BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 PHẠM THỊ NGỌC MAI NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG TỚI KHẢ NĂNG TẠO MÀNG BACTERIAL CELLULOSE CỦA VI KHUẨN GLUCONACETOBACTER Chuyên ngành: Sinh thái học Mã số: 60 42 01 20 ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung HÀ NỘI, 2014 ii LỜI CẢM ƠN Trong quá trình tìm hiểu, nghiên cứu và hoàn thành luận văn tốt ngiệp, tôi đã nhận được những lời chỉ bảo, hướng dẫn tận tình của cô giáo: PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung. Tôi xin chân thành cảm ơn cán bộ phòng Vi sinh trường ĐHSP Hà Nội 2 . Bên cạnh đó, Ban giám hiệu, Phòng sau đại học, các Phòng, Ban trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo các điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong quá trình làm việc. Cùng với đó là sự hỗ trợ nhất định từ gia đình và bạn bè. Tôi xin chân thành cảm ơn những sự giúp đỡ quý báu đó! Hà Nội, tháng 12 năm 2014 Học viên Phạm Thị Ngọc Mai iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung. Luận văn này không có sự trùng lặp với các đề tài khác. Hà Nội, tháng 12 năm 2014 Học viên Phạm Thị Ngọc Mai iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BC : Bacterial cellulose GK : Glucokinase PMG : Phosphoglucomutase STT : Số thứ tự CFU : Colony Forming Unit MT : Môi trường VSV : Vi sinh vật Cs : Cộng sự Nxb : Nhà xuất bản v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter theo Frateur (1950) Bảng 3.1. Một số dặc điểm về hình thái khuẩn lạc và tế bào của 18 mẫu vi khuẩn acetic Bảng 3.2. Khả năng sinh acid acetic của 18 mẫu vi khuẩn acetic Bảng 3.3. Khảo sát khả năng tạo màng BC của các mẫu vi khuẩn acetic Bảng 3.4. Khảo sát khả năng tạo màng BC của một số chủng vi khuẩn Gluconacetobacter Bảng 3.5. Bảng 3.6. Bảng 3.7. Bảng 3.8. Bảng 3.9. Bảng 3.10. Bảng 3.11. Khả năng thấm hút nước của màng BC sau khi xử lý Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng tạo màng BC Ảnh hưởng của hàm lượng glucose đến khả năng tạo màng BC Ảnh hưởng của nguồn nitơ hữu cơ đến khả năng tạo màng BC Ảnh hưởng của hàm lượng pepton đến khả năng tạo màng BC Ảnh hưởng của hàm lượng nitơ vô cơ đến khả năng tạo màng BC Ảnh hưởng của hàm lượng (NH 4 ) 2 SO 4 đến khả năng tạo màng BC Bảng 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ KH 2 PO 4 đến khả năng tạo màng BC Bảng 3.13. Đặc tính của màng BC lên men sau 5 ngày ở 2 lô thí nghiệm Bảng 3.14. Các bước xử lý màng sau lên men vi MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 1. Lý do chọn đề tài 1 2. Mục đích nghiên cứu 2 3. Nội dung nghiên cứu 2 4. Ý nghĩa của đề tài 2 5. Điểm mới của đề tài 2 NỘI DUNG 4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. 4 1.1. Lược sử nghiên cứu vi khuẩn Gluconacetobacter 4 1.2. Tổng quan về vi khuẩn Gluconacetobacter 9 1.2.1. Đặc điểm hình thái, tế bào học 9 1.2.2. Đặc điểm nuôi cấy 10 1.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 10 1.2.4. Đặc điểm về sinh trưởng 11 1.3. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Gluconacetobacter 12 1.3.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon 12 1.3.2. Nhu cầu Nitơ của sinh vật 13 1.3.3. Nhu cầu nguồn photpho 14 1.4. Đặc điểm và cơ chế hình thành màng BC 17 1.4.1. Đặc điểm cấu trúc của cellulose 17 1.4.2. Đặc điểm cấu trúc của màng BC 18 1.5. Các đặc điểm của quá trình lên men 19 1.5.1. Ảnh hưởng của oxy 19 1.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ 21 vii CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1. Đối tượng nghiên cứu và thiết bị hóa chất 23 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 23 2.1.2. Hóa chất 23 2.1.3. Dụng cụ và thiết bị 23 2.1.4. Môi trường nghiên cứu 24 2.1.4.1. Môi trường giữ giống (MT1) 24 2.1.4.2. Môi trường nhân giống (MT2)…………………………… 24 2.1.4.3. Môi trường lên men (MT3)……………………………… 24 2.2. Phương pháp nghiên cứu…………………………………………24 2.2.1. Phương pháp vi sinh vật 24 2.2.1.1. Phương pháp đếm khuẩn lạc……………………………… 24 2.2.1.2. Phương pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn gluconacetobacter thuần khiết………………………………………………………………… 25 2.2.1.3. Phương pháp phân biệt tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter bằng phương pháp nhuộm Gram…………………………… ………… …25 2.2.1.4. Phương pháp bảo quản chủng giống trên thạch nghiêng…….26 2.2.1.5. Phương pháp hoạt hoá giống…………………………………26 2.2.1.6. Phương pháp lên men tạo màng……………… ……………27 2.2.2. Phương pháp xử lý và bảo quản màng BC………………….…27 2.2.3. Phương pháp ứng dụng làm bao bì bảo quản thực phẩm………… 28 2.2.4. Phương pháp toán học………………………………………… ……28 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN………… ….31 3.1. Phân lập vi khuẩn Acetic từ màng bia, dịch hoa quả, tuyển chọn các mẫu vi khuẩn Gluconacetobacter 31 3.2. Nghiên cứu một số đặc tính hình thái, sinh lý, sinh hóa vi khuẩn Gluconacetobacter 40 viii 3.2.1. Quan sát hình dạng tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter trên kính hiển vi quang học………………………………… 40 3.2.2. Sinh trưởng trên môi trường thạch đĩa……………………………….40 3.2.3. Hoạt tính catalase…………………………………………………….41 3.2.4. Khả năng sinh acid acetic của vi khuẩn Gluconacetobacter trên môi trường Blue bromphenol………………………………………….41 3.3. Quá trình lên men tạo màng ………………………………………… 42 3.4. Nghiên cứu ảnh hường của một số môi trường dinh dưỡng tới khả năng tạo màng BC của vi khuẩn Gluconacetobacter 45 3.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ Glucose đến hình thành màng BC 45 3.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ (NH 4 ) 2 SO 4 đến hình thành màng BC 50 3.4.3. Ảnh hưởng của nồng độ KH 2 PO 4 đến hình thành màng BC 53 3.5. Xử lý màng sau lên men……………………………………………… 55 3.6. Ứng dụng màng trong bảo quản thực phẩm……………………………60 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………………………67 1. Kết luận 67 2. Đề nghị 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Màng sinh học (Bacterial cellulose; BC) có cấu trúc và đặc tính rất giống với cellulose của thực vật (gồm các phân tử glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 glucorit) cellulose vi khuẩn khác với cellulose thực vật ở chỗ không chứa các hợp chất cao phân tử như: ligin, hemicellulose và sáp nến do vậy chúng có những đặc tính vượt trội với độ dẻo dai, bền chắc. Ngoài ra, màng BC còn chứa nhiều dưỡng chất, acid hữu cơ đồng thời là một hàng rào cản oxi và các sinh vật khác và ngăn cản tác động của tia UV…[2]. Nhờ những đặc tính độc đáo trên mà màng BC được coi là nguồn polimer mới, là một giải pháp trên con đường tìm nguồn nguyên liệu mới hiện nay. Nó đã và đang thu hút được sự chú ý của nhiều nhà khoa học ngay từ nửa sau của thế kỷ XIX và hiện được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: dùng làm màng phân tách cho quá trình xử lí nước, chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào, dùng trong y học làm da tạm thời thay thế da trong quá trình trị bỏng, làm mặt nạ dưỡng da cho con người. Đặc biệt trong lĩnh vực công nghiệp thực phẩm, màng BC đã được ứng dụng để bảo quản thực phẩm trong thời gian dài ở nhiệt độ phòng [5], [9]. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng BC còn ở mức độ khiêm tốn, các nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng lại bước đầu. Do sự đa dạng về các mặt ứng dụng như trên và với mong muốn được tìm hiểu thêm về vi khuẩn Gluconacetobacter, quá trình tạo màng BC cũng như nhiều ứng dụng hữu ích của nó, tôi quyết định chọn đề tài “ Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới khả năng tạo màng Baterial cellulose của vi khuẩn Gluconacetobacter ” 2 2. Mục tiêu Tìm được thành phần môi trường dinh dưỡng thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn có khả năng tạo màng BC. 3. Nội dung 3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng BC từ bia, dịch hoa quả lên men giấm 3.2. Nghiên cứu đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Gluconacetobacter B 2 3.3. So sánh khả năng tạo màng BC được tạo ra từ vi khuẩn Gluconacetobacter B 2 với vi khuẩn Gluconacetobacter BHN 2 3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới khả năng tạo màng BC 3.5. Lên men tạo màng BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter B 2 trên môi trường thay thế 3.6. Xử lý và bảo quản màng BC sau lên men 3.7. Ứng dụng màng BC trong bảo quản thực phẩm, thay thế túi nilon 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 4.1. Ý nghĩa khoa học Môi trường dinh dưỡng có ý nghĩa rất quan trọng tới sự phát triển của vi khuẩn Gluconacetobacter. Nguồn dinh dưỡng quyết định tới khả năng hình thành màng BC. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn Nghiên cứu tìm ra chủng vi khuẩn Gluconacetobacter có khả năng tạo màng BC có chất lượng tốt với chi phí thấp, ứng dụng bảo quản thực phẩm thay thế túi nilon. 5. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 5.1. Đối tượng nghiên cứu Chủng vi khuẩn Gluconacetobacter được phân lập từ bia, dịch hoa quả lên men giấm, vi khuẩn Gluconacetobacter BHN 2 trên phòng thí nghiệm vi [...]... khuẩn Người ta dựa vào độ pH đã chia vi khuẩn ra thành các loại: vi khuẩn acid, vi khuẩn trung tính, vi khuẩn bazơ Đã có rất nhiều nghiên cứu về ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của vi khuẩn Gluconacetobacter và hầu hết đều chỉ ra rằng chủng vi khuẩn Gluconacetobacter sinh trưởng và phát triển trong môi trường hơi có tính acid (pH: 4,5 - 6) [6] 1.2.7 Ảnh hưởng của nồng độ acid acetic và rượu etylic... ảnh hưởng đến tính thấm hút của màng tế bào, vì thế nó ảnh hưởng trực tiếp đến sự trao đổi chất của vi khuẩn Sự tổng hợp ATP, đặc biệt là hoạt tính của enzyme rất nhạy cảm với sự thay đổi pH Độ pH ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn, ảnh hưởng lớn đến khả năng tổng hợp cellulose vì pH kích thích quá trình trao đổi chất của tế bào, độ pH quá cao hay quá thấp cũng gây ức chế cho vi khuẩn. .. trong lớp màng cellulose Điều này làm cản trở nghiên cứu về quá trình chuyển hóa, vận chuyển chất dinh dưỡng và oxy đến tế bào Lớp màng cellulose do vi khuẩn Gluconacetobacter tạo ra bao xung quanh môi trường hạn chế nguồn oxy từ bên ngoài vào môi trường, điều này 16 ngăn cản sự cung cấp oxy cho các vi khuẩn hiếu khí khác, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình cạnh tranh sinh tồn của vi khuẩn Gluconacetobacter. .. bảo vệ, cung cấp dinh dưỡng, giúp vi khuẩn bám vào giá thể 5 Theo Sokolniki và cs độ dai và chắc của màng cellulose do vi khuẩn sinh ra có liên quan đến hình dạng của tế bào vi khuẩn [28] Nếu độ dài (chiều dài của tế bào) càng cao thì tính bền vững của màng cellulose do vi khuẩn đó tổng hợp càng lớn Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu tác giả Nguyễn Thúy Hương (2006) khi nghiên cứu về mối liên hệ... photphat các môi trường dinh dưỡng còn có tác dụng tạo ra tính đệm của môi trường Ngoài ra còn nhiều nguyên tố vi lượng cũng có vai trò ảnh hưởng đến sinh trưởng của chủng Gluconacetobacter và quá trình hình thành màng BC như Mg, Fe, S, Ca, Mn, Na, Cl… Nếu thiếu một trong số các nguyên tố vi lượng thì chủng vi khuẩn Gluconacetobacter sinh trưởng và phát triển không bình thường 10 1.2.4 Ảnh hưởng của oxi... thước tế bào vi khuẩn và độ chịu lực của màng BC cũng cho rằng những vi khuẩn có tế bào dài thì màng BC mà chúng tạo ra có khả năng giữ nước tốt hơn và có độ dai chắc hơn, còn những dòng Gluconacetobacter có hình dạng tròn dài thì màng BC có khả năng chịu lực thấp hơn [13] 1.1.3 Đặc điểm nuôi cấy Trên môi trường thạch đĩa vi khuẩn Gluconacetobacter hình thành khuẩn lạc nhẵn hoặc sù sì, rìa mép khuẩn lạc... của cellulose do cấu trúc của cellulose vi khuẩn có khả năng biến đổi trong quá trình nuôi cấy - Kiểm soát được kích thước, cấu trúc và chất lượng của cellulose (kiểm soát được cellulose kết tinh dị hình) trong quá trình nuôi cấy tạo cellulose - Cellulose vi khuẩn là cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp mà không gắn lygnin, có thể dễ dàng phân hủy bởi một số nhóm vi sinh vật Vì vậy cellulose vi. .. màng BC làm da nhân tạo, làm mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ 20 1.5.2 Ở Vi t Nam Ở Vi t Nam, những nghiên cứu về màng BC là khá mới mẻ Các công trình nghiên cứu mới chỉ quan tâm tới quá trình tạo màng, đặc tính về cấu trúc màng làm cơ sở chế tạo màng trị bỏng; sản xuất thạch dừa; những điều kiện tối ưu cho sự sinh trưởng, phát triển và tạo màng của A.xylinum Có thể kể đến một số nghiên cứu điển hình như:... Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Gluconacetobacter 1.2.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon Để vi khuẩn sinh trưởng và phát triển tốt hơn cần cung cấp nguồn cacbon phù hợp Tuỳ nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon được cung cấp là vô cơ hay hữu cơ Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ cacbon phụ thuộc vào hai yếu tố: thành phần hoá học và tính chất sinh lý của nguồn thức ăn, đặc điểm sinh lý của từng loại vi sinh... acetic [3], [4] 1.2.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ Vi khuẩn Gluconacetobacter thuộc vi khuẩn ưa ấm, nhiệt độ hoạt động thích hợp là từ 25-300C, nhiệt độ quá thấp làm chậm quá trình lên men, nhiệt độ cao sẽ làm ức chế hoạt động của vi khuẩn, khi nhiệt độ tăng quá cao thì quá trình sinh sản của vi khuẩn sẽ bị dừng lại làm giảm hiệu suất của quá trình lên men [3], [6] 1.2.6 Ảnh hưởng của pH pH được đo bằng . xử lý Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng tạo màng BC Ảnh hưởng của hàm lượng glucose đến khả năng tạo màng BC Ảnh hưởng của nguồn nitơ hữu cơ đến khả năng tạo màng BC Ảnh hưởng của hàm. vi khuẩn Gluconacetobacter B 2 với vi khuẩn Gluconacetobacter BHN 2 3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới khả năng tạo màng BC 3.5. Lên men tạo màng BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter. DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 PHẠM THỊ NGỌC MAI NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG TỚI KHẢ NĂNG TẠO MÀNG BACTERIAL CELLULOSE CỦA VI KHUẨN GLUCONACETOBACTER