BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỌ QUỐC DŨNG NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHITOSAN ĐỂ KHỬ ALDEHYDE TRONG RƯỢU ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS TRANG SĨ TRUNG TS. NGUYỄN VĂN HÒA Nha Trang – 2015 i LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và thực hiện đề tài tốt nghiệp, tôi đã nhận được sự quan tâm tận tình của quý thầy cô hướng dẫn khoa học, Khoa Công nghệ Thực phẩm, Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường và các cá nhân trong trường, đã giúp tôi hoàn thành đề tài này. Tôi xin chân thành cám ơn sâu sắc tới thầy giáo hướng dẫn PGS.TS Trang Sĩ Trung và TS Nguyễn Văn Hòa, đã hết lòng chỉ bảo và hướng dẫn tận tình, thường xuyên theo dõi quá trình thực hiện đề tài. Xin chân thành cám ơn sự giúp đỡ đặc biệt của ThS. Nguyễn Công Minh, ThS. Phạm Thị Đan Phượng, đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin chân thành cám ơn Ban Giám Hiệu, Khoa Công nghệ Thực phẩm Trường Đại học Nha Trang đã tạo điều kiện cho tôi thuận lợi trong quá trình học tập, nghiên cứu và bảo vệ đề tài. Xin cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã quan tâm, chia sẻ khó khăn và động viên để tôi hoàn thành tốt công việc. ii MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................ IV DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................................. V LỜI MỞ ĐẦU .................................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................................... 5 1.1. TÌM HIỂU VỀ RƯỢU CỒN TRẮNG TRUYỀN THỐNG ................................................... 5 1.1.1. Tính chất vật lý và hóa học của rượu ............................................................ 5 1.1.2. Thành phần hóa học của rượu cồn trắng....................................................... 6 1.1.3. Tác hại của rượu đến sức khỏe con người ..................................................... 8 1.1.4. Quy trình sản xuất rượu truyền thống.......................................................... 10 1.2. CHITOSAN VÀ ỨNG DỤNG ..................................................................................... 12 1.2.1. Cấu trúc của chitosan................................................................................... 12 1.2.2. Độ deacetyl chitosan .................................................................................... 13 1.2.3. Phân tử lượng của chitosan ......................................................................... 13 1.2.4. Một số tính chất của chitosan ...................................................................... 14 1.2.4.1. Khả năng kháng khuẩn, kháng nấm .......................................................... 14 1.2.4.3. Tính khử aldehyde của chitosan ................................................................ 16 1.2.4.4. Một số tính chất khác của chitosan ........................................................... 18 1.2.5. Quy trình sản xuất chitosan tổng quát từ phế liệu thủy sản bằng phương pháp hóa học........................................................................................................... 18 1.2.6. Một số ứng dụng của chitosan trong thực phẩm ......................................... 20 1.3. MỘT SỐ CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI ................................. 22 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 24 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ...................................................................................... 24 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................. 25 2.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát ................................................................. 25 2.2.2. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dung dịch chitosan tới khả năng khử aldehyde trong rượu. .................................................................. 27 2.2.3. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của độ deacetyl chitosan tới khả năng khử aldehyde trong rượu. .............................................................................. 29 2.2.4. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của trọng lượng phân tử chitosan tới khả năng khử aldehyde trong rượu. .................................................................. 31 2.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ............................................................................. 32 2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU............................................................................... 33 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................... 34 3.1. THÀNH PHẦN VÀ TÍNH CHẤT CỦA RƯỢU TRƯỚC KHI KHỬ ALDEHYDE ................. 34 iii 3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ DUNG DỊCH CHITOSAN ĐẾN KHẢ NĂNG KHỬ ALDEHYDE TRONG RƯỢU................................................................... 34 3.3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ĐỘ DEACETYL CHITOSAN ĐẾN KHẢ NĂNG KHỬ ALDEHYDE TRONG RƯỢU. ......................................................................... 37 3.4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA TRỌNG LƯỢNG PHÂN TỬ CHITOSAN ĐẾN KHẢ NĂNG KHỬ ALDEHYDE TRONG RƯỢU................................................................... 39 3.5. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH KHỬ ALDEHYDE TRONG RƯỢU BẰNG CHITOSAN. ............... 41 3.5.1. Sơ đồ quy trình: ............................................................................................ 41 3.5.2. Thuyết minh quy trình: ................................................................................. 42 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN ........................................................................... 43 KẾT LUẬN .................................................................................................................... 43 ĐỀ XUẤT Ý KIẾN .......................................................................................................... 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 44 PHỤ LỤC ....................................................................................................................... 47 iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Diễn giải CFU Colony Forming Units Cps Centipoises DD Degree of Deacetylation DH Degree of Hydrolysis TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam QCVN Quy chuẩn Việt Nam v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Yêu cầu cảm quan của rượu cồn. ..................................................................... 7 Bảng 1.2. Yêu cầu về thành phần hóa học của rượu cồn: ................................................ 7 Bảng 1.3. Quy định hàm lượng aldehyde tính theo acetaldehyde trong thực phẩm hoặc đồ uống trên thị trường Nhật Bản năm 1993 . ................................................................ 10 Bảng 1.4. Một số ứng dụng chính của chitosan và dẫn xuất trong thực phẩm . ............ 21 Bảng 2.1. Các tính chất ban đầu của chitosan ................................................................ 24 Bảng 3.1. Thành phần và tính chất của rượu trước khi khử aldehyde ........................... 34 vi DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Quy trình chế biến rượu truyền thống . .......................................................... 11 Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của chitosan . ...................................................................... 13 Hình 1.3. Phương trình phản ứng của chitosan và aldehyde . ........................................ 17 Hình 1.4. Phản ứng giữa chitosan với furfural aldehyde ............................................... 17 Hình 1.5. Cơ chế phản ứng giữa aldehyde và chitosan ................................................. 18 Hình 1.6. Quy trình sản xuất chitosan tổng quát từ phế liệu thủy sản .......................... 19 Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát ................................................................... 26 Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dung dịch chitosan tới khả năng khử aldehyde trong rượu. ............................................................ 28 Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của độ deacetyl chitosan tới khả năng khử aldehyde trong rượu. ................................................................................ 29 Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của trọng lượng phân tử chitosan tới khả năng khử aldehyde trong rượu. ............................................................ 31 Hình 3.1. Hiệu suất khử aldehyde trong rượu của từng nồng độ dung dịch chitosan.... 35 Hình 3.2. Hiệu suất khử aldehyde trong rượu của chitosan có độ DD khác nhau ......... 38 Hình 3.3. Hiệu suất khử aldehyde trong rượu của từng loại trọng lượng phân tử chitosan ............................................................................................................................ 40 Hình 3.4. Sơ đồ quy trình đề xuất khử aldehyde trong rượu bằng chitosan .................. 41 1 LỜI MỞ ĐẦU Rượu là một sản phẩm có từ lâu đời, mang tính truyền thống của nhiều dân tộc trên thế giới, đặc biệt rượu được sử dụng trong các dịp lễ hội, tết, đình đám, hay là một món quà giá trị để tặng người thân... Từ thời xa xưa con người đã biết làm nước uống bằng phương pháp lên men, tuy nhiên đến thế kỷ XVI việc sản xuất rượu mới trở thành một ngành công nghiệp, và cũng từ đó ngày càng có nhiều thành tựu khoa học kỹ thuật ứng dụng vào ngành công nghiệp này. Theo quan điểm về uống rượu của nhiều nhà khoa học: rượu (hay rượu ethanol) nói theo y học là chất độc đối với con người. Điều này không ai chối cãi và rất đúng, nhưng chỉ đúng khi uống quá liều lượng cho phép đối với mỗi người. Mặt khác, ngoài thành phần chính là ethanol, trong rượu còn có một số chất có giá trị dinh dưỡng như đường, các vitamin, một số nguyên tố vi lượng... Nếu thỉnh thoảng hoặc ngày một lần uống vào buổi tối không quá 50 ml (một chén uống trà) rượu ngâm thuốc bắc thì chúng ta sẽ ăn và ngủ cũng tốt hơn. Lúc đó rượu sẽ làm tăng sức khỏe, con người sẽ cảm thấy sảng khoái tinh thần, thậm chí minh mẫn hơn. Về mặt kinh tế, ngành sản xuất rượu là ngành có vốn đầu tư ban đầu ít, khả năng thu hồi vốn nhanh, đem lại lợi nhuận cao, vì vậy nhiều nước trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng đã và đang đầu tư phát triển ngành sản xuất rượu [6]. Ở nước ta, nghề nấu rượu đã có từ lâu đời trong dân gian. Ở miền núi, đồng bào dân tộc dùng gạo, ngô, sẵn nấu chín rồi cho lên men, men này được lấy từ lá cây hoặc cho men thuần khiết. Ở một số nơi khác, người ta nuôi cấy và phát triển nấm men, nấm mốc trong thiên nhiên trên môi trường thích hợp (gạo và một số vị thuốc bắc) để lên men rượu từ nguyên liệu tinh bột đã được nấu chín. Vì vậy nguồn nguyên liệu trong sản xuất rượu đã góp phần tạo nên nét đặc sắc cho sản phẩm của vùng đó, chẳng hạn như rượu Vân Hà – Đại Lâm thường gọi là rượu làng Vân (Hà Bắc), rượu cần Tây 2 Nguyên, rượu Bầu Đá (Bình Định), rượu nếp than (nếp cẩm), rượu Gò Đen ở Bến Lức – Long An,... Tất cả đều làm theo kinh nghiệm “cha truyền con nối” [6]. Việc nấu rượu truyền thống nếu thực hiện đúng thì rượu làm ra phải nói là uống rất ngon, vị đậm và êm dịu, say mà không cảm thấy sốc hoặc đau đầu. Tuy nhiên, hầu hết rượu truyền thống trước khi đưa ra bán trên thị trường chưa được đánh giá và nghiên cứu đầy đủ do đó chất lượng sản phẩm chưa đảm bảo và có thể ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe người sử dụng. Ở Việt Nam có khoảng 328 cơ sở sản xuất rượu quy mô lớn với sản lượng 360 triệu lít/năm, các hộ gia đình sản xuất ước tính khoảng 250 triệu lít/năm, trong đó 90% sản lượng là rượu nấu thủ công, chính vì vậy ẩn chứa rất nhiều nguy cơ cho sức khỏe. Nồng độ các chất độc trong rượu tự nấu cao hơn 30-80 lần so với các loại rượu do nhà máy sản xuất [1], [6]. Bên cạnh đó, aldehyde có rất nhiều trong rượu đầu, do vậy rượu càng mạnh thì hàm lượng aldehyde càng lớn. Acetaldehyde là thành phần chính chiếm trên 90% tổng lượng aldehyde trong rượu. Chất này làm trầm trọng thêm các bệnh liên quan đến rượu như loét dạ dày, huyết áp cao, rối loạn tâm thần, gan nhiễm mỡ và xơ gan, tiểu đường, vô sinh nam, đặc biệt là ung thư đường tiêu hóa như ung thư vòm họng, thực quản, dạ dày… Năm 1988, Cơ quan Quốc tế Nghiên cứu về ung thư IARC (International Agency for Research on Cancer), một bộ phận của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã xếp acetaldehyde có trong rượu là loại chất gây ung thư thuộc nhóm 1, là nhóm các chất gây ung thư ở người [21]. Theo cách truyền thống, để loại bỏ chất aldehyde, rượu được lọc qua một lớp than hoạt tính sạch. Lớp than này có tác dụng hấp thụ một số chất độc, trong đó có aldehyde. Tuy nhiên, đây là một cách làm thủ công, mất thời gian và có thể làm bẩn rượu, đồng thời có thể ảnh hưởng đến chất lượng cũng như cảm quan của rượu. Hơn nữa, phương pháp này khó khả thi khi lọc một lượng rượu lớn. 3 Nghiên cứu mới đây của một số nhà khoa học thì chitosan phản ứng với aldehyde tạo ra azometin, là một hợp chất không độc hại [3]. Chitosan là dẫn xuất của chitin – một polysaccharide có nhiều trong vỏ của các loài giáp xác. Chitosan có khả năng tạo thành màng mỏng, kết hợp với nước, chất béo, ion kim loại, có tính kháng khuẩn… vì vậy chitosan được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Nhưng ngay cả những đề tài khoa học đã công bố trong và ngoài nước cũng chỉ đề cập đến phản ứng giữa chitosan với aldehyde và sản phẩm tạo ra của phản ứng đó, chứ chưa ứng dụng để khử aldehyde trong một sản phẩm cụ thể, ví dụ như rượu. Chính vì vậy “nghiên cứu ứng dụng chitosan để khử aldehyde trong rượu” mang tính cấp thiết. Tên đề tài: Nghiên cứu ứng dụng dụng chitosan để khử aldehyde trong rượu. Nội dung của đề tài bao gồm: - Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chitosan đến khả năng khử aldehyde trong rượu. - Nghiên cứu ảnh hưởng của độ deacetyl chitosan đến khả năng khử aldehyde trong rượu. - Nghiên cứu ảnh hưởng của trọng lượng phân tử chitosan đến khả năng khử aldehyde trong rượu. Mục tiêu của đề tài: Nghiên cứu xây dựng quy trình khử aldehyde trong rượu bằng chitosan có DD, trọng lượng phân tử và nồng độ phù hợp. Ý nghĩa khoa học: - Tạo ra dẫn liệu khoa học có giá trị tham khảo cho sinh viên và cán bộ kỹ thuật trong ngành công nghệ thực phẩm. 4 - Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở để các nhà chế biến áp dụng giải pháp tương tự nhằm hạn chế có hiệu quả sự xuất hiện của độc chất aldehyde trong sản phẩm rượu. Ý nghĩa thực tiễn: - Tăng giá trị chất lượng của sản phẩm rượu cồn truyền thống. - Nâng cao khả năng cạnh tranh, đẩy mạnh phát triển cho các làng nghề sản xuất rượu truyền thống. - Đề cao yếu tố sức khỏe của người sử dụng. - Mở rộng thêm ứng dụng của chitosan vào các lĩnh vực khác nhau. 5 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Tìm hiểu về rượu cồn trắng truyền thống Rượu là đồ uống chứa cồn, được sản xuất từ quá trình lên men, có hoặc không chưng cất từ tinh bột của các loại ngũ cốc. Một số loại rượu được gọi tên như: rượu Đế, rượu Ngang, rượu Lậu, rượu Quốc Lủi...Tuy có các tên gọi rất đa dạng nói trên để chỉ bản chất của loại rượu chưng cất thủ công này, phần lớn các vùng miền cả nước hiện nay vẫn thường gọi tên rượu đơn thuần gắn với tên của địa phương sản xuất rượu (như “rượu Vọc”, “rượu Bình Khương Thôn”, “rượu Kim Sơn”, rượu làng Vân, “rượu Kim Long”, rượu Bầu Đá, rượu Mẫu Sơn, rượu Xuân Thạnh, rượu Phú Lộc, đế Gò Đen ...) đã tạo nên những thương hiệu rượu địa phương nức danh không chỉ với người dân trong nước mà còn cả người nước ngoài. Ngoài ra, cũng thường thấy rượu được gọi theo tên của nguyên liệu chính được sử dụng nấu rượu (như rượu nếp cái hoa vàng, rượu ba trăng, rượu ngô Bắc Hà, rượu nếp cẩm, rượu nếp hương, rượu mầm thóc ...). Một số loại rượu nấu thủ công đóng trong chai, bình và có nhãn mác sản phẩm có thể mang tên rượu vodka. Rượu cồn trắng hay còn được gọi là rượu etylic, ancol etylic, rượu ngũ cốc hay cồn, là một hợp chất hữu cơ, nằm trong dãy đồng đẳng của rượu metylic, dễ cháy, không màu, là một trong các rượu thông thường có trong thành phần của đồ uống chứa cồn. Trong cách nói dân dã, thông thường nó được nhắc đến một cách đơn giản là rượu [5], [6]. 1.1.1. Tính chất vật lý và hóa học của rượu Tính chất vật lý: Rượu là một chất lỏng, không màu, trong suốt, mùi thơm dễ chịu và đặc trưng, vị cay, nhẹ hơn nước (khối lượng riêng 0,7936 g/ml ở 15oC), dễ bay hơi, sôi ở nhiệt độ 78,39oC, hóa rắn ở -114,15oC, tan trong nước vô hạn, tan trong eter và cloroform, hút ẩm, dễ cháy, khi cháy không có khói và ngọn lửa có màu xanh da trời. Sở dĩ rượu tan 6 vô hạn trong nước và có nhiệt độ sôi cao hơn nhiều so với este hay aldehyde có khối lượng phân tử xấp xỉ là do sự tạo thành liên kết hydro giữa các phân tử rượu với nhau và với nước [8]. Rượu etanol có tính khúc xạ hơi cao hơn so với của nước, với hệ số khúc xạ là 1,36242 (ở λ=589,3 nm và 18,35°C). Tính chất hóa học : Rượu có đầy đủ các tính chất hóa học của ethanol. Phản ứng thế với kim loại kiềm, kim loại kiềm thổ: 2C2H5OH + 2Na → 2 C2H5ONa + H2 Phản ứng este hóa, phản ứng giữa rượu và acid với môi trường là acid sulfuric đặc nóng tạo ra este: C2H5OH + CH3COOH → CH3COOC2H5 + H2O Phản ứng loại nước như tách nước trong một phân tử để tạo thành olefin, trong môi trường acid sulfuric đặc ở 170oC: C2H5OH → C2H4 + H2O Hay tách nước giữa 2 phân tử rượu thành ether: C2H5OH + C2H5OH → C2H5-O- C2H5 + H2O [8]. 1.1.2. Thành phần hóa học của rượu cồn trắng Rượu có một số thành phần hóa học như sau: - Rượu etylic C2H5OH: 7-16 % V/V - Các acid tổng: các acid bay hơi: acid acetic; các acid hữu cơ: acid citric, acid ascorbic. - Chất khoáng: Cl-, SO42-, Na+, Mg2+… - Các hợp chất bay hơi: các aldehyde/acetaldehyde. - Các hợp chất Nitơ: protein, acid amin [5]. 7 Một số quy định về cảm quan và các thành phần hóa học có trong rượu: Bảng 1.1. Yêu cầu cảm quan của rượu cồn (TCVN 7043:2002) [14] Tên chỉ tiêu Yêu cầu Màu sắc Không màu hoặc trắng trong Mùi Mùi đặc trưng của nguyên liệu lên men, không có mùi lạ Vị Không có vị lạ, êm dịu Trạng thái Trong, không vẩn đục, không có cặn Bảng 1.2. Yêu cầu về thành phần hóa học của rượu cồn (QCVN 63:2010/BYT) [12] Tên chỉ tiêu 1. Độ cồn, phần trăm thể tích etanol ở 20 oC, không nhỏ hơn 2. Hàm lượng axit tổng số, tính theo axit axetic, mg/l cồn 100o, không lớn hơn 3. Hàm lượng este, tính theo etyl axetat, mg/l cồn 100o, không lớn hơn 4. Hàm lượng aldehyd, tính theo axetaldehyd, mg/l cồn 100o, không lớn hơn 5. Hàm lượng rượu bậc cao, tính theo Mức quy định 96 Phương pháp thử TCVN 8008:2009; AOAC 982.10 Phân loại chỉ tiêu A 15 TCVN 8012:2009; AOAC 945.08 B 13 TCVN 8011:2009; AOAC 968.09; AOAC 972.10 B 5 TCVN 8009:2009; AOAC 972.08; AOAC972.09 A 5 B 8 6. 7. 8. 9. metyl 2-propanol, mg/l cồn 100o, không lớn hơn Hàm lượng metanol, g/l cồn 100o, không lớn hơn Hàm lượng chất chiết khô, mg/l cồn 100o, không lớn hơn Hàm lượng các chất dễ bay hơi có chứa nitơ, tính theo nitơ, mg/l cồn 100o, không lớn hơn Hàm lượng furfural 0,5 TCVN 8010:2009;AOAC 972.11 A 15 AOAC 920.47; EC No. 2870/2000 (Annex I) B 1 Không phát hiện B TCVN 7886:2009; AOAC 960.16 A 1.1.3. Tác hại của rượu đến sức khỏe con người Tác hại của rượu là do một số chất có độc tính tồn tại bên trong, cụ thể: Độc tính Ethanol: Việc sử dụng một lượng vừa phải ethanol thì không có hại cho cơ thể nhưng một lượng lớn rượu chứa ethanol có thể dẫn đến tình trạng say rượu hay ngộ độc cấp tính và các tình trạng nguy hiểm cho sức khỏe như: nôn ọe, khó thở do thiếu oxi, đột tử hoặc tình trạng nghiện rượu dẫn đến tổn thương gan, não nếu sử dụng thường xuyên [5]. Độc tính Methanol: Methanol rất độc, chỉ một lượng nhỏ xâm nhập vào cơ thể cũng có thể gây mù lòa, lượng lớn hơn có thể gây tử vong [5]. Độc tính Aldehyde: Khi uống rượu vào, rượu được hấp thụ qua niêm mạc ruột vào máu, tới gan dưới tác động của men alcol dehydrogenase, rượu được aldehyde hóa và chuyển thành acetaldehyde, acetaldehyde là một chất rất độc, là tác nhân gây ra các bệnh liên quan đến việc sử dụng rượu như: ung thư gan, xơ gan, hội chứng tim mạch, 9 dạ dày, tổn thương não, thay đổi sinh lý, tâm lý, suy giảm các chức năng tư duy, chức năng sinh dục và nhiều chức năng khác. Acetaldehyde là một chất oxy hóa mạnh, gây tổn thương cấu trúc dẫn tới rối loạn chức năng của các tế bào, tổ chức. Nếu uống một lượng rượu vừa phải, lượng acetaldehyde tạo ra mà cơ thể đủ khả năng phân hủy thì sẽ không gây ra các tác hại. Mặt khác, khi acetaldehyde được tạo ra chúng bị một men có tên là aldehyde dehydrogenase-2 chuyển hóa thành acid acetic thông qua phản ứng khử hydro. Acid acetic trong điều kiện có oxy sẽ chuyển hóa thành acetyl-CoA và đi và đi vào chu trình Krebs và sản phẩm chuyển hóa cuối cùng là tạo ra CO2 và H2O được thải ra ngoài qua đường tiết niệu và đường hô hấp [5], [6]. Có thể nói, độc tính aldehyde là rất mạnh, đe dọa trực tiếp tới sức khỏe của người sử dụng rượu. Đáng báo động hơn khi theo công bố của Viện Vệ sinh Y tế Công cộng Thành phố Hồ Chí Minh (Bộ Y tế) (2012) trong 54 mẫu rượu không nhãn mác ở Thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận thì có tới 47 mẫu rượu chứa aldehyde vượt mức cho phép. Không chỉ rượu thủ công, kết quả kiểm nghiệm cũng cho thấy rượu xịn, rượu có mác ngoại cũng chứa hàm lượng aldehyde rất cao [6]. Chính vì vậy, cần có những phương pháp loại bỏ aldehyde trong rượu để đảm bảo tính an toàn về sức khỏe cho người sử dụng. Một số phương pháp thường dùng để loại aldehyde trong rượu: Phương pháp 1: Sử dụng máy lọc rượu: Rượu cho chạy qua máy lọc có tác dụng lọc bỏ, giảm bớt các tạp chất, aldehyde, methanol, ethanol, este, mùi ngái, nồng, váng cặn trong rượu để rượu đạt các chỉ tiêu hoá học đảm bảo tiêu chuẩn rượu đóng chai. Nhưng chi phí lắp đặt máy lọc rượu cao không phù hợp với quy mô sản xuất hộ gia đình. Phương pháp 2: Sử dụng than hoạt tính: khi sử dụng rượu, muốn loại bỏ aldehyde người ta có thể lọc qua lớp than hoạt tính sạch. Bởi than này có tác dụng hấp thụ chất độc, khi rượu chứa aldehyde chảy qua cũng được lọc sạch. Tuy nhiên, đây được xem là một cách thủ công, mất thời gian và có thể làm bẩn rượu, ảnh hưởng đến 10 chất lượng cũng như cảm quan của rượu, đặc biệt khi cần dùng đến một lượng rượu lớn và cũng không thể kiểm chứng được hàm lượng aldehyde còn lại sau khi lọc. Để biết một mẫu rượu có chứa aldehyde với hàm lượng vượt quá mức cho phép hay là được chấp nhận hay không, chúng ta có thể tham khảo một số quy định trong nước và quốc tế sau. Một số quy định về hàm lượng aldehyde trong rượu/đồ uống chứa cồn: - Ở Việt Nam: QCVN 6-3:2010/BYT “Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về các sản phẩm đồ uống chứa cồn” quy định: Hàm lượng aldehyde tính theo acetaldehyde, mg/l cồn 100o không lớn hơn 5 [12]. - Quốc tế: Ở Nhật Bản: Quy định về hàm lượng aldehyde trong rượu/đồ uống chứa cồn được quy định tại Bảng 1.3. Bảng 1.3. Quy định hàm lượng aldehyde tính theo acetaldehyde trong thực phẩm hoặc đồ uống trên thị trường Nhật Bản năm 1993 [24] Thực phẩm Hàm lượng Thể tích/sản Hàm lượng hoặc đồ uống acetaldehyde phẩm acetaldehyde (mg) (ppm) Sake I 60,2 375 ml/chai 22,6 Sake II 14,8 375 ml/chai 5,54 Sake III 23,5 375 ml/chai 8,8 Sake IV 23,4 375 ml/chai 8,76 Sake V 36,0 375 ml/chai 13,5 “Rượu Sake là một thứ rượu nhẹ truyền thống nấu từ gạo qua nhiều công đoạn lên men của người dân Nhật Bản”. 1.1.4. Quy trình sản xuất rượu truyền thống Sau đây là quy trình chế biến rượu truyền thống thông dụng nhất: 11 Trước tiên là chuẩn bị nguyên liệu: Trong sản xuất rượu ở nước ta , gạo là nguyên liệu thường được sử dụng nhiều nhất. Rượu nấu từ các loại gạo khác nhau thì cho ra chất lượng khác nhau, ví dụ gạo tẻ nấu chất lượng sẽ không thơm và ngọt bằng khi nấu với gạo nếp nhưng đổi lại giá thành sẽ rẻ hơn rất nhiều với cùng 1 quy trình đó. Theo kinh nghiệm, rượu nấu từ gạo nếp là ngon nhất, khi uống cho cảm giác êm nồng, thơm ngon, đằm thắm. Nguyên liệu thứ 2 vô cùng quan trọng tới đó là men 36 vị thuốc bắc, thông thường ở một số vùng miền khác chỉ là men 8 - 10 vị. Nguyên liệu Xử lý nguyên liệu Nấu chín Làm nguội Trộn men Bánh men Lên men hở Lên men kín Chưng cất Bã hèm chăn nuôi Rượu Hình 1.1. Quy trình chế biến rượu truyền thống [6] 12 Tiếp theo là công đoạn nấu nguyên liệu và trộn men, mục đích của quá trình nấu nguyên liệu là nhằm phá vỡ màng tế bào của tinh bột, chuyển tinh bột thành trạng thái hòa tan trong dung dịch. Nguyên liệu sau khi nấu được bỏ ra nong, mành sạch, để nguội đến 30-35o thì rắc bột men vào, trộn đều. Tỉ lệ men so với lượng gạo rơi vào khoảng từ 3-7% khối lượng. Sau đó là công đoạn lên men, công đoạn này bao gồm lên men hở và lên men kín. Lên men hở là quá trình tạo điều kiện cho enzyme amylase của nấm mốc và vi khuẩn xúc tác thủy phân tinh bột. Cơm đã trộn men được đem ủ trong khoảng 5-10 giờ để mốc mọc cả khối cơm, sau đó vun thành đống, phủ kín bằng vải và giữ ở nơi thoáng mát nhiệt độ 28-32o trong 3-4 ngày có thể sớm hoặc muộn hơn 1-2 ngày tùy vào thời tiết. Lên men kín là quá trình nấm men sử dụng đường tạo ra để lên men rượu. Khi cơm rượu có mùi thơm nhẹ của rượu, ăn thấy ngọt, có hơi cay vị của rượu thì chuyển sang ủ trong chum vại kín với nước sạch theo tỷ lệ 1 phần gạo với 2-3 phần nước. Thời gian ủ kéo dài khoảng 12-15 ngày đối với đáy chìm và 18-22 ngày đối với đáy nổi và có thể sớm hoặc muộn hơn 1-2 ngày tùy vào thời tiết. Tiếp theo là công đoạn chưng cất cơm rượu sau khi đã kết thúc quá trình lên men kín và thu được rượu trắng truyền thống. Với 10 kg gạo chỉ rút được 3-5 lít rượu thậm chí có những hôm thời tiết oi bức chỉ rút được tối đa 2 lít, với những người mới vào nghề gặp thời tiết như thế có thể phải mất trắng nồi rượu [5], [6]. 1.2. Chitosan và ứng dụng 1.2.1. Cấu trúc của chitosan Chitosan là polysacaride mạch thẳng, được hình thành từ quá trình deacetyl chitin, trong đó nhóm (–NH2) thay thế nhóm (-COCH3) ở vị trí C(2) do vậy chitosan được cấu tạo từ các mắt xích D-glucozamin liên kết với nhau bởi các liên kết β-(1-4)glicozit. Chitosan được phát hiện lần đầu tiên bởi Rouget vào năm 1859. Chitosan thường ở dạng vảy hoặc dạng bột có màu trắng ngà. Công thức cấu tạo của chitosan 13 gần giống như chitin và cellulose, chỉ khác là chitosan chứa nhóm amin ở cacbon thứ 2 [18]. Chitosan có nhiều tính chất hóa học và sinh học quan trọng (hoạt tính kháng khuẩn, chống oxy hóa…), các tính chất của chitosan phụ thuộc lớn vào độ deacetyl và trọng lượng phân tử. Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của chitosan [18] 1.2.2. Độ deacetyl chitosan Độ deacetyl (DD) của chitosan là một thông số quan trọng, hoặc độ acetyl hóa (DA=100-DD), đặc trưng cho tỉ lệ giữa 2-acetamido-2-deoxy-D-glucopyranose với 2amino-2-deoxy-D-glucopyranose trong phân tử chitosan. Chitosan có độ deacetyl cao, tức là chứa nhiều nhóm amino [18]. Chitosan có độ DD khác nhau dẫn đến sự khác nhau về khối lượng phân tử, độ nhớt, khả năng hòa tan trong acid... Ngoài độ deacetyl thì sự phân bố của các nhóm glucosamine cũng ảnh hưởng đến tính chất của chitosan. 1.2.3. Phân tử lượng của chitosan Phân tử lượng của chitosan là một thông số cấu trúc quan trọng, nó quyết định tính chất của chitosan như khả năng kết dính, tạo màng, tạo gel, khả năng hấp phụ chất màu, đặc biệt là khả năng ức chế vi sinh vật. Chitosan có phân tử lượng càng lớn thì có độ nhớt càng cao. Thông thường, phân tử lượng của chitosan nằm trong khoảng từ 14 100.000 Dalton đến 1.200.000 Dalton (Li và cộng sự, 1997). Phân tử lượng của chitosan phụ thuộc vào nguồn chitin và điều kiện deacetyl và thường rất khó kiểm soát. Tuy nhiên, chitosan có phân tử lượng thấp thì thường có hoạt tính sinh học cao hơn, thường có nhiều ứng dụng trong nông nghiệp, y học và công nghệ sinh học. Chitosan có phân tử lượng lớn có khả năng tạo màng tốt và màng chitosan tạo thành có sức căng tốt. Độ nhớt của chitosan phụ thuộc vào phân tử lượng. Chitosan có phân tử lượng thấp có độ nhớt từ 30-200 cps và chitosan có phân tử lượng lớn hơn 1 triệu Dalton có độ nhớt lên đến 3.000-4.000 cps. Ngoài ra, độ nhớt của chitosan còn phụ thuộc vào độ deacetyl, cường độ ion, pH, nhiệt độ [18]. 1.2.4. Một số tính chất của chitosan Chitosan là chất rắn màu trắng đến trắng ngà, xốp, không mùi vị và có thể xay hoặc nghiền nhỏ. Chitosan không tan trong nước, dung dịch kiềm và phần lớn các dung môi hữu cơ nhưng lại có khả năng tan trong dung dịch acid hữu cơ và vô cơ. Độ nhớt của chitosan trong acid phụ thuộc vào mức độ deacetyl hóa. Độ nhớt của chitosan với DD = 100 là 10.800 cm3/g. Chitosan có nhiệt độ nóng chảy 309 – 311oC. 1.2.4.1. Khả năng kháng khuẩn, kháng nấm Chitosan có khả năng ức chế nhiều chủng vi sinh vật: vi khuẩn Gram âm, vi khuẩn Gram dương và vi nấm. Khả năng ức chế vi sinh vật của chitosan phụ thuộc vào độ deacetyl, phân tử lượng. So với chitin, chitosan có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm tốt hơn vì chitosan tích điện dương ở vị trí cacbon thứ 2 ở pH nhỏ hơn. Chitosan có độ deacetyl cao trên 85% thì có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm tốt. Chitosan có phân tử lượng dưới 2.000 Dalton thì khả năng ức chế vi sinh vật kém. Chitosan có phân tử lượng trên 9.000 Dalton thì có khả năng ức chế vi sinh vật cao (Jeon và cộng sự, 2000) [22]. Tuy nhiên, chitosan có phân tử lớn thì khả năng kháng khuẩn cũng thấp. Chitosan được hòa tan trong các dung môi hữu cơ như acid acetic, acid lactic và được sử dụng để xử lý kháng khuẩn, kháng nấm. 15 Chitosan có khả năng ức chế Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula glutensis, Botrytis cinerea, Rhizopus stolonifer, Aspergillus niger. Nồng độ ức chế của chitosan phụ thuộc vào loại chitosan, loài vi sinh vật, điều kiện áp dụng và thường sử dụng trong khoảng 0,0075% đến 1,5%. Ngoài ra, các dẫn xuất của chitosan cũng có khả năng kháng nấm, kháng khuẩn tốt. N-carboxymethylchitosan ở nồng độ 0,1-5 mg/ml trong môi trường pH=5,4 làm giảm khả năng sinh độc tố aflatoxin của Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus (Shahidi và cộng sự, 1999) [18]. 1.2.4.2. Khả năng chống oxy hóa của chitosan Chitosan còn có khả năng chống oxy hóa. Khả năng chống oxy hóa của chitosan cũng phụ thuộc vào độ deacetyl, phân tử lượng và độ nhớt của chitosan. Chitosan có độ nhớt thấp thì có khả năng chống oxy hóa cao. Cơ chế chống oxy hóa của chitosan có thể giải thích bằng nhiều cơ chế khác nhau: - Park và cộng sự (2004) cho rằng chitosan có thể khử các gốc tự do khác nhau do tác động của nitơ vào vị trí cacbon số 2 của chitosan. - Xie và cộng sự (2001) báo cáo rằng cơ chế xử lý của chitosan có liên quan đến một thực tế là các gốc tự do có thể phản ứng với các ion hydro từ các ion amoni NH3+ để tạo thành một phân tử ổn định. Các NH3+ được hình thành bởi các nhóm amin hấp thụ một ion hydro từ các dung dịch [27]. - Jeon và cộng sự (2002) cũng cho rằng cơ chế chống oxy hóa của chitosan có thể là do hoạt tính tạo phức với các ion kim loại hoặc do chitosan kết hợp với lipid. Màng chitosan cũng thể hiện tác dụng hạn chế oxy hóa lipid do màng chitosan làm rào cản đối với oxy [22]. - Trần Thị Luyến cho rằng do các nhóm amino của phân tử chitosan có thể kìm hãm sự oxy hóa lipid, do tác động kìm hãm vậy nên mới hạn chế được sự hoạt động oxy hóa của nhóm kim loại [9]. 16 1.2.4.3. Tính khử aldehyde của chitosan Tính khử aldehyde của chitosan phụ thuộc vào đặc tính của chitosan (độ DD, khối lượng phân tử), nồng độ aldehyde, hàm lượng chitosan dùng và pH của dung dịch. Tính chất hóa lý của chitosan phụ thuộc vào pH của dung dịch theo cân bằng sau: Theo đó, nhóm –NH2 có tính base và ở pH< 6,3 chitosan bị proton hóa (-NH3+) tạo thành polyelectrolyte cation và tan trong nước. Ở dạng này, chitosan khó phản ứng. Ở pH >7, chitosan bị đề proton, cặp electron không liên kết của nitơ dễ dàng thực hiện các phản ứng hóa học với aldehyde hoặc acid alhydride. Cơ chế khử aldehyde của chitosan: Chitosan là một poly-2-amino-D-glucose. Trong phân tử có các nhóm chức alcol bậc 1, alcol bậc 2, nhóm amino; trên nguyên tử Nitơ oxy có đôi điện tử không phân chia do đó chúng đóng vai trò tác nhân nucleophin. Nhóm amino của chitosan có khả năng phản ứng với các aldehyde tạo ra các azometin của chitosan. “Phản ứng azometin hóa chitosan là loại phản ứng có tính chọn lọc cao so với các phản ứng biến tính khác thực hiện trên khung phân tử chitosan vì chỉ có nhóm amino mới tham gia phản ứng với nhóm aldehyde tạo ra hợp chất azometin. Chitosan có nhóm chức amino nên chitosan có khả năng phản ứng với các aldehyde tạo ra azometin của chitosan”. Azometin là những chất có cấu trúc (-CH=N-) thường không bền do khuynh hướng polyme hóa, ngưng tụ hoặc thủy phân. Dạng mạch hở thường không bền, không thể tách ra thành dạng tự do. Các azometin có cấu trúc thế thì 17 bền vững hơn azometin có cấu trúc không thế. Với các azometin thế ở N (dãy N-alkyl hóa hoặc N-aryl hóa) cấu trúc R-CH=N-R’ thì gốc R là mạch hở thường là chất lỏng và kém bền, trong đó cấu trúc CH2=N-R’ tồn tại ở trạng thái trimer hóa song cấu trúc của nó là một dị vòng, các chất khác nhanh chóng bị trùng hóa [3], [13]. Azometin (Schiff Base) đã được các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu từ lâu và được xem là một hợp chất không độc hại, không chỉ được sử dụng như một hợp chất trung gian để tổng hợp một số hợp chất dị vòng chứa N hay tổng hợp ßaminoceton mà chính bản thân nó cũng có một số tác dụng sinh học như kháng khuẩn, kháng nấm, điều trị lao, hủi, lợi tiểu... Ngoài ra, azometin có thể tham gia xúc tác phản ứng trong quá trình đường phân và trong sự trao đổi chất của các acid amin [3]. Như vậy, phản ứng khử aldehyde của chitosan tạo ra sản phẩm là một hợp chất có lợi cho sức khỏe. Phương trình phản ứng: Hình 1.3. Phương trình phản ứng của chitosan và aldehyde [3] Trong đó, R có thể là aryl, alkyl hay gốc dị vòng. Ví dụ: phản ứng giữa chitosan với furfural aldehyde Hình 1.4. Phản ứng giữa chitosan với furfural aldehyde [3] 18 Nói về cơ chế phản ứng giữa aldehyde và chitosan có thể được biểu diễn qua sơ đồ sau: Hình 1.5. Cơ chế phản ứng giữa aldehyde và chitosan [3] 1.2.4.4. Một số tính chất khác của chitosan Ngoài các tính chất nêu trên, chitosan còn có thể gắn kết tốt với lipid, protein, các chất màu. Do chitosan không tan trong nước nên chitosan ổn định hơn trong môi trường nước so với các polyme tan trong nước như alginate, agar. Khả năng tạo phức, hấp phụ với lipid, protein và chất màu phụ thuộc nhiều vào phân tử lượng, độ deacetyl hóa, độ rắn và độ tinh khiết của chitosan và thường biến động lớn với các mẫu chitosan. Chitosan có độ deacetyl cao thì thường hấp phụ màu tốt [18]. 1.2.5. Quy trình sản xuất chitosan tổng quát từ phế liệu thủy sản bằng phương pháp hóa học Nguyên liệu đưa vào quy trình có thể là tôm, cua, ghẹ… Trước khi thực hiện công đoạn khử protein, cần phải rửa sạch nguyên liệu, loại bỏ tạp chất. Đây là bước cần thiết để nâng cao hiệu quả của quá trình xử lý tiếp theo và chất lượng của chitosan. Quá trình protein được thực hiện hoặc bằng ngâm trong Na2CO3 hoặc NaOH. Nồng độ NaOH xử lý tùy vào từng loại nguyên liệu và điều kiện xử lý, thông thường NaOH gấp 4-5 lượng nguyên liệu. Nếu áp dụng nhiệt độ cao thì có thể giảm nồng độ NaOH xử lý. 19 Nguyên liệu Khử protein bằng NaOH Rửa trung tính Khử khoáng bằng HCl Rửa trung tính Tẩy màu bằng NaOCl hoặc H2O2 Rửa Sấy Chitin Deacetyl trong NaOH đặc Rửa trung tính Sấy Chitosan Hình 1.6. Quy trình sản xuất chitosan tổng quát từ phế liệu thủy sản [18] 20 Tiếp theo là công đoạn khử khoáng, thông thường quá trình này được thực hiện trong dung dịch HCl gấp 4-5 lượng nguyên liệu, quá trình khử khoáng thường diễn ra rất nhanh trong giai đoạn đầu của quá trình xử lý nên cần khuấy đảo tốt để phản ứng diễn ra đồng đều. Lưu ý, quá trình khử khoáng ảnh hưởng mạnh đến chuỗi chitin và chitosan thu được nên cần phải kiểm soát tốt điều kiện xử lý cho phù hợp. Công đoạn khử khoáng có thể thực hiện trước công đoạn khử protein và ngược lại, tuy nhiên cần phải tính ảnh hưởng của các quá trình này đến chất lượng của chitin và chitosan. Quá trình khử acetyl được tiến hành với các điều kiện xử lý khác nhau nên cho ra các sản phẩm chitosan cuối cùng với tính chất rất đa dạng. Quá trình rửa cần được đặc biệt chú ý vì nếu rửa không đạt yêu cầu, một lượng acid và xút còn lại sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả quá trình xử lý sau và chất lượng của chitosan thành phẩm. Chitosan có thể được làm khô bằng cách phơi nắng hoặc sấy khô ở nhiệt độ 50-60oC [18]. 1.2.6. Một số ứng dụng của chitosan trong thực phẩm Hiện nay chitosan được sử dụng rất phổ biến trong sản xuất thực phẩm. Có thể sử dụng để thu hút nước và chất béo (quá trình nhũ hóa), quá trình đồng hóa, kết hợp với thuốc nhuộm, quá trình đông đặc. Chitosan cũng được chứng minh là có khả năng tạo dạng màng mỏng để sử dụng như là những lớp màng mỏng hoặc những lớp bao không độc hại (có thể ăn được). Màng bao chitosan có thể cải thiện khả năng bảo quản các loại thực phẩm dễ bị thối rữa bằng cách giảm lượng không khí bên trong bao gói cũng như giảm quá trình thoát hơi nước [11]. - Có thể nhúng trực tiếp thực phẩm vào dung dịch chitosan pha sẵn rồi để khô, tạo thành một lớp màng mỏng tự nhiên trên bề mặt sản phẩm: trứng, thịt cá, rau quả, giá đỗ, bánh gạo, nhúng cải bắp trước khi làm kim chi... - Hoặc cũng có thể tạo thành màng trước rồi mới cho sản phẩm vào: bánh mì, xúc xích... 21 - Hoặc cho chitosan trực tiếp vào sản phẩm dạng lỏng: xử lý nước quả, làm trong giấm, bảo quản tàu hũ, đồng hóa sữa, kem và mayonaise... Một số ứng dụng chính của chitosan trong công nghệ thực phẩm được trình bày ở Bảng 1.4. Bảng 1.4. Một số ứng dụng chính của chitosan và dẫn xuất trong thực phẩm [18] Ứng dụng Đối tượng Loại Dạng Tạo màng, chống biến nâu, Dâu Chitosan Dung dịch chống mất nước, hạn chế hao Vải Chitosan Dung dịch hụt trọng lượng, kháng nấm, Nhãn Chitosan Dung dịch bảo quản trái cây, rau Na Chitosan Dung dịch Xoài, thanh long, Chitosan Dung dịch Rau diếp Chitosan Dung dịch Kháng khuẩn, kháng nấm, Thịt bò tẩm gia Chitosan Dung dịch chống oxy hóa trong bảo vị quản và chế biến thịt, cá, đậu Xúc xích heo Chitosan Màng phụ, bánh mì Xúc xích gà Oligoglucosamin Bột Cá Chitosan Dung dịch Mực một nắng Chitosan Dung dịch Trứng gà Chitosan Dung dịch Nước táo ép Chitosan Dung dịch Đậu phụ Chitosan Dung dịch Bánh mì Chitosan Dung dịch Nước táo, nước Chitosan Dung dịch cà rốt cắt lát surimi Chitosan làm chất trợ lắng, 22 làm trong trong công nghệ vải, nước cà sản xuất nước quả và rượu chua, rượu 1.3. Một số công trình nghiên cứu liên quan đến đề tài Những nghiên cứu trong và ngoài nước tập trung chủ yếu vào việc tổng hợp dẫn xuất giữa chitosan và aldehyde. Nguyễn Thị Huệ và Đỗ Sơn Hải (2006) [4], đã tổng hợp một số azometin của chitosan với một số aldehyde thơm: benzaldehyde, p-nitro, p-metoxi-benzaldehyde. Phương trình phản ứng: Trong đó X = -H, -NO2, -OCH3 R. Muzzarelli (1994) đã công bố công trình điều chế một loạt các azometin của chitosan với các aldehyde: salixylaldehyde, veratraldehyde, vanillin, syrinaldehyde, xeton thơm và axetolvainilon. R. Andreas (2000) đã tổng hợp một loạt azometin của chitosan với các aldehyde béo: focmaldehyde, propionaldehyde, capronaldehyde, phenylpropionaldehyde, với aldehyde thơm N-benzaldehyde [3]. Các công trình này chỉ nghiên cứu chế tạo dẫn xuất của chitosan với aldehyde là những dẫn xuất có lợi cho khoa học. Ngoài ra, Chung Chin Yu, Kuang Hsuan Yang, Y chuan Liu, Bo Chuen Chen (2010) đã nghiên cứu công trình “Chế tạo kích thước các hạt nano vàng và ứng dụng xúc tác phản ứng phân hủy acetaldehyde của chitosan”. Trong công trình này, các nhà khoa học đã nghiên cứu kích thước các hạt nano vàng gắn trên chitosan trong dung dịch để xúc tác cải thiện khả năng phân hủy acetaldehyde ở nhiệt độ phòng. 23 Keng Liang Ou, Ting Chu Hsu, Yu Chuan Liu, Kuang Hsuan Yang (2013) đã nghiên cứu “Chiến lược phát hiện hiệu quả các acetaldehyde bằng cách sử dụng tăng cường bề mặt tán xạ Raman của hạt chitosan có cấu trúc Nano vàng”. Các nhà nghiên cứu cho rằng sự hiện diện của acetaldehyde trong cơ thể có thể gây nguy hại cho gan. Thông thường, nồng độ của acetaldehyde được đo bằng cách sử dụng sắc ký khí khối phổ. Phát triển công nghệ phân tích mới cho việc phát hiện acetaldehyde sẽ tăng cường sự an toàn đối với con người. Trong công trình này, các nhà nghiên cứu đã tăng cường bề mặt tán xạ Raman lên hạt chitosan bằng cách sử dụng các chu trình oxy hóa khử điện hóa để tập trung và phát hiện acetaldehyde. Tuy nhiên, acetaldehyde có thể phản ứng với cấu trúc nano trên hạt chitosan để tạo thành một Schiff Base. Các công trình nghiên cứu này chủ yếu tập trung vào việc thúc đẩy phản ứng giữa chitosan với acetaldehyde bằng cách bổ sung các chất xúc tác là các hạt nano vàng. Điều này đòi hỏi một trình độ khoa học kỹ thuật hiện đại tiên tiến, trong bối cảnh của Việt Nam cũng như điều kiện thí nghiệm của Trường Đại học Nha Trang thì không thể áp dụng được. Ngoài ra, những nghiên cứu trên chưa đưa kết quả ứng dụng vào một sản phẩm thực phẩm cụ thể như rượu, bia, đồ uống có cồn… Như đã đề cập, đề tài này không chỉ nghiên cứu phản ứng giữa chitosan với aldehyde mà còn ứng dụng phản ứng đó hay nói cách khác chính là việc ứng dụng chitosan để khử aldehyde vào một sản phẩm cụ thể đó là rượu cồn trắng truyền thống, sản phẩm mà có sự tồn tại của aldehyde trong dung dịch của nó. Đây có thể coi là một đề tài khoa học hoàn toàn mới. Ngoài ra, chúng ta còn biết được nồng độ, loại chitosan được sử dụng như thế nào để khử aldehyde với hiệu suất cao nhất. 24 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Rượu cồn: rượu cồn được mua tại gia đình chị Hoàng Thị Tâm Địa chỉ: Phước Lợi – Phước Đồng – Thành Phố Nha Trang Chitosan: chitosan dùng trong nghiên cứu được nhóm sinh viên chúng tôi trực tiếp sản xuất theo phương pháp hóa học từ nguyên liệu vỏ tôm. Chitosan thành phẩm có dạng vảy, màu trắng ngà. Các tính chất ban đầu của chitosan được phân tích và kết quả được trình bày trong Bảng 2.1. Bảng 2.1. Các tính chất ban đầu của chitosan Chỉ tiêu Kết quả Độ ẩm (%) 10 Độ tan (%) 98,7 Độ đục (FTU) 9 DD (%) 70-75 Độ nhớt (cps) 3250 Trọng lượng phân tử (KDal) Hàm lượng protein (%) ≥ 1000 3,3 Kết quả cho thấy chitosan có khả năng hòa tan rất tốt trong dung dịch acid acetic 1%. Với độ nhớt > 3000 centipoises chứng tỏ mẫu chitosan này có trọng lượng phân tử ≥ 1000 KDal. Như vậy, để có được các mẫu chitosan có trọng lượng phân tử thấp và trung bình chúng ta phải thực hiện các công đoạn cắt mạch tiếp theo. Cũng như DD 25 nằm trong khoảng 70-75%, phải thực hiện các công đoạn deacetyl tiếp theo để mẫu chitosan có DD cao hơn. Hóa chất: Các loại hóa chất được sử dụng nhiều như: acid acetic (CH3COOH), acid sunfuric (H2SO4), Ethanol 95% (theo thể tích), Fuchsin gốc, Na2S2O5, dung dịch acetaldehyde tiêu chuẩn. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát Thuyết minh sơ đồ: Rượu sau khi được mua về từ gia đình chị Hoàng Thị Tâm, Phước Lợi – Phước Đồng – Thành Phố Nha Trang được đem đi đo độ cồn và hàm lượng aldehyde có bên trong. Sau đó tiến hành đánh giá cảm quan sơ bộ mẫu rượu này về các yếu tố như độ đục độ trong, mùi vị, trạng thái dòng chảy. Kết quả đo được ghi chép lại để làm kết quả đối chứng. Chitosan sau khi được sản xuất xong phải được tiến hành xác định các thông số tính chất ban đầu như độ DD, trọng lượng phân tử, độ ẩm… Cân chính xác khối lượng chitosan, hòa tan trong dung dịch acid acetic 1%. Dùng máy đo pH để xác định pH của dung dịch chitosan vừa pha, điều chỉnh về pH=3-6,2 bằng dung dịch NaOH hoặc HCl. Sau đó, lấy 3 bình định mức, cho vào mỗi bình định mức 100 ml rượu. Cho tiếp dung dịch chitosan với cùng một thể tích vào 3 bình định mức trên, đậy nút lại và lắc đều rồi để yên ở điều kiện phòng thí nghiệm trong thời gian 24h. Mục đích của công đoạn này là xác định được nồng độ xử lý, độ DD, trọng lượng phân tử chitosan thích hợp nhất để khả năng khử aldehyde là tối ưu nhất. Sau 24h, lấy rượu ở 3 bình định mức đem đi đo lại độ cồn và hàm lượng aldehyde còn lại bên trong. Tiến hành đánh giá lại các yếu tố cảm quan. Đối chiếu với kết quả đối chứng rồi đánh giá khả năng khử aldehyde trong rượu của chitosan. Từ đó đề xuất quy trình khử hợp lý. 26 Rượu Bổ sung chitosan để khử aldehyde trong rượu ở nhiệt độ phòng trong 24h Xác định nồng độ chitosan thích hợp Xác định độ DD chitosan thích hợp Xác định phân tử lượng chitosan thích hợp Đánh giá khả năng khử aldehyde của chitosan, thông qua: - Đo độ cồn trong rượu - Đo hàm lượng aldehyde trong rượu Đề xuất quy trình thích hợp Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát Kết quả mong đợi: - Xác định được loại chitosan với nồng độ xử lý thích hợp nhất để khử aldehyde thông qua hiệu suất khử, loại nào có hiệu suất khử cao hơn thì lựa chọn. - Hàm lượng aldehyde trong rượu sau khi xử lý biến mất hoàn toàn hoặc giảm về mức thấp. 27 - Các yếu tố như cảm quan của rượu không thay đổi hoặc thay đổi rất ít khi xử lý rượu bằng chitosan. 2.2.2. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dung dịch chitosan tới khả năng khử aldehyde trong rượu. Mục đích thí nghiệm: xác định được nồng độ dung dịch chitosan thích hợp nhất để khử aldehyde trong rượu với hiệu quả tối ưu nhất. Thuyết minh sơ đồ: Rượu sau khi được mua về từ gia đình chị Hoàng Thị Tâm, Phước Lợi – Phước Đồng – Thành Phố Nha Trang được đem đi đo độ cồn và hàm lượng aldehyde có bên trong. Sau đó tiến hành đánh giá cảm quan sơ bộ mẫu rượu này về các yếu tố như độ đục độ trong, mùi vị, trạng thái dòng chảy. Kết quả đo được ghi chép lại để làm kết quả đối chứng. Sau đó, hòa tan 0,33 g chitosan trong 30 ml acid acetic 1% thành dung dịch chitosan 1% (tương đương 10.000 ppm). Dùng máy đo pH hoặc giấy đo pH để xác định pH của dung dịch chitosan vừa pha, điều chỉnh về pH=3-6,2 bằng dung dịch NaOH hoặc dung dịch HCl. Lấy 7 bình định mức, cho vào lần lượt mỗi bình định mức 100 ml rượu, đánh số thứ tự để dễ dàng phân biệt. Thêm lần lượt từng thể tích dung dịch chitosan tương ứng với các nồng độ 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100 ppm vào 7 bình định mức trên. Đậy nút bình định mức, trộn đều và để yên ở điều kiện phòng thí nghiệm trong vòng 24h. Sau 24h, lấy mẫu rượu trong 7 bình định mức đi đo lại độ cồn và hàm lượng aldehyde còn lại bên trong. Tiến hành đánh giá lại các yếu tố cảm quan. Đối chiếu với kết quả đối chứng và chọn nồng độ dung dịch chitosan nào thích hợp nhất để khử aldehyde. Lặp lại các bước thí nghiệm 3 lần để có được kết quả chính xác nhất. Kết quả mong đợi: Xác định được nồng độ dung dịch chitosan thích hợp nhất để khử aldehyde thông qua hiệu suất khử, nồng độ nào có hiệu suất khử cao hơn thì lựa chọn. 28 Hàm lượng aldehyde trong rượu sau khi xử lý biến mất hoàn toàn hoặc giảm về mức thấp. Các yếu tố cảm quan của rượu không thay đổi hoặc thay đổi rất ít khi xử lý rượu bằng chitosan. Rượu Bổ sung chitosan để khử aldehyde trong rượu ở nhiệt độ phòng trong 24h Xác định nồng độ chitosan thích hợp 10ppm 15ppm 20ppm 25ppm 50ppm 75ppm 100ppm Đánh giá khả năng khử aldehyde của chitosan, thông qua: - Đo độ cồn trong rượu - Đo hàm lượng aldehyde trong rượu Chọn nồng độ chitosan thích hợp Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dung dịch chitosan tới khả năng khử aldehyde trong rượu 29 2.2.3. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của độ deacetyl chitosan tới khả năng khử aldehyde trong rượu . Mục đích thí nghiệm: xác định được độ DD chitosan thích hợp nhất để khử aldehyde trong rượu với hiệu quả tối ưu nhất. Rượu Bổ sung chitosan để khử aldehyde trong rượu ở nhiệt độ phòng trong 24h Xác định độ DD chitosan thích hợp 70%-75% 80%-85% ≥90% Đánh giá khả năng khử aldehyde của chitosan, thông qua: - Đo độ cồn trong rượu - Đo hàm lượng aldehyde trong rượu Lựa chọn độ DD thích hợp Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của độ deacetyl chitosan tới khả năng khử aldehyde trong rượu 30 Thuyết minh sơ đồ: Rượu sau khi được mua về từ gia đình chị Hoàng Thị Tâm, Phước Lợi – Phước Đồng – Thành Phố Nha Trang được đem đi đo độ cồn và hàm lượng aldehyde có bên trong. Sau đó tiến hành đánh giá cảm quan sơ bộ mẫu rượu này về các yếu tố như độ đục độ trong, mùi vị, trạng thái dòng chảy. Kết quả đo được ghi chép lại để làm kết quả đối chứng. Lấy 3 loại chitosan có các độ deacetyl như sau: - Mẫu 1: độ deacetyl nằm trong khoảng 70%-75% - Mẫu 2: độ deacetyl nằm trong khoảng 80%-85% - Mẫu 3: độ deacetyl ≥ 90% Hòa tan trong dung dịch acid acetic 1%. Điều chỉnh pH=3-6,2 bằng dung dịch NaOH hoặc dung dịch HCl. Lấy 3 bình định mức, cho vào mỗi mẫu 100 ml rượu, đánh dấu số thứ tự để dễ dàng phân biệt. Thêm cùng 1 lượng thể tích dung dịch chitosan với nồng độ thích hợp nhất đã xác định ở thí nghiệm trên vào 3 bình định mức trên. Đậy nút bình định mức, trộn đều và để yên ở điều kiện phòng thí nghiệm trong vòng 24h. Sau 24h, lấy mẫu rượu trong 3 bình định mức đi đo lại độ cồn và hàm lượng aldehyde còn lại bên trong. Tiến hành đánh giá lại các yếu tố cảm quan. Đối chiếu với kết quả đối chứng và chọn độ DD chitosan nào thích hợp nhất để khử aldehyde. Lặp lại các bước thí nghiệm 3 lần để có được kết quả chính xác nhất. Kết quả mong đợi: - Xác định được độ deacetyl chitosan thích hợp nhất để khử aldehyde thông qua hiệu suất khử, độ deacetyl nào có hiệu suất khử cao hơn thì lựa chọn. - Hàm lượng aldehyde trong rượu sau khi xử lý biến mất hoàn toàn hoặc giảm về mức thấp - Các yếu tố cảm quan của rượu không thay đổi hoặc thay đổi rất ít khi xử lý rượu bằng chitosan. 31 2.2.4. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của trọng lượng phân tử chitosan tới khả năng khử aldehyde trong rượu. Mục đích thí nghiệm: xác định được trọng lượng phân tử chitosan thích hợp nhất để khử aldehyde trong rượu với hiệu quả tối ưu nhất. Rượu Bổ sung chitosan để khử aldehyde trong rượu ở nhiệt độ phòng trong 24h Xác định độ trọng lượng phân tử chitosan thích hợp ≤200KDal 600-800KDal ≥1000KDal Đánh giá khả năng khử aldehyde của chitosan, thông qua: - Đo độ cồn trong rượu - Đo hàm lượng aldehyde trong rượu Lựa chọn trọng lượng phân tử chitosan thích hợp Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của trọng lượng phân tử chitosan tới khả năng khử aldehyde trong rượu 32 Thuyết minh sơ đồ: Rượu sau khi được mua về từ gia đình chị Hoàng Thị Tâm, Phước Lợi – Phước Đồng – Thành Phố Nha Trang được đem đi đo độ cồn và hàm lượng aldehyde có bên trong. Sau đó tiến hành đánh giá cảm quan sơ bộ mẫu rượu này về các yếu tố như độ đục độ trong, mùi vị, trạng thái dòng chảy. Kết quả đo được ghi chép lại để làm kết quả đối chứng. Lấy mẫu chitosan đã xác định được độ deacetyl cùng nồng độ xử lý thích hợp nhất, đưa đi xác định trọng lượng phân tử và cắt mạch để chuẩn bị các mẫu chitosan như sau: - Mẫu 1: chitosan có trọng lượng phân tử ≤ 200 KDal - Mẫu 2: chitosan có trọng lượng phân tử nằm trong khoảng 600-800 KDal - Mẫu 3: chitosan có trọng lượng phân tử ≥1000 KDal Hòa tan trong dung dịch acid acetic 1%. Điều chỉnh pH=3-6,2 bằng dung dịch NaOH hoặc dung dịch HCl. Lấy 3 bình định mức, cho vào mỗi mẫu 100 ml rượu, đánh dấu số thứ tự để dễ dàng phân biệt. Thêm cùng 1 lượng thể tích dung dịch chitosan với nồng độ thích hợp nhất đã xác định ở thí nghiệm trên vào 3 bình định mức trên. Đậy nút bình định mức, trộn đều và để yên ở điều kiện phòng thí nghiệm trong vòng 24h. Sau 24h, lấy mẫu rượu trong 3 bình định mức đi đo lại độ cồn và hàm lượng aldehyde còn lại bên trong. Tiến hành đánh giá lại các yếu tố cảm quan. Đối chiếu với kết quả đối chứng và lựa chọn trọng lượng phân tử chitosan nào thích hợp nhất để khử aldehyde. Lặp lại các bước thí nghiệm 3 lần để có được kết quả chính xác nhất. 2.3. Các phương pháp phân tích 2.3.1. Độ ẩm, hàm lượng khoáng được phân tích theo phương pháp chuẩn của AOAC [20]. 2.3.2. Xác định hàm lượng protein trong chitosan bằng phương pháp Microbiuret của Rao và cộng sự [23]. 33 2.3.3. Xác định độ nhớt biểu kiến của chitosan được đo bằng nhớt kế Brookfield [18]. 2.3.4. Xác định độ đục của chitosan bằng máy đo độ đục [17]. 2.3.5. Xác định độ tan của chitosan bằng phương pháp hòa tan trong acid acetic 1% và lọc, xác định lượng không tan [20]. 2.3.6. Xác định độ deacetyl hóa của chitosan được xác định theo phương pháp quang phổ [25]. 2.3.7. Xác định trọng lượng phân tử của chitosan. 2.3.8. Phương pháp xác định hàm lượng aldehyde của rượu bằng phương pháp quang phổ kết hợp phương pháp chuẩn của TCVN ( TCVN 8009:2009) [15]. 2.3.9. Xác định độ cồn của rượu được đo bằng cồn kế bách phân. 2.4. Phương pháp xử lý số liệu Số liệu báo cáo là trung bình của 3 lần phân tích. Kết quả được xử lý bằng phần mềm Microsoft Exel. Giá trị của p < 0.05 được xem là có ý nghĩa về mặt thống kê. 34 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thành phần và tính chất của rượu trước khi khử aldehyde Bảng 3.1. Thành phần và tính chất của rượu trước khi khử aldehyde Thành phần, tính chất Kết quả Độ cồn 38-40 độ Hàm lượng aldehyde 5,67-7,35 mg/L Màu sắc Trắng trong Mùi Mùi đặc trưng của nguyên liệu lên men, không có mùi lạ Vị Không có vị lạ, êm dịu Trạng thái Trong, không vẩn đục, không có cặn Rượu cồn được mua tại gia đình chị Hoàng Thị Tâm, Phước Lợi – Phước Đồng – Thành Phố Nha Trang. Vì rượu để lâu ngày có thể bị mất đi một số hợp chất bay hơi quan trọng nên mỗi lần tiến hành thí nghiệm phải mua về một lượng rượu mẫu vừa đủ. Tuy là cùng một nơi sản xuất nhưng độ cồn của các mẫu rượu lại ở trong khoảng 38-40 độ. Hàm lượng aldehyde của các mẫu rượu này xấp xỉ 5,67-7,35 mg/L vượt quá mức cho phép theo quy định ở Việt Nam. Cho nên, đặt ra một vấn đề đó là cần phải tiến hành khử aldehyde trong mẫu rượu này một cách triệt để hoặc về mức cho phép. Ngoài ra, các yếu tố cảm quan khác như màu sắc, mùi, vị, trạng thái của các mẫu rượu đều bình thường. 3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dung dịch chitosan đến khả năng khử aldehyde trong rượu. Rượu mẫu sau khi được chuẩn bị thì tiến hành đánh giá cảm quan sơ bộ. Vì mỗi lần bố trí thí nghiệm phải sử dụng một mẫu rượu khác nhau nên tiến hành đánh giá cảm quan cho từng mẫu. 35 Mặt khác, hàm lượng aldehyde trong rượu cồn là rất nhỏ (mg/L) nên lựa chọn nồng độ chitosan khi xử lý là ppm, để không ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất khử aldehyde cũng như các yếu tố cảm quan của mẫu rượu đó. Cho nên tôi lựa chọn khoảng nồng độ để tiến hành thí nghiệm trong đề tài này là : 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100 ppm. Để xác định ảnh hưởng của nồng độ dung dịch chitosan đến khả năng khử aldehyde trong rượu, chúng ta xét qua một yếu tố đó là hiệu suất khử, được thông qua Hình 3.1. Hiệu suất khử aldehyde (%) 35 30 25 20 15 10 5 0 10ppm 15ppm 20ppm 25ppm 35ppm 50ppm 75ppm 100ppm Hình 3.1. Hiệu suất khử aldehyde trong rượu của từng nồng độ dung dịch chitosan Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài thì nồng độ 50 ppm có hiệu suất khử aldehyde trong rượu cao nhất (≈ 30%), tương ứng hàm lượng aldehyde còn lại trong rượu là thấp nhất. Nồng độ chitosan 10ppm có hiệu suất khử thấp nhất (≈ 10%). Bên cạnh đó, các yếu tố cảm quan sơ bộ đều không thay đổi nên lựa chọn nồng độ 50 ppm là nồng độ thích hợp nhất để tiến hành thí nghiệm. Nếu như là một phản ứng hóa học một chiều thông thường giữa hai chất theo nguyên tắc nếu một chất hết thì chất còn lại phải dư. Tuy nhiên, phản ứng giữa chitosan và aldehyde là phản ứng thuận nghịch (phản ứng hai chiều) do đó khi tăng 36 nồng độ chitosan lên cao chitosan sẽ kết tủa lại nên khả năng phản ứng với aldehyde sẽ giảm, vì phản ứng chủ yếu xảy ra trên bề mặt. Ngoài ra, tính khử aldehyde của chitosan phụ thuộc vào đặc tính của chitosan (độ DD, trọng lượng phân tử), nồng độ aldehyde, hàm lượng chitosan đã dùng và pH của dung dịch. Tính chất hóa lý của chitosan phụ thuộc vào pH của dung dịch theo cân bằng sau: Theo đó, nhóm –NH2 có tính bazơ và ở pH< 6,3 chitosan bị proton hóa (-NH3+) tạo thành polyelectrolyte cation và tan trong nước. Ở dạng này, chitosan khó phản ứng với aldehyde vì nhóm -NH3+ khá bền và không tham gia phản ứng hóa học. Ở pH >7, chitosan bị đề proton, cặp electron không liên kết của nguyên tử nitơ dễ dàng thực hiện các phản ứng hóa học với aldehyde hoặc acid alhydride. Tuy nhiên, do ở pH>7 chitosan không tan mà kết tủa nên phản ứng chỉ xảy ra trên bề mặt hạt kết tủa. Do đó, một số nghiên cứu khác các nhà khoa học gắn hạt nano vàng lên các hạt tủa này làm xúc tác cho quá trình khử aldehyde (Teh Hua Tsai và cộng sự, 2013) [26]. Nồng độ chitosan ảnh hưởng rất lớn đến khả năng khử aldehyde và là yếu tố quan trọng nhất liên quan xuyên suốt đến các thí nghiệm sau này. Cần sử dụng chitosan ở một nồng độ hợp lý vì khi tăng nồng độ chitosan sẽ làm tăng số điện tích cùng dấu, đẩy nhau tạo nên một mạng lưới keo, cản trở khả năng phản ứng giữa các phân tử chitosan và aldehyde trong dung dịch rượu [18]. Chitosan tích điện dương khi hòa tan trong môi trường acid loãng. Nó có khả năng bám dính bề mặt các ion tích điện âm và có khả năng tạo phức với các kim loại và tương tác tốt với các polyme tích điện âm 37 [18]. Tính khử aldehyde của chitosan chủ yếu là nhờ quá trình hấp thụ acetaldehyde lên chitosan. Cho nên, khi bố trí thí nghiệm này với dải nồng độ tăng từ 10 ppm đến 100 ppm, mật độ nhóm -NH3+ tăng lên khiến phản ứng giữa nhóm -NH3+ với các anion mang điện tích âm của aldehyde trong dung dịch cũng tăng lên: Vì vậy, khi tăng nồng độ lên hiệu suất khử sẽ tăng và đạt mức cao nhất ở 50 ppm, nếu tiếp tục tăng nồng độ từ 50 ppm lên đến 100 ppm hiệu suất khử sẽ giảm dần. Các mẫu rượu sau khi được xử lý bằng chitosan đều có hàm lượng aldehyde ở mức cho phép. Kết luận: Lựa chọn nồng độ 50 ppm là nồng độ thích hợp nhất khử aldehyde và để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của độ deacetyl chitosan đến khả năng khử aldehyde trong rượu. Để xác định ảnh hưởng của độ deacetyl chitosan đến khả năng khử aldehyde trong rượu, chúng ta xét qua một yếu tố đó là hiệu suất khử, được thông qua Hình 3.2. Hiệu suất khử aldehyde (%) 38 70 60 50 40 30 20 10 0 (70-75) (80-85) (>90) DD (%) Hình 3.2. Hiệu suất khử aldehyde trong rượu của chitosan có độ DD khác nhau Khi tiến hành thí nghiệm này, mẫu rượu sử dụng có độ cồn đo được là 38 độ, các yếu tố cảm quan trước và sau khi xử lý bằng chitosan đều bình thường. Với nồng độ dung dịch chitosan sử dụng thích hợp nhất là 50ppm, kết quả cho thấy, chitosan có DD > 90% có hiệu suất khử aldehyde cao nhất (≈ 60%), chitosan có DD = 70-75% có hiệu suất khử aldehyde thấp nhất (≈ 20%), còn chitosan có DD = 8085% có hiệu suất khử aldehyde (≈ 38%). Các mẫu rượu sau khi được xử lý bằng chitosan đều có hàm lượng aldehyde ở mức cho phép. Chitosan tích điện dương khi hòa tan trong môi trường acid loãng. Nó có khả năng bám dính bề mặt các ion tích điện âm và có khả năng tạo phức với các kim loại và tương tác tốt với các polymer tích điện âm [18]. Khi chitosan có DD càng cao thì sự có mặt của nhóm -NH3+càng nhiều, như vậy sẽ làm tăng nồng độ nhóm NH3+ trong dung dịch chitosan, khi đó các gốc amino tích điện dương sẽ trung hòa điện tích với các anion tích điện âm trong dung dịch [14]. Nhóm -NH3+ sẽ phản ứng với các anion tích điện âm của aldehyde tạo ra các azometin (phương trình phản ứng bên dưới). 39 Như vậy, càng nhiều nhóm -NH3+ thì càng có nhiều phản ứng xảy ra, dẫn đến hiệu suất khử càng tăng. Tuy nhiên, hiệu suất khử aldehyde của chitosan có DD > 90% ở thí nghiệm này chưa được cao là vì theo cơ chế khử thì nhóm –NH2 có tính bazơ và ở pH< 6,3 (bố trí thí nghiệm với khoảng pH=3-6,2) chitosan bị proton hóa (-NH3+) tạo thành polyelectrolyte cation và tan trong nước. Ở dạng này, chitosan khó phản ứng với aldehyde vì nhóm -NH3+ khá bền và không tham gia phản ứng hóa học. Do đó, tuy nồng độ -NH3+ nhiều hiệu suất khử aldehyde chỉ đạt ≈ 60% là cao nhất. Kết luận: Lựa chọn chitosan có DD > 90% là loại chitosan thích hợp nhất để khử aldehyde trong rượu cồn. 3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của trọng lượng phân tử chitosan đến khả năng khử aldehyde. Để xác định ảnh hưởng của trọng lượng phân tử chitosan đến khả năng khử aldehyde trong rượu, chúng ta xét qua một yếu tố đó là hiệu suất khử, được thông qua Hình 3.3. Hiệu suất khử aldehyde (%) 40 80 70 60 50 40 30 20 10 0 (≤200) (600-800) (≥1000) KDal Hình 3.3. Hiệu suất khử aldehyde trong rượu của từng loại trọng lượng phân tử chitosan Khi tiến hành thí nghiệm này, mẫu rượu sử dụng có độ cồn đo được là 38 độ, các yếu tố cảm quan trước và sau khi xử lý bằng chitosan đều bình thường. Với dung dịch chitosan có DD > 90%, ở nồng độ xử lý thích hợp nhất là 50ppm, kết quả cho thấy, chitosan có trọng lượng phân tử thấp ≤ 200 KDal có hiệu suất khử aldehyde cao nhất (≈ 64%); so với hai mẫu chitosan còn lại, mẫu chitosan có trọng lượng phân tử ≥ 1000 KDal có hiệu suất khử aldehyde thấp nhất (≈ 33%) còn mẫu chitosan có trọng lượng phân tử trung bình 600-800 KDal có hiệu suất khử ≈ 47%. Điều này dễ giải thích vì chitosan có phân tử lượng cao có khả năng tạo màng tốt và màng chitosan tạo thành lại có sức căng tốt, điều này ngăn cản sự tiếp xúc giữa các aldehyde với phân tử chitosan. Mặt khác, tính khử aldehyde của chitosan chủ yếu là nhờ quá trình hấp thụ aldehyde lên bề mặt của chitosan. Do đó, chitosan có trọng lượng phân tử càng cao thì khả năng khử aldehyde càng yếu. Ngoài ra, chitosan trọng lượng phân tử thấp linh động hơn trong các phản ứng hóa học, linh động hơn trong các 41 tương tác với các chất tích điện âm so với chitosan có trọng lượng cao và có khả năng hòa tan rất tốt, khả năng tạo màng yếu cho nên sự tiếp xúc giữa các aldehyde với phân tử chitosan cao, dẫn đến phản ứng diễn ra tốt [18]. Khả năng khử aldehyde của chitosan phụ thuộc vào đặc tính của chitosan (ví dụ như độ DD), nồng độ aldehyde, hàm lượng chitosan đã dùng và pH của dung dịch; ngoài ra cơ chế phản ứng giữa chitosan và aldehyde là phản ứng 2 chiều thuận nghịch cho nên với những điều kiện tối ưu về độ DD và nồng độ dung dịch xử lý thì hiệu suất khử aldehyde của loại chitosan có trọng lượng phân tử ≤ 200 KDal là cao nhất trong 3 loại chitosan trên cũng chỉ đạt ≈ 64%. Kết luận: Lựa chọn chitosan có trọng lượng phân tử ≤ 200 KDal là loại chitosan thích hợp nhất để khử aldehyde trong rượu cồn. 3.5. Đề xuất quy trình khử aldehyde trong rượu bằng chitosan. Từ kết quả nghiên cứu thí nghiệm, tôi xin đề xuất quy trình khử aldehyde trong rượu cồn bằng chitosan như sau. 3.5.1. Sơ đồ quy trình: Rượu Bổ sung chitosan để khử aldehyde trong rượu ở nhiệt độ phòng trong 24h Chitosan: DD > 90%, ≤ 200 KDal Hòa tan trong acid acetic 1% Đánh giá khả năng khử aldehyde của chitosan, thông qua: - Đo độ cồn của rượu - Đo hàm lượng aldehyde trong rượu Hình 3.4. Sơ đồ quy trình đề xuất khử aldehyde trong rượu bằng chitosan 42 3.5.2. Thuyết minh quy trình: - Chuẩn bị mẫu: Rượu sau khi mua về được bảo quản ở điều kiện thường. Khi tiến hành thí nghiệm, đánh giá cảm quan rượu rồi đem đi xác định các yếu tố sau: + Độ cồn của rượu + Hàm lượng aldehyde trong rượu Đây là các yếu tố ban đầu của rượu mẫu, sau khi có kết quả cần ghi lại để làm kết quả đối chứng so sánh với kết quả sau khi đã xử lý bằng dung dịch chitosan. Sử dụng chitosan có DD > 90%, trọng lượng phân tử ≤ 200KDal, pha thành nồng độ 50 ppm bằng dung dịch acid acetic 1%. Tiến hành khử aldehyde trong mẫu rượu ban đầu bằng cách thêm đúng thể tích dung dịch chitosan 50 ppm vào. Để hỗn hợp dung dịch ở điều kiện thường phòng thí nghiệm trong vòng 24h. Sau 24h, thu hồi lại hỗn hợp dung dịch rượu đem đi tiến hành xác định lại các yếu tố sau: + Độ cồn của rượu + Hàm lượng aldehyde trong rượu + Yếu tố cảm quan Đây là các yếu tố của rượu sau khi đã xử lý bằng dung dịch chitosan. Sau khi đã có được kết quả, so sánh với kết quả đối chứng ban đầu. Đưa ra kết luận xem khả năng khử aldehyde trong rượu của chitosan như thế nào. Khả năng khử aldehyde trong rượu của chitosan được biểu thị qua hiệu suất khử. 43 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN Kết luận 1. Đề tài đã đánh giá được ảnh hưởng của nồng độ, trọng lượng phân tử, DD của chitosan đến khả năng khử aldehyde trong rượu cồn. 2. Xác định được nồng độ, trọng lượng phân tử, DD của chitosan thích hợp ứng dụng để khử aldehyde trong rượu cồn: nồng độ 50ppm, trọng lượng phân tử ≤ 200 KDal, DD ≥ 90 %. 3. Đề xuất được quy trình khử aldehyde trong rượu cồn bằng loại chitosan cùng nồng độ xử lý thích hợp. Với quy trình xử lý và loại chitosan đã lựa chọn thì hiệu suất xử lý cao nhất là 90,21% , ở điều kiện phòng, thời gian xử lý 24h. Đề xuất ý kiến Vì thời gian thực hiện đề tài có hạn, đồng thời gặp khó khăn về điều kiện cơ sở vật chất phòng thí nghiệm do đó tôi chưa thực hiện được một số nội dung liên quan đến đề tài nên có một số đề xuất như sau: 1. Tiếp tục thí nghiệm xác định được thông số pH thích hợp nhất của dung dịch chitosan để khử aldehyde trong rượu cồn. 2. Khi sản xuất chitosan, ở các công đoạn rửa cần sử dụng nước cất hoặc nước có độ tinh khiết cao nhất để nâng cao chất lượng của chitosan. 3. Khi tiến hành phân tích, một số loại hóa chất rất độc hại như Fuchshin gốc là một chất gây ung thư, do đó người trực tiếp sử dụng cần phải đeo găng tay y tế, khẩu trang chống độc; tránh tiếp xúc hoặc hít vào. 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Trần Thị Hồng Chúc (2008), Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình bảo quản rượu nếp than sản xuất bằng công nghệ enzyme và nấm men thuần chủng, Luận văn tốt nghiệp Kỹ sư, Trường Đại Học Cần Thơ. 2. Hà Thành Chung (2001), Nghiên cứu quy trình tinh chế chitosan từ phế liệu tôm, Đồ án tốt nghiệp, Trường Đại Học Nha Trang. 3. Nguyễn Quyết Chiến (2002), Nghiên cứu và ứng dụng các hợp chất azometin, oxim và hydrazon, Đồ án tốt nghiệp, Trường Đại Học Dược Hà Nội. 4. Nguyễn Thị Huệ, Đỗ Hải Sơn (2006), Nghiên cứu phản ứng thủy phân chitosan bằng một số acid hữu cơ, Tạp chí khoa học, Trường Đại Học Quốc Gia Hà Nội, tr. 91-96. 5. Trương Quốc Khánh (2011) , Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng và hiệu suất thu hồi rượu gạo sản xuất ở quy mô hộ gia đình, Luận văn Thạc sỹ Kỹ thuật, Trường Đại học Đà Nẵng. 6. Trần Trung Kiên (2010), Điều tra hiện trạng sản xuất rượu truyền thống ở Bến Lức – Long An và đề xuất giải pháp nâng cao chất lượng sản phẩm, Đồ án Môn học chuyên ngành, Trường Đại Học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh. 7. Đỗ Thị Liền (2008), Nghiên cứu cắt mạch Chitosan bằng hydroperoxit và thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của chúng, Luận văn thạc sĩ kỹ thuật, Đại học Nha Trang. 8. Ngô Thị Luyên, Bài Giảng Hóa Học, 54 (9), tr. 5-20. 9. Trần Thị Luyến (2004), Báo cáo tổng kết dự án sản xuất thử nghiệm cấp Bộ sản xuất chitin-chitosan từ phế liệu thủy sản, Trường Đại Học Nha Trang, Nha Trang. 45 10. Trần Thị Luyến, Huỳnh Nguyễn Duy Bảo và cộng sự (2000), Hoàn thiện quy trình sản xuất chitin-chitosan và chế biến một số sản phẩm công nghiệp từ phế liệu tôm, cua, Báo cáo Đề tài cấp bộ, Trường Đại học Nha Trang. 11. Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn (2006), Sản xuất các chế phấm kỹ thuật và y dược từ phế liệu thủy sản, Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 12. Quy chuẩn Việt Nam 6-3:2010/Bộ Y Tế (2010), “Quy chuẩn quốc gia đối với các sản phẩm đồ uống có cồn”. 13. Khiếu Thị Tâm (2012), Nghiên cứu phản ứng lưới hoá chitosan, một số dẫn xuất của chitosan và khả năng hấp phụ ion kim loại Nặng, Đồ án tốt nghiệp , Trường Đại học Khoa học tự nhiên - ĐHQG HN. 14. Tiêu chuẩn Việt Nam 7043:2002 (2002), “Rượu trắng - quy định kỹ thuật”. 15. Tiêu chuẩn Việt Nam 8009:2009 (2009), “Rượu chưng cất – Xác định hàm lượng aldehyde”. 16. Nguyễn Đình Thưởng, Nguyễn Thanh Hằng (2007), Công nghệ sản xuất và kiểm tra cồn Ethylic, Nhà xuất bản Khoa Học Kỹ Thuật. 17. Trang Sĩ Trung (2008), Nghiên cứu kết hợp phương pháp sinh học để nâng cao hiệu quả quy trình sản xuất chitin-chitosan từ phế liệu vỏ tôm, Báo cáo Đề tài cấp Bộ, Trường Đại Học Nha Trang. 18. Trang Sỹ Trung, Trần Thị Luyến, Nguyễn Anh Tuấn, Nguyễn Thị Hằng Phương (2009), Chitin – chitosan từ phế liệu thủy sản và ứng dụng, Nhà xuất bản Nông Nghiệp. Tài liệu tiếng Anh 19. Adachi, Mizoi, Naito, Yamamoto, Fujiwara, Ninomiya (1991), Determination of ß-carbolines in foodstuffs by high-performance liquid 46 chromatography and high-perfor- mance liquid chromatography-mass spectrometry, J. Chromatogr. 538, pp. 331-339. 20. AOAC (1990), Official Method of Analysis, Vol.15th Association of official analytical chemists, Arlington, VA, 70-75. 21. Boffetta P, Hashibe M, La Vecchia C, Zatonski W, Rehm J (2006), The burden of cancer attributable to alcohol drinking, International Journal of Cancer Aug. 119 (4): 884-887. 22. Jeon, Y-J., Shahidi, F., Kim, S-K, (2002), Preparation of chitin and chitosan oligomers and their application in physiological functional foods, Food Review International, 16 (2):159-776. 23. Rao, M. S, Nyein, K. A, Trung, T. S. and Stevens, W. F. (2007), “Optimum parameters for production of chitin and chitosan from Squilla (S. empusa)”, J. Appl. Polym. Sci. 103, pp. 3694-3700. 24. Takashi Miyake, Takayuki Shibamoto (1993), Quantitative Analysis of Acetaldehyde in Foods and Beverages, J. Agric. Food. Chem. 41, pp.1968-1970. 25. Tan, S. C., Khor, E., Tan, T. K. and Wong, S. M. (1996), “The degree of deacetylation of chitosan: advocating the first derivative UV spectrophotometry method of determination”, Talanta. 45, pp. 713-719. 26. Teh Hua Tsai, Chung Chin Yu, Yu Chuan Liu, Kuang Hsuan Yang (2013), Effectively Catalytic Decomposition of Acetaldehydes in Spirits by Using Chitosan-Capped Gold Nanoparticles, J. Appl. Polym. Sci. 130, pp. 86-91. 27. Xie W., Xu P., Liu Q. (2001), Antioxidant activity of water-soluble chitosan derivatives, Bioorg. Med. Chem. Letters., 11, 1699-1701. 47 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Các phương pháp phân tích chính sử dụng trong đề tài 1. Xác định hàm lượng ẩm và hàm lượng khoáng [20] Cốc sấy được sấy khô ở nhiệt độ 105oC trong 5-6 giờ (đến khối lượng không đổi), sau đó để trong bình hút ẩm để làm nguội. Cân xác định khối lượng của cốc sấy là W1. Cho mẫu vào cốc sấy cân được khối lượng là W 2. Sấy ở 105oC trong 24 giờ, cân được khối lượng W3 (AOAC, 1990). Tất cả khối lượng xác định đều tính theo gram. Hàm lượng ẩm được tính theo công thức sau: % Hàm lượng ẩm = [(W2 - W3)/(W2 - W1)] x 100. Sau khi xác định hàm lượng ẩm, ta đem nung cốc sấy có chứa mẫu khô ở nhiệt độ 600oC, khoảng 6 giờ, để trong bình hút ẩm và cân được khối lượng W 4. Hàm lượng tro được xác định theo công thức sau: % Hàm lượng tro = [(W4 – W1)/(W2 – W1)] x 100. 2. Xác định hàm lượng protein trong mẫu chitosan bằng phương pháp Microbiuret [18] Thuốc thử Microbiuret: Dung dịch 1: Hòa tan 173 g natri citrat và 100 g natri cacbonat trong 500 ml nước cất nóng. Dung dịch 2: Hòa tan 17,3 g đồng sunfat trong 100 ml nước cất. Trộn dung dịch 1 và dung dịch 2 sau đó làm đầy đến 1000 ml bằng nước cất. Dung dịch thuốc thử được giữ trong chai màu. Xây dựng đường chuẩn: Pha dung dịch protein chuẩn BSA ở các nồng độ 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25 mg/ml. Cho vào mỗi ống nghiệm 4 ml BSA chuẩn sau đó thêm 200 µl dung dịch thuốc thử microbiuret, ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, sau đó đo phổ UV ở bước sóng 330 nm. 48 Từ các số liệu thu thập được, lập phương trình đường chuẩn để từ đó tính toán hàm lượng protein trong mẫu. Phương pháp chiết mẫu: Cân 1g chitosan, thêm 10 ml NaOH 3%, sau đó ủ ở 80oC trong 8 giờ. Sau khi ủ, tiến hành lọc khối ủ (sử dụng 10 – 15 ml NaOH 3% nữa để rửa mẫu); định mức dịch lọc đến một thể tích nhất định (V1). Dịch lọc được mang đi ly tâm với tốc độ 5000 vòng trong 15 phút. Sử dụng 4 ml dịch sau ly tâm sau đó thêm 200 µl dung dịch thuốc thử microbiuret, ủ trong 15 phút ở nhiệt độ phòng và đo màu ở bước sóng 330 nm. Từ giá trị OD thu được, thay vào phương trình đường chuẩn để suy ra hàm lượng protein trong mẫu. Tính toán kết quả: Hàm lượng protein trong chitosan được xác định theo công thức sau: Hàm lượng protein (%) = V1 (ml) x C (mg/ml) x 100 w (g) x (100-MC)/100 x 1000 mg/g Trong đó: V1: thể tích dịch lọc (ml) C: Hàm lượng protein tính theo đường chuẩn Microbiuret (mg/ml) W: khối lượng mẫu ủ (g) MC: độ ẩm của mẫu (%) 3. Xác định độ deacetyl của chitosan bằng phương pháp UV [25]. Xây dựng đường chuẩn N-acetyl glucosamine: Hòa tan 0,1105 g N-acetyl glucosamine trong 10 ml H3PO4 được dung dịch có nồng độ 0,05 M Lấy 2 ml dung dịch trên sau đó thêm 98 ml nước cất được dung dịch có nồng độ 0,001 M. 49 Từ dung dịch trên ta pha thành các dung dịch có nồng độ tương ứng là 0,0001; 0,0002; 0,0004; 0,0006; 0,0008; 0,001 M. Sau khi đã có dãy nồng độ như trên, tiến hành do OD ở bước sóng 210 nm để xây dựng đường chuẩn N-acetyl glucosamine. Chuẩn bị mẫu chitosan Hòa tan 100 mg chtosan trong 20 ml H3PO4 85 %, khuấy đảo ở 60oC trong vòng 40 phút. Lấy 10 ml dung dịch ở trên định mức đến 100 ml bằng nước cất, sau đó ủ dung dịch trên trong 2 giờ ở 60oC. Sau khi ủ, dung dịch trên được do OD ở bước sóng 210 nm. Từ kết quả đo được, thay vào đường chuẩn N-acetyl glucosamine để tính ra lượng N-acetyl glucosamine. Tính kết quả Độ deacetyl của chitosan được tính theo công thức sau  molGlcNAC   DD = 100 * 1   molGclNAC   molGcl   molGcl  w  molGclNAC * 0.20321 0.16117 Trong đó: W: khối lượng mẫu khô tuyệt đối µmol Gcl NAC: hàm lượng N-acetyl glucosamine xác định theo đường chuẩn µmol Gcl: hàm lượng glucosamine 50 4. Xác định độ nhớt của chitosan [18] Độ nhớt của chitosan được xác định bằng nhớt kế Brookfield, model RVT. Dung dịch chitosan 1% hòa tan trong acid acetic 1%. Tiến hành đo độ nhớt bằng trục quay số 61 và 64, tốc độ quay 30vòng/phút ở 20oC, đơn vị tính là centipoises. 5. Xác định độ tan của chitosan [20] Giấy sấy được sấy khô ở nhiệt độ 105oC trong 5 giờ (đến khối lượng không đổi), sau đó để trong bình hút ẩm để làm nguội. Cân xác định khối lượng của giấy sấy là W1. Cân 0.2g chitosan hòa tan trong 20ml dung dịch acid acetic 1%. Để 24h, định mức lên 200ml bằng nước cất, sau đó tiến hành lọc. Sấy ở 1050C trong 24h, cân xác định khối lượng W2. Độ tan tính theo công thức sau: % Độ tan = [W2/ (W1 x Độ ẩm)] x 100. 6. Xác định trọng lượng phân tử của mẫu chitosan [23] Mục đích: xác định trọng lượng phân tử của các mẫu chitosan đã chuẩn bị. Trọng lượng phân tử chitosan có thể được xác định bằng một số phương pháp như phương pháp sắc kí, phân tán ánh sáng hoặc đo độ nhớt. Tuy nhiên hiện nay phương pháp được dùng phổ biến đó là xác định thông qua độ nhớt nội được đo bằng nhớt kế mao quản Ubbelohde. Ưu điểm:Nhanh và dễ tiến hành Nhược điểm:Sai số lớn phụ thuộc nhiều vào thao tác người thực hiện.Chỉ cho biết khối lượng phân tử trung bình của dung dịch.  Chuẩn bị: Chuẩn bị dung dịch Axit acetic (CH3COOH) 0.2M: pha 100ml CH3COOH 0.2M Chuẩn bị Sodium acetate (CH3COONa) Chuẩn bị dung môi: CH3COOH 0.2.M/CH3COONa 0.1M Chuẩn bị Chitosan mẫu (0.3%): chitosan mẫu được pha trong CH3COOH 0.2M/ CH3COONa 0.1M. Dùng xiranh và phin lọc 5 m để lọc. 51  Tiến hành thí nghiệm: - Cài đặt nhiệt độ cho bộ ổn nhiệt: 300C - Dung dịch CH3COOH/CH3COONa là dung môi nên cần phải xác định thời gian chảy của dung môi. Dung dịch CH3COOH/CH3COONa được lọc bằng phin lọc 5 m. Lấy 4 ml dung dịch này đưa vào nhớt kế. Lắp nhớt kế vào giá đỡ, đợi khoảng 10 phút để dung dịch cần đo đạt được nhiệt độ cài đặt trong bể ổn nhiệt. Tiến hành đo. Trên bộ điều khiển cần cài đặt số lần đo và thời gian nghỉ giữa các lần đó, sau đó bấm start. Bộ điều khiển sẽ điều khiển quá trình hoàn toàn tự động. Đầu tiên dịch được hút lên trên ống bên trái của nhớt kế sau khi đến một mức nào đó (cao hơn vạch bắt đầu đếm giờ) thì việc hút dịch ngừng lại. Dịch bắt đầu chảy xuống dưới tác dụng của trọng lực. Đến khi mức dịch ngang bằng với vạch trên thì máy tự động tính giờ. Khi mức dịch ngang bằng với vạch dưới thì sẽ kế thúc quá trình đếm giờ. - Tính trung bình thời gian chảy của dung môi (trung bình cộng của số lần) - Làm vệ sinh nhớt kế: rửa sạch bằng nước cất (dùng chân không nước chảy để hút), rửa bằng aceton, làm khô bằng bơm chân không. - Lắp nhớt kế vào giá tiếp tục đo dung dịch cần đo. - Làm sạch nhớt kế. - Pha loãng dung dịch ban đầu thành các dung dịch loãng hơn: Pha loãng 1(C1): 1 ml dung dịch ban đầu + 9 ml dung môi Pha loãng 2(C2): 2 ml dung dịch ban đầu + 8 ml dung môi Pha loãng 3(C3): 3 ml dung dịch ban đầu + 7 ml dung môi Pha loãng 4(C4): 4 ml dung dịch ban đầu + 6 ml dung môi Pha loãng 5(C5): 5 ml dung dịch ban đầu + 5 ml dung môi - Tiến hành đo thời gian chảy của các dung dịch được pha loãng. - Sau mỗi lần đo một dung dịch cần phải làm vệ sinh nhớt kế một lần. Tính kết quả: 52 Sau khi có được kết quả là thời gian chảy của dung môi và thời gian chảy của dung dịch cần đo với các nồng độ khác nhau, tiến hành tính toán một số thông số, vẽ đồ thị và từ đó có được độ nhớt nội. Solution (with polymer) viscosity (độ nhớt dung dịch) : η Solvent viscosity (độ nhớt dung môi) : ηo Relative viscosity (độ nhớt tương đối) : η = Specific viscosity (độ nhớt cụ thể) : ηsp = η ηo η−ηo ηo = 𝑡 𝑡𝑜 = ηr – 1 = 𝑡 𝑡𝑜 −1 Do [η] = (ηsp/C)C→O = (ηred)C→O nên ta có thể xác định độ nhớt nội (intrinsic viscosity) bằng cách ngoại suy khi nồng độ bằng không. Trong đó C: g / ml. Trọng lượng phân tử trung bình thông qua độ nhớt được tính toán dựa trên các phương trình Mark- Houwink: [η]=KMa Trong đó: K = 0,0966 a = 0,742 7. Xác định hàm lượng aldehyde trong rượu cồn bằng phương pháp quang phổ [15]  Giới hạn xác nhận: Phương pháp này áp dụng cho các sản phẩm có hàm lượng aldehyde, tính theo acetaldehyde, trong khoảng từ 0,00025% đến 0,00125% (theo khối lượng).  Nguyên tắc: 53 Schiff là thuốc thử dùng để nhận biết sự có mặt của các aldehyde trong dung dịch mẫu. Các aldehyde phản ứng với thuốc thử schiff tạo ra dung dịch có màu hồng tươi. Sử dụng máy quang phổ UV-VIS để xác định hàm lượng aldehyde còn lại trong dung dịch mẫu. Từ đó có thể biết được hiệu suất khử aldehyde.  Tiến hành Bước 1: Pha chế hóa chất - Thuốc thử Schiff: Lấy 350ml nước cất vào bình tam giác, thêm 1g fuchsin gốc và khuấy đều đến khi hòa tan. Thêm 2g Na2S2O5, trộn và để yên 5 đến 10 phút. Thêm 9ml dung dịch H2SO4, lắc kỹ, đậy nút và để yên khoảng 12h. Khử màu dung dịch bằng cacbon hoạt tính. - Dung dịch acetaldehyde tiêu chuẩn: Lấy 0.25ml dung dịch acetaldehyde 40% chuyển vào bình định mức dung tích 100ml, pha loãng đến vạch mức bằng ethanol (dung dịch I) Chuyển 10ml dung dịch trên vào bình định mức dung tích 100ml, pha loãng đến vạch mức bằng ethanol và lắc đều (dung dịch II). Chú ý: 1ml của dung dịch II này chứa 0,0001g acetaldehyde. Bước 2: Xây dựng “phương trình đường chuẩn hàm lượng aldehyde trong rượu cồn” bằng phương pháp đo OD Lấy 8 ống nghiệm, cho vào lần lượt các ống theo thứ tự như sau: Ống 1: 5ml nước cất + 1ml thuốc thử Schiff Ống 2: 1ml dung dịch II + 4ml nước cất + 1 ml thuốc thử Schiff Ống 3: 1.5ml dung dịch II + 3.5ml nước cất + 1 ml thuốc thử Schiff Ống 4: 2ml dung dịch II + 3ml nước cất + 1 ml thuốc thử Schiff Ống 5: 2.5ml dung dịch II + 2.5ml nước cất + 1 ml thuốc thử Schiff Ống 6: 3ml dung dịch II + 2ml nước cất + 1 ml thuốc thử Schiff Ống 7: 3.5ml dung dịch II + 1.5ml nước cất + 1 ml thuốc thử Schiff 54 Ống 8: 4ml dung dịch II + 1ml nước cất + 1 ml thuốc thử Schiff Đậy nút lại, lắc đều và để yên trong 30 phút. Rồi đo màu bằng máy đo quang phổ UV-VIS ở bước sóng 550nm. Bước 3: Xác định hàm lượng aldehyde trong mẫu rượu (mẫu rượu ban đầu và mẫu rượu sau khi đã xử lý bằng chitosan) Lấy 4ml rượu mẫu cho vào ống nghiệm, thêm tiếp 1ml nước cất và 1ml thuốc thử Schiff. Đậy nắp lại và trộn đều, để yên trong 30 phút rồi đem đi đo màu bằng máy đo quang phổ UV-VIS ở bước sóng 550nm. Sau khi đã có kết quả đo, áp dụng vào “phương trình đường chuẩn hàm lượng aldehyde trong rượu cồn” đã xây dựng ở trên sẽ xác định được hàm lượng aldehyde có trong các mẫu rượu thử. 8. Xác định độ cồn đo bằng cồn kế bách phân Giữ rượu ở 20oC trong 30 phút, rót rượu vào ống đong khô, sạch, rót cẩn thận theo thành ống đong, để tránh tạo bọt khí quá nhiều. Thả từ từ cồn kế vào ống đong sao cho cồn kế không chìm quá sâu so với mức đọc. Để cồn kế ổn định. Đọc độ cồn trên cồn kế, không để có bọt khí bám vào cồn kế làm sai lệch kết quả. Trường hợp rượu không ở nhiệt độ 20oC thì phải đọc nhiệt độ của rượu và độ cồn cùng lúc. Sau đó tra bảng hiệu chỉnh để có độ rượu ở 20oC. Phụ lục 2: Kết quả xây dựng “phương trình đường chuẩn hàm lượng aldehyde trong rượu cồn” Phương trình đường chuẩn hàm lượng aldehyde trong rượu cồn được hiển thị qua Hình P2.1. Khi xử lý trên máy tính theo phương trình hồi quy tuyến tính ta thu được phương trình liên quan: y = 35,166x – 0,5651 với độ tin cậy R² = 0,9919 Trong đó: y: mật độ quang phổ 55 x: hàm lượng aldehyde tính theo acetaldehyde tiêu chuẩn Đường chuẩn thực tế khá thẳng nên có thể sử dụng phương trình trên để tính OD nhanh kết quả khi phân tích các mẫu. 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 y = 35.166x - 0.5651 R² = 0.9919 0 0.02 0.04 0.06 0.08 Hàm lượng acetaldehyde tiêu chuẩn Hình P2.1. Phương trình đường chuẩn hàm lượng aldehyde trong rượu cồn 56 Phụ lục 3. Một số hình ảnh thiết bị phân tích sử dụng trong đề tài Hình P3.1. Tủ sấy 57 Hình P3.2. Tủ ấm Hình P3.3. Cân phân tích 58 [...]... thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dung dịch chitosan tới khả năng khử aldehyde trong rượu 29 2.2.3 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của độ deacetyl chitosan tới khả năng khử aldehyde trong rượu Mục đích thí nghiệm: xác định được độ DD chitosan thích hợp nhất để khử aldehyde trong rượu với hiệu quả tối ưu nhất Rượu Bổ sung chitosan để khử aldehyde trong rượu ở nhiệt độ phòng trong 24h... Các yếu tố cảm quan của rượu không thay đổi hoặc thay đổi rất ít khi xử lý rượu bằng chitosan Rượu Bổ sung chitosan để khử aldehyde trong rượu ở nhiệt độ phòng trong 24h Xác định nồng độ chitosan thích hợp 10ppm 15ppm 20ppm 25ppm 50ppm 75ppm 100ppm Đánh giá khả năng khử aldehyde của chitosan, thông qua: - Đo độ cồn trong rượu - Đo hàm lượng aldehyde trong rượu Chọn nồng độ chitosan thích hợp Hình 2.2... lại bên trong Tiến hành đánh giá lại các yếu tố cảm quan Đối chiếu với kết quả đối chứng rồi đánh giá khả năng khử aldehyde trong rượu của chitosan Từ đó đề xuất quy trình khử hợp lý 26 Rượu Bổ sung chitosan để khử aldehyde trong rượu ở nhiệt độ phòng trong 24h Xác định nồng độ chitosan thích hợp Xác định độ DD chitosan thích hợp Xác định phân tử lượng chitosan thích hợp Đánh giá khả năng khử aldehyde. .. tiến, trong bối cảnh của Việt Nam cũng như điều kiện thí nghiệm của Trường Đại học Nha Trang thì không thể áp dụng được Ngoài ra, những nghiên cứu trên chưa đưa kết quả ứng dụng vào một sản phẩm thực phẩm cụ thể như rượu, bia, đồ uống có cồn… Như đã đề cập, đề tài này không chỉ nghiên cứu phản ứng giữa chitosan với aldehyde mà còn ứng dụng phản ứng đó hay nói cách khác chính là việc ứng dụng chitosan để. .. phương pháp loại bỏ aldehyde trong rượu để đảm bảo tính an toàn về sức khỏe cho người sử dụng Một số phương pháp thường dùng để loại aldehyde trong rượu: Phương pháp 1: Sử dụng máy lọc rượu: Rượu cho chạy qua máy lọc có tác dụng lọc bỏ, giảm bớt các tạp chất, aldehyde, methanol, ethanol, este, mùi ngái, nồng, váng cặn trong rượu để rượu đạt các chỉ tiêu hoá học đảm bảo tiêu chuẩn rượu đóng chai Nhưng... [3] Như vậy, phản ứng khử aldehyde của chitosan tạo ra sản phẩm là một hợp chất có lợi cho sức khỏe Phương trình phản ứng: Hình 1.3 Phương trình phản ứng của chitosan và aldehyde [3] Trong đó, R có thể là aryl, alkyl hay gốc dị vòng Ví dụ: phản ứng giữa chitosan với furfural aldehyde Hình 1.4 Phản ứng giữa chitosan với furfural aldehyde [3] 18 Nói về cơ chế phản ứng giữa aldehyde và chitosan có thể được... thấp 27 - Các yếu tố như cảm quan của rượu không thay đổi hoặc thay đổi rất ít khi xử lý rượu bằng chitosan 2.2.2 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dung dịch chitosan tới khả năng khử aldehyde trong rượu Mục đích thí nghiệm: xác định được nồng độ dung dịch chitosan thích hợp nhất để khử aldehyde trong rượu với hiệu quả tối ưu nhất Thuyết minh sơ đồ: Rượu sau khi được mua về từ gia đình... dụng nấu rượu (như rượu nếp cái hoa vàng, rượu ba trăng, rượu ngô Bắc Hà, rượu nếp cẩm, rượu nếp hương, rượu mầm thóc ) Một số loại rượu nấu thủ công đóng trong chai, bình và có nhãn mác sản phẩm có thể mang tên rượu vodka Rượu cồn trắng hay còn được gọi là rượu etylic, ancol etylic, rượu ngũ cốc hay cồn, là một hợp chất hữu cơ, nằm trong dãy đồng đẳng của rượu metylic, dễ cháy, không màu, là một trong. .. các azometin của chitosan với các aldehyde: salixylaldehyde, veratraldehyde, vanillin, syrinaldehyde, xeton thơm và axetolvainilon R Andreas (2000) đã tổng hợp một loạt azometin của chitosan với các aldehyde béo: focmaldehyde, propionaldehyde, capronaldehyde, phenylpropionaldehyde, với aldehyde thơm N-benzaldehyde [3] Các công trình này chỉ nghiên cứu chế tạo dẫn xuất của chitosan với aldehyde là những... (2010) đã nghiên cứu công trình “Chế tạo kích thước các hạt nano vàng và ứng dụng xúc tác phản ứng phân hủy acetaldehyde của chitosan Trong công trình này, các nhà khoa học đã nghiên cứu kích thước các hạt nano vàng gắn trên chitosan trong dung dịch để xúc tác cải thiện khả năng phân hủy acetaldehyde ở nhiệt độ phòng 23 Keng Liang Ou, Ting Chu Hsu, Yu Chuan Liu, Kuang Hsuan Yang (2013) đã nghiên cứu “Chiến ... tài: Nghiên cứu ứng dụng dụng chitosan để khử aldehyde rượu Nội dung đề tài bao gồm: - Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ chitosan đến khả khử aldehyde rượu - Nghiên cứu ảnh hưởng độ deacetyl chitosan. .. cập đến phản ứng chitosan với aldehyde sản phẩm tạo phản ứng đó, chưa ứng dụng để khử aldehyde sản phẩm cụ thể, ví dụ rượu Chính nghiên cứu ứng dụng chitosan để khử aldehyde rượu mang tính cấp... nghiên cứu ảnh hưởng độ deacetyl chitosan tới khả khử aldehyde rượu Mục đích thí nghiệm: xác định độ DD chitosan thích hợp để khử aldehyde rượu với hiệu tối ưu Rượu Bổ sung chitosan để khử aldehyde