BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI  LÊ THỊ LAN ANH NGHIÊN CỨU ðIỀU KIỆN LÊN MEN VÀ TINH CHẾ INTERLEUKIN-2 TÁI TỔ HỢP CỦA NGƯỜI TỪ ESCHERICHIA COLI LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số : 60.42.80 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. TRƯƠNG NAM HẢI TS. NGUYỄN ðỨC BÁCH HÀ NỘI – 2012 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… i LỜI CẢM ƠN ðầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Trương Nam Hải, Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học, Trưởng phòng Kỹ thuật di truyền và TS. Nguyễn ðức Bách, cán bộ giảng dạy và nghiên cứu bộ môn Công nghệ sinh học ứng dụng - Khoa Công nghệ sinh học, Trường ðại học Nông nghiệp - Hà Nội ñã tận tình hướng dẫn và truyền ñạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm giúp ñỡ, sự chỉ bảo tận tình về chuyên môn và sự ñộng viên chân thành của NCS. Nguyễn Hồng Thanh và NCS. Trần Ngọc Tân cùng tập thể cán bộ nghiên cứu của Phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học. Tôi xin gửi lời cảm ơn ñến Ban Lãnh ñạo Viện Công nghệ sinh học, các thầy cô giáo trong Khoa Công nghệ sinh học, các cán bộ của Viện ðào tạo sau ñại học, Trường ðại học Nông nghiệp - Hà Nội ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi ñể tôi hoàn thành luận văn thạc sỹ này. Cuối cùng, tôi xin ñược gửi tới gia ñình, bạn bè lòng biết ơn vì ñã luôn ñộng viên, giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày 22 tháng 5 năm 2012 Học viên cao học Lê Thị Lan Anh Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… ii LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam đoan luận văn thạc sỹ công nghệ sinh học với đề tài “Nghiên cứu tối ưu ñiều kiện lên men và tinh chế interleukin-2 tái tổ hợp của người từ Escherichia coli” là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi. Các kết quả và số liệu trong luận văn là trung thực. Hà Nội, ngày 22 tháng 5 năm 2012 LÊ THỊ LAN ANH Học viên cao học khóa 19 Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Amp Ampicillin APS Ammonium persulfate BCG Baccillus Calmette-Gurin bp Base pair dNTP 2’-deoxyribonucleotide 5’-triphosphate E. coli Escherichia coli EDTA Ethylene diamin tetra acetic acid EtBr Ethidium bromide GMP Good Manufacture Practising HIV Human immunodeficiency virus HPLC High Performance Liquid Chromatography IFN Interferon IL-2 Interleukin-2 IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside kDa Kilo Dalton LB Môi trường Luria-Bertani LBA Môi trường LB có bổ sung Amp LH1 Lysyl hydroxylase 1 MCB Master Cell Bank MWCB Manufacturer’s Working Cell Bank NK Natural killer (tế bào diệt tự nhiên) Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… iv OD Optical Density Pichia pastoris Pichia pastoris PBS Phosphate Buffer Saline FDA Food and Drug Administration PMSF Phenyl Methane Sulphonyl Fluoride PVDF Polyvinylidene difluoride rhIL-2 Recombinant human Interleukin-2 SDS Sodium dodecyl Sulphate SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate – Polyacrylamide Gel Electrophoresis TAE Tris-Acetate-EDTA TE Tris-EDTA TEMED N, N, N’, N’- Tetramethyl-Ethylenediamin TNF Tumor necrosis factor (yếu tố hoại tử ung thư) Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… v DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Thành phần môi trường M9……………………………………………………….25 Bảng 2. Thành phần dung dịch đổ gel polyacrylamide 12,6% 29 Bảng 3. Bảng 3. Các dung dịch trong nhuộm bạc………………………………………… 30 Bảng 4. So sánh các thông số trong quá trình tạo sản phẩm IL-2 tinh chế từ E. coli và P. pastoris……………………………………………………………………………………………… 51 Bảng 5. Dữ liệu kiểm tra hoạt tính của các mẫu IL-2 tái tổ hợp M1.1 – M1.5 lô 1……… 53 Bảng 6. Dữ liệu kiểm tra hoạt tính của các mẫu IL-2 tái tổ hợp M2.1 – M2.4 lô 2……… 54 Bảng 7. Dữ liệu kiểm tra hoạt tính của các mẫu IL-2 tái tổ hợp M3.1 – M3.4 lô 3……… 54 Bảng 8. Hoạt tính theo đơn vị Units/mg của các mẫu IL-2……………………………… 55 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… vi DANH MỤC HÌNH, ðỒ THỊ Hình 1. Cơ chế gây ung thư 4 Hình 2. Hình thái học ung thư 4 Hình 3. Cơ chế hoạt động của Interleukin-2 13 Hình 4. U hắc tố da 14 Hình 5. Ung thư thận 16 Hình 6. Hệ thống lên men Bioflo 20 Hình 7. Hệ thống tinh chế protein HPLC 22 Hình 8. Khả năng sinh tổng hợp IL-2 của chủng E. coli theo thời gian sinh trưởng trong môi trường cảm ứng 39 Hình 9. Ảnh hưởng của nồng độ IPTG đến khả năng tổng hợp IL-2 trong tế bào E. coli 40 Hình 10. Khả năng sinh tổng hợp IL-2 của chủng E. coli trong các môi trường lên men khác nhau 42 Hình 11. Phân tích IL-2 dạng tan và không tan của IL-2 trong các môi trường lên men khác nhau 44 Hình 12. Sản phẩm IL-2 biểu hiện trong tế bào E. coli trong hệ thống lên men Bioflo 110 quy mô 5 lít trên gel SDS-page và western blotting 45 Hình 13. Kiểm tra các mẫu xử lý sinh khối tế bào E. coli chứa IL-2 tái tổ hợp trên gel Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… vii polyacrylamide 12,6% 46 Hình 14. Kiểm tra tính tan của IL-2 trong các nồng độ Gnd-HCl khác nhau trên gel polyacrylamide 12,6% 47 Hình 15. Sắc ký đồ tinh chế IL-2 trên hệ thống HPLC 49 Hình 16. Kiểm tra sản phẩm tinh chế IL-2 bằng kỹ thuật SDS-page 49 Hình 17. Kiểm tra sản phẩm tinh chế IL-2 bằng kỹ thuật SDS-page 50 Hình 18. Kiểm tra độ sạch của các sản phẩm protein 51 Hình 19. Đồ thị hoạt tính theo đơn vị Units của các mẫu thí nghiệm 55 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… viii MỤC LỤC PHẦN 1. MỞ ðẦU…………………………………………………………………………… 1 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………………………………………… 3 2.1. Tổng quan về ung thư và phương pháp điều trị ung thư ……… ………………………….3 2.1.1. Cơ chế gây ung thư……………………………………………………………… 3 2.1.2. Tình hình nghiên cứu ung thư trên thế giới và Việt Nam……………………… 4 2.1.3. Một số phương pháp điều trị ung thư hiện nay………………… ………………6 2.2. Cytokine…………………………………………………………………………………….8 2.2.1. Cytokine và vai trò của chúng trong thực tế…………………………………… 8 2.2.2. Các loại cytokine và ứng dụng của chúng trong thực tế………………………….9 2.3. Interleukin-2……………………………………………………………………………….11 2.3.1. Cấu trúc gen il-2 của người …………………………………………………… 11 2.3.2. Cơ chế hoạt động của IL-2………………………………………………………12 2.3.3. Sản phẩm IL-2 tái tổ hợp và ứng dụng………………………………………… 14 2.3.4. Các nghiên cứu và ứng dụng IL-2 trong điều trị ung thư trên thế giới Việt Nam.17 2.3.5. Lên men sản xuất protein tái tổ hợp và hệ thống lên men Bioflo 110………… 19 2.4. Hệ thống tinh chế protein HPLC………………………………………………………… 21 2.5. Thử hoạt tính sinh học của interleukin-2 trên dòng tế bào CTLL2……… ………………22 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……………………………….24 3.1. Vật liệu………………………….…………………………………………………………24 3.1.1. Các chủng sinh vật, plasmid và tế bào CTLL2………………………………….24 3.1.2. Hóa chất, enzym, máy móc và thiết bị………………… ………………………24 3.1.3. Các dung dịch sử dụng và môi trường nuôi cấy…………………………………25 3.2. Phương pháp nghiên cứu………………………………………………………………… 27 3.2.1. Lên men tạo sản phẩm IL-2 với dòng tế bào E. coli…………………………… 27 3.2.2. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide-SDS…………………… 27 3.2.3. Phương pháp kiểm tra tính bắt cặp đặc hiệu với kháng thể kháng hIL-2 bằng phương pháp Western blotting…………………………………………………………………30 3.2.4. Lên men lượng lớn tạo sản phẩm IL-2 với dòng tế bào E. coli trên hệ thống lên men Bioflo 110 quy mô 5 lít 32 3.2.5. Phá tế bào bằng siêu âm…………………………………………………………33 3.2.6.Phá tế bào và xử lý mẫu protein IL-2 trước khi qua cột sắc ký………… ………34 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… ix 3.2.7. Tinh chế protein bằng hệ sắc ký HPLC………………………………………….35 3.2.8. Xác định độ tinh khiết của sản phẩm IL-2 tái tổ hợp sau tinh sạch 36 3.2.9. Phương pháp kiểm tra hoạt tính IL-2 sau tinh sạch…………………………… 37 PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN………………………………… 39 4.1. Lựa chọn điều kiện lên men E. coli biểu hiện IL-2 dạng đơn ………………………… 39 4.1.1. Lựa chọn thời gian thu mẫu sau cảm ứng……………………………………… 39 4.1.2. Nồng độ IPTG thích hợp cho sinh tổng hợp IL-2………………………………40 4.1.3. Lựa chọn môi trường lên men phù hợp…………………………………………41 4.1.4.Kiểm tra tính tan (solution bodies) và không tan (inclusion bodies) của protein tái tổ hợp IL-2 trong E. coli trong các môi trường……………………………………………… 43 4.2. Lên men sản phẩm IL-2 trong hệ thống lên men Bioflo 110 quy mô 5 lít……………… 44 4.3. Phá tế bào E. coli và xử lí tiền tinh chế IL-2………………………………………………45 4.4. Kiểm tra tính tan của IL-2 trong các nồng độ GuHCl khác nhau……… ……………….46 4.5. Tinh sạch IL-2 từ dòng tế bào E. coli………………………… …………………48 4.6. Kiểm tra độ sạch của sản phẩm protein IL-2 bằng phần mềm Quantity One…… 51 4.7. Kiểm tra hoạt tính IL-2 tái tổ hợp trên tế bào CTLL2…………………………… 52 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ……………………………………………………… 57 5.1. Kết luận……………………………………………………………………………………57 5.2. Kiến nghị………………………………………………………… ………………………57 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………………… 58 PHỤ LỤC………………………………………………………………………………63 [...]... …………………… 18 2.3.5 Lên men s n xu t protein tái t h p và h th ng lên men Bioflo 110 * Lên men s n xu t protein tái t h p Lên men nuôi c y vi sinh v t s n xu t protein tái t h p là quá trình nuôi c y vi sinh v t trong m t môi trư ng dinh dư ng và ñi u ki n phù h p ñ vi sinh v t sinh trư ng, phát tri n t o s n ph m protein tái t h p mong mu n S n xu t protein tái t h p là quá trình ñưa m t gen vào trong m t... trong quá trình lên men Vì ñây là h th ng lên men dung tích l n, do v y, ñ ñ m b o hi u qu lên men cao ñ ng th i tránh lãng phí cho quá trình lên men thì ch ng lên men c n ñư c nuôi c y t i ưu trư c khi ñưa vào h th ng lên men Bioflo 110 2.4 H th ng tinh ch protein HPLC HPLC (high-performance liquid chromatography) là h th ng s c ký hi n ñ i ñư c dùng ph bi n trong phân tích, ñ nh lư ng và tinh s ch các... ñưa vào s n xu t th nghi m quy mô l n Trong quá trình lên men, có r t nhi u y u t quy t ñ nh ñ n hi u su t lên men và ch t lư ng s n ph m lên men như: môi trư ng dinh dư ng, lư ng oxy hòa tan trong môi trư ng, nhi t ñ và pH trong quá trình nuôi c y, th i gian nuôi c y, [34] Vì v y, ñ t i ưu ñư c các ñi u ki n chu n trên c n có m t h th ng lên men trong ñó các thông s và di n bi n c a quá trình lên men. .. nông nghi p …………………… 20 H th ng lên men Bioflo 110 là m t h th ng lên men t ñ ng v i dung tích 4 ñ n 10 lít ñư c s d ng cho lên men nuôi c y t bào ñ ng v t, t bào th c v t, t bào côn trùng, n m men và vi khu n V i h th ng lên men này chúng ta hoàn toàn có th theo dõi ñư c m i di n bi n c a quá trình lên men, n m ñư c các thông s quan tr ng như nhi t ñ , pH, oxy hòa tan, và d dàng thu m u cũng như b sung... như quá trình tinh ch ñ nh n ñư c IL-2 tái t h p d ng s ch ph c v cho các nghiên c u, kh o nghi m s n ph m sau này Xu t phát t nh ng cơ s khoa h c và th c ti n trên, chúng tôi ti n hành th c hi n ñ tài: Nghiên c u ñi u ki n lên men và tinh ch interleukin-2 tái t h p c a ngư i t Escherichia coli nh m s n xu t thành công IL-2 tái t h p ph c v cho ñi u tr ung thư t i Vi t Nam Trư ng ð i h c Nông nghi... ng h th ng lên men Bioflo 110, v i h th ng này các thông s c a quá trình lên men ñ u ñư c ki m soát ch t ch qua h th ng máy tính giúp cho vi c theo dõi di n ti n c a quá trình lên men ñư c ñ m b o T ñó giúp chúng ta d dàng theo dõi ti n trình lên men và có bi n pháp x lý k p th i khi có s c Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p …………………… 19 * H th ng lên men Bioflo... trình lên men ch ng E coli sinh t ng h p IL-2 mà chúng ta c n ph i nghiên c u như thành ph n môi trư ng, nhi t ñ nuôi c y, pH môi trư ng, n ng ñ ch t c m ng, th i gian thu s n ph m sau c m ng, y u t nh hư ng ñ n m t ñ t bào cu i cùng Vì v y, c n thi t ph i có quá trình t i ưu ñi u ki n lên men ñ ñ t hi u su t thu h i s n ph m protein tái t h p cao nh t, cũng như quá trình tinh ch ñ nh n ñư c IL-2 tái. .. bào và các t bào lympho xâm l n kh i u ði u này ñã giúp cho cơ th ch ng l i b nh ung thư 2.3.3 S n ph m IL-2 tái t h p và ng d ng * S n ph m IL-2 tái t h p Năm 1992, t p ñoàn Chiron c a M ñã cho ra ñ i s n ph m IL-2 tái t h p v i s s a ñ i m t acid amin v trí 125 và không có acid amin alanine ñ u N có tên thương m i là Proleukin và ñư c FDA cho phép s d ng trong ñi u tr ung thu th n, u h c t da và h... protein tái t h p ñư c t o ra hi n nay là interferon, insulin, albumin huy t thanh ngư i, factor VIII, factor IX, epidermal growth factor, somatostatin bò, chymosin bò, IL-2, Quá trình lên men s n xu t protein tái t h p ñòi h i các y u t như ti t protein mong mu n, t i thi u vi c phân h y s n ph m mong mu n và luôn ki m soát ñư c toàn b quá trình t ng h p trong th i gian lên men Tùy t ng lo i protein và. .. sung IL-2 vào môi trư ng nuôi c y dòng t bào CTLL2 thì tùy thu c vào ho t tính c a IL-2 mà t bào CTLL2 s duy trì s s ng và ñư c kích ho t ñ phát tri n và sinh s n Ho t tính c a IL-2 càng m nh thì kh năng ho t hóa s phát tri n và sinh s n c a t bào CTLL2 càng t t D a vào ñ c tính này, chúng tôi ñã l a ch n dòng t bào CTLL-2 ñ dùng cho ki m tra ho t tính sinh h c c a protein tái t h p IL-2 sau khi tinh s . học với đề tài Nghiên cứu tối ưu ñiều kiện lên men và tinh chế interleukin-2 tái tổ hợp của người từ Escherichia coli là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi. Các kết quả và số liệu trong. Xuất phát từ những cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: Nghiên cứu ñiều kiện lên men và tinh chế interleukin-2 tái tổ hợp của người từ Escherichia coli nhằm. GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI  LÊ THỊ LAN ANH NGHIÊN CỨU ðIỀU KIỆN LÊN MEN VÀ TINH CHẾ INTERLEUKIN-2 TÁI TỔ HỢP CỦA NGƯỜI TỪ ESCHERICHIA COLI