1 LỜI MỞ ðẦU Listeria monocytogenes những năm gần ñây nổi lên như một tác nhân gây bệnh từ thực phẩm quan trọng. ðây là một loại trực khuẩn Gram dương ngắn, nhỏ, không sinh bào tử, thường có kiểu chuyển ñộng xoay tròn quanh trục thân thành từng ñợt rất ñặc trưng trong tiêu bản giọt treo. Chúng có thể phát triển trên môi trường nuôi cấy ñơn giản ở vùng pH giữa 5 và 9. Trên môi trường thạch rắn, khuẩn lạc của chúng trông như những giọt sương trong suốt, hơi nhuốm màu lam nhạt khi nhìn qua anh sang phản chiếu dưới góc 45 0 . Về mặt sinh hóa Listeria monocytogenes dễ bị nhầm với những vi sinh vật như Lactobacillus, Brochothrix, Erysipelothrix và Kurthia. Một số thử nghiệm sinh hóa ñã ñược áp dụng ñể phân biệt Listeria monocytogenes với các loài Listeria khác như Listeria innocua, Listeria welshimeri và Listerisamurrayi. Xác ñịnh kiểu huyết thanh cũng là một cách ñịnh danh quan trọng ñối với vi sinh vật này. Listeria thuộc loại ưa lạnh, có thể phát tirển ở nhiệt ñộ thấp ñến 2,5 0 C và cao ñến 44 0 C. Các chuyên gia FDA khuyến cáo cần lưu ý việc làm vệ sinh ống dẫn lạnh trên trần vì ñó là nơi có ñiều kiện thuận lợi cho Listeria phát triển và tích tụ. Liều lượng gây bệnh của Listeria monocytogenes hiện vẫn chưa ñược biết. Bệnh bắt ñầu từ ñường tiêu hóa với những triệu chứng như tiêu chảy, sốt nhẹ. Trường hợp nặng, chủng gây bệnh có thể sinh sản trong các ñại thực bào và gây nhiễm trùng máu. Vi khuẩn tác ñộng lên hệ thần kinh trung ương, tim, mắt và có thể xâm nhập vào bào thai trong bệnh mẹ gây sẩy thai, ñẻ non hoặc nhiễm trùng thai nhi. Listeria monocytogenes ñã ñược phân lập từ nhiều loại thực phẩm khác nhau như thịt, cá, rau, sữa và cà bề mặt nước. Cần lưu ý kiểm tra sự hiện diện của vi sinh vật ở mọi công ñoạn trong quá trình chế biến thực phẩm, từ môi trường, nguyên 2 liệu, ñiều kiện sản xuất, vận chuyển ñến sản phẩm cuối cùng. Nấu chín thực phẩm là một biện pháp hữu hiệu ñể giảm nguy cơ nhiễm bệnh. 3 CHƯƠNG I: MỞ ðẦU 1.1. ðặt vấn ñề. - ðất nước ta có nhiều ñiều kiện thuận lợi ñể phát triển ngành nuôi trồng thủy hải sản. Bờ biển Việt Nam khá dài và rộng, lại nằm trong vùng giao nhau giữa các dòng nước và có khí hậu nhiệt ñới nên trữ lượng hải sản rất dồi dào và có giá trị kinh tế cao. Vì vậy, ngành ñánh bắt nuôi trồng thủy hải sản ở nước ta không ngừng phát triển, không những ñáp ứng mhu cầu trong nước mà còn xuất khẩu ra thị trường nước ngoài như: Trung Quốc, ðài Loan, Hàn Quốc, Nhật, Mỹ, Anh…. Chất lượng vệ sinh thực phẩm hiện nay ñang là mối quan tâm hàng ñầu khi xuất khẩu thực phẩm sang các quốc gia khác, ñặc biệt là ñối với mặt hàng thủy hải sản ñông lạnh. - Tuy nhiên, việc xuất khẩu thủy hải sản của nước ta ñang gặp khá nhiều khó khăn và một trong nhửng vấn ñề ñó là việc nhiễm các tác nhân gây bệnh, gây ñộc như: dư lượng kháng sinh, vi sinh vật gây bệnh…. và Listeria monocytogenes là một trong những tác nhân gây bệnh và gây ngộ ñộc trong sản phẩm thủy hải sản ñông lạnh. - Trong vấn ñề ngộ ñộc thực phẩm, vi khuẩn Listeria monocytogenes gây ra bệnh Losteriosis. Ca ñầu tiên của bệnh Listeriosis ñã ñược nói ñến cách ñây 70 năm, nhưng phải ñợi ñến những năm 1980, vi khuẩn Listeria monocytogenes mới ñược chính thức xác nhận là tác nhân gây ngộ ñộc từ thực phẩm. Listeria monocytogenes hình thành nên các triệu chứng như; sốt, khó chịu, ñau lưng. Nếu ñộc tố ñủ mạnh, chúng sẽ gây ra ngộ ñộc thực phẩm cấp tính trong khoảng 12 giờ, với các triệu chứng như: nôn mửa, tiêu chảy, ñau quặn bụng, nhức ñầu… 4 - Với ý nghĩa khoa học và thực tiễn như vậy, chúng tôi quyết ñịnh thực hiện ñề tài: “quy trình phát hiện Listeria trong thủy sản ñông lạnh”. 1.2. Mục tiêu nghiên cứu. - Tìm hiểu tác nhân gây bệnh Listeria monocytogenes trong thủy sản và tìm hiểu các phương pháp xác ñịnh Listeria monocytogenes trong các sản phẩm thủy sản ñông lạnh. 5 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1. Giới thiệu về thủy hải sản và tình hình nhiễm khuẩn của thủy hải sản ở Việt Nam và trên thế giới. 2.1.1. Giới thiệu chung về thủy hải sản. - Hải sản là bất kỳ ñộng vật hoặc thực vật biển ñươc phục vụ như thực phẩm và là thức ăn của con người. Hải sản bao gồm ñộng vật biển như; cá và các ñộng vất có vỏ khác ( bao gồm cả ñộng vật thân mềm và ñộng vật giáp xác.). - Việc thu hoạch thủy hải sản tự nhiên ñược gọi là ñánh bắt cá. Ngành ñánh bắt cá và nuôi trồng thủy hải sản ñược biết ñến như là: nuôi biển, nuôi trồng thủy sản, hoặc trong trường hợp của cá thì nuôi cá. Hải sản thường ñươc phân biệt với thịt. Mặc dù, nó vẫn có một số tính chất của ñộng vật và nó ñược loại trừ trong một số chế ñộ ăn chay. Hải sản là một nguồn quan trọng trong việc bổ sung nguồn protein trong nhiều khẩu phần ăn trên thế giới, ñặc biệt ở các vùng ven biển. - Hiện có hơn 32000 loài cá ñược sử dụng làm nguồn thực phẩm cho con người. Ví dụ như: cá ñối, cá chép, cá da trơn, cá chim lớn, cá trích, cá thu, cá mè, cá cơm… và một số loài khác. - Thủy hải sản ñông lạnh là thủy hải sản sạch ñược sơ chế, chế biến theo quy trình nghiêm ngặt về vệ sinh an toàn thực phẩm. Quy trình sơ chế, chế biến và ñưa ra sản phẩm theo phương pháp IQF ñưa ra sản phẩm ñông lạnh với chất lượng tốt nhất. Ngay từ khâu nguyên liệu ñược tuyển chọn kỹ lượng với chất lượng ñảm bảo và sau ñó sẽ ñược sản xuất trên dây truyền vô trùng tuyệt ñối ñảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm, từ ñó sẽ ñưa ra các sản phẩm an toàn. Trước khi các sản phẩm ñó ñến tay người tiêu 6 dùng, chúng ñược kiểm tra bởi các cơ quan y tế và ñược cấp giấy phép vệ sinh an toàn thực phẩm. Chính vì vậy, thực phẩm ñông lạnh là sản phẩm có chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm rất cao. 2.1.2. Tình hình nhiễm khuẩn của thủy hải sản Việt Nam. - Trong 3 mùa hè liên tiếp, Viện dinh dưỡng quốc gia ñã thực hiện ñề tài nghiên cứu: “Thực trạng ô nhiễm vi sinh vật vào thực phẩm thủy hải sản ñông lạnh và chế biến trên ñịa bàn Hà Nội”. Kết quả kiểm tra vi sinh vật tại phòng thí nghiệm 300 mẫu thực phẩm thủy hải sản ñông lạnh và chế biến sẵn (ñược lấy ngẫu nhiên) từ một số chợ và siêu thị trong 6 quận thành Hà Nội cho thấy 82 mẫu không ñạt tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm. Trong ñó có 36 mẩu cá ñông lạnh, 29 mẫu tôm, cua sơ chế, 8 mẫu tép và 6 mẫu nem chả giò… - ðặt biệt có tới gần 30% mẫu không ñạt nhiễm một số loại vi sinh vật vượt quá giới hạn cho phép. Trong dó có 49 mẫu không ñạt tiêu chuẩn về Coliforms ( chiếm 16.3%), 34 mẫu không ñạt về E.coli (11%), 28 mẫu không ñạt về C.perfrigens (9.3%) và 7 mẫu không ñạt về Vibrio parahaemolyticus(2.3%). Trong 28 mẫu nhiễm C.perfrigens chủ yếu là: mẫu mắm tôm, mắm tép… có thể gây ngộ ñộc bất cứ lúc nào. Nguy hại hơn cả là trong hải sản ñông lạnh có vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ñươc xác nhận là nguyên nhân gây ra nhiều vụ ngộ ñộc thức ăn do cá biển và hải sản. Bệnh hầu hết xãy ra vào mùa hè ñối với những người ăn gỏi cá và những thực phẩm chưa chín, có thể gây ngộ ñộc, gây ñau bụng, nôn, sốt, ñặc biệt là gây ra tiêu chảy. 2.1.3. Tình hình nhiễm khuẩn của thủy hải sản trên thế giới. 7 - Ngộ ñộc tiêu chảy ñược phát hiện vào năm 1976 từ con trai nhiễm ñộc tại Nhật Bản. - Ngộ ñộc Venerupin ñầu tiên bùng phát do ăn hào và nghêu chỉ có trong vùng biển nước Nhật vào một thời ñiểm ñặt biệt nào ñó trong năm, chất ñộc tạo ra bở nhiều sinh vật sinh sản mau lẹ, rất nhiều trong cuối mùa ñông, ñôi khi xuất hiện ngoài khơi nước Bồ ðào Nha. Cơn bệnh có thể làm hư gan, chết khoảng 1/3 nạn nhân. - Cuối năm 1987, ngộ dộc mất trí nhớ ñược ñể ý khi nó phát triển nhiều tại phía ðông Canada thủ phạm là chất acid domoic, một chất ñộc neurotoxinmanh phát sinh từ tảo diatom Nitzschia punens trong nước lạnh.Nạn nhân sẽ bị mất trí nhớ trong một thời gian ngắn, một số ca dẫn ñến tử vong. - Ăn phải tảo ñỏ gây ra ngộ ñộc nguy hiểm, vào năm 1991 tại ñảo Guam ñã có 13 trường hợp ngộ ñộc do ăn phải tảo ñỏ Polycavemosa tsudai, có 3 trong số ñó bị chết. - Năm 2004 ñã có 53 cảnh báo về vượt quá giới hạn sulphit trong tôm. Trong ñó mặt hàng tôm chín chiếm 31 cảnh báo, ñây cũng là mặt hàng có quy ñịnh sulphit nghiêm ngặt nhất (không quá 50 miligram/kg tôm). Quy ñịnh này cũng có nghĩa là: mặc dù, nếu một nhà chế biến thực phẩm tuân thủ nghiêm các tiêu chuẩn ñối với tôm nguyên liệu, nhưng sau khi nấu chín tôm thì công ty này vẫn có thể vi phạm giới hạn tiêu chuẩn (do giới hạn quy ñịnh ñối với tôm chín thấp hơn rất nhiều). - Năm ngoái, ñã có 41 trường hợp bị Rasff cảnh báo lây nhiễm loại vi khuẩn Listeria monocytogenes. Trong ñó, cá hồi xông khói của ðan Mạch bị cảnh báo 19 lần và cá hồi của ðức bị 10 lần. 8 - Cũng theo hệ thống cảnh báo của Rasff, năm ngoái có 39 cảnh báo về sự xuất hiện của Histamin trong thủy sản. Trong ñó, cá ngừ chiếm 31 cảnh báo và hầu hết là mặt hàng ướp lạnh, sau khi nhập khẩu ñã ñược ñóng túi chân không ở Hà Lan. Nước bị cảnh báo nhiều nhất là Inñônêxia. - Các thanh tra của Italia cũng ñã phát hiện và cảnh báo 41 lần về việc lây nhiễm ký sinh trùng (Anisakis), chủ yếu trong cá thu tươi xuất xứ từ Nauy, ðan Mạch, và cá vây chân từ Anh. - Cảnh báo về dư lượng Cactimi trong thủy hải sản chiếm 43 lần, ít hơn một nửa so với số lượng cảnh báo hồi năm 2003 (103) lần, và chủ yếu liên quan ñến các sản phẩm cá kiếm và nhuyễn thể chân ñầu. Số lần cảnh báo về lây nhiễm thủy ngân trong cá kiếm năm 2004 là 30 lần, tăng nhẹ so với năm 2004. 2.2. Giới thiệu về vi khuẩn Listeria monocytogenes. 2.2.1. Lịch sử phát hiện. Hình 2.1: Vi khuẩn Listeria monocytogenes. 9 - Chi Listeria ñược ñặt theo tên nhà ngoại khoa người Anh, Joseph Lister. Năm 1918, một loại vi khuẩn tương tự như Erysipelothrix rhusiopathiae ñược phân lập từ dịch não tủy của một quân nhân người Pháp. Chủng vi khuẩn này ñược lưu giữ tại viện Pasteur Paris, nhưng phải nhiều năm sau ñó, vi khuẩn này mới ñược mệnh danh là Listeria monocytogenes. - Năm 1924, Murray và cộng sự, trong quá trình nghiên cứu một dịch bệnh trên các ñộng vật thí nghiệm, ñã phân lập ñược một chủng vi khuẩn từ các hạch Lympho của các ñộng vật bị bệnh. Sau ñó , lấy vi khuẩn này tiêm cho các con khỏe mạnh thì thấy ở chúng, có hiện tượng tăng bạch cầu ñơn nhân, tương tự như bệnh của quân nhân người Pháp nói trên. Vì vậy, ông ñặt tên cho nó là: Bacillus monocytogenes. Ba năm sau, tại Nam Phi, Piie khi ñó ñang nghiên cứu sự mang Yersinia peptis trên chuột ñã phân lập ñược một vi khuẩn từ gan chuột và ông ñặt tên nó là Listeria hepatolytica. Trực khuẩn này không thể phân biệt với Bacillus monocytogenes và chủng vi khuẩn lưu giữ ở viện Pasteur Paris. Chính vì vậy, pirie ñã ñề xuất một tên mới chỉ chung cho các chủng này là Listeria monocytogenes. - Năm 1929, Nyfeldt phân lập ñược Listeria monocytogenes từ máu của một bệnh nhân bị sốt kèm theo viêm hạch và ông tin rằng ñó là tác nhân gây bệnh tăng bạch cầu ñơn nhân nhiễm trùng. Tất nhiên, nhiều tác giả khác ñã không ñồng ý với lập luận của Nifeldt. Nhiều năm sau ñó, những công bố kinh ñiển về bệnh nhiễm Listeria (Listeriosis) trên người, kể cả ở trẻ sơ sinh và người lớn, cho thấy những bằng chứng giống như trong y văn nhưng có nhũng tranh luận rằng, khả năng truyền bệnh từ ñộng vật sang người là cực kỳ hiếm. 10 - Năm 1950, những nghiên cứu ñầu tiên, thực sự mang tính hệ thống về nhiễm Listeria trên người ñã thực hiện. Tuy nhiên, phải mất thêm ba thập kỷ nữa, sau hàng loạt các báo cáo dịch ñược công bố mới thấy, nghiên cứu về Listeria monocytogenes từ chỗ tương ñối bế tắc ñã trở nên sáng sủa hơn. Từ ñó tới nay, chủ ñề này ñã thu hút ñược sự quan tâm nghiên cứu của nhiều chuyên ngành, không chỉ bởi vì tầm quan trọng của Listeria monocytogenes với sức khỏe cộng ñồng, mà còn là vì, vi khuẩn này ñã trở thành một mẫu hình nghiên cứu thực nghiệm cho hiện tượng ký sinh nội bào không bắt buộc. 2.2.2 Phân loại. Hình 2.2. Vi khuẩn Listeria monocytogenes - Loài khuẩn giống Listeria là những vi khuẩn hình que Gram dương, ngắn, chúng kỵ khí, dương tính với catalase, âm tính với oxidase, di ñộng ở 20- 25 0 C và không di ñộng ở 37 0 C. - Phân loại học của Listeria.spp trong giới vi sinh vật như sau:  Thuộc giới: Bacteria.  Ngành : Fitmicutes.  Lớp: Bacilli. [...]...B : Bacillales H : Listeriaceae Gi ng: Listeria - Hi n t i có 7 loài Listeria ñư c công nh n: Listeria monocytogenes Listeria ivanovii Listeria innocua Listeria wells Listeria seeligeri Listeria grayi (loài này hi n bao g m c loài c p dư i Listeria murayi.) - Trong ñó, các loài này ch có 2 loài gây b nh qua th c nghi m và t nhiên, Listeria monocytogenes và Listeria ivanovii Trư c kia, chúng... này, thêm 7 loài khác ñư c xác ñ nh: Listeria invanovii (trư c ñây g i là Listeria monocytogenes serovar5), Listeria innocua, Listeria welshimeri, Listeria seeligeri, Listeria muarrayi, Listeria grayi và Listeria denitrificans Listeria denitrificans ñư c phân lo i là Jonesia denitrifocans Listeria murrays và Listeria grayi t ng ñư c cho là có khác bi t so v i các loài Listeria khác ñ ñ m b o cho s thành... chính c a các loài Listeria là kháng nguyên thân (O) và kháng nguyên lông (H) .Quy trình ñ nh type huy t thanh hi n nay d a trên các kháng nguyên này, ñã phân lo i ñư c 6 nhóm huy t thanh (1/2, 3, 4, 5, 6 và 7) và phân lo i sâu hơn thành các serovar cho t t c các loài tr Listeria grayu và Listeria invanoii Trong khi Listeria invanoii và Listeria welshimeri có th ñư c phân bi t v i Listeria monocytogenes... S phát hi n này có th gi i thích vai trò c a LLO trong quá trình xâm nhi m c a Listeria monocytogenes Sau quá trình th c bào, môi trư ng acid c a không bào ch a t bào vi khu n s ho t hoá LLO Chính ñ c t này xúc ti n quá trình ly gi i không bào và vi khu n xâm nh p vào t bào ch t, trong khi ñó pH cao hơn s làm gi m ho t tính c a LLO 2.2.6.3 Vai trò c a y u t ñ c l c _ Listeria monocytogenes t n t i trong. .. màng i − Nhi m Listeria tr sơ sinh: 22 G n gi ng như các trư ng h p nhi m khu n liên c u nhóm B nhi m Listeria tr sơ sinh, tr sơ sinh có th ñư c chia thành hai nhóm kh i phát s m và mu n Kh i phát s m là bi u hi n nhi m khu n trong vòng 5 ngày, nh t là kho ng 48 gi sau sinh B nh kh i phát mu n thì phát b nh sau 5 ngày t khi sinh, trung bình là 14 ngày T l t vong cao t i 60% cho nhóm kh i phát s m và 25%... xãy ra sau khi tr ñư c sinh ra dã ñư c ghi nh n trong nhi u báo cáo v các nhóm nhi m Listeria kh i phát mu n B nh kh i phát mu n hay có viêm màng não ho c viêm não màng não ( 90% các trư ng h p) Kh i phát muôn thư ng âm th m hơn so v i th b nh kh i phát s m v i nh ng tri u ch ng thư ng g p như tr bú kém ho c b bú, khó ch u và s t 23 - Nhi m Listeria Nhi m Listeria ngư i trư ng thành ngư i trư ng thành... Broth (XPR) - Thu c th catalase, oxidase 3.1.5 .Quy trình phân tích vi khu n Listeria Monocytogenes 3.1.5.1 Quy trình ki m nghi m vi khu n Listeria monocytogenes 35 300C, 24h ð ng nh t 25g m u trong 225ml LB I, 300C,24h C y 0.1ml canh khu n sang 10ml môi trư ng LB II Ria lên ñĩa Oxford Agar ho c ñĩa Palcam Agar, 300C, 48h Ch n các khu n l c ñ c trưng c a Listeria Ria lên ñĩa th ch TSA, CAMP v i S.aureus... gây b nh c a vi khu n Listeria monocytogenes - T lâu, các nhà khoa h c ñã phát hi n ra r ng vi khu n Listeria lây lan t t bào này sang t bào khác trong cơ th con ngư i - Sau khi xâm nh p vào cơ th qua ñư ng tiêu hóa, Listeria monocytogenes ti p t c di chuy n qua d dày r i ñi vào các mô ru t non c a v t ch , bao g m các t bào bi u mô và các ñ i th c bào c a m ng Peyer Trong su t quá trình di chuy n chúng... là 2 tu n trong nhi m khu n nguyên phát và nhi m Listeria ph n mang thai ít nh t 3 tu n v i viêm màng não và b nh tr sơ sinh Li u trình ng n hơn có th làm b nh tái phát Viêm màng trong tim có th c n ñư c ñi u tr t i 6 tu n - V i nh ng b nh nhân không dung n p v i ampicillin +/- aminoglycoside, cotrimoxazole ñư c coi là li u pháp thay th ch p nh n ñư c - Vi c l a ch n kháng sinh cho b nh nhân trong trư... ng 3.1.1 Nguyên lý và phương pháp − S d ng phương pháp c y ñ m Listeria monocytogenes trên môi trư ng nuôi c y chuyên bi t sau khi khu n l c nghi ng m nhi t ñ 300C trong 48h ch n các kh ng ñ nh Listeria monocytogenes b ng các th nghi m sinh hóa 3.1.2 Ph m vi phát hi n vi khu n − Phát hi n s hi n di n c a vi khu n Listeria monocytogenes trong th y s n 3.1.3 D ng c s d ng − M u th c ph m c n ki m tra . trình phát hiện Listeria trong thủy sản ñông lạnh . 1.2. Mục tiêu nghiên cứu. - Tìm hiểu tác nhân gây bệnh Listeria monocytogenes trong thủy sản và tìm hiểu các phương pháp xác ñịnh Listeria. loài khác. - Thủy hải sản ñông lạnh là thủy hải sản sạch ñược sơ chế, chế biến theo quy trình nghiêm ngặt về vệ sinh an toàn thực phẩm. Quy trình sơ chế, chế biến và ñưa ra sản phẩm theo phương. monocytogenes trong các sản phẩm thủy sản ñông lạnh. 5 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1. Giới thiệu về thủy hải sản và tình hình nhiễm khuẩn của thủy hải sản ở Việt