 8: Nhum nhõn ca to S mangrovei PQ6 vi thuc nhum acetocarmine 1% cỏc thi gian khỏc Hỡnh 9: Nhum nhõn ca to S mangrovei PQ6 vi thuc nhum acetocarmine 1% cú b sung thờm NaOH 2,5% Hỡnh 10: S lng nhõn ca to S mangrovei PQ6 bt mu vi thuc nhum acetocarmine 1% Hỡnh 11: Nhõn v NST ca to S mangrovei PQ6 nhum bng thuc nhum giờmsa 4% Hỡnh 12: Nhum NST ca to S mangrovei PQ6 vi thuc nhum DAPI ( phúng i nh 500X) Hỡnh 13: nh minh t bo cỏc thi im nuụi cy khỏc nhum mu bng giờmsa 4% Hỡnh 14: nh minh mu b nhim vi khun nhum NST S mangrovei PQ6 bng thuc nhum giờmsa 4% Hỡnh 15: nh minh t bo S mangrovei PQ6 khụng b v mng t bo nhum vi thuc nhum giờmsa 4% on Th H Thu Lp: KS.CNSH 11-04 vii Khúa lun tt nghip 2015 M U T bo l n v t chc c bn ca c th sng Trong t bo cú cha cỏc bo quan v nhõn Nhõn t bo l cu thnh bt buc ca t bo eukaryote, vỡ nhõn cú cha nhim sc th (NST), l cu trỳc mang vt cht di truyn ADN (axớt deoxyribonucleotide) ca t bo v c th Nhim sc th c quan sỏt u tiờn bi Nageli nm 1842, nhng n nm 1888, NST mi c Waldeyer t tờn l chromosome (chromo cú ngha bt mu nhum v some ngha l mt th) (Elderige, 1985) Nhim sc th úng vai trũ rt quan trng di truyn ca cỏc loi, mt yu t quyt nh cho s tin húa hay suy thoỏi ca ging nũi Cú th núi hn 100 nm qua, cha cú mt cu trỳc sinh hc no nh NST ó thu hỳt nhiu phũng thớ nghim, nhiu nh nghiờn cu, s dng nhiu phng tin k thut cng nh tiờu tn nhiu kinh phớ nghiờn cu Mc ớch cui cựng l lm sỏng t cu trỳc phõn t, siờu vi th cng nh c ch hot ng ca chỳng t bo Mt nhng k thut nghiờn cu NST rt c in nhng rt hiu qu ú l phng phỏp nhum NST T bo ca mi loi sinh vt khỏc thỡ cú b NST khỏc nhau, c trng v s lng v hỡnh thỏi cho mi loi Vi phng phỏp nhum, chỳng ta cú th nghiờn cu c s lng v hỡnh thỏi NST ca mt loi no ú Do ú, tỡm c mt quy trỡnh nhum NST ti u nghiờn cu s lng v hỡnh thỏi ca nú c trng cho mt loi no ú rt cn thit Vi to bin d dng Schizochytrium mangrovei PQ6 c phõn lp ti huyn o Phỳ Quc- Kiờn Giang nm 2006-2008 õy l loi vi to cú tim nng ng dng cao bi vỡ chỳng cú kh nng thớch nghi rng vi s thay i ca iu kin nuụi nh nhit , pH, mn; kh nng sn xut sinh cao, hm lng lipit ln (70 % sinh khụ v sinh to ny giu axớt bộo khụng bóo hũa a ni ụi c bit l axớt docosahexaenoic (DHA, C22:6-3; chim n 20 50 % so vi axớt bộo tng s) Cho n nay, sinh to ny ó c ng dng nhiu lnh vc nh s dng trc tip sinh to ti lm thc n ti sng cho cỏc i ng nuụi trng thy sn, lm nguyờn liu sn sut thc phm chc nng, tỏch chit cỏc cht cú hot tớnh sinh hc cao nh EPA (axớt eicosapentaenoic, C20:5-3), DHA, DPA (axớt docopentaenoic, C22:5-6) lm on Th H Thu Lp: KS.CNSH 11-04 Khúa lun tt nghip 2015 nguyờn liu sn xut du sinh hc hay tỏch chit squalene mt cht cú hot tớnh chng oxi húa cao lm m phn Mt hng ng dng khỏc cng ó nghiờn cu thnh cụng l sn xut biodiesel t sinh ny Mc dự chng vi to ny ó c ng dng nhiu lnh vc nờu trờn nhng nhng nghiờn cu v di truyn (nh kớch thc h gen, s lng, hỡnh thỏi v cu trỳc NST) ca cỏc loi to khỏc thuc c chi Schizochytrium ny u cha c nghiờn cu c trờn th gii cng nh Vit Nam Vỡ vy, chỳng tụi mong mun thc hin ti nghiờn cu Bc u xõy dng qui trỡnh nhum nhim sc th t bo vi to bin d dng Schizochytrium mangrovei PQ6 nhm xỏc nh c s lng v hỡnh thỏi nhim sc th (karyotype) ca to ny Mc ớch ca ti nghiờn cu ca chỳng tụi nh sau: +/ Tỡm qui trỡnh nhum nhim sc th ti u cho loi vi to bin d dng S mangrovei PQ6 +/ Xỏc nh c s lng v hỡnh thỏi nhim sc th (karyotype) ca to ny Cụng vic nghiờn cu c thc hin ti phũng Cụng ngh To, Vin Cụng ngh sinh hc thuc Vin Hn lõm Khoa hc v Cụng ngh Vit Nam on Th H Thu Lp: KS.CNSH 11-04 Khúa lun tt nghip 2015 CHNG I: TNG QUAN TI LIU 1.1 GII THIU CHUNG V TO V VI TO 1.1.1 Khỏi nim chung v to, vi to bin To (Algae) l nhng thc vt bc thp (thc vt cú bo t, c th khụng phõn chia thnh thõn, r, lỏ) Trong t bo to cú cha dip lc v chỳng sng ch yu nc [5] Vi to (Microalgae) l tt c cỏc loi to cú kớch thc hin vi tc l mun quan sỏt c chỳng thỡ phi s dng kớnh hin vi Trong s khong 50.000 loi to trờn th gii thỡ vi to chim khong 2/3 Vai trũ quan trng ca vi to th hin qua quỏ trỡnh quang hp hp th CO2, cung cp O2 cho cỏc sinh vt khỏc trờn trỏi t, khộp kớn vũng tun hon vt cht v lm tng tc quay vũng ca cỏc chu trỡnh ú [6] To cú mt khp ni trờn trỏi t, t nh nỳi cao cho n di ỏy bin sõu, thm c sõu khong 200 m di ỏy bin nu nh nc bin ú sch Nhng loi to sng cỏc thy vc c gi l to phự du (phytoplankton) cũn c gi l to ỏy (Phytobentos) Dng to cng sinh vi nm thnh a y cng l dng phõn b rt rng rói v nhiu loi ó c khai thỏc dựng lm dc phm, nc hoa, phm nhum v cỏc mc ớch kinh t khỏc (hin ó bit ti 20.000 loi a y thuc 400 chi khỏc nhau) 1.1.2 Phõn loi Cn c vo mu sc, s cú mt ca cỏc cht d tr, thnh phn v, cu to nhõn t bo ngi ta cú th chia to thnh nhng ngnh khỏc Vi to ch yu thuc v cỏc chi ngnh sau: - Ngnh Cholorophyta (To lc): Cỏc Pediastrum, chi Closterium, Staurastrum, Coelastrum, Dunaliella, Dyctyosphaerium, Chlamydomonas, Scenedesmus, Haematococcus, Tetraselmis, Chlorella - Ngnh Heterokontophyta (To lụng roi lch): Cỏc chi Melosira, Asterionella, Cymatopleurra, Somphonema, Fragilaria, Stephanodiscus, Navicula, Malomonas, Dinobryon, Peridinium, Isochrysis, Chaetoceros, Phaeodactylum, Skeletonema, Nitzschia on Th H Thu Lp: KS.CNSH 11-04 Khúa lun tt nghip 2015 hnh nhc trng 2-3 ln nhng thi gian ngn tt hn nhc trng ln nhng thi gian di 500 500 500 Hỡnh Hỡnh nh t bo to S mangrovei PQ6 cỏc ln nhc trng khỏc A: Nhc trng ln; B: Nhc trng ln; C: Nhc trng ln 3.2 NH HNG CA TC LY TM LấN KT QU NHUM T BO TO S MANGROVEI PQ6 Kt qu v nh hng ca tc ly tõm lờn kt qu nhum t bo to S mangrovei PQ6 c trỡnh by bng Bng nh hng ca tc ly tõm lờn kt qu nhum mu Tc ly tõm Nhc trng ln T bo khú lng bc c nh carnoy nờn phi tng thi gian ly 800 rpm tõm, thu c ớt t bo, t bo cú kớch thc to, t bo b phỏ mng 50 - 60% T bo khú lng bc c nh carnoy, tng thi gian ly tõm, thu 1000 rpm c ớt t bo, t bo b phỏ mng 50 - 60% Mt s nhõn t bo b vng ngoi T bo lng nhiu, ch yu l t 1200 rpm bo cú kớch thc trung bỡnh T bo b phỏ mng 50 - 60%, nhõn b vng ngoi nhiu on Th H Thu Lp: KS.CNSH 11-04 Nhc trng ln T bo khú lng bc c nh carnoy nờn tng thi gian ly tõm, thu c ớt t bo nhng t bo cú kớch thc ln, t bo b phỏ mng 60 - 70% T bo khú lng bc c nh carnoy nờn tng thi gian ly tõm, thu c ớt t bo, t bo b phỏ mng 70 - 80 % Mt s nhõn t bo b vng ngoi Ch yu l t bo cú kớch thc trung bỡnh, t bo b phỏ mng 70 80 %, nhõn b vng ngoi nhiu 34 Khúa lun tt nghip 1500 rpm 2015 D lng, cú thờm nhiu t bo D lng, cú thờm nhiu t bo lng lng T bo b phỏ mng 50 - T bo b phỏ mng 70 - 80 %, nhõn b 60%, nhõn b vng ngoi nhiu vng ngoi nhiu Khụng quan sỏt Khụng quan sỏt c NST c NST T bo rt d lng, cú thờm nhiu t bo lng T bo b phỏ 2000 rpm mng 60%, nhõn b vng ngoi ton b Khụng quan sỏt c NST Rt d lng, ly tõm phỳt, cú thờm nhiu t bo lng T bo b phỏ mng 70 80 %, nhõn b vng ngoi ton b Khụng quan sỏt c NST Kt qu thu c c ch trờn bng ó cho thy: Khi tng tc ly tõm mu quỏ trỡnh nhc trng mu s thu c cỏc phõn on t bo cú kớch thc khỏc tc ly tõm thp 800 rpm, cỏc t bo thu c ch yu dng t bo cú kớch thc ln Khi nhc trng vi KCl 0,075 M, cỏc t bo ny b v mng nhõn chim t l khỏ cao 60 80% Nhõn nm bờn danh gii t bo Khi tng tc ly tõm quỏ trỡnh nhc trng mu lờn 1000 2000 rpm, s lng t bo b v mng khụng tng nhng nhõn ca cỏc t bo ó b phỏ mng b vng ngoi nhiu nờn soi mu di kớnh hin vi chỳng tụi khụng quan sỏt thy nhõn ca t bo to Do ú, tc ly tõm mu thớch hp quỏ trỡnh nhc trng l 800 rpm tc ly tõm ny, phn trm t bo b phỏ v mng chim 60 80% v nhõn t bo c nh khu ranh gii bờn ca t bo 3.3 NHUM NHIM SC TH TO S MANGROVEI PQ6 VI THUC NHUM ACETOCARMINE 1% Chỳng tụi tin hnh nhum NST ca to S mangrovei PQ6 vi thuc nhum acetocarmine 1% Kt qu nghiờn cu thu c c trỡnh trỡnh by hỡnh on Th H Thu Lp: KS.CNSH 11-04 35 Khúa lun tt nghip 2015 To ngy To ngy Nhum acetocarmine 1% ngy To ngy To ngy To ngy To ngy To ngy Nhum acetocarmine 1% ngy To ngy To ngy Hỡnh Nhum nhõn ca to S mangrovei PQ6 vi thuc nhum acetocarmine 1% cỏc thi gian khỏc Kt qu thu c c ch trờn hỡnh ó cho thy: Cỏc mu to nhum thi gian cng lõu vi thuc nhum, kh nng bt mu vo vựng nhõn cng tt Cú s khỏc bit rừ rt gia hỡnh nh mu nhum theo tng ngy mu nhum ngy cho hỡnh nh p, rừ rng, sc nột cỏc ngy nuụi khỏc, thuc nhum bt mu vo nhõn khụng rừ rng Tuy nhiờn, chỳng tụi ch quan sỏt c nhõn ca t bo to, cha quan sỏt c NST ca to ny Chỳng tụi cng tin hnh b sung thờm NaOH 2,5 % tng s bt mu ca thuc nhum vo vt cht di truyn nh hng ca thi gian b sung NaOH 2,5% vo thuc nhum acetocarmine 1% lờn s bt mu ca nhõn t bo to S mangrovei PQ6 c trỡnh by hỡnh Khi b sung thờm dung dch NaOH 2,5% vo thuc nhum acetocarmine 1% cỏc thi gian khỏc nhau: 30 phỳt, 1, 2, 3, gi Sau ú, mu vi hn hp axớt ethanol: axớt axetic (98:2 v/v) v lm tiờu bn nhum Kt qu nghiờn cu thu c ó cho chỳng tụi thy vic b sung thờm NaOH 2,5 % vo thuc nhum lm on Th H Thu Lp: KS.CNSH 11-04 36 Khúa lun tt nghip 2015 rỳt ngn thi gian bt mu vi thuc nhum i vi mu, tng tng phn gia cỏc vựng bt mu vi thuc nhum Do vy, nhõn t bo d quan sỏt c hn Nh vy, qui trỡnh nhum nhõn ti u ca to S mangrovei PQ6 l mu to c nuụi cy ngy, sau ú, mu c c nh dung dch paraformandehyt 4% ngy Tip ú, cỏc t bo sau c nh c nhum vi thuc nhum acetocarmine 1% cú b sung thờm dung dch NaOH 2,5% thi gian gi v mu bng hn hp axớt ethanol: axớt axetic (98:2 v/v) cho hỡnh nh p, nhỡn rừ nhõn, tng phn cao gia cỏc phn nhum v khụng nhum Hỡnh Nhum nhõn ca to S mangrovei PQ6 vi thuc nhum acetocarmine 1% cú b sung thờm NaOH 2,5% Trong quỏ trỡnh nhum nhõn t bo to vi thuc nhum acetocarmine 1%, chỳng tụi quan sỏt c s lng nhõn ca to ny bt mu vi thuc nhum thay i t 1, 2, 4, 8tựy thuc vo giai on sinh trng ca to Hỡnh 10 minh s lng nhõn bt mu vi thuc nhum acetocarmine 1% ó quan sỏt c iu kin thớ nghim ca chỳng tụi Hỡnh 10 S lng nhõn ca to S mangrovei PQ6 bt mu vi thuc nhum acetocarmine 1% on Th H Thu Lp: KS.CNSH 11-04 37 Khúa lun tt nghip 2015 Kt qu nghiờn cu thu c ca chỳng tụi cng tng ng vi cỏc kt qu ó cụng b ca Honda v cs (1998) [23] nhum nhõn ca to Schizochytrium limacinum vi thuc nhum DAPI To S limacinum cng cú hin tng a nhõn, s lng nhõn t bo thay i ph thuc vo giai on sinh trng ca to T bo sinh dng phõn chia liờn tc nhng khụng phõn chia mng t bo hỡnh thnh cm t bo a nhõn cha 16 nhõn Tỳi ng bo t phỏt trin cha 30 ng bo t, mi bo t ch cú nhõn Nh vy, kt qu ny chỳng tụi cng cung cp nhng c s khoa hc khng nh chớnh xỏc loi to chỳng tụi s dng nghiờn cu ny thuc chi Schizochytrium 3.4 NHUM MU BNG THUC NHUM GIấMSA 4% Khi nhum t bo to vi thuc nhum acetocarmine 1% chỳng tụi ch quan sỏt c nhõn v s lng nhõn ca to S mangrovei PQ6, khụng quan sỏt c b NST ca to ny Do vy, chỳng tụi tin hnh nhum th mu to ny vi thuc nhum giờmsa - thuc nhum bt mu hng vi vt cht di truyn Kt qu nhum mu t bo to S mangrovei PQ6 vi thuc nhum giờmsa 4% c trỡnh by hỡnh 11 Nhõ Nhõ 1000 1000 NS NS 1300 2000 Hỡnh 11 Nhõn v NST ca to S mangrovei PQ6 nhum bng thuc nhum giờmsa 4% on Th H Thu Lp: KS.CNSH 11-04 38 Khúa lun tt nghip 2015 Kt qu thu c c ch trờn hỡnh 11 ó cho thy: Vi qui trỡnh nhum NST vi thuc nhum giờmsa 4% cho kt qu khỏ tt Mng t bo b v hon ton, nhõn t bo bt mu hng m, s lng nhõn cng thay i tựy tng trng thỏi t bo (1, 2, 4, 8nhõn ó quan sỏt c) Chỳng tụi cng quan sỏt c im bt mu hng, cú dng hỡnh que hoc du phy mt s t bo Tuy nhiờn, s lng t bo quan sỏt c dng ny rt ớt v cha cú tớnh lp li Do vy, chỳng tụi tm kt lun to ny cú s lng NST l (n= 3) 3.5 NHUM NHIM SC TH BNG THUC NHUM DAPI Do NST ca to rt nh v cú hỡnh dng tng ng nờn rt khú quan sỏt di kớnh hin vi quang hc nhum t bo bng cỏc thuc nhum thụng thng Do vy, tng tớnh c hiu cho NST, chỳng tụi tip tc s dng thuc nhum DAPI cht ny s gn vo si ADN v phỏt hunh quang bc súng 390 nm DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) l mt thuc nhum hunh quang liờn kt mnh m vi vựng giu AT ADN Nú c s dng rng rói kớnh hin vi hunh quang Do thuc nhum DAPI cú th i qua mt mng t bo nguyờn nờn nú cú th s dng nhum mu c cỏc t bo sng v c nh Tuy nhiờn, i vi t bo sng, cht ny i qua mng kộm hiu qu hn vy hiu qu nhum kộm hn Kt qu nhum NST ca to S mangrovei PQ6 vi thuc nhum DAPI v soi di kớnh hin vi hunh quang c trỡnh by hỡnh 12 Hỡnh 12 Nhum NST ca to S mangrovei PQ6 vi thuc nhum DAPI ( phúng i nh 500X) on Th H Thu Lp: KS.CNSH 11-04 39 Khúa lun tt nghip 2015 Kt qu thu c c trỡnh by hỡnh 12 ó cho chỳng tụi thy s lng cỏc mu cú v bi s ca im bt mu vi DAPI v phỏt hunh quang chim ti 80% tng s mu quan sỏt c Tuy nhiờn, nh quang hc m, cỏc t bo b tan v vún cm li nờn s lng t bo c th/ mu chỳng tụi khụng quan sỏt c Ngoi ra, chỳng tụi cng quan sỏt thy mt s mu bt mu DAPI v phỏt hunh quang 2, 4, 5, 10 im sỏng trờn mu quan sỏt c Nh vy, s lng im sỏng bt mu vi thuc nhum DAPI v phỏt hunh quang mu to S mangrovei PQ6 cha cú tớnh logic Tuy nhiờn, kt hp vi cỏc kt qu nhum t bo vi thuc nhum giờmsa 4% quan sỏt di kớnh hin vi quang hc, chỳng tụi tm kt lun rng to S mangrovei PQ6 cú nhim sc th (n = 3) 3.6 MT S NGUYấN NHN NH HNG TI KT NHUM MU Chỳng tụi cha th xỏc nh chớnh xỏc s lng NST v xõy dng kiu nhõn (karyotype) vi to bin d dng S mangrovei PQ6 cha thu c nhiu tiờu bn giai on metaphase v s lng NST thu c cũn dao ng cỏc phng phỏp nhum khỏc Kt qu nhum khụng tt cú th mt s yu t sau: a Thi im ly mu Vic chn la thi im ly mu nh hng ln n kt qu nhum Thi gian ly mu dng t bo no (ng bo t, amip hay t bo sinh dng hỡnh cu) hoc tui t bo (sau 1, 2, 3, ngy nuụi cy) nh hng ti s lng mu thu c giai on metaphase l giai on NST cun xon cc i v trung mt phng xớch o giai on ny, NST quan sỏt c l rừ nht Trong thớ nghim ca chỳng tụi, cỏc tiờu bn thu c giai on ny rt thp, chỳng tụi hu nh cha quan sỏt c rừ NST to ny Hn na, chn khụng ỳng thi im ly mu s nh hng n quỏ trỡnh nhum t bo cú cỏc thnh phn khỏc s gõy nhiu hỡnh nh quan sỏt c nh minh hỡnh 13 on Th H Thu Lp: KS.CNSH 11-04 40 Khúa lun tt nghip 2015 Hỡnh 13 nh minh t bo cỏc thi im nuụi cy khỏc nhum mu bng giờm sa 4% b Thao tỏc nuụi cy phũng thớ nghim T cy v dng c thao tỏc phi c chiu tia UV trc mi ln thc hin, tt c dng c phi c kh trựng cn thn trc mang vo phũng cy v t cy vụ trựng Vic nuụi cy mu cng phi m bo vụ trựng bi vỡ nu mu b nhim (vớ d nh vi khun) thỡ nhum NST ca to cú th b nhm ln vi vi khun vỡ vi khun cng cú kh nng bt mu c trng vi thuc nhum (Hỡnh 14) Vi khu Vi khu Hỡnh 14 nh minh mu b nhim vi khun nhum NST S mangrovei PQ6 bng thuc nhum giờm sa 4% c Thi gian nhc trng mu Chỳng tụi tin hnh nhc trng mu vi dung dch KCl 0,075M 30 phỳt Vi thi gian ny, chỳng tụi nhn thy mt s t bo mng nhõn cũn v NST khụng th bung c v cng khụng tri u trờn lam kớnh (Hỡnh 15) on Th H Thu Lp: KS.CNSH 11-04 41 Khúa lun tt nghip 2015 Hỡnh 15 nh minh t bo to S mangrovei PQ6 khụng b v mng t bo nhum vi thuc nhum giờmsa 4% d Thit b thớ nghim phúng i ca kớnh hin vi v phõn gii ca mỏy nh l mt yu t nh hng ln n kt qu Ban u chỳng tụi chp hỡnh bng mỏy k thut s, cỏc hỡnh thu c rt m v khú nhn dng nhim sc th Khi chuyn sang chp trờn mỏy nh cú gn trc tip lờn kớnh hin vi thỡ tm nh p hn v cú th quan sỏt nhim sc th rừ hn on Th H Thu Lp: KS.CNSH 11-04 42 Khúa lun tt nghip 2015 KT LUN V KIN NGH KT LUN T cỏc kt qu ó c trỡnh by nờu trờn ó cho phộp chỳng tụi xin rỳt mt s kt lun nh sau: 1/ quan sỏt c nhõn t bo to S mangrovei PQ6 vi tng phn cao thỡ s dng mu to sau ngy nuụi, c nh mu vi dung dch carnoy ln v nhum vi thuc nhum acetocarmine 1% cú b sung dung dch NaOH 2,5% thi gian gi Sau nhum 45 phỳt vi thuc nhum, mu c bng hn hp ethanol: axớt axetic (t l 98: v/v) 2/ To S mangrovei PQ6 cú hin tng a nhõn S lng nhõn ca to ny thay i t 1, 2, 4, 8ph thuc vo giai on phỏt trin ca to 3/ Vi qui trỡnh nhum to S mangrovei PQ6 thớch hp: nhc trng bng dung dch KCl 0,075M ng fancol vi thi gian 30 phỳt Sau ú mu c c nh bng dung dch carnoy v nhum nhim sc th ca to bng thuc nhum giờmsa 4% hoc thuc nhum DAPI cú th nhum c nhim sc th ca to ny Tuy nhiờn, s lng nhim sc th thu c ca to ny cú s khỏc cha mang tớnh qui lut v t l thnh cụng thp cha c s kt lun s lng nhim sc th chớnh xỏc ca chng PQ6 KIN NGH Qua kt qu nghiờn cu thu c nờu trờn, chỳng tụi xin a mt s kin ngh cho cỏc nghiờn cu tip theo nh sau: Kho sỏt thờm thi gian ngõm colcemid i vi t bo to S mangrovei PQ6 thu c s lng t bo dng pha metaphase nhiu nht Tip tc nhum t bo to vi thuc nhum DAPI thu c cỏc d liu khoa hc v s lng nhim sc th, t ú tin hnh phõn tớch thng kờ thu c kt qu chớnh xỏc v s lng nhim sc th ca loi to S mangrovei PQ6, t ú xỏc nh karyotype to ny S dng phng phỏp in di xung in trng xỏc nh s lng nhim sc th ca to S mangrovei PQ6 on Th H Thu Lp: KS.CNSH 11-04 43 Khúa lun tt nghip 2015 TI LIU THAM KHO TI LIU THAM KHO TING VIT Hong Lan Anh, inh Th Ngc Mai, inh Th Thu Hng, ng Dim Hng (2009) Nghiờn cu mt s c im sinh hc chng vi to bin d dng giu DHA Schizochytrium sp TB17 phõn lp t vựng rng ngp mn Diờm in, Thỏi Bỡnh Bỏo cỏo khoa hc hi ngh cụng ngh sinh hc ton quc, Cụng ngh sinh hc phc v Nụng Lõm nghip, Thy sn, Cụng nghip, Y- dc v bo v mụi trng, Thỏi Nguyờn NXB Thỏi Nguyờn 492 - 496 Nguyn Nh Hin (2005) Sinh hc phõn t v t bo c s khoa hc ca cụng ngh sinh hc NXB GD, H Tõy 133-192 ng Dim Hng, Hong Lan Anh, Ngụ Hoi Thu (2008) Phõn lp c vi to bin d dng Schizochytrium giu DHA vựng bin Huyn o Phỳ Quc Tp sinh hc 30(2): 50-55 ng Dim Hng, Hong Minh Hin, Phm Hng Sn (2006) S dng rong bin Vit Nam nh l ngun thc phm chc nng, thuc v phõn bún K yu 2006-Vin Cụng ngh Sinh hc-Vin khoa hc v Cụng ngh Vit Nam NXB Khoa hc t nhiờn v Cụng ngh 241-243 ng ỡnh Kim, ng Hong Phc Hin (1999) Cụng ngh sinh hc vi to NXB Nụng Nghip, H Ni Ngụ K Sng, Nguyn Th Quý, Nguyn Vn Hũa (1994) Kt qu bc u nghiờn cu to lam c nh nit Tp sinh hc, 16(3): 50-54 Ngụ Hoi Thu, Hong Lan Anh, ng Dim Hng (2010) Nghiờn cu ng dng sinh vi to bin ca Schizochytrium mangrovei PQ6 s dng cho thc n ti ca tu hi ngao (Lutraria Rhyncheana Jones) Tp sinh hc, 32(4): 83-88 Dng c Tin, Vừ Vn Chi (1978) Phõn loi hc thc vt- thc vt bc thp NXB H v THCN, H Ni TI LIU THAM KHO TING ANH Allen MB (1959) Studies with Cyanidium caldarium, an anomalously pigmented chlorophyte Arch Microbiol, 32: 270-277 on Th H Thu Lp: KS.CNSH 11-04 44 Khúa lun tt nghip 2015 10 Bonner JT, Frascella EB (1953) Variations in cell size during the development of the slime mold Dictyostelium discoideum Biol Bull, 104: 297-300 11 Booth (1971) Occurrence and distribution of some zoosporic fungi from soil of Hibben and Moresby Islands, Queen Charlotte Islands Can J Bot, 49: 951-965 12 Borowitzka MA (1995) Microalgae as source of pharmaceuticals and other biologically active compounds J Appl Algol, 7: 3-15 13 Bourre GM, Durrand G, Pascal G, Youyou A (1989) Brain cell and tissue recovery in rats made deficient in n-3 fatty acids by alteration of dietary fat J Nut., 119: 15-22 14 Cohen D, Finkel A, Sussman M (1976) On the role in larviculture of Macrobrachium rosenbergii Aquaculture, 8:199-207 15 Critchley T, Ohno M (1998) Seaweed resources of the Wrold JICA, Yokosuka 16 Eldridge FE (1985) Laboratory Producers for chromosome studies Cytogenetic of liverstock, 93-112 17 Fritz L, Triemer RE (1983) An ultra-structural study of mitosis in a marine dinoflagellate: Prorocentrum minimum J Protozool, 30: 437-444 18 Fujimura T, Okamoto H (1972) Notes on progress made in developing a mas culturing technique for Marcrobachium rosenbergii in Hawaii Coastal Aquaculture in the Indo-Pacific Region, 313-27 19 Gaertner A (1977) Revision of the Thraustochytriaceae (lower marine fungi) I Ulkenia nov gen., with description of three new species Verửff Inst Meeresforsch Bremerh, 16:139-157 20 Gross W (1999) Revision of comparative traits for the acido- and thermophilic red algae Cyanidium and Galdieria Enigmatic Microorganisms and Life in Extreme Enviroments, 437-446 21 Herbert CM, Jennifer MV (1983) Working with animal chromosome nd ed Books, 290 pages 22 Hitoshi K, Hiroshi Y, Jun T (1967) The Number of Chromosomes in some Species of Porphyra Bull Fac Fish., Hokkaido Univ., XVIII, on Th H Thu Lp: KS.CNSH 11-04 45 Khúa lun tt nghip 2015 23 Honda D, Yokochi T, Nakahara T, Erata M v Higashihara T (1998) Schizochytrium limacinum sp nov., a new thraustochytrid from a mangrove area in the west Pacific Ocean Mycol Res, 102: 439-448 24 Hong DD, Hoang LA, Ngo HT (2011) Study on biological characteristics of heterotrophic marine microalga Schizochytrium mangrovei PQ6 isolated from Phu Quoc Island, Kien Giang Province, Vietnam Journal of Phycology, 47(4): 944-954 (SCI, IF= 2,071) 25 Lewis TE, Nicols PD, Mckeekin TA (1999) The biotechnological potential of thraustochytrids Mar Biotechnol, 1: 580-587 26 Loeblich AR, Hedberg MF (1976) Desmokont mitosis: involvement of several microtubule containing channels Botanica Mar, 19: 255-256 27 Maddox MB, Sandifer PA, Manzi JJ (1977) Algal supplement enhancement of Macrobrachium rosenbergii (de Man) larviculture Proc Wld Mariculture Soc, 8:207-223 28 Malecha SR (1983) Commercial seed production of the freshwater prawn, Macrobrachinum rosenbergii, in Hawaii CRC Handbook of Mariculture, 1: 205-230 29 Miller JD, Jones EBG (1983) Observations on the association of thraustochytrid marine fungi with decaying seaweed Bot Mar, 24: 345-351 30 Morita E, Kumon Y, Nakahara T, Kagiwada S, Noguchi T (2006) Docohexaenoic acid production and lipid-body in Schizochytrium limacinum SR21 Mar Biotechnol, 8: 319-327 31 Muravenko O, Samatadze T, Zelenin A (1999) Image and visual analyses of Gbanding patterns of camomile chromosomes Membr Cell Biol, 12: 845-855 32 Muravenko O, Selyakh I, Kononenko N v Stadnichuk I (2001) Chromosome numbers and nuclear DNA contents in the red microalgae Cyanidium caldarium and three Galdieria species Eur J Phycol, 36: 227-232 33 Oakley B, Dodge JD (1974) Kinetochores associated with the nuclear envelope in the mitosis of a dinoflagellate J Cell Biol, 63: 322-325 on Th H Thu Lp: KS.CNSH 11-04 46 Khúa lun tt nghip 2015 34 Ordog V, Szigeti J, Puluz O (1996) Proceeding of the conference on progress in plant sciences from plant sciences from plant breeding to growth regulation Pannon University 35 Perret E, Davoust J, Albert M, Besseau L, Soyer-Gobillard MO (1993) Microtubular spindle and centrosome structure during the cell cycle in a dinoflagellate Crypthecodinium cohnii B: immunocytochemical study J Cell Sci, 104: 639-651 36 Porter D (1989) Phylum Labyrinthulomycota Handbook of Protoctists, 388398 37 Porter D (1990) Handbook of protictistol, 38: 127-145 38 Raghukumar S (2002) Ecology of marine protists, the Labyrinthulomycetes (Thraustochytrids and labyrinthulids) Eur J Protistol, 38: 127-145 39 Raghukumar S (2008) Thraustochytrid marine protists: production of PUFAs and other emerging technologies Mar Biotechnol, 10: 631-640 40 Raikov IB (1995) The dinoflagellate nucleus and chromosomes: mesokaryote concept reconsidered Acta Protozool, 34: 238-247 41 Ris H, Kubai DF (1974) An unusual mitotic mechanism in the parasitic protozoan Syndinium J Cell Sci, 60: 702-720 42 Rizzo PJ (1987) Biochemistry of the dinoflagellate nucleus The Biology of Dinoflagellates, 143-173 43 Rizzo PJ (1991) The enigma of the dinoflagellate chromosome J Protozool, 38: 246-252 44 Soyer-Gobillard MO (1996) The genome of the primitive eukaryote dinoflagellates: organization and functioning Zoological Studies, 35: 78-84 45 Spector DL (1984) Dinoflagellate nuclei Dinoflagellate, 107-147 46 Spector DL, Vasconcelos AC, Triemer RE (1981) DNA duplication and chromosome structure in the dinoflagellates Protoplasma, 105: 185-194 47 Sussman M (1951) The origin of cellular heterogeneity in the slime molds, Dictyosteliacae J Exp Zool, 118: 407418 48 Unagul P, Assantachai C, Phadungruengluij S, Suphantharika M, Tanticharoen M, Verduyn C (2007) Coconut water as a medium additive for the production of on Th H Thu Lp: KS.CNSH 11-04 47 Khúa lun tt nghip 2015 docosahexaenoic acid (C22:6n-3) by Schizochytrium mangrovei Sk-02 Bioresource Technology, 98(2): 281-287 49 Unagul P, Assantchai C, Phadungruengluij S, Suphantharika M, Verduyn C (2005) Properties of the docohexaenoic acid-producer Schizochytrium mangrovei Sk-02: effects of glucose, temperature and salinity and their miteraction Botanica Marina, 48: 387-394 50 Yabu H, Tokida J (1966) Application of aceto-iron-haematoxylin-chloral hydrate method to chromosome staining in marine algae Bot Mag, 79 (937): 381 51 Wade PA, Pruss DP, Wolffe AP (1997) Histone acetylation: chromatin in action Trends Biochem Sci, 22: 128-132 52 Wilson CM (1952) Sexuality in the Acrasiales Proc Natl Acad Sci U.S, 38: 659-662 53 Wittman W (1965) Aceto-iron-haematoxylin-chloral hydrate for chromosome staining Stain Tech, 40(3): 161-164 54 Wu TS, Yu TS, Lin PL (2005) Effect of culture conditions on docohexaenoic acid production by Schizochytrium sp S31 Process Biochem, 40(9): 3103-3108 TI LIU THAM KHO TRANG WEB 55 http://www.4shared.com/file/65964696/deacf5a4/Nhom-9CNSX.Tao.html 56 http://www.tiasang.com.vn/Default.aspx?CategoryID=2&News=8436&tabid=1110 57 http://violet.vn/bio52hue/entry/showprint/entry_id/1948343) 58 http://truyenky.vn/threads/cau-truc-sieu-vi-cua-the-nhiem-sac.9113/ 59 http://dominhhung.violet.vn/document/show/entry_id/8187740 60 http://www.computationalbioenergy.org/QSpec/Schizochytrium%20SR21.htm on Th H Thu Lp: KS.CNSH 11-04 48 [...]... luận văn với nội dung Bước đầu xây dựng qui trình nhuộm nhiễm sắc thể ở tế bào vi tảo biển Schizochytrium mangrovei PQ6 với mục tiêu tìm ra qui trình nhuộm nhiễm sắc thể của tảo này để xác định được hình thái và số lượng của loài vi tảo này, góp phần cung cấp những dữ liệu cho giải mã hệ gen của loài vi tảo biển dị dưỡng S mangrovei PQ6 – nguồn tài nguyên sinh vật tiềm năng của Vi t Nam Đoàn Thị Hà... nhân tế bào tảo S limacinum bắt màu xanh sau khi nhuộm bằng chất phát huỳnh quang DAPI và số lượng nhân của tảo này thay đổi từ 1, 2, 4…tùy thuộc vào giai đoạn sinh trưởng của tế bào Tuy nhiên, tác giả cũng không công bố về số lượng NST quan sát được ở chủng vi tảo này 1.5 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ VI TẢO BIỂN SCHIZOCHYTRIUM MANGROVEI PQ6 Schizochytrium mangrovei PQ6 là vi tảo biển dị dưỡng mới thuộc chi Schizochytrium. .. trong vi c bảo quản cũng như nuôi cấy tế bào, do các tế bào của mô này đòi hỏi phải có môi trường sinh khiết như ở trong có thể và tế bào phải bám dính trên một giản thể mới tồn tại và phát triển được c Tế bào bạch cầu Cho tới năm 1960, tế bào bạch cầu chưa được dùng để nghiên cứu NST Vì người ta cho rằng tế bào bạch cầu, đặc biệt là tế bào lympho không thể phân chia khi đã đi vào dòng máu trong cơ thể. .. muối biển nhân tạo -17,5), lắc ở 200 vòng/phút, 28 - 300C Sau 24 đến 96 giờ nuôi cấy, các tế bào Schizochytrium mangrovei PQ6 có dạng tròn, kích thước dao động từ 10 đến 20 µm và có thể quan sát thấy rõ các thể lipit trong tế bào Sinh khối Schizochytrium mangrovei PQ6 được thu hoạch bằng phương pháp ly tâm ở 4000 vòng/ phút trong 10 phút để làm nguyên liệu cho thí nghiệm xác định nhiễm sắc thể của tảo. .. quả chính xác b Tế bào nuôi cấy in vitro Khắc phục nhược điểm của những tế bào in vivo, kỹ thuật trên sử dụng nguồn tế bào đã được nuôi cấy in vitro để thay thế Năm 1885, Roux là người đã báo cáo đầu tiên về nuôi cấy tế bào in vitro, hơn 100 năm qua thuật ngữ “nuôi cấy tế bào vẫn được dùng, mặc dù lĩnh vực này đã được mở rộng từ thập niên 1950 khi các nhà khoa học đã sử dụng những tế bào nuôi cấy rời... http://truyenky.vn/threads/cau-truc-sieu -vi- cua-the-nhiem-sac.9113/) 1.3 CHU KỲ SỐNG CỦA TẾ BÀO Chu kỳ sống của tế bào là thời gian diễn ra kể từ thời điểm tế bào được hình thành nhờ phân bào của tế bào mẹ và kết thúc sự phân bào hình thành tế bào mới Người ta chia chu kỳ tế bào ra làm hai thời kỳ chính: gian kỳ (interphase), kỳ phân Đoàn Thị Hà Thu – Lớp: KS.CNSH 11-04 16 Khóa luận tốt nghiệp 2015 bào (mitosis) Thời gian... trưng bởi năm pha [35] được thể hiện ở hình 1: Đoàn Thị Hà Thu – Lớp: KS.CNSH 11-04 4 ảo Khóa luận tốt nghiệp 2015 Hình 1: Năm pha sinh trưởng của tảo - Pha chậm hoặc cảm ứng (1): Tảo sinh trưởng chậm, mật độ tế bào tăng ít do phải thích nghi dần với môi trường sống mới - Pha sinh trưởng theo hàm số mũ (2): Ở pha này mật độ tế bào tăng nhanh - Pha giảm tốc độ sinh trưởng (3): Sự phân chia tế bào sẽ... yếu tố lý hóa khác bắt đầu hạn chế sự sinh trưởng - Pha ổn định (4): Mật độ tế bào tương đối ổn định, không thay đổi do các yếu tố hạn chế và tốc độ sinh trưởng ở trạng thái cân bằng - Pha tàn lụi (5): Chất lượng môi trường trở nên xấu đi, các chất dinh dưỡng suy kiệt tới mức không thể duy trì được sự sinh trưởng Mật độ tế bào giảm mạnh 1.1.5 Vai trò của vi tảo Tảo nói chung và vi tảo nói riêng có vai... gian tế bào ở giai đoạn gian kỳ rất dài, chiếm hơn 90% thời gian chu kỳ sống của tế bào Thời gian này tùy thuộc vào thời gian của 3 pha G1 + S +G2, đặc biệt tùy thuộc vào G1 Vì ở các tế bào khác nhau thì thời gian G1 là rất khác nhau, còn giai đoạn S và G2 tương đối ổn định [16] Ví dụ ở tế bào chuột, thời gian ở G1 là 9,5 giờ, S 7,5 giờ, G2 là 1 giờ và thời gian ở kỳ phân bào 45,5 phút Vậy thời gian tế. .. sinh khối tế bào Ở Nhật Bản, hiệu suất lên men của chủng Schizochytrium sp SR1 đạt 48,1g/ L sinh khối khô sau 4 ngày nuôi cấy, với hàm lượng lipit chiếm 77% sinh khối khô và DHA chiếm 43,1% lipit tương đương 13,3g DHA/ L [39] 1.5.2.2 Ở Vi t Nam Vi tảo Schizochytrium là chi vi tảo biển dị dưỡng thứ 2 thuộc họ Thraustochytriidae được phát hiện và phân lập ở Vi t Nam Từ các mẫu lá cây trôi dạt ở ven bìa