BỘ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI ố*,£Q°>^ TRẨN THỊ THU THẢO NGHIÊN CỨU XÂY DựNG TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG CỦA HYDROXYURE (KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DUỌC SỸ KHÓA 21KG-' f A ĩ ' } c' [ ỳ v m % ỉ ỹ Người hướng dẫn: TIẾN SỸ NGUYỄN THỊ KlỄỦ ANH Nơi thực hiện: PHỊNG THÍ NGHIỆM TRUNG TÂM TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI Thòi gian thực hiện: Từ 3/2007 - 5/2007 HÀ NỘI, -2 0 LỜI CẢM ƠN & n \ x i 1^ c l\ấ n t K ò n k c ả m ơn c c i k ầ y c ô g i o ~Crưởv\g đ i K ọ c D u ợ c •H nộị cfã l n líiak d y d e m f^on s u ô t n a m Uọc Đ c b iẹ t gUÌ lời t^aia c a m ơkA tói TTiêtt s ỹ /VlguyốKx TTkị K j ể u A n K lagUỜi đ ă f^ ụ c l i ế p kucíng d a n c k í b 7000000 I ■ặ 6000000 i Chuẩn bị dung dịch chuẩn, thử: Dung dịch chuẩn hydroxyure: cân xác khoảng 50 mg hydroxyure chuẩn đối chiếu cho vào bình định mức 50 ml Thêm pha động vừa đủ đến vạch, lắc Lọc qua màng lọc có đường kính lỗ lọc 0,45 |im Dung dịch thử hydroxyure: cân xác khoảng 50 mg hydroxyure mẫu thử cho vào bình định mức 50 ml khác Thêm pha động vừa đủ đến vạch, lắc Lọc qua lỗ lọc có đường kính lỗ lọc 0,45 ụ,m ^ Tiến hành đo: * Chạy pha động để cân cột 30 phút * Khi tín hiệu đường ổn định, tiến hành chạy sắc ký dung dịch thử chuẩn, ghi lại sắc đồ với thơng số diện tích pic dung dịch thử chuẩn 33 r- Tính kết quả: Hàm lượng % hydroxyure mẫu thử tính theo cơng thức sau: x% = A,mcCc— x io o Acmtạ -N ) Trong đó: At Ac diện tích pic dung dịch mẫu thử mẫu chuẩn Cc hàm lượng % chất chuẩn (Cc =98%) Mcvà mt khối lượng mẫu chuẩn mẫu thử (mg) N: Hàm lượng (%) nước mẫu thử Sau tiến hành sắc ký kết thu sau Bảng 2.5: Kết định lượng TT M ẫu % nước ^cân (mg) Diện tích píc(A) Hàm lượng (mAU.giây) (%) HI 0,101% 49,8 2306661 97,44 H2 0,152% 51,9 2413431 97,87 H3 0,116% 49,3 2262832 96,56 H4 0,129% 48,5 2350455 101,98 Chuẩn 0% (khan) 49,9 2326890 98,00 Hàm lượng CH4N20 xác định qua mẫu chế phẩm đạt từ 96,56 đến 101,98%, mẫu thử hầu hết đạt hàm lượng (3/4 mẫu), cho thấy quy trình tổng hợp ổn định, nhiên có mẫu chưa đạt (96,56%), nên cần phải hồn thiện quy trình tổng hợp + Yêu cầu: mẫu thử chứa không 97,0%, không 103,0% CH4N20 tính theo khối lượng làm khơ + Kết luận: Mẫu H l, H2, H4 đạt Mẫu H3: không đạt Từ kết nghiên cứu trên, đề xuất tiêu chuẩn sở (tiêu chuẩn kỹ thuật phương pháp thử) Hydroxyure 34 TIÊU CHUẨN C SỞ BỌ YTE TCCS số: Hydroxyure TRƯỜNG ĐẠI HỌC Có hiệu lực từ ngày ký DƯỢC HÀ NỘI CÁC CHỈ TIÊU KỸ THUẬT 1.Tính chất: bột kết tinh, màu trắng gần trắng, hút ẩm Điểm chảy: 138- 145°c Định tính: có phản ứng dương tính với Hydroxyure M ất khối lượng làm khô: không 1,0% / 5.Tro sulfat: không 0,5% Kim loại nặng: không 0,003% Tạp liên quan: tổng tạp khơng q 1,0% i • ' / - - 8.Định lượng: không 97,0% không 103,0% CH4N20 tính theo chế phẩm làm khơ PHƯƠNG PHÁP THỬ 1.Tính chất: lấy lượng bột trải lên tờ giấy, dàn đều, mỏng, thử cảm quan Độ chảy: sấy khô lượng mẫu thử kiện chân không 60°c Tiến hành theo dẫn dược điển Việt Nam III, phụ lục 5.19 chuyên luận “ xác định nhiệt độ nóng chảy” Định tính: * Phương pháp phổ hấp thu hổng ngoai: làm viên với KBr tiến hành theo dẫn Dược điển Việt Nam III, phụ lục 3.2 Yêu cầu: phổ mẫu thử phải trùng với phổ chất chuẩn đối chiếu 35 • Phương pháp SKLM: Tiến hành theo dẫn Dược điển Việt Nam III, phụ lục 4.4 • Điều kiện sắc kỷ: - Bản mỏng: silicagel - Pha động: pyridin-nước-ethylacetat (2:2:10) - Thể tích chấm sắc ký: |_il - Dung dịch phát hiện: dung dịch dimethyl aminobenzaldehyd 10 g/1 dung dịch acid HC1 IM • Tiến hành: Dung dịch thử: hoà tan 50 mg hydroxyure thử ml nước cất Dung dịch đối chiếu: hoà tan 50 mg hydroxyure chuẩn ml nước cất • Triển khai sắc kỷ: Trên mỏng silicagel dùng mao quản |Lil chấm vết: thử, đối chiếu Để khô không khí Tiến hành chạy sắc ký đoạn 13-15 cm Lấy để khơ khơng khí Phun dung dịch thuốc thử Yêu cầu: vết sắc đổ dung dịch thử phải vị trí màu sắc với vết sắc đồ chuẩn đối chiếu M ất khôi lượng làm khô: Tiến hành theo dẫn dược điển Việt Nam III, phụ lục 5.16, phương pháp sấy chân không 60°c thử 2,00 g mẫu Tro sulfat: Tiến hành: tiến hành theo dẫn Dược điển Việt Nam III, phụ lục 7.7, phương pháp I Kim loại nặng: tiến hành theo phương pháp chuyên luận thử giới hạn kim loại nặng, dược điển Việt Nam III, phụ lục 7, 4.7, phương pháp I 36 Dung dịch thừ cân khoảng 2,00 g hòa tan 10 ml nước cất Sử dụng dung dịch chì mẫu ppm làm dung dịch đối chiếu Tạp chất liên quan: phương pháp HPLC * Điều kiện sắc ký: xem phần định lượng Chuẩn bị dung dịch thử phần định lượng Triển khai sắc ký dung dịch thử thời gian gấp lần thời gian lưu Hydroxyure Lượng (%) tạp tính theo cơng thức sau: % tạp = -ậ i- xioo p : /=1 Tổng lượng (%) tạp chất tính theo cơng thức sau: V A % tổng = — I Í=1 xioo Trong đó: Ai diện tích tạp chất i ỵ.Ar diện tích pic tất pic trừ pic ứng với Hydroxyure pic chất không bị lưu giữ Ỳ, diện tích pic tất pic trừ chất /=1 không bị lưu giữ Định lượng: phương pháp HPLC *Điều kiện sắc ký: - Cột: C18 (150*4,6 mm; |j,m) - Pha động: MeOH- H20 (5:95) - Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút - Thể tích tiêm: 20 Ịil - Bước sóng: 214 nm 37 *Tiến hành: Dung dịch chuẩn hydroxyure: cân xác khoảng 50 mg hydroxyure chiết từ chế phẩm cho vào bình định mức 50 ml Thêm pha động vừa đủ đến vạch, lắc Lọc qua màng lọc có đường kính lỗ lọc 0,45 |Lim Dung dịch thử hydroxyure: cân xác khoảng 50 mg hydroxyure tổng hợp cho vào bình định mức 50 ml khác Thêm pha động vừa đủ đến vạch, lắc Lọc qua lỗ lọc có đường kính lỗ lọc 0,45 jum *Tính kết quả: Hàm lượng % hydroxyure mẫu thử tính theo cơng thức sau: x%= A,mcCc xioo Acmt(\-N ) Trong đó: At Ac diện tích pic dung dịch mẫu thử mẫu chuẩn Cc nồng độ % dung dịch mẫu chuẩn ( coi Cc = 98%) Mcvà mt khối lượng mẫu chuẩn mẫu thử (mg) N hàm lượng nước chế phẩm thử 38 KẾT QUẢ KIỂM NGHIỆM NGUYÊN LIỆU HYDROXYURE BỘ Y TẾ CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI Độc lập - Tự d o - Hạnh phúc PHIẾU KIỂM NGHIỆM Mẫu kiểm nghiệm: chế phẩm nghiên cứu Hydroxyure, mẫu H2 Nơi sản xuất: mơn Hố hữu cơ, Trường đại học Dược Hà nội Yêu cầu kiểm nghiệm: kiểm tra chất lượng Thử theo: tiêu chuẩn dự thảo Tình trạng mẫu nhận mở niêm phong để kiểm nghiệm: mẫu thử đựng lọ thủy tinh kín, nhãn rõ ràng YÊU CẦU KẾT QUẢ Tính chất: bột kết tinh trắng gần trắng, hút ẩm Đạt Độ chảy: 138-145°c Đạt ( 141,l ° c ) Định tính: ngun liệu phải có kết dương tính với Hydroxyure Đúng Mất khối lượng làm khô: không 1,0% Đạt (0,12%) Tro sulfat: không 0,5% Đạt (0,16%) Kim loại nặng: không 0,003% Đạt Tạp liên quan: Tổng tạp không 1,0% Đạt (0,99%) Định lượng: từ 97,0% đến 103,0% CH4N20 tính theo chế phẩm làm khơ Đạt (97,87) 39 2.3 BÀN LUẬN Ở nước ta, nguyên liệu Hydroxyure tổng hợp mơn Hóa hữu cơ, Trường đại học Dược Hà nội Với mục tiêu đưa nguyên liệu vào trình sản xuất tạo chế phẩm có tác dụng điều trị, hiệu cao, an tồn u cầu quan trọng nguyên liệu phải đảm bảo chất lượng tốt Trong đó, dược điển Việt Nam III chưa có chuyên luận Hydroxyure nên để đánh giá chất lượng nguyên liệu này, tiến hành xây dựng tiêu chất lượng cho nguyên liệu Hydroxyure phù hợp với điều kiện thực tế Việt Nam Các phương pháp phân tích dùng đánh giá chất lượng nguyên liệu có độ xác cao, đặc hiệu phù hợp với điều kiện trang thiết bị kiểm nghiệm Việt Nam * Định tính: sử dụng phương pháp phổ hấp thụ hồng ngoại Nguyên liệu Hydroxyure có CTCT: NH2-CO-NH-OH, chứa nhiều nhóm chức khác nên có khả hấp thụ IR cho đỉnh hấp thụ đặc trưng Cấu trúc phân tử đơn giản phổ khơng phức tạp nên dễ dàng dàng biện giải phổ để xác định nhóm chức hợp chất đối chiếu với phổ chất chuẩn tiến hành song song điều kiện Bên cạnh đó, phương pháp có độ xác cao, phù hợp để định tính mẫu thử có độ tinh khiết cao nguyên liệu Hydroxyure không cần phải trải qua giai đoạn tinh chế mẫu thử chế phẩm có lẫn nhiều thành phần khác Ớ nước ta, phổ IR sử dụng phổ biến, phòng kiểm nghiệm Việt Nam hầu hết trang bị phương tiện nên việc định tính Hydroxyure hồn tồn khả thi * Định lượng: sử dụng phương pháp HPLC Với điều kiện sắc ký đơn giản, dễ dàng triển khai phịng thí nghiệm Việt Nam: 40 - Cột: C18 - Pha động hỗn hợp MeOH- H20: hòa tan tốt mẫu thử, đảm bảo cho trình tách hỗn hợp nhiều chất Đổng thời MeOH có hạn đo u v 205 nm, tỉ lệ chiếm 5% nên phân tích bước sóng 214 nm hồn tồn phù hợp Khoảng nồng độ Hydroxyure tuyến tính xác định khoảng hẹp từ 0,5- 1,5 mg/ml để dung dịch định lượng thu diện tích píc có quan hệ tuyến tính với nồng độ, hệ số tương quan r diện tích pic đáp ứng nồng độ xấp xỉ 1, cho thấy sử dụng phương pháp so sánh với chất chuẩn để tính kết quả; từ đưa nồng độ mg/ml làm nồng độ thực định lượng Để hạn chế sai số, phải chuẩn bị dung dịch thử dung dịch chuẩn có nồng độ xấp xỉ Phương pháp định lượng có độ lặp lại tốt (RSD = 0,87< 2%) Độ xác định phương pháp thêm chuẩn, kết thực nghiệm có độ thu hồi 100,97- 102,54%, cho thấy phương pháp có độ đảm bảo Từ sở đề xuất tiêu chuẩn kỹ thuật phương pháp thử Hydroxyure So với tiêu chuẩn đưa nước phát triển, xây dựng hầu hết tiêu kỹ thuật phương pháp thử đảm bảo độ xác, tin cậy cao đồng thời dễ triển khai phòng kiểm nghiệm Việt Nam Các tiêu chuẩn kỹ thuật đưa phù hợp làm sở để đánh giá chất lượng Hydroxyure nghiên cứu tổng hợp kiểm nghiệm Tuy nhiên, có số tiêu chưa có điều kiện đưa vào xây dựng như: thử giới hạn dung môi tồn dư, tạp chất dễ bay cần tiếp tục triển khai thực 41 PH Ầ N 3: K Ế T L U Ậ N Kết thúc khóa luận, chúng tơi thu kết sau: Đã xây dựng tiêu chất lượng cho nguyên liệu tương đương với quy định Dược điển nước phát triển s Đã xây dựng phương pháp thử thích hợp để đánh giá tiêu chất lượng Hydroxyure Trong + Định tính: Phương pháp phổ hấp thụ hồng ngoại: phương pháp có độ xác cao, phổ Hydroxyure tương đối đơn giản, dễ đối chiếu, phù hợp với đối tượng nghiên cứu nguyên liệu Phương pháp SKLM: phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, rẻ tiền đáng tin cậy + Tạp liên quan: phương pháp HPLC + Định lượng: phương pháp HPLC, phương pháp thẩm định chặt chẽ, đảm bảo cho kết định lượng có độ xác cao s ứng dụng phương pháp xây dựng để kiểm tra, đánh giá chất lượng nguyên liệu Hydroxyure thử nhằm hồn thiện qui trình tổng hợp Tiêu chuẩn kiểm nghiệm xây dựng sở để kiểm tra chất lượng nguyên liệu đồng thời tài liệu pháp lý quan trọng hồ sơ xin đăng ký sản xuất phân phối Đề xuất s Hoàn thiện tiêu chuẩn, phương pháp thử cho Hyđroxyure, tiêu: tạp dung môi tồn dư, tạp chất dễ bay S Đưa dự thảo sở thẩm định để lập hồ sơ xin đăng ký sản xuất nhằm tạo nguồn nguyên liệu thuốc điều trị bệnh 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Luận án TS "Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn phương pháp đánh giá chất lượng viên nén Keto proíen TDK 200mg bào chế Việt Nam" Nguyễn Thị Kiều Anh Bộ Y tế năm (2002), Dược thư quốc gia Việt Nam Bộ y tế, 2005, Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất y học, Hà nội Bộ Y tế, Dược điển Việt Nam III, Nhà xuất Y học, Hà nội Hóa chất điều tri bệnh ung thư, Nhà xuất Y hoc, Hà nôi tr3- o Hướng dẫn thực hành chuẩn đoán, điều trị bệnh ung thư, Nhà xuất Y học, 2001 tr 2-5 Nguyễn Thị Kiều Anh, Thẩm định phương pháp phân tích dịch sinh học, tài liệu sau đại học Tào Duy Cần, 2005, Tra cứu biệt dược thuốc thường dùng, Nhà xuất y khoa Hà nội, tập tr 643 Trường Đại học Dược Hà nội- Hóa phân tích, tập Tiếng Anh: 10 British Pharmacopeia 2005, Vol II, p 11007- 1008 11 European Pharmacopoeia 2002, pl343- 1344 12 Handbook of HPLC, Marcel Deker Inc, USA 1998 13 Joumal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals, Vol 14 Martindal The completed drug reíerence 15 Munson J.w (1984) High- Períormance Liquid Chromatography: Instrumentation and pharmaceutical applications in pharmaceutical analysis 16 P.J.Graham (1955) Synthes of ureas,US.Patent 2, p 705-727 17 Pharmacopoeia of the people republic of China, 2000, vol 1, p 339 18 R Deghenghi (1960) Hydroxyurea, organic Syntheses, vol 4, p 60 The United States Pharmacopeia 28 (2005), Vol I, p 1089- 1090 43 ... Xây dựng tiêu chất lượng cho nguyên liệu Hydroxyure ^ Xây dựng phương pháp thử để đánh giá tiêu chất lượng đưa r ’ ứng dụng phương pháp xây dựng để kiểm tra, đánh giá chất lượng nguyên liệu Hydroxyure. .. lượng hydroxyure? ?? với mục tiêu: + Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu Hydroxyure + Xây dựng phương pháp kiểm nghiệm phù hợp để đánh giá chất lượng Hydroxyure Phần 1- TỔNG QUAN 1.1 Vài nét hydroxyure. .. tiêu chuẩn chất lượng kèm với phương pháp thử phù hợp Trong đó, Dược điển Việt nam chưa có chuyên luận riêng hydroxyure, chúng tơi tiến hành thực đề tài ? ?Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng