BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI CAO THỊ TUẤT TRIỂN KHAI MÔ HÌNH THỬ NGHIỆM ĐỘC TẾ BÀO TRUNG GIAN BỞI TRAIL ĐỂ ĐÁNH GIÁ TRÊN MỘT SỐ DƯỢC LIỆU LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2014 BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI CAO THỊ TUẤT TRIỂN KHAI MÔ HÌNH THỬ NGHIỆM ĐỘC TẾ BÀO TRUNG GIAN BỞI TRAIL ĐỂ ĐÁNH GIÁ TRÊN MỘT SỐ DƯỢC LIỆU LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH HÓA SINH DƯỢC MÃ SỐ: 60720408 Người hướng dẫn khoa học: TS. Phạm Thị Nguyệt Hằng TS. Nguyễn Thị Lập HÀ NỘI 2014 LỜI CẢM ƠN Trước hết cho phép tôi được bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới TS. Phạm Thị Nguyệt Hằng, TS. Nguyễn Thị Lập đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị thuộc khoa Dược lý – Sinh hóa – Viện Dược Liệu đã giúp đỡ và ủng hộ tôi trong suốt quá trình làm thực nghiệm tại khoa. Xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Hóa sinh – Trường Đại học Dược Hà Nội đã ủng hộ tôi trong quá trình học tập và làm đề tài tốt nghiệp. Cuối cùng xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè – những người luôn sát cánh, động viên, khích lệ tôi cố gắng học tập, phấn đấu để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2014 Học viên: Cao Thị Tuất MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Đại cương về bệnh ung thư 3 1.1.1. Định nghĩa 3 1.1.2. Phân loại ung thư theo nguồn gốc tế bào 3 1.1.3. Cơ chế sinh bệnh ung thư 3 1.1.4. Nguyên nhân bệnh sinh 5 1.1.5. Triệu chứng lâm sàng 10 1.1.6. Các thuốc điều trị ung thư hiện nay 11 1.2. Apoptosis (Tế bào chết theo chương trình) 14 1.2.1. Quá trình apoptosis 14 1.2.2. Các con đường apoptosis 15 1.3. TRAIL và các thụ thể của TRAIL 17 1.3.1. Cấu trúc và tác dụng 18 1.3.2. Cơ chế tác dụng 19 1.4. Phương pháp MTT 21 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1. Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu 23 2.2. Phương pháp nghiên cứu 23 2.2.1. Nghiên cứu triển khai mô hình thử nghiệm độc tế bào trung gian bởi TRAIL 23 2.2.2. Nghiên cứu khả năng ức ché tế bào bằng mô hình thử nghiệm độc tế bào trung gian bởi TRAIL 26 2.3. Xử lý số liệu: 28 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29 3.1. Triển khai mô hình thử nghiệm độc tế bào trung gian bởi TRAIL 29 3.1.1. Khảo sát nồng độ nuôi cấy 2 dòng tế bào ung thư vú (MDA– MB–231) và tế bào ung thư tử cung (HeLa) 29 3.1.2. Khảo sát nồng độ TRAIL đối với từng dòng tế bào 30 3.1.3. Tác dụng của thuốc chữa ung thư đối chứng Adriamycin khi kết hợp và không kết hợp với TRAIL 31 3.2. Đánh giá tác d ụng ức chế của 27 mẫu d ư ợc liệu tr ên mô hình thử nghiệm độc tế bào trung gian bởi TRAIL 32 3.2.1. Đánh giá tác d ụng ức chế của 27 mẫu d ư ợc liệu tr ên 2 dòng t ế bào ung thư vú (MDA- MB-231) và tế bào ung thư tử cung (HeLa) 32 3.2.2. Kh ảo sát tính giá trị IC 50 38 Chương 4. BÀN LUẬN 42 4.1. Mô hình th ử nghiệm độc tế b ào trung gian b ởi TRAIL 42 4.2. V ề tác dụng ức chế tế b ào c ủa các mẫu d ư ợc liệu tr ên 2 dòng t ế bào ung thư vú (MDA-MB-231) và tế bào ung thư tử cung (HeLa) 44 KẾT LUẬN 50 KIẾN NGHỊ VÀ ĐỀ XUẤT 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRAIL: Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand TNF: Tumor necrosis factor (yếu tố hoại tử khối u) FADD: Fas-associating protein with death domain (Fas-protein liên kết có miền chết) DD: Death domain (Miền chết) DISC: Death-inducing signaling complex (phức hợp tín hiệu gây chết) Apaf-1: Apoptotic protease-activating factor-1 (yếu tố hoạt hóa các enzyme ly giải protein liên quan đến quá trình Apoptosis) MMP: Mitochondrial membrane permeabilization (tính thấm hoá của màng ty thể) AIF: Apoptosis inducing factor (yếu tố gây ra apoptosis) Bid: Bcl-2 inhibitory BH3-domain-containing protein ( protein có BH3 ức chế Bcl-2) Bcl-2: B-cell lymphoma Bcl- XL: B-cell lymphoma- extra large OPG: Osteoprotegerin SMAC/DIABLO: Second mitochondria-derived activator of caspase/direct inhibitor of apoptosis binding protein with low pI (protein hoạt hóa caspase có nguồn gốc tư ty thể / ức chế trực tiếp của protein liên quan quá trình apoptosis với pI thấp) XIAP: X-linked inhibitor of apoptosis (chất ức chế liên kết với X của quá trình apoptosis) MTT: 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide DMEM: Dulbecco's Modified Eagle Medium Adr: Adriamycin DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1: Khảo sát nồng độ nuôi cấy dòng tế bào ung thư vú (MDA- MB-231) 29 Bảng 3.2: Khảo sát nồng độ nuôi cấy dòng tế bào ung thư tử cung (Hela) 29 Bảng 3.3: Tác dụng ức chế của TRAIL trên 2 dòng tế bào ung thư 30 Bảng 3.4: Tác dụng ức chế của Adriamycin trên 2 dòng tế bào ung thư 31 Bảng 3.5: Tác dụng ức chế của Adriamycin trên dòng tế bào ung thư vú (MDA- MB-231) khi có TRAIL (T+) hoặc không có TRAIL (T-) 32 Bảng 3.6: Tác dụng ức chế của Adriamycin trên dòng tế bào ung thư tử cung (Hela) khi có TRAIL (T+) hoặc không có TRAIL (T-) 32 Bảng 3.7: Danh sách các mẫu thử tác dụng ức chế 2 dòng tế bào ung thư [2, 13, 34, 39] 33 Bảng 3.8: Tác dụng ức chế của các mẫu thử trên dòng tế bào ung thư vú (MDA- MB-231) khi có TRAIL (T+) hoặc không có TRAIL (T-) 35 Bảng 3.9: Tác dụng ức chế của các mẫu thử trên dòng tế bào ung thư tử cung (HeLa) khi có TRAIL (T+) hoặc không có TRAIL (T-) 37 Bảng 3.10: Nồng độ IC 50 của các mẫu dược liệu trên dòng tế bào ung thư vú (MDA- MB-231) khi có TRAIL (T+) hoặc không có TRAIL (T-) 39 Bảng 3.11: Nồng độ IC 50 của các mẫu dược liệu trên dòng tế bào ung thư tử cung (Hela) khi có TRAIL (T+) hoặc không có TRAIL (T-) 41 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1: Ti ến tr ình Apoptosis 15 Hình 1.2: S ơ đ ồ con đ ư ờng apoptosis nội sinh v à ngo ại sinh 16 Hình 1.3: Các th ụ thể của TRAIL 19 Hìn h 1.4: Cơ ch ế tác dụng của TRAIL 20 Hình 1.5: Ph ản ứng chuyển MTT th ành formazan 22 [...]... đề tài “ Triển khai mô hình thử nghiệm độc tế bào trung gian bởi TRAIL để đánh giá trên một số dược liệu với các mục tiêu sau: 1 Triển khai được mô hình thử nghiệm độc tế bào trung gian bởi TRAIL 2 Đánh giá được tác dụng của 26 mẫu dược liệu trên mô hình này 2 Chương 1 TỔNG QUAN 1.2 Đại cương về bệnh ung thư 1.1.1 Định nghĩa Ung thư là một nhóm các bệnh liên quan đến việc phân chia tế bào một cách... có TRAIL - Đánh giá độc tế bào bằng thử nghiệm MTT: Làm tương tự như ở phần 2.2.1.1 2.2.2 Nghiên cứu khả năng ức chế tế bào bằng mô hình thử nghiệm độc tế bào trung gian bởi TRAIL 2.2.2.1 Nghiên cứu khả năng ức chế của các mẫu dược liệu trên 2 dòng tế bào ung thư vú (MDA-MB-231) và tế bào ung thư tử cung (HeLa) Các mẫu dược liệu sẽ được đem đánh giá tác dụng gây độc tế bào khi kết hợp với TRAIL và không... gốc tự nhiên để làm cho TRAIL có tác dụng trong điều trị ung thư thông qua mô hình đánh giá độc tế bào trung gian bởi TRAIL [15, 26, 33, 36, 38, 52, 56, 58, 64, 67] Và khả năng gây độc tế bào ung thư của các chất thường được đánh giá bằng thử nghiệm MTT Từ những nhiên nghiên cứu trên gợi mở cho chúng tôi hướng triển khai mô hình mới để sàng lọc các thuốc hỗ trợ điều trị ung thư từ dược liệu 1.4 Phương... thư, tế bào sinh sản vô hạn độ ngoài sự kiểm soát của cơ thể đã phá vỡ mức hằng định (tế bào sinh nhiều hơn tế bào chết) Cơ chế của tăng sinh số lượng của các quần thế tế bào có thể do chu trình tế bào được rút ngắn dẫn đến tăng số lượng tế bào được tạo ra trong một đơn vị thời gian, hoặc do giảm vận tốc tế bào chết đi cũng đưa đến kết quả có nhiều tế bào được tạo ra hơn Một cơ chế khác là tế bào Go... dùng để đánh giá khả năng gây độc tế bào của tác nhân nghiên cứu Phương pháp này dựa trên hoạt động của enzyme dehydrogenase của ty thể trong các tế bào sống Muối MTT được vận chuyển vào trong tế bào và bị khử bởi enzyme dehydrogenase trong ty thể tạo ra sản phẩm formazan tích lũy trong tế bào Khả năng khử MTT của tế bào cho thấy mức độ nguyên vẹn của ty thể cũng như mức độ sống sót của tế bào Số lượng... bỏ môi trường, thu lại tế bào và các tế bào được duy trì trong môi trường DMEM có bổ sung huyết thanh thai bò 10%, dung dịch kháng sinh và kháng nấm 1% (penicillin 50.000 units/l và streptomycin 50 mg/l) Tế bào được nuôi cấy cho phát triển tới mức khoảng 70%, thay môi trường sạch - Nuôi cấy tế bào: Đếm số lượng tế bào đã được hoạt hóa ở trên ở 5 nồng độ 5x104 tế bào/ giếng, 2x104 tế bào/ giếng, 1x104 tế. .. dung môi DMSO 0,1% Tiếp theo đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm Mật độ quang sẽ phản ánh số lượng tế bào sống sót - % tế bào sống sau khi đã xử lý thuốc so với chứng trắng được tính theo công thức như sau: + % tế bào sống = [OD540 của tế bào được xử lý thuốc] / [OD540 của tế bào không được xử lý thuốc] x 100% + % ức chế = 100 - % tế bào sống 2.2.1.2 Khảo sát nồng độ TRAIL đối với từng dòng tế bào 24... cách tháo dỡ các tế bào nhưng không lan truyền bừa bãi đến các tế bào xung quanh Ở cấp độ tế bào, quá trình này đặc trưng bởi một sự khởi phát làm thủng các tế bào và sau đó phá vỡ những mối liên hệ tế bào -tế bào Các tế bào co tròn lại vào màng nội bào và các bào quan cô đặc lại nhiều hơn trong tế bào chất, sau đó chúng sẽ tối hơn [53] Đáng chú ý là ở thời kì muộn của quá trình, các bào quan vẫn còn... từng mảnh và tế bào tương tự cũng chia tách thành một số mảnh nhỏ còn nguyên vẹn hoặc các thể apoptosis không bắt màu thuốc nhuộm Sau đó xảy ra sự thực bào, một quá trình trong đó các đại thực bào di cư hay các tế bào biểu mô khoẻ mạnh xung quanh nuốt các mảnh vỡ của tế bào Kết quả là, các thể apoptosis gắn vào một túi được bao bọc bởi màng trong một tế bào gọi là thể thực bào Cuối cùng, tế bào chủ 14... chủ 14 hay thể thực bào và chất chứa của nó dần dần bị suy thoái, và trong nhiều trường hợp, một tế bào mới thay thế tế bào cũ trong một vài giờ [53, 55] Apoptosis Tế bào chết theo chương trình Màng tế bào phồng xẹp bất thường Tế bào bình thường Tế bào co lại, chất nhiễm sắc cô đặc Ly giải các thể apoptosis Hình thành các thể apoptosis Nhân xẹp lại, màng tế bào tiếp tục phồng xẹp Hình 1.1: Tiến trình . “ Triển khai mô hình thử nghiệm độc tế bào trung gian bởi TRAIL để đánh giá trên một số dược liệu với các mục tiêu sau: 1. Triển khai được mô hình thử nghiệm độc tế bào trung gian bởi TRAIL. . bào bằng mô hình thử nghiệm độc tế bào trung gian bởi TRAIL 26 2.3. Xử lý số liệu: 28 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29 3.1. Triển khai mô hình thử nghiệm độc tế bào trung gian bởi TRAIL 29. BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI CAO THỊ TUẤT TRIỂN KHAI MÔ HÌNH THỬ NGHIỆM ĐỘC TẾ BÀO TRUNG GIAN BỞI TRAIL ĐỂ ĐÁNH GIÁ TRÊN MỘT SỐ DƯỢC LIỆU LUẬN