BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN NGỌC ÁNH KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG LÊN KHẢ NĂNG TẠO ENZYM CỦA VI KHUẨN Bacillus subtilis natto KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN NGỌC ÁNH KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG LÊN KHẢ NĂNG TẠO ENZYM CỦA VI KHUẨN Bacillus subtilis natto KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS. Đàm Thanh Xuân Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp dược HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn đến cô giáo, TS. Đàm Thanh Xuân và DS. Lê Ngọc Khánh, những người thầy đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo cho tôi trong thời gian làm khóa luận. Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên trong bộ môn Công Nghiệp Dược đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu để hoàn thành khóa luận. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian tôi học tập tại trường. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, bạn bè đã luôn giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian học tập vừa qua. Hà Nội, ngày 21 tháng 5 năm 2013. Sinh viên Nguyễn Ngọc Ánh MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 2 1.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis natto 2 1.1.1. Phân loại khoa học 2 1.1.2. Nguồn gốc 2 1.1.3. Đặc điểm hình thái 2 1.1.4. Đặc điểm sinh dưỡng 3 1.1.5. Đặc điểm sinh lý 3 1.1.6. Sản phẩm trao đổi chất của B. subtilis natto 3 1.2. Natto và Nattokinase 4 1.2.1. Natto 4 1.2.2. Các enzym có khả năng tiêu huyết khối trước Nattokinase 5 1.2.3. Nattokinase 6 1.3. Quá trình lên men sản xuất enzym 10 1.3.1. Các phương pháp lên men sản xuất enzym từ vi sinh vật 10 1.3.2. Thu nhận chế phẩm enzym 11 1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự tổng hợp enzym 11 1.4. Các nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh enzym Nattokinase của vi khuẩn 12 1.4.1. Ngoài nước 13 1.4.2. Trong nước 13 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị sử dụng 14 2.1.1. Vi sinh vật sử dụng 14 2.1.2. Nguyên liệu, hóa chất sử dụng: 14 2.1.3. Các môi trường sử dụng: 14 2.1.4. Thiết bị 15 2.1.5. Dụng cụ 16 2.2. Nội dung nghiên cứu 16 2.2.1. Phân lập vi khuẩn B. subtilis natto từ sản phẩm Natto và xác định enzym do Bacillus subtilis natto tạo ra 16 2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện dinh dưỡng lên khả năng tạo enzym của B. subtilis natto 16 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 16 2.3.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn từ sản phẩm Natto 16 2.3.2. Phương pháp nhuộm Ogiestka 17 2.3.3. Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng 17 2.3.4. Phương pháp nhân giống trong môi trường lỏng 17 2.3.5. Phương pháp lên men chìm vi khuẩn 18 2.3.6. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên khả năng sinh enzym 18 2.3.7. Phương pháp xác định sự có mặt của enzym trong sản phẩm Natto 19 2.3.8. Phương pháp xác định enzym trong dịch trong và trong sinh khối của dịch lên men vi khuẩn Bacillus subtilis natto 19 2.3.9. Phương pháp thử hoạt tính protease: 19 2.3.10. Phương pháp thử hoạt tính amylase 20 2.3.11. Phương pháp thử hoạt tính cellulase: 20 2.3.12. Phương pháp thử hoạt tính fibrinolytic (tiêu fibrin) 21 CHƯƠNG BA: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22 3.1. Phân lập vi khuẩn B. subtilis natto từ chế phẩm Natto và xác định enzym do vi khuẩn sinh ra 22 3.1.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis natto từ chế phẩm Natto 22 3.1.2. Xác định một số enzym do vi khuẩn sinh ra 23 3.1.3. Xác định enzym trong sản phẩm Natto 25 3.2. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh enzym của vi khuẩn B. subtilis natto 26 3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn hydratcarbon 26 3.2.2. Lựa chọn nồng độ maltose thích hợp nhất 30 3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của đậu tương và chất cảm ứng 32 3.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của một số muối vô cơ 34 3.2.5. Xây dựng môi trường tổng hợp cho vi khuẩn Bacillus subtilis natto sinh protease 35 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39 DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1: Thành phần chính trong 100g Natto 4 Bảng 2.2: Thực phẩm chức năng chứa Nattokinase 9 Bảng 2.1 . Các nguyên liệu, hóa chất sử dụng 14 Bảng 2.2. Các thiết bị sử dụng 15 Bảng 3.1. Kết quả định tính enzym trong dịch ly tâm và trong sinh khối 24 Bảng 3.2. Hoạt tính enzym thể hiện bằng đường kính vòng phân giải cơ chất của dịch enzym chiết từ phần hạt đậu và phần dịch nhớt của Natto 25 Bảng 3.3. Hoạt tính protease của dịch lên men khi nuôi cấy trong môi trường MT2 và môi trường MT2 có bổ sung các nguồn hydratcarbon khác nhau thể hiện bằng đường kính vòng phân giải casein 27 Bảng 3.4. Hoạt tính amylase và cellulase của dịch lên men khi nuôi cấy trong môi trường MT2 và môi trường MT2 có bổ sung các nguồn hydratcarbon khác nhau thể hiện bằng đường kính vòng phân giải cơ chất 27 Bảng 3.5. Thời gian tiêu fibrin của dịch lên men thu được khi nuôi cấy trong môi trường có bổ sung các nguồn hydratcarbon khác nhau 29 Bảng 3.6. Hoạt tính protease của dịch lên men khi nuôi cấy trong 30 môi trường MT2 và môi trường MT2 có bổ sung maltose ở các nồng độ khác nhau thể hiện bằng đường kính vòng phân giải casein Bảng 3.7. Hoạt tính amylase và cellulase của dịch lên men khi nuôi cấy trong môi trường MT2 có bổ sung maltose ở các nồng độ khác nhau thể hiện bằng đường kính vòng phân giải cơ chất 31 Bảng 3.8. Hoạt tính protease của dịch lên men khi nuôi cấy trong môi trường MT2 và môi trường MT2 có bổ sung đậu tương và casein thể hiện bằng đường kính vòng phân giải cơ chất 32 Bảng 3.9. Hoạt tính enzyme của dịch lên men khi nuôi cấy trong môi trường MT2 và MT2 có bổ sung một số muối vô cơ, thể hiện bằng đường kính vòng phân giải cơ chất 34 Bảng 3.10. Hoạt tính enzyme của dịch lên men khi nuôi cấy trong môi trường MT2 và môi trường tổng hợp, thể hiện bằng đường kính vòng phân giải cơ chất 36 Bảng 3.11. Thời gian tiêu fibrin của dịch lên men thu được khi nuôi cấy trong môi trường canh thang và môi trường tổng hợp 37 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ Tên hình Trang Hình 1.1: Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis natto 2 Hình 1.2. Cấu trúc bậc 3 của Nattokinase 7 Hình 1.3. Cơ chế tiêu fibrin của Nattokinase 8 Hình 3.1. Ảnh khuẩn lạc phân lập được và hình ảnh tế bào vi khuẩn khi soi trên kính hiển vi độ phóng đại 1.000 lần 22 Hình 3.2. Kết quả thử hoạt tính protease, amylase, cellulase trong dịch ly tâm và dịch chiết từ sinh khối 24 Hình 3.3. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nguồn hydratcarbon đến hoạt tính enzym của vi khuẩn 28 Hình 3.4. Biểu đồ so sánh khả năng sinh enzym của Bacillus subtilis natto khi nuôi cấy trong môi trường MT2 và môi trường tổng hợp 37 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Tên đầy đủ 1 B. subtilis natto Bacillus subtilis natto 2 E. coli Escherichia coli 3 CU Caseinolytic units 4 FU Fibrinolytic units 5 U Unit 6 t- PA Tissue plasminogen activator 7 γ – PGA γ - polyglutamat 8 Na CMC Natri carboxymethylcellulose [...]... natto tạo ra - Phân lập vi khuẩn B subtilis natto từ chế phẩm Natto - Xác định enzym do B subtilis natto tạo ra khi lên men chìm trong môi trường MT2 - Xác định enzym trong sản phẩm Natto 2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện dinh dưỡng lên khả năng tạo enzym của B subtilis natto - Khảo sát ảnh hưởng của nguồn hydratcarbon: glucose, saccharose, maltose, lactose - Khảo sát ảnh hưởng của đậu tương (dạng... protease và hạn chế sinh amylase, cellulase 3.2 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh enzym của vi khuẩn B subtilis natto 3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn hydratcarbon Mục đích: Tìm nguồn hydratcarbon thích hợp cho vi khuẩn B subtilis natto sinh ra nhiều protease nhất Tiến hành: - Tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường MT2 và môi trường MT2 có bổ sung một số hydratcarbon... phần để có enzym tinh khiết hơn [4], [5] 1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới sự tổng hợp enzym a Ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng Dinh dưỡng là yếu tố quan trọng có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển và tổng hợp enzym của vi sinh vật Cùng một loại vi sinh vật nhưng nếu nuôi cấy trên các môi trường có thành phần dinh dưỡng khác nhau thì mức độ tạo thành enzym và thành phần enzym được tạo thành... luận Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh enzym của vi khuẩn Bacillus subtilis natto” được thực hiện với hai mục tiêu: 1 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis natto từ sản phẩm Natto trên thị trường và xác định một số enzym do vi khuẩn sinh ra 2 Bước đầu lựa chọn môi trường nuôi cấy cho Bacillus subtilis natto sản xuất protease tiêu fibrin 2 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Vi khuẩn. .. pháp lên men chìm vi khuẩn [6] Pha 50ml môi trường MT2 vào bình nón 100ml, nút bông, hấp tiệt trùng ở 115ºC; 0,6 atm trong 20 phút Để nguội ở nhiệt độ phòng Cấy 5 ml dịch nhân giống vào bình nón, sau đó tiến hành nuôi trên máy lắc ở 37 ºC trong 24 giờ, tốc độ lắc 150 vòng /phút 2.3.6 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên khả năng sinh enzym Nguyên tắc: So sánh khả năng sinh enzym. .. toàn khi sử dụng Trong điều kiện lên men chìm, vi khuẩn Bacillus subtilis natto còn có khả năng sinh nhiều enzym ngoại bào như protease, amylase, cellulase Vi c thay đổi môi trường dinh dưỡng có thể ảnh hưởng đến sự sinh enzym của vi khuẩn Vì thế, lựa chọn một môi trường tốt nhất cho enzym sinh lượng lớn protease và giảm bớt các enzym khác đóng vai trò quan trọng trong vi c tách chiết protease, sau đó... sát ảnh hưởng của đậu tương (dạng bột và dạng hạt) và của chất cảm ứng (casein) - Khảo sát ảnh hưởng của một số muối vô cơ: MgSO4, MnCl2, CaCl2 - Tạo môi trường tổng hợp và so sánh khả năng tạo enzym của Bacillus subtilis natto khi nuôi cấy trong môi trường tổng hợp với trong môi trường ban đầu 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn từ sản phẩm Natto [6] Cân 10 g Natto cho vào... [4], [6] c Ảnh hưởng của nhiệt độ Phần lớn các vi sinh vật có khả năng tổng hợp các enzym đều thuộc loại ưa nhiệt trung bình, có nhiệt độ tối thích 22- 32oC, một số vi khuẩn thích hợp ở nhiệt độ cao hơn (35-55 oC) và chúng có khả năng tổng hợp các enzym có độ bền nhiệt cao Khi nâng nhiệt độ môi trường tới quá mức thích hợp thì khả năng sinh tổng hợp enzym bị giảm rõ rệt [4], [6] d Ảnh hưởng của thời... cấy thích hợp của mỗi loại vi sinh vật được xác định bằng thời gian cho phép tích tụ enzym tối đa Thời gian đó phụ thuộc vào từng chủng vi sinh vật và ít phụ thuộc vào enzym chúng tổng hợp Ngoài ra, tùy từng loại vi khuẩn mà ta lựa chọn điều kiện cấp khí và độ ẩm cho ph ù hợp [4], [5] 1.4 Các nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh enzym Nattokinase của vi khuẩn Cùng với... pháp 2.3.5 Sau đó, đem thử và so sánh hoạt tính enzym của dịch lên men từ các môi trường theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.9, 2.3.10, 2.3.11 Làm 3 lô ở 3 thời điểm khác nhau và lấy kết qủa trung bình - Khảo sát ảnh hưởng của đậu tương (dạng bột và dạng hạt) và của chất cảm ứng tạo protease (casein): Pha 50ml các môi trường như sau: môi trường MT2, môi trường MT2 bổ sung riêng từng thành phần: 2% đậu . do vi khuẩn sinh ra 23 3.1.3. Xác định enzym trong sản phẩm Natto 25 3.2. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh enzym của vi khuẩn B. subtilis natto 26 3.2.1. Khảo. HÀ NỘI – 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN NGỌC ÁNH KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG LÊN KHẢ NĂNG TẠO ENZYM CỦA VI KHUẨN Bacillus subtilis natto KHÓA. 2.3.5. Phương pháp lên men chìm vi khuẩn 18 2.3.6. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên khả năng sinh enzym 18 2.3.7. Phương pháp xác định sự có mặt của enzym trong sản