BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT -------***------Lê Phƣơng Hoàng Anh NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN, TỐI ƢU LÊN MEN VÀ TINH CHẾ INTERLEUKIN-2 NGƢỜI TÁI TỔ HỢP DẠNG CẢI BIẾN TRONG ESCHERICHIA COLI Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC GS. TS. Trƣơng Nam Hải Hà Nội 2013 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới GS. TS. Trương Nam Hải – Trưởng phòng Phòng Kỹ thuật di truyền, Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong suốt thời gian tôi hoàn thành khóa luận. Tiếp đến tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy, cô của trường Đại học Thái Nguyên, Viện Sinh thái và Tài Nguyên sinh vật, các thầy, cô của Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt tình giảng dạy cho tôi trong suốt thời gian tham gia khóa học. Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể các cán bộ nghiên cứu, nhân viên của phòng Kỹ thuật di truyền - Viện Công nghệ sinh học và Công ty TNHH Vắc xin và Sinh phẩm số 1(Vabiotech) trực thuộc Bộ Y Tế-Việt Nam đã tận tình chỉ bảo động viên và cho tôi những lời khuyên quý giá trong công việc cũng như cuộc sống. Và sau cùng, bằng tình cảm chân thành tôi xin được gửi lời cảm ơn tới người thân và gia đình, những người đã hết lòng ủng hộ và động viên tôi trong suốt thời gian tôi học tập và công tác. Hà Nội, ngày 02 tháng 12 năm 2013 Học viên cao học Lê Phƣơng Hoàng Anh ii Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ MỤC LỤC MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 Chƣơng 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................3 1.1 Tổng quan về ung thƣ ....................................................................................3 1.1.1 Ung thƣ ...................................................................................................3 1.1.2 Tình hình ung thƣ ở Việt Nam và trên thế giới. .....................................7 1.1.3 Các phƣơng pháp điều trị ung thƣ ........................................................10 1.1.4 Liệu pháp chữa trị ung thƣ bằng miễn dịch. .........................................11 1.2 Interleukin 2 .................................................................................................12 1.2.1 Cấu trúc gene và protein của Interleukin 2 ...........................................12 1.2.2 Hoạt tính sinh học. ................................................................................13 1.2.3 Interleukin trong chữa trị ung thƣ. ........................................................15 1.3 Hệ biểu hiện E. coli .....................................................................................16 1.3.1 Hệ biểu hiện E. coli BL21. ...................................................................17 1.3.2 Vector biểu hiện pET22b(+). ................................................................18 1.4 Sắc ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) .............................................20 1.5 Tối ƣu hóa nuôi cấy tăng sản lƣợng IL-2 bằng phần mềm thiết kế thí nghiệm Design Expert 7.0. ....................................................................................23 Chƣơng 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .........................................................25 2.1 Vật liệu ........................................................................................................25 2.1.1 Các chủng vi sinh vật, plasmid .............................................................25 2.1.2 Hóa chất, enzyme, phần mềm. .............................................................25 2.1.3 Máy móc ...............................................................................................25 2.2 Phƣơng pháp ................................................................................................25 2.2.1 Tách chiết DNA plasmid từ E. coli.......................................................26 2.2.2 Điện di DNA trên gel agarose. .............................................................27 2.2.3 Lên men tạo sản phẩm IL-2 với dòng tế bào vi khuẩn tái tổ hợp E. coli BL21. 27 2.2.4 Phƣơng pháp giải trình tự gene .............................................................28 iii Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 2.2.5 Tối ƣu hóa điều kiện lên men bằng phần mềm Design expert 7.0. ......28 2.2.6 Phƣơng pháp điện di protein trên gel polyacrylamide. .........................30 2.2.7 Phƣơng pháp kiểm tra protein bằng phản ứng đặc hiệu kháng nguyên kháng thể Western Blot. .....................................................................................31 2.2.8 Phá tế bào bằng phƣơng pháp siêu âm và xử lý mẫu protein IL-2 trƣớc khi tinh chế. ........................................................................................................32 2.2.9 Tinh chế protein bằng hệ sắc ký đảo pha RP-HPLC. ...........................33 2.2.10 Xác định độ tinh khiết của sản phẩm IL-2 tái tổ hợp sau khi tinh sạch. 33 2.2.11 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng IL-2 bằng ELISA. ..........................34 Chƣơng 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..............................................................36 3.1 Giải trình tự gene mã hóa cho IL-2 đã đƣợc cải biến ..................................36 3.2 Biểu hiện gene il2 trong chủng vi khuẩn tái tổ hợp E. coli BL21. ..............38 3.3 Tối ƣu điều kiện lên men E. coli sản xuất IL-2 tái tổ hợp dạng cải biến bằng phần mềm design expert. .......................................................................................39 a. Khảo sát các yếu tố .........................................................................................40 b. Tối ƣu bằng phần mềm ...................................................................................41 3.4 Tinh sạch IL-2 từ dòng tế bào E. coli. .........................................................46 3.5 Xác định độ sạch của mẫu IL-2 sau tinh chế bằng phần mềm Quantity One… .....................................................................................................................48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................50 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................51 iv Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Bp base pair (cặp bazơ) IARC International Agency for Research on Cancer (Cơ quan nghiên cứu Quốc tế về Ung thƣ) IFN interferon TNF tumor neucrosis factor (là một cytokine tham gia vào quá trình làm chết tế bào ung thƣ). Amp Ampicilin DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid E. coli Escherichia coli EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EtBr Ethidium bromide IPTG Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside LB Luria-betani medium MCS Multiple cloning site PCR Polymerase Chain Reaction TAE Tris Acetate EDTA SDS Sodium dodecyl sulphate BSA Bovine serum albumin (Huyết thanh bò) dH2O distilled water (nƣớc khử trùng) v/p vòng trên phút. M mol/L ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay v Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1. 1 Hình ảnh hiển vi biểu thị tế bào ung thƣ vú và tế bào vú thƣờng ...............6 Hình 1. 2 Mẫu ung thƣ tế bào thận RCC giải phẫu. Nhiều tế bào thận bị thay thế bởi tế bào ung thƣ ..............................................................................................................8 Hình 1. 3: Ung thƣ hắc tố da .......................................................................................8 Hình 1. 4 Hai mƣơi loại ung thƣ phổ biến ..................................................................9 Hình 1. 5 Cấu trúc không gian của Interleukin 2 ......................................................12 Hình 1. 6: Sự kích thích tăng sinh và biệt hóa của IL-2 lên tế bào T .......................14 Hình 1. 7: Cơ chế hoạt động của Interleukin 2 .........................................................15 Hình 1. 8: Sơ đồ cấu trúc vector pET22b+ ...............................................................19 Hình 1. 9: Cơ chế kiểm soát biểu hiện gene nhờ chất cảm ứng IPTG ......................20 Hình 1. 10: Mô hình một hệ thống HPLC.................................................................21 Hình 1. 11: Mô hình mô tả sự hấp thụ và thôi một đoạn peptide ở pha tĩnh của sắc ký đảo pha. . ..............................................................................................................22 Hình 2. 1: Công cụ RSM-CCD của phần mềm thiết kế thí nghiệm Design Expert 7.0…………………………………………………………………………………. 29 Hình 3. 1: Kết quả điện di kiểm tra plasmid trên gel Agarose……………………………………………………………………………. 37 Hình 3. 2: Kết quả kiểm tra khả năng biểu hiện IL-2 của một số dòng tế bào vi khuẩn tái tổ hợp mang plasmid pET22-IL-2. ............................................................39 Hình 3. 3: Sơ đồ tối ƣu lên men vi khuẩn tái E. coli tái tổ hợp sản xuất IL-2. .........40 Hình 3.4: Sơ đồ biểu thị kết quả khảo sát ảnh hƣởng của từng nhân tố riêng rẽ (nhiệt độ biểu hiện, thời gian biểu hiện, nồng độ chất cảm ứng IPTG) của dòng tế bào tái tổ hợp E. coli Bl21 mang vector biểu hiện pET22b-IL-2. ........................................41 Hình 3. 5: Chi tiết thiết kế và hàm lƣợng IL-2 của sau khi thực hiện 20 thí nghiệm. ...................................................................................................................................42 Hình 3. 6: Kết quả tiến hành 20 thí nghiệm đánh giá bằng phƣơng pháp ELISA và điện di SDS– PAGE. .................................................................................................43 Hình 3. 7: Đồ thị mô hình 20 thí nghiệm của phần mềm Design Expert 7.0............44 Hình 3. 8: Kết quả biểu hiện các dự đoán mà phầm mềm đƣa ra .............................45 Hình 3. 9: Kết quả tiền xử lý tinh chế phá tế bào thu dịch thô IL-2 .........................47 Hình 3. 10: Kết quả tinh chế IL-2 bằng hệ thống sắc ký lỏng cao áp HPLC............48 Hình 3. 11: Xác định thành phần độ tinh khiết của protein ......................................49 vi Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. 1 Một số oncogene và tumor suppressor genes liên quan đến ung thƣ ở ngƣời ...........................................................................................................................4 Bảng 2.1 Công thức chế 1 bản gel acrylamide………………………..………… 30 Bảng 3. 1: Điều kiện biểu hiện của các giải pháp mà phần mềm đƣa ra nhằm tìm ra điều kiện tối ƣu cho lên men.................................................................................. 45 Bảng 3. 2: Thông số phân tích băng protein xác định độ tinh khiết của sản phẩm bằng phần mềm Quantity One ..................................................................................49 vii Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ MỞ ĐẦU Cytokine là một sản phẩm trong hệ miễn dịch, đƣợc nhiều loại tế bào tiết ra. Về chức năng chúng có tác dụng đa hƣớng, đa năng và tác dụng ngƣợc trở lại chính tế bào tiết ra chúng. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng cytokine có sự liên quan không chỉ với nguyên nhân gây ra ung thƣ mà còn liên quan tới khả năng chữa trị các bệnh ung thƣ này. Việc lựa chọn đúng các yếu tố liên quan đến quá trình hình thành và phát triển ung thƣ mang tính quyết định đến việc sử dụng cytokine trong điều trị bệnh. Hiện nay có nhiều loại cytokine đƣợc phát triển thành các dƣợc phẩm thƣơng mại. Trong số đó Interleukin-2 ngƣời tái tổ hợp là một trong những loại cytokine đƣợc thƣơng mại hóa sớm nhất và đƣợc cấp phép sử dụng bởi cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ (US Food and Drug Administration-FDA) cấp phép sử dụng trong điều trị (1992). IL-2 có khả năng chữa trị ung thƣ vú, ung thƣ phổi,… và đặc biệt là hai loại ung thƣ hắc tố da và ung thƣ biểu mô tế bào thận. Trƣớc đây để có đƣợc IL-2 tinh khiết sử dụng trong điệu trị, sản phẩm này thƣờng đƣợc tách chiết từ các dòng tế bào T tự nhiên hay bằng việc nuôi cấy các tế bào động vật, ví dụ nhƣ tế bào ung thƣ hạc bạch huyết dòng Daudi. Mặc dù vậy IL2 sản xuất theo con đƣờng này có một số hạn chế đó là lƣợng IL-2 tách chiết ra thấp không đáp ứng đủ nhu cầu, hoạt tính sinh học riêng khá thấp (105 đến 106 U/mg), và thƣờng tạo thành sản phẩm có dạng glycosyl hóa cao, tạo hiệu ứng không mong muốn tới sản phẩm khi sử dụng trong điều trị. Do vậy hƣớng tạo IL-2 ngƣời bằng công nghệ mới hơn là Công nghệ DNA tái tổ hợp đã đƣợc mở ra nhằm tạo ra đƣợc lƣợng lớn IL-2. Trên thế giới, sản phẩm IL-2 thƣơng mại chủ yếu đƣợc sản xuất dựa trên công nghệ DNA tái tổ hợp. Sản phẩm thƣơng mại Proleukin (Aldesleukin) của công ty Chiron (Hoa Kỳ) sản xuất nhờ biểu hiện trong vi khuẩn Escherichia coli là một ví dụ. Trong quá trình sản xuất nhằm tăng hoạt tính và tăng tính an toàn cho sản phẩm trình tự amino acid của IL-2 đã đƣợc cải biến. Tên hóa học của sản phẩm là desalanyl-1, serein-125 human interleukin-2 mang ý nghĩa đột biến mất alanine ở vị trí 1 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ amino acid số 1, thay thế Cysteine ở vị trí 125 bằng Serine. Hiện nay công ty Chiron đang bán IL-2 tái tổ hợp với giá 680 USD/mg. Tại Việt Nam, việc sử dụng IL-2 tái tổ hợp nói riêng và sản phẩm protein tái tổ hợp sử dụng trong điều trị nói chung vẫn còn đang bị bỏ ngỏ. Mặc dù việc nghiên cứu về DNA tái tổ hợp đã đƣợc phát triển từ hơn 10 năm trở lại đây song vẫn chƣa có sản phẩm tái tổ hợp nào đƣợc triển khai áp dụng hoàn toàn quá trình nghiên cứu đến quá trình sản xuất. Ngoài ra sản phẩm Proleukin đã hết hạn bảo hộ độc quyền, do đó đây là một cơ hội để chúng tôi có thể nghiên cứu và tạo đƣợc sản phẩm Interleukin-2 ngƣời tái tổ hợp của Việt Nam, dùng trong điều trị ung thƣ với hi vọng sản phẩm đạt chất lƣợng tốt và giá thành rẻ hơn so với sản phẩm nhập khẩu. Chính vì vậy trong nghiên cứu của mình chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện, tối ƣu lên men và tinh chế IL-2 ngƣời tái tổ hợp dạng cải biến trong E. coli” nhằm tạo ra đƣợc một sản phẩm Interleukin-2 có trình tự amino acid giống với sản phẩm Proleukin đã đƣợc FDA Hoa Kỳ công nhận, có khả năng chữa ung thƣ. Mục tiêu của đề tài là nâng cao năng suất tổng hợp cũng nhƣ tinh sạch IL-2 dạng cải biến với chi phí thấp để có thể đƣa sản phẩm IL-2 ngƣời tái tổ hợp tiêu thụ trên thị. Nghiên cứu này đƣợc thực hiện nhờ sự hỗ trợ kinh phí của Dự án: “Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất Interleukin-2 ngƣời tái tổ hợp trên dòng tế bào E. coli” Mã số KC.04.DA02/11-15, và đƣợc ứng dụng kết quả thu đƣợc từ nghiên cứu và triển khai của các đề tài: (1) Đề tài khoa học công nghệ cấp Nhà nƣớc: “Nghiên cứu tạo Interleukin-2 tái tổ hợp dùng cho điều trị ung thư” (Mã số: KC.04.33) do Viện Công nghệ sinh học chủ trì, giai đoạn 2005-2007. (2) Đề tài khoa học công nghệ cấp Nhà nƣớc: “Nghiên cứu đánh giá hiệu lực của Interleukin-2 tái tổ hợp sản xuất tại Việt Nam dùng trong hỗ trợ điều trị ung thư” (Mã số: KC.04.21/06-10) do Viện Công nghệ sinh học chủ trì, giai đoạn 2009-2010. 2 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Chƣơng 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về ung thƣ 1.1.1 Ung thư Ung thƣ từ lúc bắt đầu hình thành đến lúc xuất hiện trải qua nhiều bƣớc, nhiều chu trình trao đổi chất và hoạt động bất thƣờng. Các khối u ác tính hay còn gọi là ung thƣ đƣợc biểu thị bởi các đặc tính: phát triển không ngừng, không theo mục đích, không theo mong muốn, không kiểm soát và phá hoại, ức chế quá trình sinh trƣởng của các tế bào thƣờng17[17]. Tất cả sinh vật đều đƣợc tạo ra từ các tế bào sống, các tế bào này cần phải đƣợc phân chia và tăng sinh về số lƣợng trong thời kỳ sinh trƣởng và phát triển cũng nhƣ để thay thế các tế bào đã chết hoặc bị phá hủy. Quá trình đó ngƣời ta gọi là chu trình tế bào (hay còn gọi là sự phân chia tế bào và sự sinh trƣởng của tế bào). Quá trình này thƣờng đƣợc điểu khiển bởi các gene nằm trong DNA trong nhân tế bào. Những gene này đƣợc di truyền từ bố mẹ và tế bào đƣợc thừa hƣởng những đặc tính riêng biệt bao gồm kích thƣớc, màu sắc, trọng lƣợng và những kiểu hình. Khi ở trạng thái bình thƣờng các quá trình phát triển của tế bào trong mô đƣợc kiểm soát rất cân bằng. Dạng ung thƣ sẽ đƣợc tạo thành khi sự kiểm soát bằng di truyền bị mất hoặc bị phá hủy trong một hoặc nhiều tế bào, từ đó các tế bào dạng ung thƣ tiếp tục phân chia nhiều lần và phát triển. Lƣợng lớn các tế bào phân chia không theo chu trình đó sẽ gây hại đến các tế bào và mô bình thƣờng của cơ thể, mất kiểm soát dừng phân chia, đó chính là ung thƣ. Nguyên nhân gây ra ung thƣ mà chúng ta biết đến bây giờ bao gồm nguyên nhân trực tiếp hoặc gián tiếp ảnh hƣởng đến các gene điểu khiển quá trình phân chia tế bào37[37]. Những tế bào bình thƣờng có cơ chế giúp dừng quá trình phân chia. Tế bào ở những mô nhƣ mô da, máu hoặc dòng tế bào ở miệng, cổ họng hay ở dạ dày có thời gian sống ngắn nên việc phân chia xảy ra thƣờng xuyên và luôn luôn phải đƣợc thay thế mới. Tƣơng tự nhƣ vậy, sau khi bị chấn thƣơng, hay bệnh tật thì có một số tế bào bị chết, các tế bào xung quanh chỗ bị 3 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ thƣơng sẽ phân chia sản xuất ra tế bào mới thay thế cho tế bào hỏng, tuy nhiên quá trình phân chia đó nằm trong kiểm soát. Bảng 1. 1 Một số oncogene và tumor suppressor genes liên quan đến ung thƣ ở ngƣời42[42] ONCOGENES PDGF Mã hóa cho nhân tố sinh trƣởng của tiểu cầu não, liên quan đến ung thƣ não EGFR Mã cho thụ thể của nhân tố sinh trƣởng biểu bì. Liên quan đến ung thƣ não, ung thƣ vú. HER-2 hoặc ERBB2 Liên quan đến ung thƣ vú, tuyến nƣớc bọt và buồng trứng. RET Đột biến gene này gây ra ung thƣ tuyến giáp. KRAS Liên quan đến ung thƣ phổi, buồng trứng, ruột, tuyến tụy. NRAS Liên quan đến ung thƣ máu. MYC1 Liên quan đến ung thƣ vú, máu, dạ dày và phổi BCL2 Mã hóa cho protein bất hoạt quá trình tự chết của tế bào, liên quan đến ung thƣ lympho CTNB1 Mã hóa cho beta-catenin, liên quan đến ung thƣ gan. TUMOUR SUPPRESSOR GENES APC Liên quan đến ung thƣ ruột và ung thƣ dạ dày DPC4 Mã cho phân tử tín hiệu kích hoạt quá trình ức chế phân chia tế bào, liên quan đến ung thƣ tuyến tụy P53 Mã hóa cho protein p53, là gene điều khiển quá trình dừng phân chia và kích thích tế bào bất thƣờng tự chết. Liên quan đến rất nhiều loại ung thƣ. BRCA1 Liên quan đến ung thƣ vú và ung thƣ tử cung BRCA2 Liên quan đến ung thƣ vú VHL Liên quan đến ung thƣ thận WT1 Liên quan đến ung thƣ thận Wilms’ tumor 4 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Quá trình “bật” và “tắt” chế độ phân chia là nhờ hai loại gene, có chức năng đẩy mạnh hoặc ngăn chặn quá trình phân chia tế bào. Ngày nay ngƣời ta đã nghiên cứu và phân loại đƣợc 2 loại gene đó, đặt tên là Proto-oncogenes và Tumour suppressor genes. Proto-oncogenes đảm trách nhận các tín hiệu yêu cầu phân chia, phát triển, từ đó kích thích điều hòa dƣơng trong chu trình tế bào. Tumor suppressor genes có chức năng ngƣợc lại, đây là một gene điều hòa âm của sự sinh trƣởng tế bào, chúng sẽ hoạt động khi không có tín hiệu sinh trƣởng đặc biệt. Nhƣ vậy tế bào bình thƣờng có cả hai cơ chế là điều hòa âm và điều hòa dƣơng. Cơ chế “tắt” sinh trƣởng vẫn chƣa hoàn toàn đƣợc hiểu rõ tuy nhiên có thể khẳng định đây là một quá trình quan trọng và đƣợc điều khiển dƣới sự chỉ đạo của các nhân tố di truyền, mà cụ thể ở đây là các gene trong DNA22[22]. Trong trƣờng hợp ung thƣ, không có cơ chế “tắt” nghĩa là một số Protooncogenes bị đột biến gọi là Oncogene, làm tế bào phát triển khi chƣa nhận đƣợc tín hiệu yêu cầu phân chia, một vài gene tumor suppressor bị bất hoạt vì vậy việc phân chia không theo yêu cầu không bị ức chế. Các tế bào này đƣợc nhân lên và mang đột biến sẽ tiếp tục phát triển lan ra và đi vào máu hoặc mạch bạch huyết từ đó di căn ra khắp nơi trên cơ thể10[10]. Đặc tính của ung thư: Các tế bào ung thƣ rất khác nhau về tính chất có kiểu hình rất khác biệt so với các tế bào mà chúng tồn tại ở xung quanh. Tế bào ung thƣ có thể có hình dạng rất quái dị, kích thƣớc lớn. Nhân tế bào ung thƣ bất thƣờng, chúng to và sẫm mầu hơn, tế bào chất nhỏ hơn tế bào thƣờng ví dụ nhƣ tế bào ung thƣ vú và tế bào vú bình thƣờng (Hình 1. 1). 5 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ b a Hình 1. 1 Hình ảnh hiển vi biểu thị tế bào ung thƣ vú và tế bào vú thƣờng a) tế bào vú bình thƣờng và b) cụm tế bào bao gồm cả tế bào thƣờng và tế bào ung thƣ vú lây từ bệnh nhân ung thƣ vú giai đoạn cuối (độ phóng đại 400 lần)37[37]. Nguyên nhân gây ung thư: Các nhà nghiên cứu về ung thu đang cố gắng tìm kiếm nguyên nhân cho các bệnh ung thƣ và giải quyết từng nguyên nhân một. Quá trình chuyển từ tế bào bình thƣờng sang tế bào ác tính (yếu tố ung thƣ) có thể diễn ra trong thời gian từ một vài tuần đến vài năm. Sự biến đổi đó có thể do di truyền hoặc do nguyên nhân bên ngoài. Dù là nguyên nhân nào thì hầu hết các trƣờng hợp ung thƣ đều là do sự đột biến từ tế bào soma, do đột biến các oncogene và tumor suppressor, hoặc đột biến với gene sửa sai DNA trong chu trình tế bào. Ngày nay ngƣời ta tin rằng ung thƣ xảy ra trong một tế bào bình thƣờng khi xuất hiện khoảng 6-12 đột biến ở các gene quan trọng nói trên. Các tác nhân gây ung thƣ có thể đƣơc phân loại nhƣ: sai hỏng quá trình chết tự nhiên apotosis, sử dụng nhiều thuốc lá rƣợu bia, ảnh hƣởng từ các chất hóa học gây ung thƣ, hấp thụ quá nhiều tia UV, bị nhiễm phóng xạ, hoặc liên quan đến hormones4[4]. Ung thƣ có thể đƣợc phân loại dựa trên dạng tế bào khởi nguồn. Ví dụ nhƣ: ung thƣ bắt nguồn từ máu thì gọi là ung thƣ máu, bắt nguồn từ mạch bạch huyết gọi là ung thƣ mạch bạch huyết,… Ngoài ra, ung thƣ cũng có thể phân loại dựa trên dạng khối u, ví dụ nhƣ ung thƣ thể rắn (ung thƣ phổi, ung thu vú) hoặc dạng bệnh máu ác tính nhƣ ung thƣ bạch huyết, ung thƣ tủy xƣơng38[38]. 6 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 1.1.2 Tình hình ung thư ở Việt Nam và trên thế giới. Tình hình ung thƣ trên thế giới Theo điều tra của Tổ chức Y tế thế giới WHO, trong năm 2008 có khoảng 12,7 triệu ca ung thƣ mới. Khoảng 7,6 triệu ngƣời đã tử vong vì ung thƣ (cùng với các bệnh lý về tim mạch, ung thƣ là nguyên nhân hang đầu chiếm khoảng 13% tổng số tử vong trên toàn thế giới). Hiện nay dân số thế giới vào khoảng 7 tỷ ngƣời, ƣớc tính đến năm 2030 sẽ tăng lên thành 8,3 tỷ, khả năng mắc ung thƣ mới mỗi năm khoảng 27 triệu ngƣời, 17 triệu ngƣời chết vì ung thƣ38[38]. Theo tổ chức nghiên cứu thế giới về ung thƣ IARC, trong các trƣờng hợp mắc bệnh và tử vong vì ung thƣ trên thế giới, ƣớc tính khoảng hơn một nửa số ca có liên quan và hơn hai phần ba trƣờng hợp ung thƣ sẽ gia tăng ở những nƣớc có thu nhập thấp và trung bình. Ung thƣ chủ yếu tập trung vào các dạng nhƣ: ung thƣ phổi, ung thƣ vú, ung thƣ tiền liệt tuyến, ung thƣ buồng trứng, ung thƣ gan, ung thƣ máu, ung thƣ thận, ung thƣ da,…. Trong đó ung thƣ da và ung thƣ tế bào thận chiếm tỷ lệ khoảng 2% tổng số ca ung thƣ8[8]. Ung thư tế bào thận (Renal Cell Carcinoma) và ung thư hắc tố da (melanoma): Theo tổ chức Y tế Thế giới WHO, ung thƣ thận đứng thứ 14 trong bảng xếp hạng những loại ung thƣ thƣờng gặp nhất trên thế giới, với khoảng 274.000 ca mắc mới đƣợc phát hiện vào năm 2008, Ung thƣ tế bào thận (renal cell carcinoma-RCC) là dạng phổ biến nhất của ung thƣ thận. Cứ khoảng 10 ngƣời mắc ung thƣ thận thì trong đó 9 ngƣời là ung thƣ tế bào thận RCC28[28]. 7 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Hình 1. 2 Mẫu ung thƣ tế bào thận RCC giải phẫu. Nhiều tế bào thận bị thay thế bởi tế bào ung thƣ8[8] Ung thƣ da bao gồm non-melanoma và melanoma ngày càng gia tăng về số lƣợng ngƣời mắc trong một thập kỷ trở lại đây. Cụ thể có từ 2 đến 3 triệu ngƣời mắc chứng ung thƣ da non-melanoma và khoảng 132.000 ngƣời mắc chứng ung thƣ da melanoma mỗi năm. Tầng ozone bị thủng là môt trong những nguyên nhân chính gia tăng số lƣợng bệnh này, ƣớc tính cứ mỗi 10% mức ozone bị mất đi sẽ làm xuất hiện 300.000 bệnh ung thƣ da253[3][25]. Trong nhiều trƣờng hợp nguyên nhân gây ung thƣ tế bào thận và hắc tố da không xác định đƣợc. Trong một số trƣờng hợp khác ví dụ nhƣ ung thƣ do yếu tố di truyền), thì nguyên nhân gây ung thƣ là xác định đƣợc và có thể phòng ngừa, chữa trị. Hình 1. 3: Ung thƣ hắc tố da8[8] Cũng nhƣ các loại ung thƣ khác, ung thƣ tế bào thận và ung thƣ da chủ yếu đƣợc chữa trị dựa vào các phƣơng pháp, phẫu-hóa-xạ trị, và liệu pháp sinh học. Mục tiêu của liệu pháp sinh học là giúp hệ miễn dịch chiến đấu và phá hủy tế bào ung thƣ hiệu quả và mạnh mẽ hơn. Loại thuốc đƣợc sử dụng hiệu quả nhất cho ung thƣ thận và ung thƣ hắc tố da là một loại cytokine (protein hoạt hóa hệ miễn dịch 8 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ chủ) có tên là Aldesleukin của hãng Chiron Mỹ, bản chất là interleukin-2 của ngƣời dƣới dạng tái tổ hợp. Khả năng chữa trị cho hai loại ung thƣ này có thể lên đến 18% đối với ung thƣ hắc tố ác tính và 37% đối với ung thƣ tế bào thận20[20]. Hình 1. 4 Hai mƣơi loại ung thƣ phổ biến40[40] Tình hình ung thƣ ở Việt Nam Việt Nam là một nƣớc đang phát triển, thu nhập bình quân đầu ngƣời thấp, có đời sống chƣa cao, khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, chủ yếu bệnh tật là các bệnh truyền nhiễm và suy dinh dƣỡng. Xã hội ngày càng phát triển kéo theo đó là sự thay đổi về kinh tế, đời sống đƣợc nâng cao, các bệnh truyền nhiễm và suy dinh dƣỡng giảm mạnh thay vào đó các bệnh nhƣ ung thƣ, tim mạch, tiểu đƣờng tăng nhanh. Kinh tế phát triển nhanh đồng nghĩa với vấn đề ô nhiễm môi trƣờng, chất lƣợng thức ăn,… 9 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Chính vì vậy tỷ lệ ung thƣ ngày càng gia tăng. Theo bác sỹ Mai Trọng Khoa giám đốc bệnh viện Bạch Mai Hà Nội khẳng định khi trả lời phỏng vấn tờ báo Tuổi Trẻ, hiện nay tại Việt Nam có khoảng 110.000 ngƣời mắc ung thƣ mới trong đó khoảng 82.000 ngƣời tử vong do ung thƣ mỗi năm, chiếm tới 73,5% tổng số bệnh nhân ung thƣ. Đây là tỷ lệ tử vong thuộc hàng cao nhất thế giới, so với tỷ lệ tử vong trên tổng số bệnh nhân ung thƣ toàn cầu là 59,7% (đối với các nƣớc đang phát triển là 67,8% và nƣớc phát triển là 49,4%). Theo số liệu thống kê của bệnh viện K-Hà Nội và Trung tâm U bƣớu Thành phố Hồ Chí Minh, hằng năm số lƣợng bệnh nhân mắc ung thƣ tăng thêm khoảng 20-30% (Tiến sỹ Trần Văn Thuận, giám đốc bệnh viện K Hà Nội). Mƣời loại ung thƣ phổ biến nhất là phổi, dạ dày, gan, đại tràng, vòm họng, thận, da, vú, tiền liệt tuyến, cổ tử cung27[27]. 1.1.3 Các phương pháp điều trị ung thư Mặc dù ung thƣ là một căn bệnh nan y nhƣng nếu đƣợc phát hiện ở giai đoạn sớm và chữa trị kịp thời, bệnh hoàn toàn có thể đƣợc chữa khỏi. Hiện nay, phẫu trị, xạ trị và hóa trị là ba liệu pháp chuẩn trong điều trị bệnh ung thƣ. Phẫu trị ung thƣ đƣợc Halsted hệ thống vào cuối thế kỷ 19, là phƣơng pháp cắt bỏ khối u và một số mô, một số hạch bạch huyết xung quanh. Tuy nhiên phƣơng pháp này phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm kích thƣớc khối u, vị trí khối u, cách phẫu thuật và tình trạng của bệnh nhân. Phƣơng pháp xạ trị bắt đầu với Henri Becquerel, Marie Curie vào đầu thế kỷ 20, phƣơng pháp này sử dụng một dạng năng lƣợng là phóng xạ ion hóa để làm teo nhỏ và tiêu diệt khối u bằng cách làm tổn thƣơng tế bào, khiến chúng không thể phát triển và phân chia. Ngoài việc tiêu diệt tế bào thƣờng thì phƣơng pháp này còn làm tổn thƣơng cả tế bào bình thƣờng. Phƣơng pháp hóa trị mới bắt đầu sau Thế chiến thứ II, là phƣơng pháp điều trị dựa vào hóa chất có khả năng tiêu diệt tế bào ung thƣ. Chúng can thiệp vào quá trình phân bào theo các con đƣờng nhƣ quá trình phân chia nhiễm sắc thể tạo thành. 10 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Phƣơng pháp này ngoài tác động đến tế bào ung thƣ còn ảnh hƣởng đến tế bào thƣờng. Ba liệu pháp này đƣợc sử dụng chủ yếu cho ngƣời bệnh ung thƣ. Nguyên lý kết hợp nhuần nhuyễn phẫu-xạ-hóa trị liệu là liệu pháp đa mô thức đƣợc vận dụng cho kết quả tối ƣu1[1]. Để khắc phục nhƣợc điểm của các phƣơng pháp nói trên, liệu pháp sinh học nhƣ hormone trị liệu hay liệu pháp miễn dịch, đƣợc áp dụng để phối hợp điều trị một số loại ung thƣ. Điểm nổi trội của liệu pháp điều trị mới này là khả năng điều trị ngăn chặn chính xác ung thƣ mà không cần phá hủy (ví dụ các vaccine phòng ung thƣ), có thể giúp đƣa tế bào trở lại bình thƣờng (liệu pháp gene, gene therapy), hay có thể điều trị ức chế ung thƣ mà không gây nhiều phản ứng phụ nhƣ sử dụng các protein hòa tan kích thích miễn dịch. 1.1.4 Liệu pháp chữa trị ung thư bằng miễn dịch. Trên thế giới liệu pháp cytokine từ hơn 30 năm trƣớc và đƣợc coi là hƣớng điều trị tích cực với bệnh nhân ung thƣ14[14]. Ở Việt Nam việc sử dụng cytokine vẫn còn khá mới mẻ. Rất nhiều cytokine đang đƣợc nghiên cứu cũng nhƣ thử nghiệm trong điều trị lâm sàng, tuy nhiên hiện tại chỉ có một số loại cytokine đƣợc công nhận để điều trị ung thƣ chỉ gồm: IL-2, IFN-α, IL-11, G-CSF, GM-CSF. Một số cytokine khác cũng đƣợc phép sử dụng nhƣng vẫn còn hạn chế do chƣa kiểm soát đƣợc khả năng loại thải cũng nhƣ các hiệu ứng phụ khác nhƣ TNF-α, IL-12. Ƣu điểm của cytokine trong điều trị ung thƣ so với các phƣơng pháp khác là việc kiểm soát ung thƣ và các ảnh hƣởng của ung thƣ. Bệnh thiếu máu liên quan đến ung thƣ có thể đƣợc hỗ trợ bằng cách sử dụng EPO (erythropoietin)24[24]. IL11 và IL-3 kích thích sự tạo thành tiểu cầu, sử dụng để chữa bệnh thrombocytopenia sau khi đã đƣợc hóa trị liệu35[35]. IL-2 đƣợc công nhận và cấp phép để điều trị một số bệnh ung thƣ nhƣ ung thƣ biểu mô, ung thƣ mạch bạch huyết, đặc biệt là ung thƣ tế bào thận và ung thƣ da. Việc sử dụng GM-CSF và G-CSF tiếp sau hóa trị liệu và cấy ghép tủy xƣơng có thể thúc đẩy nhau quá trình phục hồi của các tế bào myeloid, giảm rủi ro lây nhiễm. 11 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Hiệu quả sử dụng cytokine để điều trị bệnh ung thƣ là chƣa vƣợt trội, tuy nhiên có sự kết hợp và bổ trợ với các phƣơng pháp khác thì hiệu quả sẽ tăng gấp nhiều lần. Ngoài ra các cytokine có thể kết hợp với kháng thể đơn dòng để tạo hiệu quả miễn dịch cao sử dụng cho mục đích khác, nhƣ làm tá dƣợc cho các loại vaccine44[44]. 1.2 Interleukin 2 Interleukin-2 của ngƣời là một loại cytokine quan trọng trong hệ thống miễn dịch, gene mã hóa cho IL-2 đƣợc tách từ tế bào lách ngƣời, tế bào lympho T,…29[29]. 1.2.1 Cấu trúc gene và protein của Interleukin 2 Gene mã hóa cho IL-2 nằm trên nhiễm sắc thể số 4. Khung đọc mở suy diễn từ trình tự cDNA mã hóa cho phân tử IL-2 hoàn chỉnh gồm 153 amino acid, trong đó 20 amino acid mở đầu là tín hiệu tiết. Trong cấu trúc DNA, gene mã hóa cho IL-2 cũng bao gồm hộp TATA, vị trí khởi đầu sao mã, phiên mã, bốn vị trí exon và ba vị trí intron. Protein hIL-2 sau quá trình biến đổi hậu dịch mã sẽ bị cắt đi 20 amino acid tín hiệu tiết và tạo thành IL-2 hoàn chỉnh gồm 133 amino acid. Hình 1. 5 Cấu trúc không gian của Interleukin 2 12 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Các kết quả nghiên cứu trƣớc đây cho thấy phân tử IL-2 có 3 vùng đóng vai trò quan trọng trong hoạt tính sinh học của IL-2 đó là: Tận cùng đầu N (từ amino acid 1 đến amino acid 20). Vùng tận cùng đầu C (từ amino acid 121 đến 133) và cầu disulfide giữa các gốc Cys58 và Cys105. Đột biến mất 20 amino acid ở đầu N và 10 amino acid ở đầu C làm mất 99% hoạt tính của IL-2 và khả năng bám vào các thụ thể của IL-2. Trình tự amino acid của IL-2 ngƣời tự nhiên chứa 3 gốc Cystein ở các vị trí 58, 105, 125. Đột biến Cys105 làm giảm 8-10 lần hoạt tính, đột biến Cys58 làm giảm hoạt tính 250 lần. Đột biến Cys125 ảnh hƣởng rất ít tới hoạt tính IL-221[21], đặc biệt nếu thay Cys125 bằng Ser125 thì hoạt tính của IL-2 không bị ảnh hƣởng. Nhờ đó nếu thay đổi Cys125 bằng Ser125 thì sẽ ngăn cản việc tạo thành cầu disulfide không mong muốn. Tại đầu N của protein IL-2 có điểm glycosyl hóa đƣợc nhận biết bởi trình tự Ala-Pro-Thr ở vị trí 3 amino acid đầu tiên. Trong tự nhiên IL-2 tồn tại ở trạng thái glycosyl hóa có tính thấm cao với màng tế bào do vây, nếu sử dụng IL-2 liều lƣợng lớn IL-2 sẽ gây nên tạo thành tính độc trong cơ thể. Vì vậy IL-2 dạng thƣơng phẩm dùng làm thuốc tiêm không đƣợc mang các gốc đƣờng ở đầu N. IL-2 thƣơng phẩm đã đƣợc FDA công nhận để chữa ung thƣ là Proleukin (Aldesleukin) của Chiron Hoa kỳ có trình tự amino acid loại bỏ alanine ở đầu N, thay thế cysteine ở vị trí 125 bằng serine12[12]. 1.2.2 Hoạt tính sinh học. Trong tự nhiên , IL-2 là một glycoprotein, có khả năng hoạt hóa tế bào giết tự nhiên (natural killer-NK) và tế bào gây độc (Cytoxic T lymphocyte - CTL), biệt hóa tế bào lympho giết tự nhiên (Lymphokine activated killer-LAK cells). Có rất nhiều nghiên cứu về IL-2 trên thế giới và các nghiên cứu đó tập trung nhiều nhất vào chức năng quan trọng của IL-2 trong hệ miễn dịch. IL-2 chủ yếu đƣợc sinh ra từ tế bào T CD4+ (tế bào trợ giúp T helper TH) ngoài ra IL-2 còn đƣợc sinh ra bởi tế bào T CD8+ và tế bào T giết tự nhiên (natural killer T-NKT cells), ở một số điều kiện đặc biệt, lƣợng nhỏ IL-2 cũng có thể đƣợc tạo ra từ các tế bào dendritic hoạt hóa (activated dendritic cells)9[9]. 13 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Hình 1. 6: Sự kích thích tăng sinh và biệt hóa của IL-2 lên tế bào T Tế bào T hoạt hóa biểu hiện thụ thể bề mặt cùng với sự tiết IL-2, IL-2 bám vào thụ thể trên tế bào và kích thích sự phân chia tế bào. Khi tế bào T không còn đƣợc kích thích bởi kháng nguyên thì thụ thể IL-2 sẽ tự tiêu biến. Nhờ khả năng kích thích làm tăng các loại tế bào có khả năng diệt khối u, khi chạm trán tế bào bất thƣờng, tế bào NKT đã hoạt hóa tấn công và tiêm những hạt tế bào chất làm phân hủy tế bào đích. Cho dù nhỏ hơn tế bào ung thƣ hay thể virus, tế bào NKT thƣờng có thể tiêu diệt cùng lúc 2 hoặc nhiều tế bào ung thƣ. Ngoài ra IL2 còn kích thích tăng sinh một số tế bào khác nhƣ tế bào T gây độc CTL, NK và LAK,… Điều này giúp cho cơ thể chống lại bệnh ung thƣ. 14 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Hình 1. 7: Cơ chế hoạt động của Interleukin 2 IL-2 có thể gây độc, gây sốt và sốc trong điều trị. Nguyên nhân gây độc đƣợc xác định là do 2 nguyên nhân. Thứ nhất, IL-2 có điểm glycosyl hóa đƣơc nhận biết bởi trình tự Ala-Pro-Thr ở 3 vị trí amino acid đầu tiên. Do vậy IL-2 tự nhiên có tính thấm cao với màng tế bào gây đọc với cơ thể bệnh nhân điều trị bằng IL-2. Thứ hai, độc tính của protein này là do IL-2 gián tiếp tác động lên các tế bào làm tăng quá trình tiết TNF, INFγ và chất độc lymphotoxin. Chính vì vậy, nhờ kỹ thuật di truyền, IL-2 có thể đƣợc cải biến theo hƣớng giảm độc tính bằng cách mất vị trí glycosyl hóa mà vẫn giữ nguyên đƣợc hoạt tính sinh học vốn có. 1.2.3 Interleukin trong chữa trị ung thư. Cho đến nay, IL-2 đã đƣợc công nhận là có hiệu quả trong việc điều trị ung thƣ, nhƣ ung thƣ bạch cầu, ung thƣ phổi, ung thu buồng trứng, ung thƣ vú,… đặc biệt là ung thƣ hắc tố và ung thƣ tế bào thận39[39]. Từ năm 1992, tổ chức FDA của Hoa kỳ đã chính thức cho phép sử dụng IL-2 cho việc chữa trị ung thƣ tế bào thận (renal cell carcinoma) và ung thƣ hắc tố da ác tính (malignant melanoma)32[32]. Tuy nhiên điều trị ung thƣ sử dụng liệu pháp IL-2 liều cao gây độc với cơ thể bệnh nhân. Hiệu ứng này gây nên những tác dụng phụ không mong muốn nhƣ chảy máu trong, phát ban, phù nề, thậm chí tử vong. Chính vì vậy sản phẩm IL-2 sản xuất bằng công nghệ tái tổ hợp thƣơng phẩm đã đƣợc phân chia vào danh mục thuốc độc bảng A19[19]. Mặc dù vậy trong quá trình điều trị, các tác dụng phụ đƣợc khắc phục bằng nhiều biện pháp khác nhau. Nhiều công trình nghiên cứu, thử nghiệm đã đƣợc 15 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ công bố trên nhiều tạp chí khoa học, trong đó có Viện Ung thƣ quốc gia Hoa Kỳ, đã tiến hành thử nghiệm IL-2 liều cao với hơn một ngàn bệnh nhân trong vòng hơn mƣời năm và xác định phƣơng pháp giảm bớt độc tính của cytokine này với ngƣời bệnh34[34]. Nhƣ vậy việc sử dụng IL-2 liều cao một cách an toàn trong điều trị là hoàn toàn khả thi. Hiện nay ở Việt Nam, phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm khoa học và công nghệ Việt Nam là đơn vị duy nhất nghiên cứu và chế tạo thành công sinh phẩm Interleukin -2 tái tổ hợp của ngƣời nhằm điều trị ung thƣ. 1.3 Hệ biểu hiện E. coli E. coli là một hệ biểu hiện lý tƣởng, dễ thao tác, có thể sản xuất dạng protein tái tổ hợp từ nhiều nguồn gốc khác nhau cũng nhƣ có khả năng thu nhận các vector bản chất là plasmid. Vi khuẩn E. coli đáp ứng đƣợc hầu hết các yêu cầu của một hệ biểu hiện, thực tế trên thế giới rất nhiều phòng thí nghiệm sử dụng vi khuẩn E. coli làm tế bào chủ để biểu hiện protein tái tổ hợp. E. coli là vi khuẩn gram âm, mỗi tế bào chỉ tồn tại một nhiễm sắc thể duy nhất hay còn gọi là nucleoid. Kích thƣớc genome của E. coli khoảng 4,6 x 106 base pairs. Hệ biểu hiện vi khuẩn là sự lựa chọn hàng đầu để sản xuất các protein tái tổ hợp. Lý do là chi phí để biểu hiện protein bằng hệ vi khuẩn thƣờng khá rẻ. Đặc biệt là với hệ biểu hiện E. coli, đây là hệ biểu hiện phổ biến nhất để sản xuất protein tái tổ hợp do có thời gian sinh trƣởng nhanh, có khả năng duy trì lên men và tạo sinh khối lớn bằng việc cung cấp thêm dinh dƣỡng vào những thời điểm nhất định. Nguyên liệu sử dụng để nuôi E. coli rẻ tiền và có hiệu suất biểu hiện cao43[43]. Quá trình biểu hiện gene (bao gồm phiên mã và dịch mã) luôn tạo ra phân tử mRNA và protein nhanh chóng. Toàn bộ trình tự của vi khuẩn này đã đƣợc giải mã bằng máy giải trình tự thế hệ mới36[36]. Hầu hết các phòng thí nghiệm đều sử dụng, với nhiều 16 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ chủng khác nhau dùng cho các mục đích riêng biệt, nhƣ tách dòng (E. coli DH10B, E. Coli DH5α,…) chủng biểu hiện ( E. coli BL21 DE3, E. coli rossetta, …). Hạn chế lớn nhất của hệ biểu hiện E. coli chính là việc thiếu các quá trình cải biến sau dịch mã nhƣ glycosyl hóa, phosphoryl hóa,… do đó các protein tái tổ hợp có nguồn gốc từ sinh vật nhân chuẩn không cuộn xoắn đúng cấu trúc, protein tái tổ hợp thƣờng tạo thành dạng không tan inclusion body, theo đó là hoạt tính sinh học cũng bị giảm đi đáng kể. Tuy nhiên đã có nhiều giải pháp để khắc phục những những nhƣợc điểm trên1613[13][16], do vậy cùng với những ƣu điểm vƣợt trội E. coli vẫn là một trong những chủng biểu hiện rộng rãi nhất trong công nghệ DNA tái tổ hợp. 1.3.1 Hệ biểu hiện E. coli BL21. E. coli BL21 là chủng thƣơng mại đƣợc sử dụng nhiều làm vật chủ biểu hiện. Hệ gene của chủng E. coli BL21 đã đƣợc cải biến một số gene là ompT, hsdS, gal, dcm,λDE3. Ý nghĩa của việc đột biến các gene đó nhƣ sau: - Gene ompT: là một gene mã cho protease nằm trên màng ngoài tế bào, chủng khuyết gene ompT giúp tránh việc các protein tái tổ hợp bị phá hủy ngay trong tế bào15[15]. - Gene hsdS: là một gene có chức năng phân giải plasmid ngoại lai xâm nhập tế bào chủ23[23], chủng BL21 khuyết hsdS để quá trình biến nạp vector tái tổ hợp đƣợc hiệu quả hơn. - Gene gal: chủng BL21 (DE3) khuyết gene gal giúp tránh việc tế bào sử dụng galactose làm nguồn carbon cho sinh trƣởng33[33]. - Gen dcm: là gene methyl hóa trình tự (CCAGG và CCTGG), chủng khuyết gene dcm tránh việc trình tự gene ngoại lai bị methyl hóa dẫn đến sai khác trong việc biểu hiện protein tái tổ hợp5[5]. 17 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ - T7 RNA Polymerase (λDE3 và lacUV5): BL21 (DE3) có hệ promoter lacUV5 dùng để điều khiển quá trình biểu hiện, đây là một promoter đã đƣợc đột biến và đƣợc tạo ra từ phage λ, promoter này mạnh hơn bất kỳ promoter của hệ biểu hiện vi khuẩn tự nhiên nào26[26]. Ngoài ra chủng E. coli BL21 (DE3) còn một dạng thƣơng mại nữa là dạng có tích hợp thêm plasmis pLysS, plasmid này mang gene mã cho T7 lysozyme làm một loại protein có 2 chức năng: (i) phân giải thành tế bào vi khuẩn, (ii) là khóa sự hoạt động của T7 RNA polymerase, sự có mặt của protein này giúp quá trình biểu hiện nhờ promoter T7 (hay còn gọi là promoter lacUV5) không đƣợc kích hoạt cho đến khi cảm ứng IPTG, lúc đó số lƣợng T7 RNA Polymerase tăng nhanh chóng, vƣợt quá khả năng ức chế của T7 lysozyme. 1.3.2 Vector biểu hiện pET22b(+). Để biểu hiện gene trong E. coli BL21 vector đƣợc sử dụng có thể là các plasmid, phage, cosmid. Vector là một plasmid đƣợc thiết kế nhằm mục đích giúp sản xuất lƣợng lớn protein khi đƣợc kích thích bằng chất cảm ứng (lactose hoặc IPTG). Cấu trúc của vector pET22b(+) đƣợc biểu thị trên Hình 1. 8. Plasmid này chứa một vài yếu tố quan trọng nhƣ gene lacI mã hóa cho protein ức chế biểu hiện gene ngoại lai, promoter T7 đặc hiệu với RNA polymerase, operator, vị trí đa điểm cắt multicloning site, điểm khởi đầu tái bản f1, gene chọn lọc (gene kháng kháng sinh ampicillin). Gene của protein tái tổ hợp cần sản xuất đƣợc chèn vào vị trí đa điểm cắt trong vector. Promoter T7 và lac operator đều nằm ở đầu 5’ của gene. Bình thƣờng T7 RNA polymerase bị ức chế bởi sự kiểm soát của sản phẩm gene lacI là lac repressor, khi có mặt chất cảm ứng IPTG, chất này sẽ làm thay đổi cấu trúc của lac repressor và T7 RNA polymerase đƣợc tạo thành từ genome của chủng E. coli DE3, nhờ đó gene ngoại lai đƣợc phiên mã và dịch mã để tổng hợp protein. Cơ chế kiểm soát biểu hiện gene bằng chất cảm ứng IPTG đƣợc thể hiện ở sơ đồ Hình 1. 9. 18 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Trong vector pET22b+ còn có trình tự tiết pelB giúp protein ngoại lai tiết ra khoang chu chất. Sau khi đi vào khoang chu chất thì đoạn peptide tín hiệu này sẽ bị cắt bởi một protease xác định. Hình 1. 8: Sơ đồ cấu trúc vector pET22b+ 19 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Hình 1. 9: Cơ chế kiểm soát biểu hiện gene nhờ chất cảm ứng IPTG 1.4 Sắc ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Sắc ký là một kỹ thuật thƣờng đƣợc sử dụng trong các phòng thí nghiệm, với mục đích nhằm phân tách một hỗn hợp và định lƣợng các chất trong hỗn hợp đó. Hỗn hợp cần phân tích đƣợc pha với dung dịch gọi là pha động, nhờ đó chúng có thể đi vào những chất giá có cấu trúc giúp mang giữ và phân tách các chất tùy theo mục đích phân tách (theo khối lƣợng, theo ái lực, theo độ kỵ nƣớc,…) gọi là pha tĩnh. Các chất khác nhau có tốc độ di chuyển trong pha tĩnh khác nhau, điều đó tạo nên sự phân tách giữa các chất trong hỗn hợp pha động. Phƣơng pháp sắc ký thƣờng chỉ cần một lƣợng nhỏ hỗn hợp để phân tích. Có nhiều loại sắc ký đã đƣợc nghiên cứu và sử dụng trên thế giới bao gồm: sắc ký lỏng, sắc ký khí, sắc ký ái lực, sắc ký giấy, sắc ký bản mỏng, sắc ký cột …. Sắc ký hiệu năng cao HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC - (High-performance liquid chromatography) hay còn gọi là sắc ký lỏng cao áp (High-pressure liquid chromatography) là kỹ thuật thƣờng sử dụng trong hóa học, sinh học để phân tích đặc tính của các chất hóa học 20 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ hoặc các đoạn peptide ngắn theo khối lƣợng, độ kỵ nƣớc 31[31],... Cấu trúc của một hệ thống sắc ký HPLC các thành phần chính nhƣ sau: Một loại cột đƣợc nhồi chất giá có bản chất khác nhau tùy mục đích phân tách: thƣờng đƣợc làm bằng thép không rỉ, chịu đƣợc áp suất cao. Chất giá nhồi trong cột thƣờng là các hạt silicagel có bọc hoặc gắn hóa học một màng mỏng chất hữu cơ có kích thƣớc từ 3 đến 10 µm. Một hệ thống bơm chuyển pha động vào cột. Một detector làm nhiệm vụ phát hiện tín hiệu vào ra (Hình 1. 10). Hình 1. 10: Mô hình một hệ thống HPLC Mẫu cần phân tích chỉ cần đƣa vào pha động bằng một thể tích nhỏ, sau đó pha động (bao gồm đệm và mẫu) sẽ đi qua pha tĩnh, nhờ ái lực mà mẫu đƣợc giữ lại, chỉ phân tách ở các thời điểm khác nhau khi có các hóa chất thích hợp ở nồng độ xác định. Với sự phát triển của các kỹ thuật về sắc ký trong những năm gần đây, sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC trở thành phƣơng pháp ƣa thích cho việc tách và phân tích định lƣợng nhiều loại mẫu. Phân tích HPLC nhanh, hiệu quả và có thể dò tìm lƣợng mẫu có lƣợng nhỏ đến 200 pg30[30]. Các loại sắc ký cột mở, sắc ký bản mỏng, sắc ký giấy đƣợc sử dụng trong những trƣờng hợp tách đơn giản các chất, 21 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ còn HPLC là kỹ thuật tách những hỗn hợp phức tạp và có khả năng tách với độ phân giải cao với tốc độ nhanh và chất lƣợng tốt hơn. Có nhiều loại sắc ký HPLC tùy vào mục đích sử dụng cũng nhƣ tính chất của các chất cần phân tách mà ngƣời ta có thể sử dụng các loại sắc ký HPLC sắc ký pha thƣờng (normal phase HPLC), sắc ký đảo pha (Reverse Phase-RP-HPLC), sắc ký lọc gel, sắc ký ái lực…Sắc ký đảo pha là một kỹ thuật đƣợc sử dụng nhiều trong hệ thống HPLC để phân tách và tinh sạch các mảnh polypeptide nhỏ. Trong sắc ký đảo pha, protein đƣợc phân tách nhờ đặc tính phân cực của chúng. Pha tĩnh không phân cực, thƣờng cấu tạo bởi một hydrocarbon, pha động thƣờng phân cực ví dụ nhƣ nƣớc, methanol, propanol hoặc acetolnitrile trộn với mẫu cần phân tách. Hỗn hợp protein và các đoạn peptide không phân cực hoặc phân cực thấp sẽ lần lƣợt phân tách ra ngoài trong hoặc ngay sau khi đƣa mẫu lên pha tĩnh. Khi bắt đầu tăng nồng độ chất phân cực trong đệm (chất cạnh tranh), phân tử có độ phân cực thấp bắt đầu đi ra trƣớc, sau đó dần dần, những chất có độ phân cực cao hơn bắt nối tiếp theo sau. Đoạn polypeptide đi vào pha tĩnh của cột sắc ký đảo pha Polypeptide được hấp thụ vào bề mặt của chất giá Polypeptide được thôi ra khỏi pha tĩnh khi nồng độ của chất cạnh tranh đạt đến khoảng tới hạn Hình 1. 11: Mô hình mô tả sự hấp thụ và thôi một đoạn peptide ở pha tĩnh của sắc ký đảo pha. Polypeptide nằm trong pha động đi vào cột, các “chân” kỵ nƣớc của bề mặt vật liệu trong pha đảo sẽ giữ các polypeptide lại, cho đến lúc nồng độ của chất cạnh tranh trong pha động đạt đƣợc giá trị tới hạn thì các polypeptide sẽ đƣợc thôi ra41[41]. 22 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 1.5 Tối ƣu hóa nuôi cấy tăng sản lƣợng IL-2 bằng phần mềm thiết kế thí nghiệm Design Expert 7.0. Trƣớc đây thông thƣờng để tăng sản lƣợng protein tái tổ hợp các nhà nghiên cứu sử dụng kỹ thuật khảo sát điểm tối ƣu của từng điều kiện. Đây là phƣơng pháp áp dụng cho từng yếu tố ảnh hƣởng đến sản lƣợng, nói chung nếu đánh giá với yếu tố riêng rẽ thì kỹ thuật này cho kết quả khả quan, tiến hành đơn giản ít thí nghiệm, tuy nhiên không thể đánh giá một cách chính xác ảnh hƣởng của các yếu tố cần tối ƣu với nhau. Nếu muốn tìm ra điểm tối ƣu (giao điểm giá trị của các nhân tố tại đó sản lƣợng protein tái tổ hợp cao nhất) thông thƣờng phải làm rất nhiều thí nghiệm và khi kết hợp các điểm tối ƣu riêng rẽ với nhau thì hiệu quả chƣa phải đã là tốt nhất11[11]. Một phƣơng pháp khác mới (phƣơng pháp đáp ứng bề mặt Respone surface methodology RSM), sử dụng thống kê toán học kết hợp với tin học7[7] sẽ mô hình hóa thí nghiệm, phƣơng pháp này cho phép khảo sát nhanh từng yếu tố cũng nhƣ tìm đƣợc điểm tối ƣu cho thí nghiệm tƣơng đối chính xác với số lƣợng thí nghiệm tiến hành ít hơn rất nhiều so với phƣơng pháp thông thƣờng, nhờ đó giảm chi phí cũng nhƣ công sức cho việc thực hiện thí nghiệm đi rất nhiều2[2]. Tuy nhiên muốn mô hình thí nghiệm có ý nghĩa, và không phải lặp lại thí nghiệm nhiều lần thì thí nghiệm tiến hành cần phải rất cẩn thận, khoa học, các phƣơng pháp đo kết quả phải đảm bảo tin cậy và có độ chính xác cao. Phần mềm Design Expert: Đây là một phần mềm đƣợc phát triển bởi hãng Stat-Ease (Hoa Kỳ). Là phần mềm tổng hợp sử dụng nhiều thuật toán và phƣơng pháp quy hoạch khác nhau để thiết kế các thí nghiệm sử dụng trong các ngành khoa học cơ bản nhƣ toán học, vật lý, hóa học và sinh học,… Một ƣu điểm của phần mềm này là có thể sử dụng phối hợp các phƣơng pháp để đánh giá và thiết kế thí nghiệm một cách tốt nhất. Phần mềm cũng cung cấp những công cụ mạnh mẽ để phân tích kết quả nhƣ công cụ ANOVA (sử dụng để phân tích giá trị thực nghiệm, tóm tắt thống kê: đƣa ra thống kê phƣơng sai, phƣơng trình hồi quy, giúp đánh giá khả năng đúng của lý thuyết với 23 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ thực nghiệm,…) công cụ DIANOSTICS giúp phân tích và chọn lựa đúng mô hình và sự phu thuộc của các giá trị theo từng mô hình, công cụ MODEL GRAPHS giúp đánh giá mô hình một cách trực quan các yếu tố theo dạng biểu đồ hình ảnh,… Thiết kế tối ƣu phức hợp trung tâm-đáp ứng bề mặt (CCD-RSM). CCD-RSM là một thiết kế nằm trong phần mềm Design Expert, đƣợc Biles và Swain phát mình vào năm 1980, sau đó phát triển dùng để tối ƣu các đại lƣợng biểu thị bằng số dựa trên thống kê và thực nghiệm6[6]. Để thực hiện phƣơng pháp này cần xác định ba đại lƣợng là: thừa số (các yếu tố cần khảo sát, mỗi yếu tố cần xác định 2 mức cao và thấp), điểm trung tâm (là điểm giữa của các đại lƣợng khảo sát) và điểm sao (là giá trị phản hồi của các đại lƣợng số bên trên). Sau khi đã có các đại lƣợng, ma trận đƣợc thiết lập tính toán sử dụng hồi quy tuyến tính để tìm ra phƣơng trình hồi quy có dạng Yi=βixi1 + …+ βpxip + εi= xiT β + εi, i= 1,…n, Trong đề tài này chúng tôi sử dụng phần mềm Design Expert 7 của hãng StatEase, trong đó có sử dụng phƣơng pháp đáp ứng bề mặt-phƣơng án cấu trúc có tâm để thiết kế quy hoạch thực nghiệm nhằm thu đƣợc sản lƣợng IL-2 cực đại từ dịch nuôi cấy tế bào vi khuẩn E. coli BL21 tái tổ hợp ở quy mô bình tam giác. 24 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Chƣơng 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu 2.1.1 Các chủng vi sinh vật, plasmid  Vector tái tổ hợp pET22-IL-2  Chủng vi sinh vật (Invitrogen): chủng biểu hiện E. coli BL21. 2.1.2 Hóa chất, enzyme, phần mềm.  Thang DNA chuẩn, thang protein chuẩn, (Fermentas); D-glucose, ampicillin Tris-HCl, glycine, SDS (BioRad); phenol, chloroform, methanol, isoamylalcohol, glycerol, ethanol, Na2CO3, NaHCO3, Na2HPO4, NaH2PO4, KCl, NaCl, K2HPO4, HCl, HSO4, acetic acid (Merck); cao nấm men, bactopepton, bacto-tryptone (BD), các hoá chất thông dụng khác (BioLab, BioRad, Merk, Fermentas).  Các enzyme hạn chế, Taq DNA polymerase, T4 DNA ligase, phosphatase kiềm (BioLab và Fermentas). Bộ kit dùng để tinh sạch DNA từ agarose gel (QIAGen).  Phần mềm Quantity One, Design Expert 7.0. 2.1.3 Máy móc Máy ly tâm lạnh cỡ lớn (Sorvall), máy ly tâm lạnh cỡ nhỏ (Sorvall), box cấy (Sanyo), Máy điện di DNA (Mupid), máy vortex (Rotolab), bộ điện di và máy điện di protein đứng (Bio-rad), máy speedvac AES1010 (Savant), máy lắc ổn nhiệt KS260 basic (IKA), máy PCR PTC-100 Thermal Cycles (MJ Research), bể ổn nhiệt waterbatch (Memmert), máy siêu âm (Microson), máy giải trình tự gene ABI 3100 (ABI), máy xung điện gene pulser II (Bio-rad), máy đo OD (LaboMed), máy khuấy từ (IKA Labotechnik), tủ lạnh 4°C, -20°C, -85°C (Sanyo). 2.2 Phƣơng pháp 25 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 2.2.1 Tách chiết DNA plasmid từ E. coli. Cơ sở lý thuyết: Dƣới tác dụng của các hóa chất NaOH, SDS thành tế bào vi khuẩn bị phá vỡ, và các phân tử protein, DNA genome bị biến tính. Khi thay đổi giá trị pH của dịch chiết tế bào bằng dung dịch Kali acetate, các phân tử protein và DNA genome biến tính sẽ kết tủa. Phần protein còn lại cùng các mảnh vỡ của tế bào sẽ đƣợc kết tủa bằng dung dịch Chloroform : Isoamylalcohol (24:1 v/v) và đƣợc tách ra khỏi phần dung dịch chứa DNA plasmid bằng cách ly tâm ở tốc độ cao. DNA plasmid nẳm ở pha trên đƣợc thu lại bằng cách tủa trong cồn tuyệt đối. RNA có trong dung dịch đƣợc loại bỏ bằng cách bổ sung nƣớc chứa RNase 10 µg/µL. Các dung dịch cần dùng: Dung dịch I (Glucose 50 mM ; TrisHCl 25 mM pH 8,0; EDTA 10 mM pH 8,0), dung dịch II (NaOH 0,2 N; SDS 1%), dung dịch III (CH3COOK 3 M; CH3COOH 5 M), ethanol 100%, ethanol 70%, chloroform : isoamylalcohol (24:1 v/v) nƣớc chứa RNase 10 mg/mL. Môi trƣờng LB (Cao nấm men 0,5%, Bacto trypton 1%, NaCl 1%). Môi trƣờng chọn lọc LBA (LB, bổ sung Ampicillin để đạt nồng độ cuối cùng là 100 μg/mL). Môi trƣờng LB đặc (LB, bổ sung thêm 1,5% agar). LBA đặc (LB đặc, bổ sung Ampicillin đến nồng độ cuối cùng 100 μg/mL). Cách tiến hành: Nhặt một khuẩn lạc tế bào E. coli đƣợc chuyển vào 2 mL môi trƣờng LBA và nuôi cấy lắc với tốc độ 200 v/p ở 37°C qua đêm. Tế bào sau khi nuôi cấy đƣợc thu lại bằng cách ly tâm trong 5 phút với tốc độ 5000 v/p và đƣợc hòa vào 100 L dung dịch I. Mẫu đƣợc làm huyền phù bằng máy vortex và để ở nhiệt độ phòng trong vòng 5 phút. Thêm 200 L dung dịch II pha mới hoàn toàn, lắc nhẹ nhàng và đặt trên đá trong khoảng 10 phút. Thêm 150 L dung dịch III lạnh, đảo nhanh và đặt trên đá trong khoảng 5 phút. Lúc này, xác tế bào và DNA genome bị kết tủa lại thành mảng trắng, dễ dàng đƣợc loại bỏ bằng ly tâm với tốc độ 13000 v/p trong 10 phút. Để loại bỏ triệt để các protein bám DNA, dung dịch pha tan đƣợc hòa theo tỷ lệ 1:1 (v/v) với chloroform:isoamyl alcohol (24:1), lắc đều và ly tâm 10 phút với tốc độ 13000 v/p. Dung dịch pha trên đƣợc chuyển sang ống eppendorf 26 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ mới. Lặp lại bƣớc loại bỏ protein với 400 L dung dịch hỗn hợp cholorofom : isoamyl alcohol. Sau khi ly tâm, pha trên chứa DNA plasmid đƣợc thu lại. DNA plasmid đƣợc tủa bằng hai lần thể tích cồn tuyệt đối. Mẫu đƣợc giữ ở -20°C trong 2 giờ. DNA plasmid đƣợc thu lại bằng cách ly tâm 13000 v/p trong 10 phút và đƣợc rửa lại bằng cồn 70%. Phần tủa DNA đƣợc làm khô bằng máy Speed Vac và hòa vào 30 l H2O có chứa RNase ở nồng độ cuối cùng là 0,1 mg/mL. DNA plasmid đƣợc kiểm tra trên gel agarose 0,8% hoặc đƣợc cất giữ ở -20°C. 2.2.2 Điện di DNA trên gel agarose. Cơ sở lý thuyết: Trong môi trƣờng pH trung tính, DNA mang điện tích âm, do vậy nếu đặt trong điện trƣờng đều thì DNA sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dƣơng. Trên gel agarose, DNA sẽ đƣợc phân tách theo kích thƣớc: DNA có kích thƣớc nhỏ di chuyển nhanh hơn DNA có kích thƣớc lớn. Sau đó DNA đem nhuộm với EtBr, các băng DNA bắt màu với thuốc nhuộm sẽ quan sát đƣợc dƣới ánh sáng UV. So sánh với thang chuẩn DNA có thể ƣớc đoán đƣợc khối lƣợng phân tử các băng DNA. Cách tiến hành: DNA đƣợc bổ sung với loading dye 6X (Fermentas) theo tỷ lệ tƣơng ứng là (5:1), sau đó dịch mẫu đƣợc tra vào các giếng trên gel. Đặt bản gel theo đúng chiều dòng điện từ (-) sang (+). Sau khi điện di, bản gel đƣợc nhuộm với EtBr khoảng 10 phút, rồi quan sát băng DNA dƣới ánh sáng đèn UV. 2.2.3 Lên men tạo sản phẩm IL-2 với dòng tế bào vi khuẩn tái tổ hợp E. coli BL21. Cơ sở lý thuyết: Tế bào vi khuẩn E.coli tái tổ hợp mang gene tổng hợp IL-2 đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng LBA ở 37°C, 200 v/p. Nhờ cơ chế cảm ứng operon lac bằng hóa chất IPTG, protein IL-2 đƣợc tổng hợp sau 5 giờ. Cách tiến hành: Một khuẩn lạc đƣợc nuôi lắc qua đêm trong 2 mL LB có bổ sung Ampicilin đến nồng độ cuối cùng là 100 µg/mL (LBA). Sau đó chuyển 30 µL dịch nuôi cấy sang 100 mL môi trƣờng LBA lắc trong khoảng 2 giờ ở nhiệt độ 37°C 27 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ đến khi OD600 đạt khoảng từ 0,6 đến 0,8 thì bắt đầu bổ sung IPTG đến nồng độ cuối cùng là 1mM để cảm ứng, rồi tiếp tục nuôi lắc ở 37°C. Mẫu đƣợc thu lại sau khi cảm ứng 4 giờ, bằng máy ly tâm ở tốc độ 5000 v/p trong 5 phút. 2.2.4 Phương pháp giải trình tự gene Thành phần của phản ứng khuyếch đại DNA của phƣơng pháp giải trình tự gồm: 3,2 pM mồi, 200 ng DNA plasmid, BigDye, đệm dùng cho BigDye trong tổng thể tích 20 µL với chu trình nhiệt trên máy PCR nhƣ sau: 96°C-1 phút; 25 chu kỳ (96°C-10 giây, 50°C-10 giây, 60°C-4 phút); bảo quản ở 4°C. Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch, kết tủa và làm khô DNA, bổ sung 10µL Hi-Di Formamid và biến tính ở 95°C trong 5 phút. Các mẫu đƣợc đƣa vào các giếng của khay đựng mẫu sau đó điện di bằng máy trong ống vi mao quản 80 cm x 50 µm chứa POP-4 (ABI-Mỹ). Trình tự đọc đƣợc sẽ đƣợc xử lý bằng phần mềm Avant Data Collection v1.0. 2.2.5 Tối ưu hóa điều kiện lên men bằng phần mềm Design expert 7.0. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sản lượng IL-2: Để tối ƣu bằng phần mềm, các yếu tố ảnh hƣởng đến năng suất tạo IL-2 đƣợc khảo sát trƣớc, bao gồm: nhiệt độ lên men, nồng độ chất cảm ứng IPTG, thời gian thu mẫu, và OD bắt đầu cảm ứng. Các điều kiện để lên men đƣợc chọn để làm chuẩn là nhiệt độ lên men 37°C, nồng độ IPTG 1 mM, thời gian thu mẫu 5 giờ, OD bắt đầu cảm ứng từ 0,6 đến 0,8. Khi tiến hành khảo sát yếu tố nào thì thay đổi yếu tố đó và giữ nguyên giá trị của các yếu tố còn lại theo điều kiện chuẩn. Tối ưu điều kiện lên men nhằm thu được sản lượng IL-2 lớn nhất bằng phần mềm chuyên dụng: Sau khi xác định đƣợc các yếu tố chính ảnh hƣởng đến sản lƣợng IL2, mô hình RSM-CCD giúp xác định giá trị tối ƣu và đƣợc nghiên cứu ở 3 mức ( -1, 0, +1, ), trong 15 hoặc 20 thí nghiệm tùy thuộc vào lựa chọn thiết kế. Chọn các điểm tại đó sản lƣợng IL-2 sau khảo sát cao nhất làm giá trị trung tâm (giá trị 0), 28 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ chọn giá trị thấp nhất và cao nhất của từng yếu tố mà tại đó sản lƣợng IL-2 bắt đầu bị ảnh hƣởng làm giá trị tới hạn (-1) và (+1). Hình 2. 1: Công cụ RSM-CCD của phần mềm thiết kế thí nghiệm Design Expert 7.0 Trong phần mềm design expert 7.0, bƣớc đầu tiên chọn File/New Design. Trong thẻ Respone Curface chọn Central Composite (Hình 2. 1). Trong phần Numberic Factors chọn 3 yếu tố ảnh hƣởng đến sản lƣợng IL-2. Khai tên, giá trị tới hạn (-1 và +1). Chọn kiểu thí nghiệm đầy đủ (20 thí nghiệm) hoặc rút gọn (15 thí nghiệm). Sau khi đã nhập đầy đủ thông tin phần mềm sẽ cho ra 20 thí nghiệm để tiến hành, kết quả thu đƣợc từ 20 thí nghiệm đó đƣợc nhập tiếp tục vào phần kết quả. Từ đó sẽ cho ra những điểm tối ƣu mà hàm lƣợng IL-2 đạt giá trị cao nhất. 29 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Công việc cuối cùng để hoàn thiện tối ƣu là tiến hành thí nghiệm với các điểm tối ƣu đó so sánh với 20 thí nghiệm đã tiến hành để kiểm chứng. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide. 2.2.6 Cơ sở lý thuyết: Điện di là quá trình dịch chuyển của phân tử dƣới tác dụng của điện trƣờng qua các mạng lƣới. Các phân tử có tốc độ di chuyển tùy thuộc vào điện tích, kích thƣớc khối lƣợng, hình dạng phân tử. Protein đƣợc xử lý với SDS là chất mang điện âm có khả năng bám vào protein làm protein tích điện tích âm đồng thời biến tính protein, tạo dạng thành dạng thẳng. Do cùng có điện tích và là dạng thẳng nên protein có tốc độ di chuyển phụ thuộc vào kích thƣớc, khối lƣợng. Các dung dịch cần dùng: Để chế 1 bản gel Acrylamide cần: Bis-Acrylamide 30%, APS 10%, Glyxerol 50%, TEMED. Đệm Tris-HCl 1,5 M pH 8,8 cho gel tách. TrisHCl 0,5 M pH 6,8 cho gel cô. Đệm chạy điện di 6x: 7 mL Tris HCl pH 6,8; 3 mL Glycerol 100%; 1 g SDS; 1,2 mg Bromophenol blue; 0,6 mL 2-mecaptoethanol. Bảng 2. 1 Công thức chế 1 bản gel acrylamide Thành phần Gel tách (4,5 mL) Gel cô (1 mL) H2O 0,55 mL 0,45 mL Tris HCl 1,5M (pH8,8) 1,125 mL - Tris HCl 0,5M (pH6,8) - 0,3 mL Glycerol (50%) 0,9 mL - Bis/acrylamide 1,89 mL 0,14 mL SDS 10% 45µL 4 µL APS 30 µL 8 µL TEMED 3 µL 1 µL 30 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Cách tiến hành: Các tế bào thu lại nhờ ly tâm đƣợc phá bằng đệm xử lý mẫu 6X và ủ ở 100oC trong 10 phút để phá tế bào, tích điện âm cho protein. Lắp bản gel, tra mẫu vào các giếng và chạy với cƣờng độ dòng cố định từ 20-30 mA trong khoảng 45 phút. Gỡ bản gel và đem nhuộm bạc, hoặc nhuộm comassie để xem kết quả. Nhuộm bạc: Gel đƣợc ngâm trong dung dịch cố định (Ethanol 50%, Acid acetic 12%, Formaldehyte 0,05%) lắc với thời gian khoảng 60 phút, sau đó rửa 3 lần với H2O 1X trong 20 giây, rửa bằng dung dịch rửa (Ethanol 100%) 2 lần, mỗi lần 20 phút. Sau đó cho vào dung dịch làm tăng độ nhạy (Na2S2O3 0,02%) lắc trong 10 phút. Rửa với H2O 1X 2 lần mỗi lần 20 giây. Nhuộm bản gel bằng dung dịch nhuộm bạc (AgNO3 0,2%; Formaldehyte 0,075%) trong 20 phút. Hiện màu các băng protein bằng dung dịch hiện màu (Na2CO3 6%; Na2S2O3 0,0004%, Formaldehyte 0,05%). Dừng phản ứng hiện màu bằng dung dịch dừng phản ứng (Glycine 0,5 g; H2O 50 mL). Nhuộm comassie: Bản gel đƣợc gỡ ra và đem rửa với dung dịch rửa I (Methanol 10%, Acetic acid 10%) trong 10 phút. Sau đó nhuộm bản gel bằng thuốc nhuộm comassie từ 30 đến 60 phút. Gel sau khi nhuộm đƣợc tẩy màu bằng dung dịch rửa II ( Ethanol 35%, Glycerol 2%) cho tới khi sạch nền và các băng quan sát rõ nét. 2.2.7 Phương pháp kiểm tra protein bằng phản ứng đặc hiệu kháng nguyên kháng thể Western Blot. Cơ sở lý thuyết: Western Blot là phƣơng pháp xác định protein một cách đặc hiệu dựa vào phản ứng kháng nguyên kháng thể. Protein nằm trên gel SDS-PAGE đƣợc chuyển sang màng hấp thụ - Polyvinylidene diflouride (PVDF), sau đó protein đƣợc xác định bằng phản ứng giữa kháng thể 1 (kháng thể kháng với Interleukin 2hãng sigma) và kháng thể 2 (kháng với kháng thể 1-hãng sigma) có gắn với chất chỉ thị màu. Cách tiến hành: Mẫu đƣợc tiến hành điện di theo phƣơng pháp SDS-PAGE, gỡ bản gel và chuyển màng bằng hệ thống chuyển màng semi-dry. Màng đƣợc ngâm trong methanol từ 5-10 phút. Song song với đó giấy thấm đƣợc ngâm trong 31 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Blotting buffer 10 phút. Mở nắp máy và xếp các thành phần theo thứ tự từ dƣới lên trên: giấy thấm-màng PVDF – gel – giấy thấm. Chạy máy với hiệu điện thế 15 V trong 20 phút). Lấy màng ra khỏi hệ thống, phủ màng bằng sữa tách bơ skim milk 5% trong dung dịch TBS ở 4°C trong 1 giờ. Màng đƣợc rửa bằng dung dịch TTBS 3 lần, mỗi lần 10 phút và TBS 3 lần, mỗi lần 5 phút. Màng sau khi rửa sạch sẽ đƣợc phủ kháng thể 1 và lắc ở nhiệt độ phòng. Sau 1 giờ phủ kháng thể màng tiếp tục đƣợc rửa bằng 2 dung dịch TTBS và TBS. Tiếp tục phủ kháng thể 2 và lắc ở nhiệt độ phòng. Sau khoảng 1 giờ lại rửa màng bằng TTBS và TBS. Hiện màu trong dung dịch hiện màu của BioRad (dung dịch TMB 1,5 mL). 2.2.8 Phá tế bào bằng phương pháp siêu âm và xử lý mẫu protein IL-2 trước khi tinh chế. Cơ sở lý thuyết: Dƣới sự rung động của sóng siêu âm, thành tế bào bị phá vỡ, protein, DNA đƣợc giải phóng ra ngoài dung dịch môi trƣờng. Xử lý trƣớc khi qua cột bằng các hóa chất đƣa IL-2 từ dạng không tan chuyển thành dạng tan nhiều lần nhằm loại bớt các protein không mong muốn và tạp chất ra khỏi hỗn hợp nhằm tạo điều kiện thuận lợi nhất trƣớc khi tinh sạch protein bằng hệ thống sắc ký đảo pha HPLC. Cách tiến hành:10 mL dịch tế bào tái tổ hợp E. coli sản xuất IL-2 (OD =100) đƣợc lấy từ tủ -80°C, bổ sung thêm 10 mL dung dịch 1 (Tris 20 mM; EDTA 10 mM; PMSF 0,05 mM), ủ ở 37°C trong bể ổn nhiệt. Sau 30 phút lấy hỗn hợp ra đem siêu âm phá tế bào lần thứ nhất 20-30 lần, mỗi lần 30 giây, giữa mỗi lần siêu âm nghỉ 10 giây, trong lúc thao tác mẫu đƣợc đặt trên đá. Ly tâm thu tủa ở tốc độ 10.000 v/p trong 10 phút, hòa tủa lại trong 10 mL dung dịch 2 (Tris 20 mM; EDTA 10 mM; PMSF 0,05 mM; Triton 100x 0,1-0,2%), vortex đề hòa lại tủa. Tiếp tục siêu âm phá tế bào lần thứ 2 với thông số nhƣ lần đầu tiên. Bổ sung dung dịch 3 (sucrose 60%) đến nồng độ cuối cùng là 20%. Hỗn hợp đƣợc ly tâm thu tủa ở tốc độ 10.000 v/p trong 20 phút. Hòa lại tủa trong 5 mL dung dịch đệm 4 (Tris 50 mM; EDTA 10 mM; Guanidine 7 M) để làn tan protein. Ly tâm ở 10.000 v/p trong 30 phút thu dịch 32 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ nổi. Hòa dịch nổi với Tris 20 mM để nồng độ Guanidine cuối cùng là 2 M, để lắng trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm thu tủa ở 10.000 v/p trong 30 phút. Hòa tủa lại trong dung dịch đệm 4, bổ sung β-mercaptoethanol 15 mM. Vortex trong điều kiện lạnh từ 8-10 giờ. Ly tâm 10.000 v/p trong 30 phút loại tủa và thu dịch nổi. Tinh chế protein bằng hệ sắc ký đảo pha RP-HPLC. 2.2.9 Cơ sở lý thuyết: Phƣơng pháp sắc ký lỏng HPLC là phƣơng pháp phân tách bao gồm 2 pha, trong đó pha động là chất lỏng (dịch protein cần phân tách) và ph tĩnh chứa trong cột chất rắn đã đƣợc phân chia dƣới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã đƣợc cải biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Sắc ký đảo pha RP-HPLC phân tách IL-2 nhờ vào sự khác nhau giữa tính phân cực của các phân tử protein. Cách tiến hành:Mẫu IL-2 đƣợc tiền xử lý ở quy trình 2.2.8, thu mẫu IL-2 sau bƣớc vortex qua đêm trong điều kiện lạnh, bổ sung TFA đến nồng độ cuối cùng là 0,1% nhằm giảm pH từ 8 xuống 3. Ly tâm 10.000 v/p trong 5 phút, thu dịch nổi. Đƣa mẫu lên cột sắc ký RP-HPLC theo chƣơng trình. Các thông số cơ bản: Cột sắc ký để phân tách mẫu Biowire pore C5 (250 mm x 10 mm x 10 µm). Thể tích mẫu đƣa lên cột 200 µL. Tốc độ dòng chảy 5 mL/phút. Bƣớc sóng của detector 280 nm. Chƣơng trình chạy:  Từ 0-6 phút: Chạy gradient từ 17% đến 50% đêm B (citric acid 0,1%; isopropanol 60%).  Từ 6 đến 17 phút: chạy 100% đệm B.  Từ 17 đến 22 phút chạy 100% đệm A (citric acid 0,1%).  Thu mẫu theo phân đoạn và điện di kiểm tra trên gel SDS-polyacrylamide 12,6% 2.2.10 Xác định độ tinh khiết của sản phẩm IL-2 tái tổ hợp sau khi tinh sạch. 33 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Cơ sở lý thuyết: Sau khi tinh chế IL-2 bằng hệ thống sắc ký đảo pha RP-HPLC, mẫu đƣợc điện di bằng phƣơng pháp SDS-PAGE. Độ tinh sạch đƣợc xác định bằng phƣơng pháp nhuộm bạc và phần mềm chuyên dụng Quatity One của hãng BioRad. Yêu cầu của sản phẩm là phải có độ tinh khiết trên 95%. Cách tiến hành: Sau khi điện di, lấy bản gel ra nhuộm comassie, rửa sạch bản gel để tránh sai số khi sử dụng phần mềm. Quét ảnh bằng hệ thống soi ảnh của BioRad, hoặc chụp ảnh bằng máy ảnh kỹ thuật số chuyên nghiệp Canon. Nhập ảnh vào máy tính, sử dụng phần mềm Photoshop chuyển từ định dạng gốc sang định dạng .tif. Mở kết quả ảnh bằng phần mềm Quantity One bản quyền. Xác định các đƣờng chạy trên ảnh gel điện di bằng công cụ Lane frames. Chỉnh các cột vào chính giữa đƣờng chạy. Trên đƣờng chạy, xác định vị trí các băng bằng công cụ Add bands. Chú ý, mỗi băng protein vừa đƣợc chọn nên xác định bao trọn toàn bộ băng để tránh sai số. Tiếp theo xác định đƣờng nền cho phổ hấp phụ qua hai chức năng Sub-background và Lane background. Nháy chuột vào nút công cụ band in lane để truy suất kết quả dạng phổ hấp phụ của protein. Sử dụng chức năng Bands attributes để tính toán mức hấp phụ trên mỗi thang protein. Kết quả đƣợc truy suất bởi công cụ Report. 2.2.11 Phương pháp xác định hàm lượng IL-2 bằng ELISA. Cơ sở lý thuyết:Dựa vào nguyên lý miễn dịch bắt cặp đặc hiệu của kháng nguyên và kháng thể, chúng tôi đánh giá hàm lƣợng IL-2 trƣớc và sau tinh chế trên đĩa ELISA nhờ kháng thể 1 kháng với IL-2 và kháng thể 2 kháng với kháng thể 1, mang cấu trúc thủy phân cơ chất có thể phát hiện bằng máy ELISA ở bƣớc sóng 450 nm. Đây là phƣơng pháp khá nhạy và chính xác nếu có IL-2 chuẩn đã biết hàm lƣợng. Các dung dịch cần dùng: dung dịch PBS (NaCl 8g; KCl 0,2 g; Na2HPO4 1,15 g; KH2PO4 0,2 g; dH2O pha tới 1 L). Coating buffer: (NaHCO3 0,05 M; Na2CO3 0,05M). Wash solution (PBS 1L; Tween-20 0,05%). Blocking solution (BSA 1% pha trong PBS). Antibody diluent 1 (BSA 1%; Tween-20 0,05%; Cold fish gelatin 34 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 0,1% pha trong PBS). Antibody diluent 2 (Tween-20 0,05%, pha trong PBS). Acetate buffer 5x (CH3COONa 1 M; CH3COOH 0,04 M; pha trong dH2O). TMB 100X (0,01 g; DMSO 1mL; pha trong dH2O đến 1L). Dung dịch cơ chất (Acetate buffer 5x 2mL; TMB 100X 100µL; H2O2 30% 25µL; pha trong dH2O đến 1L). Cách tiến hành: Phủ kháng nguyên trên đĩa: Pha loãng kháng nguyên (mẫu cần đo) trong Coating buffer bổ sung 100 µL dịch pha loãng vào mỗi giếng. Ủ đĩa khoảng 8-10 giờ ở 4°C. Loại Coating buffer và rửa mỗi giếng bằng 200 µL Wash Solution 3 lần. Khóa dung dịch: Thêm 200 µL Blocking Solution vào mỗi giếng. Ủ 30 phút, sau đó loại bỏ dịch và rửa bằng 200 µL Wash Solution 3 lần. Phủ kháng thể 1: pha loãng kháng thể đơn dòng kháng đặc hiệu IL-2 trong dịch pha loãng kháng thể 1 (Antibody Diluents) với tỷ lệ tƣơng ứng là 1:5000. Bổ sung 100 µL dịch vừa chuẩn bị vào mỗi giếng. Ủ trong 60 phút rồi loại bỏ dịch bằng 200 µL Wash Solution 3 lần. Phủ kháng thể 2: Pha loãng kháng thể kháng chuột gắn HRP trong dịch pha loãng kháng thể 2 (Antibody Diluents 2) với tỷ lệ tƣơng ứng là 1:5000, bổ sung 100 µL dung dịch vừa chuẩn bị vào mỗi giếng. Ủ 60 phút, sau đó bổ sung 200 µL Wash solution để rửa 3 lần. Hiện màu bằng phản ứng enzyme cơ chất: Chuẩn bị dung dịch cơ chất (Acetate buffer 5x; TMB 100X, H2O2). Bổ sung 100 µL vào mỗi giếng. Ủ trong 30 phút rồi bổ sung 100 µL H2SO4 nồng độ 2 M vào mỗi giếng để dừng phản ứng. Cuối cùng sử dụng máy đọc ELISA chuyên dụng đo ở bƣớc sóng 450 nm. 35 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Chƣơng 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Nhằm làm tăng hoạt tính và giảm tính độc cho sản phẩm IL-2, chúng tôi đã sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử nhằm tạo đột biến mất amino acid Alanine ở đầu N, thay thế Cysteine ở vị trí 125 bằng Serine. Trình tự amino acid suy diễn từ trình tự DNA mã hóa cho IL-2 giống hoàn toàn so với trình tự amino acid của một sản phẩm IL-2 tái tổ hợp đã đƣợc FDA công nhận cấp phép và đã đƣợc sử dụng cho các bệnh nhân ung thƣ tế bào thận và ung thƣ ác tính. Đoạn gene này sau đó đƣợc tách dòng trong vector pET22b+ tạo thành vector tái tổ hợp dùng để biểu hiện trong E. coli BL21. Vector tái tổ hợp pET22-IL-2 sau đó đƣợc gửi đi giải trình tự để kiểm tra xem vector thu đƣợc có mang đúng đoạn gene cần biểu hiện hay không. Là một sản phẩm có thể sản xuất và tiêu thụ ra thị trƣờng, vì vậy làm sao để thu đƣợc lƣợng IL2 lớn nhất, đƣợc tinh sạch với chi phí thấp là mục tiêu của để tài. Chúng tôi sử dụng phần mềm thiết kế thí nghiệm chuyên dụng là Design Expert 7.0 của hãng Stat Ease nhằm thực hiện đƣợc mục tiêu tối ƣu các điều kiện thu lƣợng lớn IL-2 tái tổ hợp ở quy mô bình tam giác. Nội dung nghiên cứu của đề tài bao gồm:  Biểu hiện gene il2 cải biến mất alanine ở đầu N, thay thế Cystein bằng Serine ở vị trí 125.  Tối ƣu điều kiện lên men nhằm thu đƣợc lƣợng IL-2 cao nhất  Tiền xử lý và tinh chế IL-2 bằng hệ thống sắc ký HPLC. Các kết quả chi tiết trong quá trình thực hiện đề tài đƣợc trình bày chi tiết ở các phần dƣới đây: 3.1 Giải trình tự gene mã hóa cho IL-2 đã đƣợc cải biến Các dòng tế bào vi khuẩn E. coli BL21 mang vector tái tổ hợp đƣợc nuôi cấy và tách chiết DNA plasmid phục vụ công việc giải trình tự gene. Vector pET22b(+) không chứa il2 sẽ có kích thƣớc khoảng 5,5 kb trong khi vector pET22b(+) chứa il2 36 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ có kích thƣớc khoảng 5,9 kb. Theo nguyên lý của điện di DNA phân tử có khối lƣợng thấp hơn sẽ di chuyển trƣớc. Nhƣ vậy theo lý thuyết vector tái tổ hợp mang gen il2 sẽ di chuyển sau vector không mang gene. 1 2 3 4 Hình 3. 1: Kết quả điện di kiểm tra plasmid trên gel Agarose. Đƣờng chạy 1-3: plasmid các dòng mang vector tái tổ hợp pET22-IL-2 Đƣờng chạy 4: dòng mang vector pET22b(+). Kết quả trên Hình 3. 1 cho thấy ở các dòng 1, 2, 3 là plasmid mang gene il2 xuất hiện băng có kích thƣớc cao hơn ở đối chứng âm vector pET22b(+) không mang gene il2 kết quả này hoàn toàn phù hợp với lý thuyết. Chứng tỏ chúng tôi đã thu đƣợc dòng vi khuẩn tái tổ hợp mang gene il2 mã hóa cho Interleukin 2 ngƣời tái tổ hợp. Để xác định trình tự il2 dạng cải biến chúng tôi đã giải trình tự. Đoạn DNA mang gene il2 đã cải có kích thƣớc 396 bp mã hóa cho IL-2 ngƣời đã đƣợc tách dòng trong vector pET22b(+). Dòng plasmid đƣợc kiểm tra trên máy ABI prism 3100. Trình tự đoạn DNA nhƣ sau: cctacttcaagttctacaaagaaaacacagctacaactggagcatttactgctggattta P T S S S T K K T Q L Q L E H L L L D L cagatgattttgaatggaattaataattacaagaatcccaaactcaccaggatgctcaca Q M I L N G I N N Y K N P K L T R M L T tttaagttttacatgcccaagaaggccacagaactgaaacatcttcagtgtctagaagaa F K F Y M P K K A T E L K H L Q C L E E gaactcaaacctctggaggaagtgctaaatttagctcaaagcaaaaactttcacttaaga E L K P L E E V L N L A Q S K N F H L R cccagggacttaatcagcaatatcaacgtaatagttctggaactaaagggatctgaaaca P R D L I S N I N V I V L E L K G S E T acattcatgtgtgaatatgctgatgagacagcaaccattgtagaatttctgaacagatgg 37 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ T F M C E Y A D E T A T I V E F L N R W attaccttttgtcaaagcatcatctcaacactaact I T F C Q S I I S T L T Trình tự đƣợc dịch ra trình tự amino acid và so sánh với ngân hàng gene bằng công cụ BLAST: IL-2 pha trƣớc 1 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQ 58 -PTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQ IL-2 cải biến 1 IL-2 pha trƣớc 61 CLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEF 117 -PTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQ 58 CLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEF IL-2 cải biến 61 CLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEF 117 IL-2 pha trƣớc 118 LNRWITFSQSIISTLT 133 LNRWITFSQSIISTLT IL-2 cải biến 118 LNRWITFSQSIISTLT 133 Nhƣ vậy trình tự gene mã hóa cho IL-2 sau khi cải biến so với đề tài nghiên cứu trƣớc “Nghiên cứu đánh giá hiệu lực của Interleukin-2 ngƣời tái tổ hợp sản xuất tại Việt Nam dùng trong hỗ trợ điều trị ung thƣ” mã số KC.04.21/06/10) đã đƣợc thay đổi làm mất bộ ba mã hóa cho amino acid Alanine ở vị trí đầu tiên trong trình tự protein IL-2. Kết quả cho thấy trình tự amino acid suy diễn từ trình tự il2 cải biến hoàn toàn giống với trình tự amino acid của sản phẩm Aldesleukin[18] 18 (hay còn gọi là Proleukin) của hãng Chiron Hoa Kỳ sản xuất đƣợc FDA công nhận có khả năng chữa trị ung thƣ, đƣợc FDA công nhận sử dụng để điều trị ung thƣ trên thế giới và đã hết hạn bảo hộ độc quyền. 3.2 Biểu hiện gene il2 trong chủng vi khuẩn tái tổ hợp E. coli BL21. Sau khi biến nạp vào tế bào biểu hiện E. coli BL21 (DE3) một số dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp pET22-IL-2 đƣợc biểu hiện để kiểm tra khả năng tổng hợp của protein IL-2. Dịch protein tổng số đƣợc đƣa về cùng giá trị số lƣợng tế bào (OD=10) sau đó đem biến tính và tiến hành điện di SDS-PAGE rồi nhuộm 38 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ comassie, và tiến hành phƣơng pháp xác định IL-2 đặc hiệu nhờ phản ứng kháng nguyên kháng thể Western blot. IL-2 IL-2 B A Hình 3. 2: Kết quả kiểm tra khả năng biểu hiện IL-2 của một số dòng tế bào vi khuẩn tái tổ hợp mang plasmid pET22-IL-2. A: kết quả SDS-PAGE nhuộm comassie; B: kết quả Western blot. Đƣờng chạy M: thang chuẩn Protein (Fermentas); Đƣờng chạy (+): IL-2 của Trung Quốc Đƣờng chạy 1 đến 5: Các dòng vi khuẩn E. coli tái tổ hợp mang vector tái tổ hợp Đƣờng chạy 6: dòng E. coli tái tổ hợp mang vector tái tổ hợp không đƣợc cảm ứng IPTG. Đƣờng chạy 7: dòng E. coli tái tổ hợp mang vector pET22 không mang gene. Kết quả trên Hình 3.2 A cho thấy cả 5 dòng tế bào tái tổ hợp đều xuất hiện băng tƣơng đối nhỏ ở vị trí khoảng 15 kDa (đúng với kích thƣớc của đối chứng dƣơng là IL-2 Trung Quốc) cả ở trên bản gel nhuộm comassie và xuất hiện băng đặc hiệu khi tiến hành Western blot. Các dòng 7 không mang gene il2 và dòng 6 không cảm ứng bằng IPTG không xuất hiện băng đặc hiệu ở màng PVDF. Kết quả trên Hình 3.2B cho thấy các dòng 2,4 là những dòng có băng đậm nhất ở vị trí 15 kDa, và dòng số 4 có khả năng tổng hợp IL-2 mạnh nhất. Do đó dòng số 4 đƣợc chọn làm dòng biểu hiện cho các bƣớc tiếp theo. 3.3 Tối ƣu điều kiện lên men E. coli sản xuất IL-2 tái tổ hợp dạng cải biến bằng phần mềm design expert. 39 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Quy trình để tối ƣu điều kiện lên men E. coli sản xuất IL-2 tái tổ hợp dạng cải biến đƣợc thể hiện nhƣ sơ đồ sau: Hình 3. 3: Sơ đồ tối ƣu lên men vi khuẩn tái E. coli tái tổ hợp sản xuất IL-2. a. Khảo sát các yếu tố Sau khi chọn đƣợc dòng tế bào E. coli BL21 tái tổ hợp biểu hiện IL-2 tốt nhất, chúng tôi tiến hành khảo sát riêng rẽ từng yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình biểu hiện gene bao gồm nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ chất cảm ứng IPTG, thời gian thu mẫu sau cảm ứng. Tất cả số liệu đƣợc tính bằng hàm lƣợng IL-2 đo bằng phƣơng pháp kháng nguyên kháng thể ELISA đƣợc trình bày trên phần phƣơng pháp. Trong lúc tiến hành chúng tôi chọn một quy trình chuẩn nhƣ ở phƣơng pháp 2.2.11 (trang 34) Kết quả trên Hình 3.4 cho thấy có sự khác biệt rõ rang về sự biểu hiện IL-2 khi tối ƣu ở các điều kiện riêng rẽ là nhiệt độ, nồng độ IPTG, và thời gian thu mẫu. Từ 40 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ các kết quả trên, IL-2 đƣợc biểu hiện tốt nhất ở các giá trị nhƣ sau: nhiệt độ sau khi cảm ứng 42°C, nồng độ IPTG 1,5 mM, thời gian thu mẫu: 3 giờ. Nhiệt độ °C 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 Nồng độ chất cảm ứng IPTG 3147 1310 30°C 1218 37°C 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 42°C 986 1066 1106 1086 1231 ng/mL Thời gian thu mẫu (giờ-h) 3000 2488 2764 2500 2000 2026 1617 1218 1500 1000 500 0 1h 0,1 mM 0,5 mM 1 mM 1,2 mM 1,5 mM 2h 3h 4h Hình 3.4: Sơ đồ biểu thị kết quả khảo sát ảnh hƣởng của từng nhân tố riêng rẽ (nhiệt độ biểu hiện, thời gian biểu hiện, nồng độ chất cảm ứng IPTG) của dòng tế bào tái tổ hợp E. coli Bl21 mang vector biểu hiện pET22b-IL-2. b. Tối ƣu bằng phần mềm Để sử dụng phần mềm Design expert cho việc tối ƣu nuôi cấy sản xuất lƣợng lớn nhất IL-2, đầu tiên phải xác định các yếu ảnh hƣởng đến sự tạo thành IL-2. Các yếu tố đó phải đƣợc xác định điểm trung tâm (0) (thƣờng là điểm cho hàm lƣợng cao nhất), điểm dƣới (-1) và điểm trên (+1) đƣợc chọn sao cho điểm (0) nằm ở chính giữa và những yếu tố có giá trị thấp hơn điểm (-1) hoặc cao hơn điểm (+1) thì đều không còn ảnh hƣởng tới sự tạo thành IL-2. Chính vì vậy đối với mỗi yếu tố chúng tôi xác định các điểm nhƣ sau: Yếu tố Điểm trung tâm (0) Phạm vi nghiên cứu (-1;+1) Nhiệt độ (°C) 42 34-50 Nồng độ IPTG (mM) 1 0,5-1,5 Thời gian biểu hiện (giờ) 3 1-5 41 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 5h Nhập giá trị đã xác định vào phần mềm nhƣ ở phần phƣơng pháp 2.2.5 (trang 28). Phần mềm sẽ thiết kế 20 thí nghiệm cần thực nghiệm, sau đó nhập kết quả vào phần mềm (phần respone) nhƣ ở Hình 3. 5: Hình 3. 5: Chi tiết thiết kế và hàm lƣợng IL-2 của sau khi thực hiện 20 thí nghiệm. Để đánh giá tƣơng quan giữa kết quả xác định hàm lƣợng bằng ELISA chúng tôi tiến hành điện di SDS-PAGE và nhuộm comassie để kiểm tra protein của 20 thí nghiệm và đối chứng âm (không cảm ứng IPTG đƣợc gọi là thí nghiệm số 21). Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: 42 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ ng/mL ng/mL 5000 5000 4000 4000 4000 3000 3000 3000 2000 2000 2000 1000 1000 1000 0 ng/mL 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 IL-2 Hình 3. 6: Kết quả tiến hành 20 thí nghiệm đánh giá bằng phƣơng pháp ELISA và điện di SDS– PAGE. Nhìn trên Hình 3. 6 có thể thấy rằng ở mẫu số 21 (đối chứng âm, không cảm ứng IPTG) không xuất hiện băng IL-2 có kích thƣớc khoảng 15 kDa, kết quả này tƣơng ứng với hàm lƣợng IL-2 thấp dƣới 1000 ng/mL. Tƣơng tự các thí nghiệm số 1,3,8, 11,12,13 đều có hàm lƣợng IL-2 thấp (thấp hơn 1000 ng/mL) thì ở vị trí 15 kDa các băng nhỏ không rõ nét. Trong khi đó các thí nghiệm còn lại có hàm lƣợng IL-2 cao hơn 1000 ng/mL thì có thể nhìn thấy băng khá đậm ở vị trí 15 kDa trùng với vị trí của IL-2 chuẩn (Trung Quốc). Sau khi tính toán và phân tích kết quả, phần mềm đƣa ra một số kết quả nhƣ sau: Phƣơng trình hồi quy tuyến tính để tính toán hàm lƣợng IL-2: Y=3234.26+224.94*A+482.81*B+174.80*C-6.20*A*B+54.65*A*C+140.10* B*C - 655.89 *A2 -886.59 *B2 +205.86 *C2. (Trong đó Y là hàm lƣợng IL-2 (ng/mL); A,B,C lần lƣợt là thời gian cảm ứng (giờ ), nhiệt độ cảm ứng (°C) và nồng độ chất cảm ứng (mM). 43 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Hình 3. 7: Mặt đáp ứng của hàm lƣợng IL-2. Hệ số xác định R2 tính đƣợc là 0,79 chứng tỏ rằng có 79% số liệu thực nghiệm phù hợp với số liệu tiên đoán bởi mô hình. Giá trị R2 phải lớn hơn 0,75 thì mô hình mới có ý nghĩa. Giá trị âm của hệ số R2 dự đoán là 0,3167 chứng tỏ rằng điểm tối ƣu sẽ cho hàm lƣợng IL-2 cao hơn 20 thí nghiệm đã tiến hành, và phù hợp với R2 hiệu chỉnh là 0,5871. Giá trị của tín hiệu gây nhiễu là 7,551; lớn hơn 4 chứng tỏ các thí nghiệm là đầy đủ. Phần mềm sau khi phân tích kết quả sẽ chọn ra điểm tối ƣu. Vì IPTG là hóa chất khá đắt tiền nên để giảm thiểu giá thành sản phẩm chúng tôi đƣa ra 2 giải pháp:  Giải pháp thứ nhất là tìm ra điểm mà hàm lƣợng IL-2 đạt đƣợc cao nhất  Giải pháp thứ hai là tìm ra điểm mà hàm lƣợng IL-2 cao nhất trong khoảng IPTG từ 0,5 đến 1 mM.  Cùng với đó chúng tôi chọn điều kiện ở điểm trung tâm (Nhiệt độ 42°C, thời gian thu mẫu 3 giờ, nồng độ IPTG 1mM) để lên men cùng làm đối chứng. 44 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Bảng 3. 1: Điều kiện biểu hiện của các giải pháp mà phần mềm đƣa ra nhằm tìm ra điều kiện tối ƣu cho lên men. Ký Nhiệt Nồng độ Thời gian Hàm lƣợng IL-2 hiệu độ(°C) IPTG(mM) thu (ng/mL) mẫu(giờ) Giải pháp 1 S1 44,8 1,5 3,4 6273,0 Giải pháp 2 S2 43,0 1,0 3,1 5908,1 Đối chứng C 42 1 3 4019,4 Tiến hành làm thêm thí nghiệm xác định các giải pháp đƣa ra bởi phần mềm, chúng tôi biểu hiện 3 điều kiện nhƣ ở Bảng 3. 1, kết quả đƣợc xác định bằng phƣơng pháp điện di SDS-PAGE, Western blot và đo hàm lƣợng IL-2 bằng phƣơng pháp ELISA. ng/mL 7000 6273 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 S1 5908 4019 IL-2 S2 IL-2 C (A) (B) Hình 3. 8: Kết quả biểu hiện các dự đoán mà phầm mềm đƣa ra A) Hàm lƣợng IL-2 khi biểu hiện ở các giải pháp; B) Kết quả kiểm tra IL-2 bằng phƣơng pháp SDS-PAGE và Western blot các giải pháp. Kết quả ở Hình 3. 8 cho thấy ở cả giải pháp 1 và giải pháp 2 mà phần mềm đƣa ra protein IL-2 đều đƣợc biểu hiện tốt cao hơn so với đối chứng C lần lƣợt là 56% và 46%. Nhƣ vậy nếu muốn sản lƣợng IL-2 thu đƣợc cao nhất thì chủng vi khuẩn tái tổ hợp phải đƣợc lên men theo quy trình ở phần phƣơng pháp 2.2.3 trang 45 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 27, với các yếu tố thay đổi nhƣ sau: nhiệt độ khi bắt đầu cảm ứng 44,8°C; nồng độ IPTG là 1,5 mM và thời gian thu mẫu là 3 giờ 24 phút (3,4 giờ). Vì hàm lƣợng IL-2 của giải pháp 1 chỉ hơn 6,1 % so với giải pháp 2, mà lƣợng IPTG cần dùng ở giải pháp 1 hơn gấp 50% so với giải pháp hai.Chính vì để giúp giảm chi phí sản xuất thì chúng tôi chọn giải pháp với điều kiện nhiệt độ lên men là 43°C, nồng độ IPTG 1 mM, thời gian thu mẫu là 3 giờ 6 phút. 3.4 Tinh sạch IL-2 từ dòng tế bào E. coli. Dịch tế bào sau khi lên men đƣợc thu lại bằng cách ly tâm và đƣa về OD 100 trong đệm Tris HCl 0,1M để chuẩn bị cho bƣớc tinh chế. Quy trình tinh chế IL-2 đƣợc tóm tắt nhƣ trong sơ đồ sau: Phá tế bào vi khuẩn E. coli Tinh chế bằng hệ thống HPLC Xử lý protein thô Bảo quản mẫu IL-2 ngƣời tái tổ hợp biểu hiện trong vi khuẩn thƣờng tồn tại ở dạng không tan (Inclusion body) do vậy trƣớc khi đƣa mẫu lên hệ thống HPLC tiến hành tinh chế, IL-2 thô trong sinh khối tế bào E. coli phải đƣợc trải qua hai quá trình: Quá trình phá tế bào và quá trình xử lý biến tính IL-2 tái tổ hợp dạng thô. Qua quá trình tối ƣu phá tế bào, tế bào đƣợc phá với 2 lần siêu âm, đồng thời xử lý protein tổng số trong dung dịch chứa đƣờng sucrose. Quá trình làm tan IL-2 ở dạng inclusion body là nhờ hóa chất Guanidine 7M và đƣa IL-2 trở về dạng không tan bằng cách hạ thấp nồng độ Gnd xuống còn 4M. Cả hai quá trình trên nhằm loại bỏ tối đa các tạp chất không mong muốn khác có trong dung dịch chứa mẫu IL-2 thô, đồng thời thu đƣợc lƣợng IL-2 nhiều nhất có thể. 46 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ IL-2 Hình 3. 9: Kết quả tiền xử lý tinh chế phá tế bào thu dịch thô IL-2 Đƣờng chạy M: thang protein chuẩn (Fermentas) Đƣờng chạy (+): IL-2 chuẩn của Trung Quốc Đƣờng chạy 1: IL-2 sau khi tiền tinh chế phá tế bào thu dịch thô. Đƣờng chạy 2: Protein tổng số của tế bào sản xuất IL-2 trƣớc khi tiền tinh chế. Kết quả trên Hình 3. 9 cho thấy ở đƣơng chạy 1 là IL-2 sau khi tiền tinh chế dịch IL-2 thô là khá sạch, ít băng ở vị trí ngoài 15 kDa rất nhiều so với đƣờng chạy số 2 là dịch protein tổng số trƣớc khi tiền tinh chế. Nhƣ vậy dịch IL-2 thô sau khi tiền tinh chế đã có thể đƣợc xử lý đƣa lên cột tinh chế HPLC. Dịch IL-2 thô sau khi tiền tinh chế đƣợc đƣa lên cột và tiến hành tinh chế nhƣ ở quy trình 2.2.9 trang 33 của luận văn. Kết quả của quá trình tinh chế đƣợc thể hiện trên sắc ký đồ HPLC Hình 3. 10). 47 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ B A IL-2 Hình 3. 10: Kết quả tinh chế IL-2 bằng hệ thống sắc ký lỏng cao áp HPLC A) Sắc ký đồ tinh chế IL-2. B) Kết quả kiểm tra IL-2 sau khi tiền tinh chế phá tế bào thu dịch thô (đƣờng chạy 1) và IL-2 sau khi tinh chế (đƣờng chạy 2). Kết quả trên hình Hình 3. 10 cho thấy sắc ký đồ xuất hiện một đỉnh hẹp, nhọn và cao đƣợc lấy ra đem điện di kiểm tra bằng phƣơng pháp nhuộm bạc và xác định đƣợc đó là IL-2. Nhìn trên Hình 3. 10B có thể nhận ra IL-2 tồn tại ở trạng thái 1 băng duy nhất, trong khi ở đƣờng chạy 1 là dịch IL-2 sau khi tiền tinh chế còn khá nhiều băng ở các vị trí khác nhau, chứng tỏ IL-2 ở phân đoạn trên đã đƣợc tinh sạch, không xuất hiện bất kỳ băng protein tạp nào khác. Phân đoạn này sau đó đƣợc đem đi xác định độ tinh sạch bằng phần mềm chuyên dụng. 3.5 Xác định độ sạch của mẫu IL-2 sau tinh chế bằng phần mềm Quantity One. Sau khi tinh sạch IL-2 bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, chúng tôi tiến hành kiểm tra độ sạch của sản phẩm bằng phần mềm chuyên dụng Quantity One của Bio-rad. Để kiểm chứng cho phƣơng pháp chúng tôi sử dụng mẫu là IL-2 thô sau tinh chế và IL-2 của Trung Quốc làm đối chứng dƣơng. Kết quả ở Hình 3. 11 cho thấy ở mẫu IL-2 của Trung Quốc (TQ), là một sản phẩm sạch đã đƣợc kiểm tra chất lƣợng về độ tinh khiết đạt hơn 95%. Sản phẩm IL- 48 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 2 TQ tồn tại 2 băng ở kích thƣớc 15 kDa và một băng cao khoảng 30 kDa, đây là dạng IL-2 kép dimer (kiểm tra bằng western blot bằng kháng thể đặc hiệu IL-2 vẫn phát hiện đƣợc băng này). Do vậy băng protein 30 kDa này vẫn chính là sản phẩm IL-2 và không ảnh hƣởng đến độ tinh khiết của sản phẩm. Từ Bảng 3. 2 độ sạch của thang protein chuẩn (fermentas) là 99%, mẫu IL-2 TQ cho tỷ lệ IL-2 đạt 95%, và mẫu IL-2 sau tinh chế của chúng tôi đạt đến 98%. Đây chính là giá trị độ tinh khiết của dịch protein IL-2 sau khi tinh chế. Với kết quả này, sản phẩm IL-2 tinh chế thu đƣợc sẽ tiếp tục xây dựng công thức bán thành phẩm và thử hoạt tính trên dòng tế bào đặc hiệu CTLL2 để xác định hoạt tính sinh học mong muốn. Maker IL-2 TQ Mẫu sau tinh chế Hình 3. 11: Xác định thành phần độ tinh khiết của protein Bảng 3. 2: Thông số phân tích băng protein xác định độ tinh khiết của sản phẩm bằng phần mềm Quantity One (tính theo % độ tinh khiết của băng protein). STT băng Maker Trung Quốc Mẫu 1 13.37838 94.14868 98.021 2 19.20191 2.351318 3 16.52623 4 17.1558 5 11.64706 6 21.09062 7 13.37838 Tổng số 99 96.5 49 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 98 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. KẾT LUẬN 1. Đã biểu hiện thành công gene il2 cải biến mới so với trình tự il2 của đề tài pha trƣớc (mất alanine ở đầu N, thay thế Cystein bằng Serine ở vị trí 125). Trình tự amino acid dịch mã từ trình tự gene il2 cải biến giống với trình tự một interleukin thƣơng phẩm trên thế giới đƣợc FDA công nhận là Proleukin (Aldesleukin) của hãng Chiron-Mỹ. 2. Tối ƣu đƣợc điều kiện lên men quy mô bình tam giác ở nhiệt độ biểu hiện 43°C, nồng độ IPTG cảm ứng là 1mM, thời gian thu mẫu là 3 giờ 6 phút. Sau khi tối ƣu, hàm lƣợng IL-2 thu đƣợc cao hơn khi biểu hiện ban đầu 46%. 3. Tiền xử lý và tinh chế IL-2 bằng hệ thống sắc ký HPLC thu đƣợc IL-2 có độ sạch tới 98% (sạch hơn so với mẫu đối chứng là IL-2 của Trung Quốc- chỉ đạt 96,5%). KIẾN NGHỊ Từ những kết quả đạt đƣợc tôi xin đƣa ra một số kiến nghị nhƣ sau: 1. Nghiên cứu nâng quy mô sản xuất IL-2 lên quy mô công nghiệp, tối ƣu lên men quy mô công nghiệp nhằm thu đƣợc lƣợng IL-2 lớn nhất để sản xuất. 2. Xác định hoạt tính sinh học của IL-2 bằng tế bào CTLL2. 3. Sản xuất thử nghiệm các loạt IL-2 tái tổ hợp trên dòng tế bào E. coli đạt tiêu chuẩn của một sản phẩm dạng tiêm. 4. Kiểm định các chỉ tiêu về an toàn và chất lƣợng của IL-2 thành phẩm. 50 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Chấn Hùng N. Hiểu biết hiện nay về bệnh ung thƣ. Y học TP. Hồ Chí Minh. 2005;9(1):115–122. 2. Bùi Hồng Q, Nguyễn Đức L. Tối ƣu hóa sinh tổng hợp LIPASE từ PICHIA ANOMALA VTCC Y0787 sử dụng ma trận PLACKETT-BURMAN và phƣơng pháp đáp ứng bề mặt - phƣơng án cấu trúc có tâm. 2009. Available at: http://elib.hou.edu.vn/handle/123456789/2758. Tiếng Anh 3. Amron DM, Moy RL. Stratospheric ozone depletion and its relationship to skin cancer. J Dermatol Surg Oncol. 1991;17(4):370–372. 4. Baba AI, Câtoi C. Comparative Oncology. Bucharest: The Publishing House of the Romanian Academy; 2007. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9557/. 5. Bhagwat AS, Sohail A, Roberts RJ. Cloning and characterization of the dcm locus of Escherichia coli K-12. J Bacteriol. 1986;166(3):751–755. 6. Biles WE, Swain JJ. Optimization and industrial experimentation. New York: Wiley; 1980. 7. Box GEP, Draper NR. Empirical model-building and response surfaces. New York: Wiley; 1987. 8. Boyle P, Levin B, Cancer IA for R on. World cancer report 2008. IARC Press; 2008. 9. Boyman O, Sprent J. The role of interleukin-2 during homeostasis and activation of the immune system. Nat. Rev. Immunol. 2012;12(3):180–190. 10. Cooper GM. Oncogenes. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9840/ 2000. Available at: 11. Deepak V, Kalishwaralal K, Ramkumarpandian S, et al. Optimization of media composition for Nattokinase production by Bacillus subtilis using response surface methodology. Bioresour. Technol. 2008;99(17):8170–8174. 12. DrugBank ed. Aldesleukin (DB00041). DrugBank. 2012. Available at: http://www.drugbank.ca/drugs/DB00041 51 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 13. Francis DM, Page R. Strategies to optimize protein expression in E. coli. Curr Protoc Protein Sci. 2010;Chapter 5:Unit 5.24.1–29. 14. Grimm EA. Cytokines: Biology and Applications in Cancer Medicine. 2000. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK20931/ 15. Grodberg J, Dunn JJ. ompT encodes the Escherichia coli outer membrane protease that cleaves T7 RNA polymerase during purification. J. Bacteriol. 1988;170(3):1245–1253. 16. Haacke A, Fendrich G, Ramage P, Geiser M. Chaperone over-expression in Escherichia coli: apparent increased yields of soluble recombinant protein kinases are due mainly to soluble aggregates. Protein Expr. Purif. 2009;64(2):185–193. 17. Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell. 2000;100(1):57–70. 18. Hora MCCC. Preparing aldesleukin for pharmaceutical use. 2006. 19. Kammula US, White DE, Rosenberg SA. Trends in the safety of high dose bolus interleukin-2 administration in patients with metastatic cancer. Cancer. 1998;83(4):797–805. 20. Lee DS, White DE, Hurst R, Rosenberg SA, Yang JC. Patterns of relapse and response to retreatment in patients with metastatic melanoma or renal cell carcinoma who responded to interleukin-2-based immunotherapy. Cancer J Sci Am. 1998;4(2):86–93. 21. Liang SM, Thatcher DR, Liang CM, Allet B. Studies of structure-activity relationships of human interleukin-2. J. Biol. Chem. 1986;261(1):334–337. 22. Lodish H, Berk A, Zipursky SL, et al. Proto-Oncogenes and Tumor-Suppressor Genes. 2000. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21662/ 23. MacWilliams MP, Bickle TA. Generation of new DNA binding specificity by truncation of the type IC EcoDXXI hsdS gene. EMBO J. 1996;15(17):4775–4783. 24. Mauro FR, Gentile M, Foa R. Erythropoietin and chronic lymphocytic leukemia. Rev Clin Exp Hematol. 2002;Suppl 1:21–31. 25. Moan J, Dahlback A. The relationship between skin cancers, solar radiation and ozone depletion. Br. J. Cancer. 1992;65(6):916–921. 26. Moffatt BA, Dunn JJ, Studier FW. Nucleotide sequence of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase. J. Mol. Biol. 1984;173(2):265–269. 52 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 27. Ngoan LT, Lua NT, Hang LTM. Cancer mortality pattern in Viet Nam. Asian Pac. J. Cancer Prev. 2007;8(4):535–538. 28. Oudard S, George D, Medioni J, Motzer R. Treatment options in renal cell carcinoma: past, present and future. Ann Oncol. 2007;18(suppl 10):x25–x31. Available at: [Accessed October 26, 2013]. 30. Regnier FE. High-performance liquid chromatography of biopolymers. Science. 1983;222(4621):245–252. 31. Rishabha Malviya VB. HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY: A SHORT REVIEW. Journal of Global Pharma Technology. 2010;2(5):22–26. 32. Safar M, Junghans RP. Interleukin 2 maintains biologic stability and sterility over prolonged time. Immunopharmacology. 2000;49(3):419–423. 33. Schnaitman CA, Austin EA. Efficient incorporation of galactose into lipopolysaccharide by Escherichia coli K-12 strains with polar galE mutations. J Bacteriol. 1990;172(9):5511–5513. 34. Schwartzentruber DJ. Guidelines for the safe administration of high-dose interleukin-2. J. Immunother. 2001;24(4):287–293. 35. Schwertschlag US, Trepicchio WL, Dykstra KH, et al. Hematopoietic, immunomodulatory and epithelial effects of interleukin-11. Leukemia. 1999;13(9):1307–1315. 36. Sim M, Seok H-S, Kim J. A Next-generation Sequence Clustering Method for E. Coli through Proteomics-genomics Data Mapping. Procedia Computer Science. 2013;23:96–101. 37. Stephens FO, Aigner K. Basics of Oncology. Springer; 2009. 38. Thomson AW, Lotze MT. The Cytokine Handbook, Two-Volume Set. Gulf Professional Publishing; 2003. 39. Titov KS, Kiselevskii MV, Demidov LV, et al. Use of recombinant interleukin2 for intrapleural therapy of tumor-associated pleurisy. Bull. Exp. Biol. Med. 2009;148(5):794–796. 40. UK CR. Cancer Worldwide - the global picture. 2013. Available at: http://www.cancerresearchuk.org/cancer-info/cancerstats/world/the-global-picture/ 41. Vydac. The Handbook of Analysis and Purification of Peptides and Proteins by Reversed-phase HPLC. Vydac; 1995. 53 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 42. Weinberg RA. How cancer arises. Sci. Am. 1996;275(3):62–70. 43. Yin J, Li G, Ren X, Herrler G. Select what you need: a comparative evaluation of the advantages and limitations of frequently used expression systems for foreign genes. J. Biotechnol. 2007;127(3):335–347. 44. Zhang C, Wang B, Wang M. GM-CSF and IL-2 as adjuvant enhance the immune effect of protein vaccine against foot-and-mouth disease. Virol. J. 2011;8:7. Internet 45. http://www.who.int/en/ 46. http://www.cancer.org 47. http://www.uspto.gov/ 48. http://www.fda.gov/ 54 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 1. Lê Phuơng Hoàng Anh, Đào Trọng Khoa, Nguyễn Hồng Thanh, Phùng Thu Nguyệt, Trƣơng Nam Hải (2013). Nghiên cứu loại bỏ nội độc tố khỏi sản phẩm interleukin-2 nguời tái tổ hợp bằng phương pháp siêu lọc và sắc ký đảo pha (RP-HPLC). Hội nghị Khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc 1, 268 – 272. 2. Lê Thị Lan Anh, Lê Phuơng Hoàng Anh, Đào Trọng Khoa, Lê Thị Thu Hồng, Phùng Thu Nguyệt, Đoàn Thị Thủy, Lƣu Anh Chiến, Trƣơng Nam Hải (2013). Nghiên cứu tối ưu biểu hiện gen mã hóa interleukin-2 nguời trong Escherichia coli. Hội nghị Khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc 1, 19 – 23. 3. Lê Thi Lan Anh, Lê Phƣơng Hoàng Anh, Đào Trọng Khoa, Lê Thị Thu Hằng, Phùng Thu Nguyệt, Nguyễn Hữu Đức, Nguyễn Thị Hằng, Trƣơng Nam Hải (2013). Biểu hiện gen mã hóa IL-2 của người với chaperon groesl và thioredoxin trong tế bào Escherichia coli BL21 (DE3). Tạp chí Khoa học và Phát triển, Trƣờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội. 11(6), 777-783. 55 Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ [...]... (Fermentas) theo tỷ lệ tƣơng ứng là (5:1), sau đó dịch mẫu đƣợc tra vào các giếng trên gel Đặt bản gel theo đúng chiều dòng điện từ (-) sang (+) Sau khi điện di, bản gel đƣợc nhuộm với EtBr khoảng 10 phút, rồi quan sát băng DNA dƣới ánh sáng đèn UV 2. 2.3 Lên men tạo sản phẩm IL -2 với dòng tế bào vi khuẩn tái tổ hợp E coli BL21 Cơ sở lý thuyết: Tế bào vi khuẩn E .coli tái tổ hợp mang gene tổng hợp IL -2. .. trên1613[13][16], do vậy cùng với những ƣu điểm vƣợt trội E coli vẫn là một trong những chủng biểu hiện rộng rãi nhất trong cơng nghệ DNA tái tổ hợp 1.3.1 Hệ biểu hiện E coli BL21 E coli BL21 là chủng thƣơng mại đƣợc sử dụng nhiều làm vật chủ biểu hiện Hệ gene của chủng E coli BL21 đã đƣợc cải biến một số gene là ompT, hsdS, gal, dcm,λDE3 Ý nghĩa của việc đột biến các gene đó nhƣ sau: - Gene ompT: là một gene... Chƣơng 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2. 1 Vật liệu 2. 1.1 Các chủng vi sinh vật, plasmid  Vector tái tổ hợp pET 22- IL -2  Chủng vi sinh vật (Invitrogen): chủng biểu hiện E coli BL21 2. 1 .2 Hóa chất, enzyme, phần mềm  Thang DNA chuẩn, thang protein chuẩn, (Fermentas); D-glucose, ampicillin Tris-HCl, glycine, SDS (BioRad); phenol, chloroform, methanol, isoamylalcohol, glycerol, ethanol, Na2CO3, NaHCO3, Na2HPO4,... riêng biệt, nhƣ tách dòng (E coli DH10B, E Coli DH5α,…) chủng biểu hiện ( E coli BL21 DE3, E coli rossetta, …) Hạn chế lớn nhất của hệ biểu hiện E coli chính là việc thiếu các q trình cải biến sau dịch mã nhƣ glycosyl hóa, phosphoryl hóa,… do đó các protein tái tổ hợp có nguồn gốc từ sinh vật nhân chuẩn khơng cuộn xoắn đúng cấu trúc, protein tái tổ hợp thƣờng tạo thành dạng khơng tan inclusion body,... phẩm Interleukin -2 tái tổ hợp của ngƣời nhằm điều trị ung thƣ 1.3 Hệ biểu hiện E coli E coli là một hệ biểu hiện lý tƣởng, dễ thao tác, có thể sản xuất dạng protein tái tổ hợp từ nhiều nguồn gốc khác nhau cũng nhƣ có khả năng thu nhận các vector bản chất là plasmid Vi khuẩn E coli đáp ứng đƣợc hầu hết các u cầu của một hệ biểu hiện, thực tế trên thế giới rất nhiều phòng thí nghiệm sử dụng vi khuẩn E coli. .. sai khác trong việc biểu hiện protein tái tổ hợp5 [5] 17 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ - T7 RNA Polymerase (λDE3 và lacUV5): BL21 (DE3) có hệ promoter lacUV5 dùng để điều khiển q trình biểu hiện, đây là một promoter đã đƣợc đột biến và đƣợc tạo ra từ phage λ, promoter này mạnh hơn bất kỳ promoter của hệ biểu hiện vi khuẩn tự nhiên nào26 [26 ] Ngồi ra chủng E coli BL21 (DE3)... để biểu hiện protein tái tổ hợp E coli là vi khuẩn gram âm, mỗi tế bào chỉ tồn tại một nhiễm sắc thể duy nhất hay còn gọi là nucleoid Kích thƣớc genome của E coli khoảng 4,6 x 106 base pairs Hệ biểu hiện vi khuẩn là sự lựa chọn hàng đầu để sản xuất các protein tái tổ hợp Lý do là chi phí để biểu hiện protein bằng hệ vi khuẩn thƣờng khá rẻ Đặc biệt là với hệ biểu hiện E coli, đây là hệ biểu hiện phổ biến. .. amino acid 20 ) Vùng tận cùng đầu C (từ amino acid 121 đến 133) và cầu disulfide giữa các gốc Cys58 và Cys105 Đột biến mất 20 amino acid ở đầu N và 10 amino acid ở đầu C làm mất 99% hoạt tính của IL -2 và khả năng bám vào các thụ thể của IL -2 Trình tự amino acid của IL -2 ngƣời tự nhiên chứa 3 gốc Cystein ở các vị trí 58, 105, 125 Đột biến Cys105 làm giảm 8-10 lần hoạt tính, đột biến Cys58... hoạt tính 25 0 lần Đột biến Cys 125 ảnh hƣởng rất ít tới hoạt tính IL -22 1 [21 ], đặc biệt nếu thay Cys 125 bằng Ser 125 thì hoạt tính của IL -2 khơng bị ảnh hƣởng Nhờ đó nếu thay đổi Cys 125 bằng Ser 125 thì sẽ ngăn cản việc tạo thành cầu disulfide khơng mong muốn Tại đầu N của protein IL -2 có điểm glycosyl hóa đƣợc nhận biết bởi trình tự Ala-Pro-Thr ở vị trí 3 amino acid đầu tiên Trong tự nhiên IL -2 tồn tại... lympho T, 29 [29 ] 1 .2. 1 Cấu trúc gene và protein của Interleukin 2 Gene mã hóa cho IL -2 nằm trên nhiễm sắc thể số 4 Khung đọc mở suy diễn từ trình tự cDNA mã hóa cho phân tử IL -2 hồn chỉnh gồm 153 amino acid, trong đó 20 amino acid mở đầu là tín hiệu tiết Trong cấu trúc DNA, gene mã hóa cho IL -2 cũng bao gồm hộp TATA, vị trí khởi đầu sao mã, phiên mã, bốn vị trí exon và ba vị trí intron Protein hIL -2 sau ... Các dòng vi khuẩn E coli tái tổ hợp mang vector tái tổ hợp Đƣờng chạy 6: dòng E coli tái tổ hợp mang vector tái tổ hợp khơng đƣợc cảm ứng IPTG Đƣờng chạy 7: dòng E coli tái tổ hợp mang vector pET22... http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Quy trình để tối ƣu điều kiện lên men E coli sản xuất IL-2 tái tổ hợp dạng cải biến đƣợc thể nhƣ sơ đồ sau: Hình 3: Sơ đồ tối ƣu lên men vi khuẩn tái E coli tái tổ hợp sản xuất IL-2 a... quyền 3.2 Biểu gene il2 chủng vi khuẩn tái tổ hợp E coli BL21 Sau biến nạp vào tế bào biểu E coli BL21 (DE3) số dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp pET22-IL-2 đƣợc biểu để kiểm tra khả tổng hợp protein