VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ****************** VŨ VĂN LỢI TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN LIGNIN PEROXIDASE ISOZYME H8 CỦA PHANEROCHAETE CHRYSOSPORIUM TRONG NẤM MEN PICHIA PASTORIS LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội - 2012 1Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT **************** VŨ VĂN LỢI TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN LIGNIN PEROXIDASE ISOZYME H8 CỦA PHANEROCHAETE CHRYSOSPORIUM TRONG NẤM MEN PICHIA PASTORIS Chuyên ngành: Vi sinh vật Mã số: 62 42 40 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. PHÍ QUYẾT TIẾN Hà Nội – 2012 2Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn i LỜI CẢM ƠN Trước hết tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Phí Quyết Tiến và TS. Phạm Thị Bích Hợp, Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Tôi xin cảm ơn các thầy, cô thuộc Viện Công nghệ Sinh học – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã giúp đỡ và chỉ bảo tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu khoa học. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Phan Thị Hồng Thảo và các cán bộ Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài này. Tôi xin cảm ơn Lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa Học và Công nghệ Việt Nam, Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen Quốc gia, nơi tôi làm việc, đã tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện luận văn. Tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí của Đề tài: CNHD.ĐT.004/08-1 ĐT.07.08/CNSHCB thuộc Đề án phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực công nghiệp chế biến đến năm 2020. Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình và bè bạn, những người luôn động viên và tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày tháng năm 2012 Vũ Văn Lợi 3Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và kết quả thí nghiệm trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Một số số liệu đã được đăng trên các tạp chí khoa học chuyên ngành như trong: “Danh mục công trình khoa học đã công bố có liên quan đến luận án”, đã được sự đồng ý cho phép sử dụng các số liệu của các đồng tác giả và phần còn lại là các kết quả như trong luận án. Hà nội, ngày tháng năm 2012 Học viên Vũ Văn Lợi 4Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT STT Từ viết tắt Tên đầy đủ 1 bp Cặp bazơ (base pair) 2 cDNA DNA bổ trợ (Complementary DNA) 3 DEPC Diethyl pyrocarbonate 4 his Histidine dehydrogenase 5 DNA Deoxyribonucleic acid 6 dNTP Deoxynucleotide 7 EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid 8 EtBr Ethidium bromide 9 kb Kilo bazơ 10 kDa Kilo Dalton 11 LiP Lignin peroxidase 12 LiP H8 Lignin peroxidase isozyme H8 13 rLiP H8 Lignin peroxidase isozyme H8 tái tổ hợp 14 mRNA ARN thông tin (messenger RNA) 15 OD Mật độ quang (Optical Density) 16 ORF Khung đọc mở (Open Reading Frame) 17 PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase chain reaction) 18 pI Điểm đẳng điện (isoelectric point) 19 RNA Ribonucleic acid 20 rRNA ARN ribosom 21 RT-PCR Phản ứng phiên mã ngược chuỗi polymerase (Reverse transcription polymerase chain reaction) 22 SDS Sodium dodecyl sulfate 23 SDS-PAGE Điện di trên gel polyacrylamide có chứa sodium doecyl sulfate 24 TAE Tris-acetat EDTA 25 TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine 26 tRNA ARN vận chuyển 5Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iv DANH MỤC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 2.1 Thành phần gel chạy SDS-PAGE 29 3.1 So sánh độ tương đồng của trình tự amino acid giữa các LiP H8 từ P. chrysosporium 38 3.2 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy tới hoạt tính rLiP H8 của chủng P. pastoris C132 44 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ methanol cảm ứng đến khả năng phát triển và sinh tổng hợp rLiP H8 của chủng P. pastoris C132 47 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men trong môi trường đến khả năng sinh tổng hợp rLiP H8 của chủng P. pastoris C132 48 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ peptone trong môi trường đến khả năng sinh tổng hợp rLiP H8 của chủng P. pastoris C132 49 3.6 Ảnh hưởng của thành phần YNB và ammonium sulfate đến hoạt tính rLiP H8. 50 6Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn v DANH MỤC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Các tiểu phần cấu tạo nên phân tử lignin 3 1.2 Cấu trúc hoá học tiêu biểu của lignin 4 1.3 Sự phân cắt liên kết Cα-Cβ và β-O-4 ở các tiểu phần của polymer lignin, tạo thành các oligomer 5 1.4 Cơ chế phân cắt mối liên kết C  -C  tạo thành gốc aryl 6 1.5 Cơ chế xúc tác của laccase 7 1.6 Nguyên lý của quá trình tích hợp gen ngoại lai vào locus his4 14 3.1 Điện di đồ sản phẩm RNA tổng số và sản phẩm cDNA của nấm đảm P. chrysosporium 36210 33 3.2 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen lipH8 và plasmid pCR2.1::lipH8 trên gel agarose 1,0% 35 3.3 So sánh trình tự amino acid suy diễn của gen lipH8 từ chủng P. chrysosporium 36210 với trình tự amino acid của các protein tương ứng từ các chủng P. chrysosporium khác được đăng ký trên GenBank 36 3.4 Cây phân loại thể hiện sự tương đồng về trình tự amino acid suy diễn của LiP H8 từ chủng P. chrysosporium 36210 và các trình tự LiP H8 tương ứng của các chủng P. chrysosporium khác 38 3.5 Điện di đồ sản phẩm cắt plasmid pPIC9::lipH8 bằng hai enzyme giới hạn 39 3.6 Điện di đồ kiểm tra sự có mặt của gen lipH8 với khuôn 40 7Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vi DNA là bộ gen của P. pastoris tái tổ hợp 3.7 Điện di đồ protein dịch nuôi cấy của năm dòng P. pastoris tái tổ hợp trên SDS-PAGE gel 42 3.8. Hoạt tính rLiP H8 của các dòng P. pastoris tái tổ hợp sau 84 giờ nuôi cấy 43 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng biểu hiện rLiP H8 của chủng P. pastoris C132 45 3.10 Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp rLiP H8 bởi chủng P. pastoris C132 trong bình lên men tự động Bioflo 110 dung tích 7,5 lít 51 3.11. Hoạt tính rLiP H8 từ chủng P. pastoris C132 trước và sau quá trình tối ưu 52 3.12. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ xúc tác của rLiP H8 sinh tổng hợp bởi P. pastoris C132 53 3.13. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ xúc tác của rLiP H8 sinh tổng hợp bởi P. pastoris C132 54 3.14 Độ bền của rLiP H8 của chủng P. pastoris C132 khi ủ ở các nhiệt độ khác nhau theo thời gian 55 3.15 Độ bền của rLiP H8 ở các pH khác nhau theo thời gian 55 8Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vii MỤC LỤC Trang  i  ii  iii  vi  v  vii MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Lignin- 3  4 1.2.1. Lignin peroxidase 5 1.2.2. Mangan peroxidase 6 1.2.3. Laccase 7  8 1.3.1. Khả năng phân giải lignin của nấm mục trắng (white-rot fungi) 8 1.3.2. Khả năng phân giải lignin của vi khuẩn 9  10   lignin peroxidase   11  12 1.6.1. Vector biểu hiện pPIC9 12 1.6.2. Chuyển gen ngoại lai vào hệ gen nấm men 13 1.6.3. Chủng biểu hiện nấm men P. pastoris GS115 14  P. pastoris 16 1.7.1. Ảnh hưởng methanol 16 9Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn viii 1.7.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy 17 1.7.3. Ảnh hưởng của điều kiện lên men 18 CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20  20 2.1.1. Các chủng sinh vật và plasmid 20 2.1.2. Hóa chất, enzyme, thiết bị nghiên cứu 20 2.1.3. Các dung dịch sử dụng và môi trường nuôi cấy 21 2.2.  22 2.2.1. Xác định hoạt tính enzyme lignin peroxidase 22 2.2.2. Điện di DNA/RNA trên gel agarose 22 2.2.3. Tách chiết RNA tổng số từ P. chrysosporium 36210 23 2.2.4. Tổng hợp cDNA 24 2.2.5. Khuếch đại gen mã hóa LiP H8 từ cDNA 24 2.2.6. Tách dòng và phân tích trình tự gen lipH8 25 2.2.7. Đăng ký trình tự lipH8 trên GenBank 25 2.2.8. Xử lý DNA bằng enzyme giới hạn 25 2.2.9. Phản ứng ghép nối gen 26 2.2.10. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E. coli và P. pastoris 26 2.2.11. Phương pháp tách chiết DNA hệ gen từ tế bào nấm men P. pastoris 28 2.2.12. Tạo chủng P. pastoris tái tổ hợp 28 2.2.13. Sàng lọc dòng P. pastoris biểu hiện LiP H8 tái tổ hợp hoạt tính cao 29 2.2.14. Xác định hàm lượng protein 29 2.2.15. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide - SDS 30 2.2.16. Nghiên cứu môi trường và điều kiện lên men biểu hiện rLiP H8 của chủng P. pastoris C132 30 2.2.17. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính và độ bền của 31 10Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn [...]... Nam, hiện nay chưa có công trình nghiên cứu nào biểu hiện các isozyme LiP từ P chrysosporium và ứng dụng trong công nghệ sản xuất bột giấy (Nguyễn Thị Thanh Kiều, Phạm Thành Hổ, 2002) Do vậy, mục tiêu của của luận văn này là: Tách dòng và biểu hiện lignin peroxidase isozyme H8 của Phanerochaete chrysosporium trong nấm men Pichia pastoris nhằm thu enzyme tái tổ hợp có hoạt tính cao Đề tài được thực hiện. .. bố hiện nay chủ yếu tập trung vào hướng tuyển chọn, tối ưu môi trường nuôi cấy của các chủng sinh LiP và đặc tính enzyme 1.6 Vector biểu hiện pPIC9 và hệ biểu hiện trong nấm men P pastoris 1.6.1 Vector biểu hiện pPIC9 Vector biểu hiện pPIC9 được thiết kế có chứa gen kháng ampicillin dùng cho chọn lọc trong tế bào E coli và gen his4 (histidinol dehydrogenase) dùng làm dấu chuẩn chọn lọc trong tế bào nấm. ..rLiP H8 sinh tổng hợp bởi P pastoris C132 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Nhân dòng gen lipH8 33 3.1.1 Tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA 33 3.1.2 Khuếch đại gen lipH8 từ cDNA 34 3.1.3 Tách dòng và phân tích trình tự gen lipH8 của P 35 chrysosporium 36210 3.2 T i ec or iể i n rLiP H8 trong P pastoris 3.3 Tạo c ủn P pastoris i ổ ợp iể 3.4 Biể i n x cđn 38 i n rLiP H8 39 oạ ín rLiP H8 ron... sự có mặt của gen ngoại lai trong hệ gen của chủng đột biến 13 24Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình 1.6 Nguyên lý của quá trình tích hợp gen ngoại lai vào locus his4 1.6.3 Chủng biểu hiện nấm men P pastoris GS115 Trong số các hệ biểu hiện gen thường được sử dụng là E coli, Bacillus sp., nấm men và tế bào động vật thì nấm men được xem là hệ biểu hiện hiệu... ngoại lai có thể hoạt động và tồn tại bền vững trong chủng biểu hiện, vector biểu hiện được tích hợp vào hệ gen của vật chủ nhờ trao đổi giữa các vùng tương đồng của vector biểu hiện và hệ gen của nấm men Thông thường, vector được mở vòng bằng một số enzyme giới hạn như SalI, StuI nằm trong trình tự gen HIS4 để định hướng vector tích hợp hiệu quả vào gen his4 bị đột biến trong hệ gen Đồng thời gen... Chủng nấm men được sử dụng trong nghiên cứu này là chủng P pastoris GS115 đã bị đột biến khuyết dưỡng histidine, do vậy chỉ những dòng nấm men tái tổ hợp đã tích hợp vector biểu hiện mới có khả năng phát triển trên môi trường không có histidine (Invitrogen, 2005, Joseph et al., 1999) 1.6.2 Chuyển gen ngoại lai vào hệ gen nấm men Đối với hệ biểu hiện P pastoris, vector thường được tích hợp vào hệ gen của. .. bởi một tổ hợp các gen và đã được biểu hiện như là sản phẩm trao đổi chất bậc hai của quá trình nuôi cấy Ngoài ra, một vài hệ biểu hiện đồng hình (homologous expression) và hệ biểu hiện dị hình (heterologous expression) cho LiP đã được nghiên cứu Một vài loại isozyme LiP mã hóa bởi các gen lip khác nhau đã được nghiên cứu trong xạ khuẩn và nấm mục trắng P chrysosporium Leisola và cộng sự đã sử dụng... 41 pastoris i ổ ợp 3.5 Nân cao ả năn iể i n rLiP H8 của c ủn P pastoris C132 43 3.5.1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy 43 3.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy 45 3.5.3 Nồng độ chất cảm ứng methanol 46 3.5.4 Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men và peptone 48 3.5.5 Ảnh hưởng của thành phần YNB và ammonium sulfate 49 3.6 Độn 50 i lên men sin 3.7 N iên cứ c c y ổn ố ản ợp rLiP H8 ưởn ới oạ ín độ ền của. .. chưa mô tả được chính xác và đầy đủ cấu trúc hoá học của lignin 1.2 Hệ enzyme phân hủy lignin Trong thực tế, lignin được phân giải bằng quá trình oxy hóa phức tạp, nhưng nhờ tác động của một số enzyme cơ bản (lignin peroxidase (LiP), mangan peroxidase (MnP) và laccase) do nấm mục trắng và vi sinh vật sinh tổng hợp Ngoài ra, một thành phần quan trọng của hệ thống enzyme phân huỷ lignin là các enzyme oxidase,... xác định Trong các isozyme trên thì LiP H2 và LiP H8 có hoạt tính phân hủy lignin cao hơn cả Khi biểu hiện enzyme LiP H8 tái tổ hợp trong Escherichia coli, enzyme chỉ có hoạt tính khi được tái cấu trúc từ dạng thể vùi LiP đã biến tính (denatured inclusion bodies) (Doyle, Smith, 1996) Biểu hiện LiP H8 trong các vật chủ khác như A niger (Aifa et al., 1999); P chrysosporium (Gelpke et al., 1999) và P methanolica . Thành Hổ, 2002). Do vậy, mục tiêu của của luận văn này là: Tách dòng và biểu hiện lignin peroxidase isozyme H8 của Phanerochaete chrysosporium trong nấm men Pichia pastoris nhằm thu enzyme tái. VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT **************** VŨ VĂN LỢI TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN LIGNIN PEROXIDASE ISOZYME H8 CỦA PHANEROCHAETE CHRYSOSPORIUM TRONG. KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ****************** VŨ VĂN LỢI TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN LIGNIN PEROXIDASE ISOZYME H8 CỦA PHANEROCHAETE CHRYSOSPORIUM