ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRƯƠNG XUÂN ĐẠI KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CHẾ ĐỘ XỬ LÍ DEMECOLCINE LÊN KẾT QUẢ LOẠI NHÂN TẾ BÀO TRỨNG LỢN PHỤC VỤ CHO NHÂN BẢN VÔ TÍNH LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC TP HỒ CHÍ MINH – NĂM 2010 LỜI CẢM ƠN Franklin Roosevelt nói câu nói bất hủ: “Trong đời người có điều tệ hại thất bại, không dám thực việc muốn làm” Trước thực đề tài suy nghĩ nhiều cảnh báo gặp thất bại, với tình yêu đam mê dành lĩnh vực nhân vô tính, bắt tay vào thực việc muốn làm Dù kết nữa, cảm thấy vui mừng qua trình làm việc tích lũy thêm kiến thức, kinh nghiệm làm công việc yêu thích Tôi công trình thành công tới đâu có điều chắn kết người thất bại dạy dỗ, động viên, bảo thầy, cô, bạn bè người thân gia đình Vì tất lòng xin gửi đến lời cảm ơn chân thành sâu sắc Trước tiên, để hoàn thành luận văn xin bày tỏ ngưỡng mộ lời cảm ơn sâu sắc đến TS Bùi Xuân Nguyên – Trưởng phòng công nghệ phôi - Viện công nghệ sinh học, người hướng dẫn khoa học cho thời gian thực đề tài Mặc dù bận rộn với công việc thầy dành thời gian bảo truyền đạt kinh nghiệm quí báu, tận tình giúp đỡ, sửa câu, chữ cho người chưa có kinh nghiệm viết văn phong khoa học để hoàn thành luận văn Thầy truyền cho niềm đam mê khoa học, nghiêm túc, trách nhiệm công việc nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy Phan Kim Ngọc tạo điều kiện cho thực đề tài luận văn Xin cảm ơn thầy lời dạy bổ ích, học nhiều từ người tâm huyết với khoa học thầy Qua gần năm học tập, làm việc mái trường Đại học Khoa học Tự nhiên TPHCM xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô BGH, Khoa Sinh học, Phòng Sau đại học…Đặc biệt, xin gửi lời tri ân đến PGS.TS Nguyễn Tường Anh, PGS.TS Phạm Thành Hổ, người thầy định hướng, dạy bảo, nhắc nhở từ ngày đầu làm luận văn Qua xin gửi lời cảm ơn đến PGS.TS Dương Tấn Nhựt (Viện sinh học Tây nguyên) giúp đỡ nhiều suốt thời gian làm đề tài, có dẫn khoa học quí báu với nhận xét thẳng thắn để giúp làm việc tốt Cảm ơn PGS.TS Nguyễn Văn Thuận (Đại học Konkuk) truyền đạt cho kinh nghiệm quí báu lĩnh vực nhân vô tính Xin gửi lời cảm ơn đến TS Nguyễn Thị Ước, anh Cao Xuân Hiếu, Luyện Quốc Hải, anh Nguyễn Xuân Hưng (Viện CNSH) có dẫn quí báu Xin gửi lời cảm ơn đến TS Lê Thị Loan (Viện Pasteur Đà Lạt), TS Nguyễn Xuân Tùng, ThS Lương Văn Dũng, ThS Nguyễn Bích Liên (Khoa Sinh học- Đại học Đà Lạt) động viên nhắc nhở Cảm ơn bạn diễn đàn sinhhocvietnam.com: Nguyễn Trường Khoa (Viện di truyền nông nghiệp), Nguyễn Xuân Cường (Viện Lâm nghiệp), Huỳnh Như Ngọc Hiển, Nguyễn Văn Cương, Nguyễn Hữu Hoàng, Nguyễn Khuê (ĐHKHTN TPHCM), Dương Văn Cường (ĐH Thái Nguyên), Lê Ngọc Hưng (ĐH Bách khoa Hà Nội), Trần Giang Vũ Vi (ĐH Bách khoa Đà Nẵng), Nguyễn Ngọc Lương (ĐH Huế) hỗ trợ báo quốc tế suốt thời gian thực đề tài Trong suốt năm làm việc với bạn phòng thí nghiệm Nghiên cứu Ứng dụng tế bào gốc xin gửi lời cảm ơn đến ThS Phạm Văn Phúc, Chị Thương Huyền bạn Lê Trầm Nghĩa Thư, Lê Thành Long, Phạm Quốc Việt, Chung Tố Nhi, Trương Hải Nhung, Nguyễn Mai Hương, Ngô Duy Bình, Nguyễn Thị Diệu Hằng, Đặng Thị Tùng Loan, Trần Thị Như Mai, Nguyễn Thành Trung, Vũ Bích Ngọc, Lê Thành Tâm bên cạnh giúp đỡ, động viên Đặc biệt, xin cảm ơn đến cộng Nguyễn Mỹ Anh, Nguyễn Khánh Hòa, Trần Thị Thu Phương, Võ Hồ Diệp Khánh thức trắng đêm năm để thực đề tài Cảm ơn bạn Nguyễn Thanh Hiền (ĐHKHTN - ĐHQG Hà Nội), Nguyễn Xuân Đồng, Lê Bá Cung, Nguyễn Đức Huy, Nguyễn Thị Phương Mai (ĐH Đà Lạt) động viên, giúp đỡ, góp ý Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến bạn Đinh Thiện Mỹ, Đinh Văn Tí em Thiện Phú, Huyền Cơ Cảm ơn bạn Hồng Phúc, Hoàng Anh, Hữu Duy, Giang, Băng, Tâm, Nhàn, Thi, Chi, Sen, Hân, Thùy, Lâm, Khương, Thảo lớp SLĐV K17 Xin cảm ơn tập thể lãnh đạo Công Ty VISSAN, cô bảo vệ, anh chị công ty, chúc công ty ngày phát triển Cảm ơn bạn lab IVF Vạn Hạnh Cảm ơn anh, chị, cô, phục vụ thư viện trung tâm thuộc ĐHQG TPHCM, thư viện Cao học ĐHKHTN, thư viện Khoa học tổng hợp TPHCM Cảm ơn em bên cạnh, động viên anh lúc khó khăn… Cảm ơn em Đoàn động viên anh hai Và hết, từ đáy lòng mình, Con xin cảm ơn Ba, Má nuôi khôn lớn, tạo điều kiện tốt cho học hành, làm việc chỗ dựa cho khó khăn TPHCM, ngày 23 tháng năm 2010 Trương Xuân Đại MỤC LỤC Lời cảm ơn Mục lục Danh mục từ viết tắt Danh mục hình Danh mục bảng Danh mục biểu đồ Đặt vấn đề Phần I: Tổng quan tài liệu 1.1 Tế bào trứng, vai trò nhân, nguyên sinh chất trình hình thành, phát triển tế bào trứng nhân vô tính 1.1.1 Sự hình thành phát triển tế bào trứng 1.1.2 Sự thành thục tế bào trứng 1.1.2.1 Sự thành thục nhân 1.1.2.2 Sự thành thục tế bào chất 1.1.3 Hoạt động phân tử tế bào trứng 1.1.3.1 MPF-nhân tố phát động chín trứng 1.1.3.2 CSF-nhóm ức chế tế bào 1.1.3.3 MAP kinase 1.1.3.4 APC- phức hợp phát động anaphase 1.1.4 Sự tái thiết lập chương trình thực cấy nhân 1.2 Đại cương loại nhân nhân vô tính động vật 1.2.1 Loại nhân phương pháp “mò mẫm” (“Blind” enucleation) 1.2.2 Loại nhân với thuốc nhuộm Hoechst ánh sáng tia cực tím 1.2.3 Loại nhân phương pháp li tâm thang nồng độ (Centrifugation enucleation) 1.2.4 Loại nhân phương pháp telophase (Telophase enucleation) 1.2.5 Loại nhân phương pháp sử dụng hóa chất hỗ trợ (Chemical assistant enucleation) 10 1.2.5.1 Tổng quan demecolcine 11 1.2.5.2 Tính chất demecolcine 11 1.3 Nhân vô tính lợn 12 1.3.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình nhân vô tính lợn 14 1.3.1.1 Tế bào cho 14 1.3.1.2 Kĩ thuật chuyển nhân 14 1.3.1.3 Hoạt hóa 15 1.3.1.4 Sự tái thiết lập chương trình phát triển phôi lợn 16 1.3.2 Những thay đổi loại nhân phương pháp sử dụng demecolcine nhân vô tính lợn 17 1.3.3 Chuẩn bị tế bào nhận 17 1.4 Nhân vô tính Việt Nam 21 Phần II: Vật liệu- phương pháp 2.1 Đối tượng thí nghiệm 23 2.2 Dụng cụ thiết bị 23 2.2.1 Dụng cụ 23 2.2.2 Thiết bị 24 2.3 Hóa chất môi trường 25 2.3.1 Hóa chất 25 2.3.2 Môi trường 25 2.3.2.1 Môi trường thu nhận buồng trứng 25 2.3.2.2 Môi trường thu nhận rửa tế bào trứng 26 2.3.2.3 Môi trường nuôi thành thục trứng in vitro 26 2.3.2.4 Môi trường ủ tế bào trứng trước loại nhân 26 2.3.2.5 Môi trường loại nhân tế bào trứng 26 2.4 Phương pháp 27 2.4.1 Phương pháp thu nhận buồng trứng lợn 28 2.4.2 Thu nhận tế bào trứng lợn 29 2.4.2.1 Thu nhận phương pháp chọc hút 29 2.4.2.2 Thu nhận phương pháp cắt nang 29 2.4.3 Phương pháp nuôi thành thục trứng in vitro 30 2.4.4 Phương pháp loại tế bào cumulus 31 2.4.5 Phương pháp khảo sát nồng độ demecolcine thích hợp cho loại nhân32 2.4.6 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng thời gian thích hợp cho việc loại nhân 32 2.4.7 Ảnh hưởng thời gian IVM đến kết loại nhân 32 2.4.8 Khảo sát ảnh hưởng demecolcine kết hợp cytochalasin B lên tế bào trứng 33 2.4.10 Phương pháp loại nhân tế bào 33 2.4.10.1 Phương pháp ép đẩy 34 2.4.10.2 Phương pháp xử lí demecolcine kết hợp hút nhân 35 2.4.11 Phương pháp nhuộm Hoechst 33342 37 2.4.12 Phương pháp thống kê 37 Phần III: Kết -biện luận 3.1 Kết thu nuôi trứng thành thục 38 3.1.1 Kết thu trứng 38 3.1.2 Kết nuôi trứng thu phương pháp cắt nang 40 3.1.3 Kết nuôi trứng thu phương pháp chọc hút 41 3.1.4 So sánh hiệu phương pháp 42 3.2 Ảnh hưởng nồng độ demecolcine lên tế bào trứng 45 3.3 Kết khảo sát thời gian xử lí demecolcine thích hợp cho loại nhân 48 3.4 Ảnh hưởng thời điểm xử lí loại nhân tế bào trứng demecolcine 49 3.5 So sánh hiệu loại nhân phương pháp ép- đẩy phương pháp xử lí demecolcine kết hợp với hút nhân 52 3.6 Kết khảo sát ảnh hưởng demecolcine cytochalasin B lên hiệu tạo chỗ nhô tế bào trứng 56 Phần IV: Kết luận-đề nghị Tài liệu tham khảo Phụ lục DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT APC BSA CB CNSH COCs CSF De DNA eGF FBS GV GVBD hCG IVM MAPK MI MII MPF MT NCSU23 NST NT PB2 PB1 PMSG PVP SCNT TCM UV anaphase promoting complex bovine serum albumin cytochalasin B công nghệ sinh học cumulus oocyte complex cytostactic factor demecolcine deoxyribonucleic acid epidermal growth factor fetal bovin serum germinal vesicle germinal vesicle breakdown human chorionic gonadotropin in vitro maturation mitogen-activated protein kinase metaphase I metaphase II maturation promoting factor microtubule north california state university 23 nhiễm sắc thể nuclear transfer polar body polar body pregnant mare’s serum gonadotropin polyvinyl pyrolidone somatic cell nuclear transfer tissue culture medium ultra violet DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu tạo tế bào trứng lợn Hình 1.2 Các giai đoạn trình sinh trứng Hình 1.3 Các giai đoạn thành thục nhân Hình 1.4 Hoạt động phân tử MPF tế bào trứng Hình 1.5 Vai trò CSF tế bào trứng Hình 1.6 Công thức cấu tạo demecolcine 11 Hình 1.7 So sánh sinh sản tự nhiên sinh sản vô tính 12 Hình 1.8 Mô hình gen trị liệu sử dụng lợn nhân vô tính 13 Hình 1.9 Các bước kĩ thuật nhân vô tính lợn 14 Hình 2.1 Hệ thống vi thao tác kính hiển vi đảo ngược 24 Hình 2.2 Tủ đựng hóa chất 25 Hình 2.3 Máy mài kim 25 Hình 2.4 Máy tạo dáng kim 25 Hình 2.5 Máy kéo kim 25 Hình 2.6 Tủ thao tác vô trùng 25 Hình 2.7 Buồng trứng lợn 28 Hình 2.8 Hình dạng tế bào trứng loại A, B, C 30 Hình 2.9 Các bước loại bỏ tế bào cumulus tế bào trứng 31 Hình 2.10 Các bước loại nhân phương pháp ép- đẩy 35 Hình 2.11 Đĩa giếng có vi giọt đĩa Φ90 có phủ dầu khoáng 35 Hình 2.12 Các bước loại nhân tế bào trứng cách hút 37 Hình 3.1 Tế bào trứng xử lí demecolcine 47 Hình 3.2 Hình dạng tế bào trứng thay đổi theo thời gian xử lí demecolcine .49 Hình 3.3 Tế bào trứng thời gian IVM khác 51 Hình 3.4 Tế bào trứng 30-32 (xử lí demecolcine) 52 29 Irina, L., Giovanna, L., Cesare, G (2006), “Birth of cloned pigs from zonafree nuclear transfer blastocysts developed in vitro before transfer”, Cloning and stem cells, 8(4) pp 283-293 30 Jimenez, C., Alejandro, C., Silvia, M., Izquierdo, C., Lang, R., Gustavo, C (2007), “Biotechnology on reproduction in vitro swine”, Journal of applied science research, pp 1917- 1920 31 Kato, Y., Tsunoda, Y (1992), “Synchronous division of mouse two-cell embryos with nocodazole in vitro”, Reproduction Fertility, 95, pp 39-43 32 Kawakami, M., Tani, T., Yabuchi, A., Kobayashi, T., Murakami, H., Fujimura, T., Kato, Y., Tsunoda, Y (2003), “Effect of demecolcine and nocodazone on the efficiency of chemically assisted removal of chromosomes the developmental potential of nuclear transferred porcine oocytes”, Cloning and Stem cells, 5(4), pp 379-387 33 Koo, D.B., Kang, Y.K., Choi, Y.H., Park, J.S., Han., Park, I.Y., Kim, S.U., Lee, K.K., Son, D.S., Chang, W.K., Han, Y.M (2000), “In vitro development of reconstructed porcine oocytes after somatic cell nuclear transfer”, Biology of reproduction, 63, pp 986-992 34 Lan, G,C., Yan-Guang, W., Dong, H., Li,G., Yong, L (2008), “Demecolcine-Assisted Enucleation of Goat Oocytes: Protocol Optimization, Mechanism Investigation, and Application to Improve the Developmental Potential of Cloned Embryos”, Cloning and Stem Cells, 10(2), pp 189-202 35 Lee, G.S., Hyun, S.H., Kim, H.S., Kim, D.Y., Lee, S.H., Lim, J.M., Lee, E.S., Kang, S.K., Lee, B.C., Hwang, W.S (2003), “ Improvement of a porcine somatic cell nuclear transfer technique by optimizing donor cell and recipient oocyte preparation” , Theriogenology, 59, pp 1949-1957 36 Li, J., Rieke, A., Day, B.N., Prather, R.S (1996), “Technical note: porcine non-surgical embryo transfer”, J Anim Sci; 74, pp 2263-2268 37 Li, X.C., Zhang, Y., Hua, S., Shu, J.H., Zhang, Z P., Cao, J.W (2007), “The use of demecolcine for enucleation of bovine oocytes”, Belg Journal Zoology, 137, pp 209-214 38 Liu, J.K., Wang, M.K., Sun, Q.Y., Xu, Z., Chen, D.Y (2000), “Effect of telophase enucleation on bovine somatic nuclear transfer”, Theriogenology, 54, pp 989-998 39 Louis, M.H (2003), Animal transgenesis and cloning, John Wiley& Sons 40 Machaty, Z., Mayes, M.A., Prather, R.S (1995), “Parthenogenetic activation of porcine oocytes with guanosine-5’-O-(3’-thiotriphosphate), Biology of Reproduction, 52, pp 753-758 41 Machaty, Z., Wang, W.H., Day, B.N, Prather, R.S (1997), “Complete activation of porcine oocytes induced by the sulphydryl reagent, thimerosal”, Biology reproduction, 57, pp 1123-1127 42 Massui, Y., Markert, C (1971), “Cytoplasmic control of nuclear behaviour during meiotic maturation of frog oocytes”, Experimetal Zoology, 177, pp 129-146 43 Mayes, M.A., Stogsdill, P.L., Parry, T.W., Kinden, D.A., Prather, R.S (1995), “Reprogramming of nucleoni after nuclear transfer of big blastomeres into enucleated oocytes”, Development Biology, 163, pp 542 44 McGrath, J., Solter, D (1984), “Inability of mouse blastomere nuclei transferred to enucleated zygotes to support development in vitro”, Science, 226, pp 1317-1319 45 Melanie, A.B., Mark, B.N., David, T.A., Christopher, G.G (2007), “Relationship between follicle size and oocyte developmental competence in vitro prepubertal and adult pigs”, Reproduction, Fertility and Development, 19, pp 797-803 46 Mendes, C.M., Mello, M.R.B., Milazzotto, M.P., Assumpção, M.E., Visintin, J.A (2007), “In vitro maturation of pig oocytes with different media, hormone and meiosis inhibitors”, Animal reproduction science, 97, pp 375- 381 47 Mitalipov, S.M., White, K.L., Farrar, V.R (1999), “Development of nuclear transfer and parthenogenetic rabit embryos activated with inositol 1,4,5triphosphate”, Biology Reproduction, 60, pp 821-827 48 Miyoshi, K., Mori, H., Yamamoto, H., Kishimoto, M., Yoshida, M (2008), “ Effects of demecolcine and sucrose on the incidence of cytoplasmic protrusions containing chromosomes in pig oocytes matured in vitro”, Reproduction and Development, 54(2), pp 117-121 49 Nagashima, H., Yamakawa, H., Saito, S (1992), “Pronuclear formation and polar body extrusion in porcine reconstructed embryos”, Ability of porcine, 2, pp 145-147 50 Naiara, Z.S., Felipe, P.,Simone, C.R., Christina, R.F., Tatiane, A.D.T., Joaquim, M.G (2009), “ Demecolcine effects on microtubule kinetics and on chemically assisted and enucleation of bovine oocytes”, Cloning and Stem cells, 11(1), pp 167-172 51 Nguyen, B.X (2006a), “Current status and trends of animal reproductive biotechnology in Vietnam”, Embryo Transfer Newsletter, 24(2), pp 5-10 52 Nguyen, B.X., Ty, L.V., Linh, B,C., Duc, N.H., Uoc,N.T (2000), “Comparision between the efficiencies of using bovine and buffalo oocytes as host ooplasts for embryo production by adult cell nuclear transfer”, Theriogenology, 53(1), pp 235 53 Nguyen, B.X., Uoc, N.T., Nagai, T., Linh, N.V., Huu, Q.X., Hanh, N.V., Thanh, N.T., Duc, N.H., Chi, B.L (2006b), “Production of Ban minipig embryos by somatic cell nuclear transfer” Reprod Fert & Development 18:1, 147 54 Nixon, V.L., Levasseur, M., McDougall, A (2002), “Ca2+ oscillations promote APC/C-dependent cyclin B1 degradation during metaphase arrest and completion of meiosis in fertilizing mouse eggs”, Current Biology, 12, pp 746-750 55 Nour, M.S., Takahashi, Y (1999), “Preparation of young preactivated oocytes with high enucleation efficiency for bovine nuclear transfer”, Theriogenology, 51, pp 661-666 56 Nurse, P (1990), “ Universal control mechanism regulating onset of Mphase”, Nature, 344(6266), pp 503-508 57 Onishi, A.M., Iwamoto, T., Akita, S., Mikawa, K., Takeda, T., Awata, H., Hanada, A.C (2000), “Pig cloning by microinjection of fetal fibroblast nuclei”, Science, 289, pp 1188-1190 58 Park, K.W., Cheong, H.T., Lai, L (2002), “ Production of nuclear transferderived swine that express the enhanced green flourescent protein”, Animal biotechnology, 12, pp 173-181 59 Paul, J., Verma, A O (2006), Nuclear transfer protocol cell reprogramming and transgenesis, Humana press 60 Peters, J.M (2002), “The Anaphase Promoting Complex: Proteolysis in mitosis and beyond”, Molecular Cell, 9, pp 93 -94 61 Polejaeva, I.A., Chen, S.H., Vaught, T.D., Page, R.L., Mullins, J., Ball, S., Dai, Y., Boone, J Walker, S Ayares, D.L Colman, A Campbell, K.H (2000), “Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells”, Nature, 407, pp 86-90 62 Prather, R.S., Machaty, Z., Day, B.N (1998), “ Development of early porcine embryos in vitro and in vivo”, Biology of reproduction, 59, pp 451455 63 Prather, R.S., Sims, M.M., First, N.L (1989), “Nuclear transplantation in early pig embryos”, Biology Reproduction, 41, pp 414-418 64 Robl, J.M., First, N.L (1985), “Manipulation og gametes and embryos in the pig”, Reproduction Fertility Supplement, 33, pp 101-104 65 Samiec, M., Skrzyszowska, L (2005), “Microsurgical nuclear transfer by intraooplasmic karyoplast injection as an alternative embryo reconstruction method in somatic cloning of pigs and other mammal species application value of the method and its technical advantages”.A review, Czech Journal animal science, 50, pp 235-242 66 Schoevers, E.J., Bevers, M.M., Roelen, B.A., Colenbrander,B (2005), “Nuclear and cytoplasmic maturation of sow oocytes are not synchronized by specific meiotic inhibition with roscovitine during in vitro maturation”, Theriogenology, 63, pp 11-30 67 Somfai, T., Kikuchi, K., Medvedev, S., Onishi, A., Iwamoto, M., Fuchimoto, D., Ozawa, M., Kaneko, H., Ohnuma, K., Sato, E., Nagai, T (2005), “Development to the blastocyst stage of immature pig oocytes arrested before the metaphase –II stage and fertilized in vitro”, Animal reproduction science, 90(3), pp 307-328 68 Song, K., Hyun, S.H., Shin, T., Lee, B (2009), “Post-activation treatment with demecolcine improves development of somatic cell nuclear transfer embryos in vitro pigs by modifying the remodeling of donor nuclei”, Molecular Reproduction & Development, 76, pp 611-619 69 Sosnowski, J., Waroczyk, M., Switonski, M (2003), “Chromosome abnormalities in vitro secondary pig oocytes matured in vitro”, Theriogenology, 60, pp 571-581 70 Swanson, K., Kuzmuk, K., Meyers, S., Beever, J., Adams, S (2005), “Swine in biomedical research”, Proceeding of the Swine in Biomedical research conference ”, pp.42-43 71 Tani, T., Shimada, H., Kato, Y., Tsunoda, Y (2006), “Demecolcineassisted enucleation for bovine cloning”, Cloning and Stem cells, 8(1), pp 61-66 72 Tatham, B.G., Dowsing, A.T., Trounson, A.O (1995), “Enucleation by centrifugation of in vitro matured bovine oocytes for use in nuclear transfer”, Biology Reproduction, 53, pp 1088-1094 73 Terlouw, S.L., Prather, R.S., Day, B.N (1993), “In vitro development of nuclear transplant pig embryos”, Theriogenology, 37, pp 309-312 74 Thuan, N.V., Thuy, B.H., Walayama, T., Miyano, T (2006), “Chromatin remodeling in somatic cells injected into mature pig oocytes”, Reproduction, 131, pp 1037-1049 75 Tsunoda, Y., Kato, Y (2000), “The recent progress on nuclear transfer in mammals”, Zoology Science, 17, pp.1177-1184 76 Uoc, N.T., Bavister, B.D., Hanh, N.V., Bui, L.C.,Thanh, N.T., Duc,N.H., Huu, Q.X., Linh, N.V., Nguyen, B.X (2005), “Somatic cell nuclear transfer in vitro non-human primates: the possibility of using oocytes matured in vitro for up to day as host ooplast” Proceedings of the annual conference of the international Embryo transfer Society, Copenhagen, Denmark, 8-12 January 2005:pp 117-118 77 Uoc, N.T., Ty, L.V.,Tuoc, D., Duc, N.H., Hanh, N.V., Thanh,N.T., Bui, L.C., Laloy, E., Renard, J.P, Nguyen, B.X (2002), “Effect of tissue sampling condition on the in vitro multiplication and reprogramming potential of somatic cells obtained from different specimens of the Saola (Pseudoryx nghetinhensis) species”, Theriogenology 57 (1):pp.437 78 Vaijta, G; Yunhai, Z., Zoltan, M (2007), “ Somatic cell nuclear transfer in pigs: recent achievements and future possibilities”, Reproduction, Fertility and Development,19, pp 403-423 79 Vajta, G., Gierris, M (2006), “Science and technology of farm animal cloning: state of the art”, Animal reproduction science , 92, pp.211-230 80 Willadsen, S.M (1986), “Nuclear transplantation in vitro sheep embryos”, Nature, 320, pp 63-65 81 Wilmut, I., Schnieke, A.E., McWhir, J., Kind, A.J., Campbell, K.H (1997), “Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells”, Nature, 385, pp 810-813 82 Xu, X., Ding, J., Seth, P.C., Harbison, D.S., Foxcroft, G,R (1995), “In vitro fertilization of in vitro matured pig oocytes: effects of boar and ejaculate fraction”, Theriogenology, 45(4), pp.745-755 83 Yin, X.J., Tani, T., Yonemura, I., Kawakami, M., Miyamoto, K., Hasegawa, R., Kato, Y., Tsunoda, Y (2002),“Production of cloned pigs from adult somatic cells by chemically assisted removal of maternal chromosomes”, Biology of reproduction, 67, pp.442-446 Tài liệu từ internet 84 http://en.wikipedia.org/wiki/Phosphate_buffered_saline 85 http://atheism.about.com/library/chronologies/blchron_sci_cloning.htm 86 http://www.biology.iupui.edu/biocourses/Biol540/12cloningfullCSS.html 87 http://www.tarleton.edu/Departments/anatomy/oogenesis.html 88 http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL3530/DB_Ch12/DBNGerm html 89 http://www.nature.com/nature/journal/v446/n7139/fig_tab/nature05688_F4 html 90 http://www.wormbook.org/chapters/www_controloocytematuration/meiotic fig1.jpg PHỤ LỤC Phụ lục 3.1 Môi trường rửa buồng trứng PBS (Phosphate buffered saline) Thành phần: NaCl 10g KCl 0,25 g Na2HPO4.12H2O 1,44g KH2PO4 0,25g Hòa tan vào lít nước cất vô trùng Chuẩn pH đến 7,4 sử dụng tối đa tháng, bảo quản nhiệt độ phòng Phụ lục 3.2 Môi trường thu nhận rửa tế bào trứng -mDPBS (modified Dulbecco’s phosphate buffered saline) Thành phần: Pha môi trường PBS (-) NaCl 4g KCl 0,1g Na2HPO4 0,575g KH2PO4 0,1g Nước cất 350mL CaCl2 0,05g MgCl2.6H2O 0,05g Nước cất 100mL Pha môi trường PBS (+) Sau chuẩn bị xong, rót từ từ PBS (+) vào PBS (-) để tránh kết tủa Bổ sung 0,5g glucose 0,018g natri pyruvate kèm theo 625µL gentamycine (nồng độ 50µg/mL) Bổ sung nước cất vô trùng cho đủ 500mL Sau lọc điều kiện vô trùng bảo quản 4-50C Phụ lục 3.3a Môi trường nuôi thành thục trứng - Môi trường IVM1 Thành phần: TCM – 199 pFF 10 % (v/v) Natri pyruvate 20 mg/mL eGF 10 ng/mL L – cystein 0.6 mM (3.5 mg/50 mL) hCG 10 IU/mL PMSG 10 IU/mL Kanamycine mg/100 mL Phụ lục 3.3b Môi trường nuôi chín trứng - Môi trường IVM2 Thành phần: Môi trường IVM2 giống thành phần môi trường IVM1 không bổ sung hormone hCG PMSG Phụ lục 3.4 Môi trường ủ trứng trước loại nhân Thành phần: TALP- HEPES free Ca2+ Polyvinylpyrolidone 0,3% Demecolcine 0,2µg/mL Sucrose 0,05M Phụ lục 3.5 Môi trường loại nhân tế bào trứng Thành phần: TALP-HEPES free Ca2+ Polyvinylpyrolidone 0,3 % Demecolcine 0,2 µg/mL Cytochalasin B µg/mL *Cách pha TALP-HEPES free Ca2+ Thành phần: Dung dịch (-): Dung dịch (+): NaCl KCl NaHCO3 NaH2PO4.2H2O Nước cất MgCl2.6H2O Nước cất 654,5 mg/100 mL 20 mg/100 mL 210 mg/100 mL 6,2 mg/100 mL 70 mL 10 mg/100 mL 20 mL Sau chuẩn bị xong, rót từ từ dung dịch (+) vào dung dịch (-) đồng thời khuấy để tránh kết tủa Bổ sung thêm: Glucose 250 mg/100 mL Natri lactate 121.1 mg/100 mL Natri pyruvate 11 mg/100 mL HEPES 120 mg/100 mL Gentamycine 150 µg/mL Bổ sung thêm nước cất cho đủ 100 mL Phụ lục 3.6 Máy kéo (microforge) Hình 1: Máy kéo (microforge) (1) Nút khởi động; (2,3,4) nút điều chỉnh nhiệt độ lực; (5) nút chọn lựa chế độ; (6) nút “start”; (7) hình hiển thị thông số; (8) trượt; (9) hộp đựng platinum heater vị trí cố định ống mao quản Bảng 3.1 Các thông số thiết lập từ máy kéo sau Các thông số Kim loại nhân Kim chuyển Holding kim nhân cho Nhiệt độ 82,5oC 76,5oC 99,5oC Lực phụ 45 45,4 40 Lực 70 75 78 Phụ lục 3.7 Máy mài (microgrinder) Hình 2: Hệ thống máy mài ảnh kim mài qua thị kính Thời gian, vận tốc dòng chảy, vận tốc xoay góc mài cài cho máy ứng với loại kim: Bảng 3.2 Các thông số tạo kim loại nhân chuyển nhân Các thông số Kim chuyển nhân Kim loại nhân Vận tốc dòng chảy Cực đại Cực đại Vận tốc xoay Cực đại Cực đại Thời gian phút phút Góc (o) 30o 30o Phụ lục 3.8 Máy tạo dáng (Microforge) Máy tạo dáng quan trọng định 50% thành công việc tạo loại kim thao tác Kỹ thuật cắt đầu kim Cắt đầu kim vị trí có đường kính thích hợp, cắt đầu kim phải thật thẳng kim không bị cong Hình 3: Kĩ thuật cắt đầu kim Kỹ thuật tạo kim giữ Hình 4: Kĩ thuật tạo kim giữ Kỹ thuật tạo đầu nhọn (spike) Đầu nhọn chóp nhọn nằm đỉnh đầu kim loại nhân vi tiêm, giúp cho kim đâm xuyên thủng trứng cách dễ dàng Hình 5: Kỹ thuật tạo đầu nhọn kim tiêm Kỹ thuật bẻ cong kim Hình 6: Bẻ cong kim thao tác góc bẻ cong KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ DEMECOLCINE Nồng độ Số tế bào trứng thử nghiệm (µg/mL) Lần Lần Số tế bào trứng có chỗ nhô Lần Lần Lần Lần 5 0.01 25 20 20 0.05 25 30 20 12 11 0.1 25 30 15 17 0.2 25 30 15 21 19 0.5 26 40 24 15 12 16 1.0 30 35 20 20 13 18 1.5 30 30 16 14 19 2.0 30 30 30 25 14 KHẢO SÁT THỜI ĐIỂM IVM Thời gian (giờ) Số tế bào trứng thử nghiệm Số tế bào trứng có chỗ nhô Lần Lần Lần Lần Lần Lần 12-14 15 15 10 22-24 12 10 10 30-32 10 10 10 10 8 36-38 12 12 12 40-44 13 12 3 KHẢO SÁT THỜI GIAN XỬ LÍ Thời gian (Phút) Số tế bào trứng thử nghiệm Số tế bào có chỗ nhô Lần Lần Lần Lần Lần Lần 10 10 10 0 ? 15 30 50 40 13 19 30 28 50 40 16 32 12 45 30 30 30 23 10 14 60 30 51 40 18 29 28 90 34 50 47 11 32 20 KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ DEMECOLCINE Nồng độ (µg/mL) 0.01 0.05 0.1 0.2 0.5 1.0 1.5 2.0 Số tế bào trứng thử nghiệm Lần Lần Lần 5 25 20 20 25 30 20 25 30 15 25 30 15 26 40 24 30 35 20 30 30 16 30 30 30 Số tế bào trứng có chỗ nhô Lần Lần Lần 12 11 17 21 19 15 12 16 20 13 18 14 19 25 14 KHẢO SÁT THỜI ĐIỂM IVM Thời gian (giờ) 12-14 22-24 30-32 36-38 40-44 Số tế bào trứng thử nghiệm Lần Lần Lần 15 15 10 12 10 10 10 10 10 12 12 12 13 12 Số tế bào trứng có chỗ nhô Lần Lần Lần 3 10 8 3 KHẢO SÁT THỜI GIAN XỬ LÍ Thời gian (Phút) 15 30 45 60 90 Số tế bào trứng thử nghiệm Lần Lần Lần 10 10 10 30 50 40 28 50 40 30 30 30 30 51 40 34 50 47 Số tế bào có chỗ nhô Lần Lần Lần 0 ? 13 19 16 32 12 23 10 14 18 29 28 11 32 20 [...]... l thnh cụng Hai loi t bo cn thit cho quỏ trỡnh nhõn bn vụ tớnh l t bo cho nhõn (donor nucleus - karyoplast) v t bo trng nhn (recipient oocytes - cytoplast) rt c quan tõm T bo trng nhn cha y cỏc thnh phn cn thit cho phộp nhõn t bo cho tỏi lp trỡnh (reprogramming) Vỡ vy, loi nhõn l chỡa khúa quan trng cho s thnh cụng ca nhõn bn vụ tớnh ng vt Trong qui trỡnh nhõn bn vụ tớnh thỡ khõu loi nhõn (enucleation)... thnh cụng ỏng khớch l Mc dự demecolcine hay colcemid l mt húa cht h tr rt tt x lớ loi nhõn t bo ng vt trờn th gii, nhng ti Vit Nam, vic s dng húa cht h tr demecolcine loi nhõn cha c cp nhiu Nhm gúp mt phn nh bộ ca mỡnh vo nhng nghiờn cu nhõn bn vụ tớnh Vit Nam, chỳng tụi thc hin ti Kho sỏt nh hng ca ch x lớ demecolcine lờn kt qu loi nhõn t bo trng ln phc v cho nhõn bn vụ tớnh Vi mc tiờu nõng cao... ny rt cn thit cho s phỏt trin phụi nhõn bn vụ tớnh sau ny trong vic tỏi cu trỳc nhõn t bo sinh dng v nguyờn sinh cht trong t bo trng 1.2.5.1 Tng quan v demecolcine Demecolcine hay Colcemid l mt cht cú dng rt gn vi colchicine cng c s dng trong di truyn hc t bo Mc dự demecolcine cú liờn quan n colchicine nhng nú ớt c hn, cú kh nng ngn chn quỏ trỡnh polymer húa to vi cu trỳc v bt hot thoi vụ sc *Tờn quc... Hỡnh 1.6 Cụng thc cu to demecolcine *Cụng thc phõn t: C15H25NO5 *Cụng thc cu to: Demecolcine khỏc colchicine l ớt hn 1 nguyờn t oxy 1.2.5.2 Tớnh cht ca demecolcine Cỏc nghiờn cu khỏc nhau cho thy demecolcine cú kh nng kt hp nhanh chúng vi tubulin, cú kh nng chuyn i thun nghch trong khi colchicine kt hp vi cỏc cu trỳc tubulin mt cỏch rt chm v khụng cú kh nng chuyn i thun nghch S dng demecolcine vi nng ... cho l nhõn t giỏn tip ca vic trao i protein xy ra sau khi chuyn nhõn Cỏc protein ny l nguyờn nhõn trong s phõn mnh ca phụi (Thuan, v cs., 2006; Paul v cs., 2006) 1.3.2 Nhng thay i khi loi nhõn bng phng phỏp s dng demecolcine trong nhõn bn vụ tớnh ln Cỏc nghiờn cu trờn t bo trng ln cho thy demecolcine bt u cú nh hng lờn thoi gim phõn sau khi x lớ 15 phỳt Khi x lớ cỏc trng ln c nuụi cy in vitro vi demecolcine. .. tr loi nhõn t bo nh: colchicine, demecolcine, ethanol, nocodazole, Vic s dng demecolcine ó c cp v s dng ngy cng nhiu trong loi nhõn thc hin nhõn bn vụ tớnh ng vt (Yin v cs., 2002) Loi nhõn bng phng phỏp s dng demecolcine nhm gii quyt nhng khú khn ca cỏc phng phỏp trờn ci thin hiu qu ca vic loi nhõn Nguyờn lớ ca phng phỏp loi nhõn bng cỏch s dng húa cht núi chung v demecolcine núi riờng l ngn chn... phng phỏp nhõn bn vụ tớnh hin nay rt thp, ch t 1-2% vo nm 2000, (Tsunoda v cs., 2000), ti 7-8% nm 2006 (Vajta v cs.,2006) Trong ú, t l thnh cụng trong nhõn bn vụ tớnh ln cng khụng phi l ngoi l Mc dự vy nhng nhõn bn vụ tớnh ln li rt c cỏc nh khoa hc c bit quan tõm vi hi vng chỳng s tr thnh cu tinh cho con ngi trong vic thay th v ghộp ni tng Con ln u tiờn ra i bng phng phỏp nhõn bn vụ tớnh trờn th gii... kho sỏt nng demecolcine 45 Bng 3.6 nh hng thi gian x lớ demecolcine 48 Bng 3.7 nh hng ca thi im x lớ demecolcine 50 Bng 3.8 Kt qu loi nhõn bng phng phỏp ộp - y 53 Bng 3.9 Kt qu x lớ loi nhõn bng demecolcine kt hp vi hỳt nhõn 54 Bng 3.10 nh hng ca De v CB lờn hiu qu to ch nhụ 56 DANH MC BIU Biu 3.1 So sỏnh t l trng ca 2 phng phỏp 43 Biu 3.2 nh hng ca nng demecolcine. .. hc khỏc trờn th gii trờn i tng khỏc nh chut, th, bũ, Robl v First ln u tiờn mụ t k thut loi nhõn v nhõn bn vụ tớnh ln vo nm 1985 (Robl v First, 1985) Hỡnh 1.9 Cỏc bc trong k thut nhõn bn vụ tớnh ln (Polejaeva, 2000) 1.3.1 Cỏc yu t nh hng n quỏ trỡnh nhõn bn vụ tớnh ln 1.3.1.1 T bo cho Cỏc t bo cho cú th ly t nhiu ngun khỏc nhau vi nhiu mc bit húa khỏc nhau: nguyờn bo si (Onishi v cs., 2000), t bo... bn vụ tớnh S kin ny ỏnh du mt bc tin nhy vt trong lnh vc nhõn bn vụ tớnh, ng thi m ra mt trang s mi cho nhõn loi Tip theo cu Dolly cỏc nh khoa hc ca cỏc nc M, Nht Bn, í, Anh, Hn Quc, ó bt u in tờn mỡnh lờn bn nhõn bn vụ tớnh ng vt trờn th gii bng nhng thnh cụng trờn cỏc i tng ng vt khỏc nh: bũ, chut, nga, ln, dờ, th, kh, Nhng thnh cụng bc u ny s gúp phn quan trng vo vic s dng cỏc c quan thay th cho ... quan v demecolcine 11 1.2.5.2 Tớnh cht ca demecolcine 11 1.3 Nhõn bn vụ tớnh ln 12 1.3.1 Cỏc yu t nh hng n quỏ trỡnh nhõn bn vụ tớnh ln 14 1.3.1.1 T bo cho ... Cụng thc cu to demecolcine *Cụng thc phõn t: C15H25NO5 *Cụng thc cu to: Demecolcine khỏc colchicine l ớt hn nguyờn t oxy 1.2.5.2 Tớnh cht ca demecolcine Cỏc nghiờn cu khỏc cho thy demecolcine cú... bn vụ tớnh ln vo nm 1985 (Robl v First, 1985) Hỡnh 1.9 Cỏc bc k thut nhõn bn vụ tớnh ln (Polejaeva, 2000) 1.3.1 Cỏc yu t nh hng n quỏ trỡnh nhõn bn vụ tớnh ln 1.3.1.1 T bo cho Cỏc t bo cho