BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN HƯƠNG GIANG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG SINH HỌC Ý DĨ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN HƯƠNG GIANG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG SINH HỌC Ý DĨ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ 60720406 Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Trần Văn Ơn HÀ NỘI 2014 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT 3 1.1.1. Vị trí phân loại 3 1.1.2. Đặc điểm thực vật 3 1.1.3. Tính đa dạng sinh học của Ý dĩ 4 1.1.3.1. Tính đa dạng sinh học của Ý dĩ ở Việt Nam 5 1.1.3.2. Tính đa dạng sinh học của Ý dĩ trên thế giới 6 1.1.4. Phân bố 7 1.2. NGHIÊN CỨU VỀ ĐA DẠNG DI TRUYỀN 8 1.3. THÀNH PHẦN HÓA HỌC 9 1.3.1. Thành phần hóa học 9 1.3.2. Các nghiên cứu chuẩn hóa thành phần tác dụng 13 1.3.2.1. Chuẩn hóa theo đơn chất 13 1.3.2.2. Chuẩn hóa gián tiếp qua các sản phẩm thủy phân 13 1.4. TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA Ý DĨ 14 1.4.1. Tác dụng chống ung thư 14 1.4.2. Tác dụng hạ đường huyết 15 1.4.3. Tác dụng trên thần kinh trung ương – vận động 16 1.4.4. Các tác dụng khác 16 1.4.5. Công dụng của Ý dĩ 17 1.5. TỔNG QUAN VỀ XÂY DỰNG DẤU VÂN TAY SẮC KÝ 18 1.5.1. Tổng quan về xây dựng dữ liệu chuẩn dược liệu 18 1.5.2. Tổng quan về xây dựng dấu vân tay bằng HPLC 18 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 20 2.1.1. Mẫu nghiên cứu hình thái và giải phẫu 20 2.1.2. Mẫu nghiên cứu đa dạng di truyền 20 2.1.3. Mẫu nghiên cứu hóa học 20 2.2. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 21 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.3.1. Phương pháp luận 22 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái, cấu tạo giải phẫu và giám định tên khoa học 22 2.3.3. Phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền 23 2.3.3.1. Phương pháp tách chiết ADN tổng số 23 2.3.3.2. Phương pháp khuếch đại ADN bằng PCR 23 2.3.3.3. Phương pháp điện di ADN trên gel agarose 24 2.3.3.4. Phương pháp tinh sạch ADN 25 2.3.3.5. Phương pháp giải trình tự ADN và xử lý kết quả 25 2.3.4. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sắc ký HPLC của Ý dĩ 25 2.3.4.1. Phương pháp xây dựng điều kiện sắc ký 26 2.3.4.2. Phương pháp xây dựng dữ liệu sắc ký HPLC 29 2.3.4.3. Phương pháp so sánh đặc điểm sắc ký HPLC của các mẫu nghiên cứu 29 2.3.5. Phương pháp định lượng hợp chất Coixol, Coixenolide, Coixan từ hạt Ý dĩ 29 2.3.5.1. Phương pháp định lượng Coixol 29 2.3.5.2. Phương pháp định lượng Coixenolide 30 2.3.5.3. Phương pháp định lượng Coixan 32 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 34 3.1. ĐA DẠNG SINH HỌC CÂY Ý DĨ 34 3.1.1. Đặc điểm chung của Ý dĩ 34 3.1.2. Đặc điểm hình thái của Ý dĩ 36 3.1.2.1. Coix lacryma-jobi L. var. lacryma-jobi 36 3.1.2.2. Coix lacryma-jobi L. var. stenocarpa Oliv. 37 3.1.2.3. Coix lacryma-jobi L. var. ma-yuen (Rom. Caill) Stapf 39 3.1.2.4. Coix sp. 41 3.1.3. Đặc điểm giải phẫu của Ý dĩ 45 3.1.3.1. Đặc điểm giải phẫu thân 45 3.1.3.2. Đặc điểm giải phẫu lá 46 3.1.4. Đa dạng di truyền của Ý dĩ 50 3.1.4.1. Tách ADN tổng số 50 3.1.4.2. Khuếch đại nucleotide bằng PCR 50 3.1.4.3. Trình tự nucleotide của Ý dĩ 50 3.2. ĐẶC ĐIỂM SẮC KÝ HPLC CỦA Ý DĨ 51 3.2.1. Xây dựng điều kiện sắc ký 51 3.2.2. Đặc điểm sắc ký HPLC của dịch chiết methanol 53 3.2.3. So sánh đặc điểm sắc ký HPLC của các mẫu Ý dĩ 53 3.3. HÀM LƯỢNG CÁC HOẠT CHẤT CHÍNH CỦA Ý DĨ 55 3.3.1. Hàm lượng Coixol 55 3.3.2. Hàm lượng Coixenolide 56 3.3.3. Hàm lượng Coixan 58 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 59 4.1. VỀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ TÍNH ĐA DẠNG SINH HỌC 59 4.1.1. Về đa dạng của Ý dĩ 59 4.1.2. Về đa dạng mẫu thu trong nghiên cứu 62 4.1.3. Về xác định tên khoa học của các mẫu nghiên cứu 62 4.2. VỀ ĐẶC ĐIỂM CẤU TẠO GIẢI PHẪU 62 4.3. VỀ ĐA DẠNG DI TRUYỀN 63 4.4. VỀ ĐẶC ĐIỂM SẮC KÝ HPLC 63 4.5. VỀ HÀM LƯỢNG CÁC HOẠT CHẤT CHÍNH 64 4.6. VỀ MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, DI TRUYỀN VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÁC MẪU Ý DĨ 66 KẾT LUẬN 68 ĐỀ XUẤT 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIỆT TẮT HPLC High performance liquid chromatography - Sắc ký lỏng hiệu năng cao ACN Acetonitril GC Gas chromatography - Sắc ký khí RSD Relative standard deviation – Độ lệch chuẩn tương đối RRT Relative retention time – Thời gian lưu tương đối ADN Acid deoxyribonucleic DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các thứ Ý dĩ thuộc loài Coix lacryma-jobi L. ở Việt Nam 5 Bảng 1.2 Danh sách tên thứ của Coix lacryma-jobi L. theo “The plant list” 7 Bảng 1.3 Các hợp chất phát hiện từ cây Ý dĩ 12 Bảng 1.4 Các điều kiện sắc ký HPLC định lượng Coixol 13 Bảng 2.5 Danh sách mẫu nghiên cứu 21 Bảng 2.6 Quy trình tách ADN sử dụng KIT tách chiết của Thermo 24 Bảng 2.7 Các thành phần cơ bản của phản ứng PCR 24 Bảng 2.8 Quy trình tinh sạch dung dịch ADN khuếch đại 25 Bảng 2.9 Các điều kiện sắc ký khảo sát 28 Bảng 2.10 Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn Coixol 30 Bảng 3.11 Tóm tắt đặc điểm hình thái của các mẫu nghiên cứu 43 Bảng 3.12 Chương trình chạy sắc ký HPLC dịch chiết methanol 51 Bảng 3.13 Thời gian lưu và diện tích pic mẫu thử 52 Bảng 3.14 RSD của thời gian lưu các pic qua 6 lần chạy lặp lại 53 Bảng 3.15 RRT các pic HPCL của các mẫu hạt Ý dĩ 53 Bảng 3.16 Dữ liệu sắc ký HPLC của các mẫu Ý dĩ 54 Bảng 3.17 Nồng độ và diện tích pic của dãy dung dịch chuẩn Coixol 55 Bảng 3.18 Hàm lượng Coixol trong các mẫu nghiên cứu 56 Bảng 3.19 Hàm lượng Coixenolide trong các mẫu nghiên cứu 58 Bảng 3.20 Hàm lượng Coixan tổng trong các mẫu nghiên cứu 58 Bảng 4.21 Các thứ của loài Coix lacryma-jobi L. theo các tài liệu công bố ở Việt Nam (đã đối chiếu tên chính thức theo The Plant List) 59 Bảng 4.22 Đặc điểm chính phân biệt các loại Ý dĩ 61 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh Ý dĩ theo Thực vật chí Trung Quốc 4 Hình 1.2 Công thức cấu tạo của Coixol và Coixenolide 11 Hình 1.3 Công thức cấu tạo của một số hợp chất lactam từ hạt Ý dĩ 11 Hình 1.4 Sơ đồ phản ứng thủy phân Coixenolide tạo 2,3-butanediol 13 Hình 1.5 Quy trình chiết xuất Coixan tổng 14 Hình 2.6 Phương pháp luận của đề tài 22 Hình 2.7 Quy trình chuẩn bị dung dịch thử chạy HPLC 27 Hình 2.8 Quy trình chuẩn bị mẫu thử định lượng Coixenolide 31 Hình 2.9 Quy trình chuẩn bị mẫu thử định lượng Coixan 33 Hình 3.10-1 Đặc điểm hình thái của cụm hoa 35 Hình 3.10-2 Đặc điểm hình thái của hoa đực 35 Hình 3.10-3 Đặc điểm hình thái hoa cái và quả 36 Hình 3.11 Đặc điểm hình thái Coix lacryma  jobi L. var. lacryma - jobi 37 Hình 3.12 Đặc điểm hình thái Coix lacryma-jobi L. var. stenocarpa Oliv. 38 Hình 3.13 Đặc điểm hình thái Coix lacryma-jobi L. var. ma-yuen (Rom.Caill) Stapf (Mẫu CL40 và CL42) 39 Hình 3.14 Đặc điểm hình thái Coix lacryma-jobi L. var. ma-yuen (Rom.Caill) Stapf (Mẫu CL30) 41 [...]... như Ý dĩ nếp, Ý dĩ tẻ, Bo bo, v.v… nhưng việc phân biệt chúng mới chỉ dựa trên một số chỉ tiêu cảm quan mà chưa chỉ ra được bản chất của chúng như sự khác biệt ở mức độ phân tử, thành phần hóa học cũng như tác dụng sinh học 1 Từ những vấn đề trên, đề tài Nghiên cứu đa dạng sinh học Ý dĩ được thực hiện với những mục tiêu sau: - Nghiên cứu đa dạng hình thái, đa dạng di truyền của các loài/ thứ Ý dĩ. .. Phước Nghiên cứu hình thái X X X X X X X X Nghiên cứu ADN X Nghiên cứu hóa học X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X 2.2 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU Nghiên cứu thực địa: Tại Trại nghiên cứu GACP của Công ty TNHH MTV Dược Khoa – Trường Đại học Dược Hà Nội (DKPharma) ở Thái Nguyên Nghiên cứu thực vật và đa dạng di truyền: tại Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội Nghiên cứu hóa học: ... canh tác và chế biến, như vỏ mỏng hơn, cây thấp hơn, v.v… Điều này dẫn đến có nhiều thứ và dạng (giống) Ý dĩ khác nhau, gây khó khăn trong việc phân biệt chúng Có thể thấy điều này qua việc phân loại Ý dĩ của các nhà nghiên cứu khác nhau 4 1.1.3.1 Tính đa dạng sinh học của Ý dĩ ở Việt Nam Theo các tác giả, Ý dĩ ở Việt Nam được chia thành 5 thứ, bao gồm : Coix lacryma-jobi L var lacryma-jobi, Coix lachryma-jobi... Đại học Dược Hà Nội và Viện Pháp Y Quân đội 21 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Phương pháp luận Khung nghiên cứu của đề tài được trình bày ở Hình 2.6 Theo đó, để hạn chế các tác động của điều kiện môi trường khác nhau, phép cố định biến đã được áp dụng: Các mẫu đa dạng được trồng ở một địa điểm, điều kiện chăm sóc và thu mẫu cùng mùa vụ Kết luận Đa dạng sinh học dựa trên ADN Đa dạng thành phần hóa học. .. gasteenii B.K.Simon, Coix lacryma-jobi L (Ý dĩ) , Coix puellarum Balansa (Ý dĩ) và 48 tên đồng nghĩa khác nhau Cây Ý dĩ được thừa nhận rộng rãi là Coix lacryma-jobi L., bao gồm nhiều thứ khác nhau 1.1.2 Đặc điểm thực vật [1], [4], [17] Cây Ý dĩ còn gọi là Dĩ mễ, Dĩ nhân, Ý dĩ nhân, Bo bo [1], Job’s tear, Tear glass, Adlay (tiếng Anh), 薏苡 (tiếng Trung), có tên khoa học Coix lacryma-jobi L Cây cỏ lớn, mọc... sắc ký đồ của dược liệu Bảng dữ liệu này cùng với sắc ký đồ chuẩn là dấu vân tay HPLC của dược liệu theo điều kiện sắc ký đã quy định 19 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1 Mẫu nghiên cứu hình thái và giải phẫu 24 mẫu hạt Ý dĩ được thu hái tại các địa điểm khác nhau ở miền Bắc Việt Nam, được gieo trồng tại cùng một thời điểm, cùng điều kiện ở Trại nghiên cứu. .. Mẫu nghiên cứu đa dạng di truyền Từ các mẫu đã được nghiên cứu về hình thái và giải phẫu, lựa chọn ra các mẫu có sự khác biệt về hình thái để nghiên cứu chi tiết về đa dạng di truyền Có 6 mẫu được xác định có sự khác biệt về hình thái Lá các mẫu này được thu hái tươi, bảo quản trong silicagelvà bảo quản trong tủ lạnh sâu -30oC Mẫu ADN được tách trong vòng 3 ngày sau khi thu hái 2.1.3 Mẫu nghiên cứu. .. được tách trong vòng 3 ngày sau khi thu hái 2.1.3 Mẫu nghiên cứu hóa học Là hạt Ý dĩ từ các mẫu được dùng để nghiên cứu đa dạng di truyền 6 mẫu hạt được sấy khô ở nhiệt độ 50oC đến hàm ẩm không quá 5,0%, nghiền thành bột mịn Danh sách các mẫu nghiên cứu được trình bày trong Bảng 2.5 20 Bảng 2.5: Danh sách mẫu nghiên cứu STT Mã mẫu Vùng sinh thái 1 2 3 4 5 6 7 8 CL1 CL2 CL3 CL5 CL7 CL8 CL10 CL11 Đồng bằng... màu trắng Mùa hoa quả : Tháng 5 - 12 3 Hình 1.1: Hình ảnh Ý dĩ theo Thực vật chí Trung Quốc [17] 1 Phần trên của mặ ất của Ý ĩ; 2 C a ma-jobi L var lacryma-jobi ; 3 Coix lacryma-jobi L var ma-yuen (Romanet du Caillaud) Stapf ; 4 Coix lacryma-jobi L var puellarum (Balansa) A Camus 1.1.3 Tính đa dạng sinh học của Ý dĩ (Coix lacryma-jobi L.) Ý dĩ là một loài cây có ích được sử dụng từ lâu đời, do đó ngoài... Nghiên cứu đa dạng hình thái, đa dạng di truyền của các loài/ thứ Ý dĩ ở trạng thái mọc hoang và trồng - Nghiên cứu đặc điểm sắc ký của các loài/ thứ Ý dĩ - Xác định hàm lượng các hoạt chất Coixan, Coixenolide và Coixol của các loài/ thứ Ý dĩ nghiên cứu 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CỦA Ý DĨ 1.1.1 Vị trí phân loại Theo Takhtajan [39], chi Coix L thuộc họ Lúa (Poaceae), bộ Lúa (Poales), phân . Tính đa dạng sinh học của Ý dĩ 4 1.1.3.1. Tính đa dạng sinh học của Ý dĩ ở Việt Nam 5 1.1.3.2. Tính đa dạng sinh học của Ý dĩ trên thế giới 6 1.1.4. Phân bố 7 1.2. NGHIÊN CỨU VỀ ĐA DẠNG. phần hóa học cũng như tác dụng sinh học. 2 Từ những vấn đề trên, đề tài Nghiên cứu đa dạng sinh học Ý dĩ được thực hiện với những mục tiêu sau: - Nghiên cứu đa dạng hình thái, đa dạng di. ĐIỂM THỰC VẬT VÀ TÍNH ĐA DẠNG SINH HỌC 59 4.1.1. Về đa dạng của Ý dĩ 59 4.1.2. Về đa dạng mẫu thu trong nghiên cứu 62 4.1.3. Về xác định tên khoa học của các mẫu nghiên cứu 62 4.2. VỀ ĐẶC