Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM LÊ THỊ NGỌC THƢƠNG TUYỂN CHỌN, TCH DNG VÀ XC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN cry1C M HA PROTEIN TINH THỂ DIỆT CÔN TRÙNG BỘ CNH VẢY TỪ VI KHUẨN Bacillus thuringiensis subsp. aizawai PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ MẪU ĐẤT TỈNH THI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên - 2012 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM LÊ THỊ NGỌC THƢƠNG TUYỂN CHỌN, TCH DNG VÀ XC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN cry1C M HA PROTEIN TINH THỂ DIỆT CÔN TRÙNG BỘ CNH VẢY TỪ VI KHUẨN Bacillus thuringiensis subsp. aizawai PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ MẪU ĐẤT TỈNH THI NGUYÊN Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGÔ ĐÌNH BÍNH Thái Nguyên - 2012 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi. Các số liệu và kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong các công trình nghiên cứu khác. Tác giả luận văn Lê Thị Ngọc Thương Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ, hỗ trợ của thầy cô, bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Tôi xin trân trọng cảm ơn tất cả những tình cảm quý báu đó. Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn tới PGS. TS Ngô Đình Bính, người thầy đã tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này. Tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn tới CN Đặng Văn Tiến cùng toàn thể cán bộ phòng Di truyền Vi sinh, Viện công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời thời gian dài thực tập. Bên cạnh đó, sự tạo điều kiện và hỗ trợ của Khoa Sau đại học, BCN Khoa và các đồng nghiệp tại Khoa Sinh – KTNN, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên cũng là động lực rất lớn giúp tôi hoàn thành tốt luận văn của mình. Cuối cùng tôi xin cảm ơn bạn bè và gia đình, những người đã luôn ủng hộ tôi trong suốt thời gian qua! Tác giả luận văn Lê Thị Ngọc Thương Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn i MỤC LỤC Trang Trang bìa phụ Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục i Danh mục các chữ viết tắt iii Danh mục các bảng iv Danh mục các hình v MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Lịch sử nghiên cứu, ứng dụng vi khuẩn Bacillus thuringiensis 3 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu vi khuẩn Bacillus thuringiensis trên thế giới 3 1.1.2. Những nghiên cứu về Bacillus thuringiensis ở Việt Nam 5 1.2. Những đặc điểm của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 7 1.2.1. Vị trí phân loại 7 1.2.2. Phân loại vi khuẩn Bacillus thuringiensis 8 1.2.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, hóa sinh của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 9 1.3. Độc tố của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 10 1.3.1. Độc tố Cry 11 1.3.2. Độc tố Cyt 11 1.3.3. Độc tố Vip 12 1.3.4. Cấu trúc của các nhóm độc tố tinh thể 12 1.3.5. Cơ chế tác động của protein độc tố tinh thể 14 1.4. Gen mã hóa protein độc tố tinh thể 16 1.4.1. Vị trí của các gen mã hóa độc tố của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 17 1.4.2. Phân nhóm gen mã hóa độc tố 17 1.5. Tổng quan về dưới loài Bacillus thuringiensis subsp. aizawai và gen cry1C 19 1.5.1. Một số đặc điểm của dưới loài Bta 19 1.5.2. Gen cry1C 20 1.6. Tổng quan về côn trùng thử nghiệm 22 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ii 1.6.1. Sâu tơ (Plutella xylostella) 22 1.6.2. Sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) 23 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHP 26 2.1. Vật liệu 26 2.2. Hóa chất và thiết bị 26 2.3. Phương pháp nghiên cứu 28 2.3.1. Phương pháp phân loại hình dạng tinh thể của các chủng Bt 28 2.3.2. Phương pháp phân loại Bacillus thuringiensis bằng phản ứng huyết thanh 28 2.3.3. Phương pháp định lượng mật độ bào tử 29 2.3.4. Phương pháp thử hoạt tính trên đối tượng sâu xanh và sâu tơ 29 2.3.5. Phương pháp tách DNA plasmid 30 2.3.6. Phương pháp PCR để khuếch đại gen cry1C 31 2.3.7. Phương pháp tách dòng gen cry1C 31 2.3.8. Phương pháp xác định trình tự nucleotid của đoạn gen tách dòng 34 2.4. Địa điểm nghiên cứu 35 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1. Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis subsp. aizawai mang gen cry1C có hoạt tính diệt sâu tơ (Plutella xylostella) và sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) 36 3.1.1. Phân loại hình dạng tinh thể của các chủng Bacillus thuringiensis nghiên cứu 36 3.1.2. Phân loại Bacillus thuringiensis bằng phương pháp huyết thanh 38 3.1.3. Thử hoạt tính của các chủng Bacillus thuringiensis subsp. aizawai trên sâu tơ (Plutella xylostella) và sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) 40 3.1.4. Kết quả khuếch đại gen cry1C ở các chủng Bacillus thuringiensis subsp. aizawai bằng phương pháp PCR 43 3.2. Tách dòng và đọc trình tự gen cry1C 44 3.2.1. Tách dòng gen cry1C 44 3.2.2. Xác định trình tự đoạn gen cry1C 49 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iii DANH MỤC CC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT STT Viết tắt Viết đầy đủ 1 Amp Ampicillin 2 bp Base pair 3 Bt Bacillus thuringiensis 4 Bta Bacillus thuringiensis subspecies aizawai 5 DNA Deoxyribonucleotide acid 6 E . coli Escherichia coli 7 EDTA Ethylene diamine tetra- acetic acid 8 OD Optical density- mật độ quang học 9 PCR Polymerase chain reaction- phản ứng chuỗi 10 SDS Sodium dodecyl sulphate 11 Sol Solution 12 TE Tris EDTA 13 X- gal 5- Bromo- 4 Cloro- 3 indolyl ß- d galactoside 14 kDa Kilo Dalton 15 dH 2 O Nước deion 16 cs cộng sự Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iv DANH MỤC CC BẢNG Trang Bảng 3.1. Hình dạng tinh thể của các chủng Bacillus thuringiensis nghiên cứu 37 Bảng 3.2. Kết quả phân loại dưới loài của các chủng Bt sinh tinh thể 39 Bảng 3.3: Kết quả thử hoạt tính diệt sâu tơ của các chủng Bta sau 3 ngày thử nghiệm 41 Bảng 3.4. Kết quả thử hoạt tính diệt sâu xanh da láng của các chủng Bta 42 sau 3 ngày thử nghiệm 42 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn v DANH MỤC CC HÌNH Trang Hình 1.1. Hình thái khuẩn lạc nhóm B.cereus (nguồn: Phòng DTVS) 7 Hình 1.2. Phản ứng ngưng kết của vi khuẩn Bacillus thuringiensis với kháng nguyên lông roi H [6] 8 Hình 1.3. Bào tử và tinh thể của Bacillus thuringiensis [24] 9 Hình 1.4. Bào tử và tinh thể Bacillus thuringiensis dưới kính hiển vi quang học khi nhuộm với fuchsin base (nguồn: Phòng DTVS) 10 Hình 1.8. Cây phân loại của hai họ độc tố Cyt và Vip [42] 12 Hình 1.6. Các block bảo thủ có mặt ở các loại độc tố Cry [26] 14 Hình 1.7. Mô hình cấu trúc chung của độc tố Cry [26] 14 Hình 1.5. Cơ chế tác động của protein tinh thể độc tố tới côn trùng đích [24] 16 Hình 1.9. Hình ảnh sâu tơ và (Plutella xylostella) thiệt hại do sâu tơ gây ra [10] 23 Hình 1.10. Vòng đời của sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) [10] 25 Hình 3.1. Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus thuringiensis trên môi trường MPA sau 72 giờ nuôi cấy ở 28 0 C 36 Hình 3.2. Hình dạng bào tử và tinh thể của chủng TN1.12 và TN 36.3 37 Hình 3.3. Hình ảnh ngưng kết của chủng 4J4 (A) và TN 6.12 (B) với typ huyết thanh H7 dưới kính hiển vi quang học 39 Hình 3.4. Thử hoạt tính diệt sâu tơ của các chủng Bta nghiên cứu 41 Hình 3.5. Hình ảnh thử hoạt tính diệt sâu xanh da láng của các chủng Bta nghiên cứu 42 Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của các chủng Bta nghiên cứu 44 Hình 3.7. Khuẩn lạc xanh và trắng trên đĩa thạch LBA sau 14 giờ nuôi cấy 45 Hình 3.8. Hình ảnh điện di sản phẩm colony - PCR với mồi M13 46 Hình 3.9. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt DNA plasmid tách chiết từ một số dòng khuẩn lạc trắng 47 Hình 3.10. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen cry1C từ DNA plasmid tái tổ hợp pGEM-T Easy – cry1C – TN28.6 - p3, pGEM-T Easy – cry1C – TN 36.3 - p1 và pGEM-T Easy – cry1C – TN 6.12 – p7 48 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Thái Nguyên là tỉnh trung du miền núi phía Bắc, nông nghiệp chiếm tỷ trọng lớn trong cơ cấu kinh tế. Cũng như nhiều vùng nông nghiệp khác, sâu hại cây trồng, đặc biệt là các loài thuộc bộ Cánh vảy như sâu tơ (Plutella xylostella), sâu xanh da láng (Spodoptera exigua)…là một trong những nhân tố gây thiệt hại lớn tới năng suất và phẩm chất nông sản. Việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học để diệt côn trùng bộ Cánh vảy (Lepidoptera) là biện pháp có hiệu quả tức thời nhưng lại gây ra những tác hại rất lâu dài cho môi trường sinh thái, đồng thời việc tồn dư thuốc trừ sâu trong nông sản gây ngộ độc cho người và động vật, là những nguyên nhân khiến thuốc trừ sâu sinh học được coi như một giải pháp hiệu quả để dần thay thế thuốc trừ sâu hóa học trong nông nghiệp. Trên thị trường thuốc trừ sâu sinh học hiện nay, các chế phẩm có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis chiếm thị phần gần như tuyệt đối [8], [39]. Bacillus thuringiensis là vi khuẩn Gram dương, trong giai đoạn sinh bào tử có khả năng tạo ra các protein tinh thể gây độc một cách đặc hiệu với các côn trùng thuộc bộ Cánh vảy (Lepidoptera), bộ Hai cánh (Diptera), bộ Cánh cứng (Coleoptera) …. Các tinh thể là hỗn hợp của một hay nhiều loại protein thuộc 2 nhóm độc tố Cry và độc tố Cyt. Các độc tố có tính đặc hiệu với côn trùng đích nhưng không gây độc cho người, động vật có xương sống, thực vật. Các độc tố tinh thể được mã hóa bởi các gen cry nằm trên các plasmid [39]. Bacillus thuringiensis subsp. aizawai (Bta) là một trong 82 dưới loài của vi khuẩn Bacillus thuringiensis, có khả năng sinh nhiều loại protein tinh thể có tác dụng diệt côn trùng thuộc nhiều bộ khác nhau. Protein tinh thể độc Cry1C là một loại protein do Bta sinh ra trong quá trình hình thành bào tử, có hoạt tính chống lại côn trùng bộ Cánh vảy rất mạnh. Việc sàng lọc và tuyển chọn dưới loài Bacillus thuringiensis có khả năng tiêu diệt nhiều loại côn trùng đích cũng như tiếp tục nghiên cứu về trình tự các gen cry [...]... 1981, gen mã hóa protein tinh thể diệt sâu đầu tiên được tách dòng và đọc trình tự Từ đó, số lượng gen mã hóa protein tinh thể của Bt được tách dòng và nghiên cứu đặc tính không ngừng tăng lên Những gen này chủ yếu thuộc 2 họ gen cry và cyt, được phân loại trong 30 nhóm khác nhau theo trình tự amino acid của protein mà chúng mã hóa Năm 1996, Estruch và cs đã phát hiện ra gen mã hóa protein Vip3A và Vip3B,... cứu sự phân bố và đa dạng gen của vi khuẩn Bt phân lập ở một số tỉnh thuộc vùng Đông Bắc Bộ đã phân loại được 22 dưới loài trên tổng số 82 dưới loài đã được phát hiện trên thế giới [3], [13] Trên cơ sở phát hiện, tách dòng và đọc trình tự gen có trong các chủng Bacillus thuringiensis phân lập tại Vi t Nam, Ngô Đình Bính và cs đã tách dòng và biểu hiện gen mã hóa tổng hợp protein Cry1C và Cry1D diệt sâu... Nhóm gen cryII: mã hóa protein gây độc cho côn trùng bộ Hai cánh, Cánh vảy Nhóm gen cryIII: mã hóa protein gây độc cho côn trùng bộ Cánh cứng Các gen cryIV: mã hóa protein gây độc cho côn trùng bộ Hai cánh Những gen mã hóa nhiều loại protein mà không tác động đến những vật chủ thông dụng trên được xếp vào nhóm cryV Hệ thống phân loại này đơn giản, dễ sử dụng nhưng cũng bộc lộ hạn chế bởi có những gen. .. yếu – tinh thể độc) được mã hóa bởi các gen cry, độc tố Cyt (độc tố phân huỷ tế bào) do gen cyt mã hoá và độc tố Vip (vegetative insecticidal protein) do gen vip mã hoá tổng hợp Gen này không xếp vào họ gen cry vì không sinh tinh thể [11], [27] 17 1.4.1 Vị trí của các gen mã hóa độc tố của vi khuẩn Bacillus thuringiensis Các gen mã hoá protein diệt côn trùng thường nằm trên các plasmid có hệ số copy... ấu trùng Manduca sexta Hiện nay, đã có hơn 600 gen đã được tách dòng và đăng kí trên ngân hàng dữ liệu gen (Gene Database) [29], [42] 1.4.2 Phân nhóm gen mã hóa độc tố Hệ thống phân loại các gen cry đầu tiên của HÖfte và Whiteley được xây dựng dựa vào bộ côn trùng đích của độc tố mà gen mã hóa để xây dựng cây phân loại gồm có 4 nhóm chính Nhóm gen cryI: mã hóa protein gây độc cho côn trùng bộ Cánh vảy. .. nhiều loại độc tố trong một tế bào Bacillus thuringiensis như plasmid của Bacillus thuringiensis var aizawai và kurstaki HD1 có 5 gen mã hóa protein diệt côn trùng [18], [26], [27], [29] Nhiều nhóm nghiên cứu đã tách dòng gen ICP (Insecticidal Crystal Protein) ở một số dưới loài Bacillus thuringiensis Năm 1981, Schnepf và Whiteley công bố đã tách dòng và biểu hiện gen cry từ Bacillus thuringiensis var kustaki... mặt phân loại nhưng lại mã hóa độc tố diệt các côn trùng thuộc các bộ khác nhau như gen cry1C mã hóa độc tố diệt côn trùng bộ Hai cánh và Cánh vảy trong khi protein cry1B lại gây độc với bộ Cánh cứng và Hai cánh [41] 18 Hệ thống phân loại mới do Crickmore và cs đề xuất có nhiều điểm đổi mới hiện được sử dụng rộng rãi So với hệ thống phân loại cũ, tên của các gen được giữ nguyên, chỉ thay thế chữ số. .. hiện, chúng mã hóa tổng hợp protein độc đối với côn trùng bộ Cánh vảy và bộ Cánh cứng [34] Nhóm gen cry8: Nhóm gen cry8 mã hóa cho các protein có hoạt lực với côn trùng thuộc bộ Cánh cứng Cho đến nay đã xác định được khoảng gần 40 gen cry8 thuộc các dưới loài Bacillus thuringiensis khác nhau Đây là nhóm gen mới đang được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu [25], [45] Nhóm gen cyt: Mã hóa protein 27... loài Bacillus thuringiensis subsp aizawai và gen cry1C 1.5.1 Một số đặc điểm của dưới loài Bta Bacillus thuringiensis subsp aizawai là một trong số 82 dưới loài của vi khuẩn Bt, thuộc typ huyết thanh số 7 theo khóa phân loại của Bonnefoi và de Barjac, 1963 Trong số các chủng Bt phân lập ở Vi t Nam có 15% số chủng là Bacillus thuringiensis subps aizawai [3], [6] 20 Bacillus thuringiensis subps aizawai. .. chuyển gen này kháng được sâu tơ, sâu đo, và sâu xanh bướm trắng [21], [22] Theo một nghiên cứu mới từ Trung Quốc, Qifa Zhang đã tạo ra lúa chuyển gen cry1C Cây lúa chuyển gen kháng được sâu cuốn lá lúa và sâu đục thân [48] Tại Vi t Nam, năm 2003, Ngô Đình Bính cùng các cs đã tách dòng và biểu hiện thành công gen mã hóa protein cry1C diệt sâu khoang từ Bacillus thuringiensis subsp .aizawai phân lập từ mẫu . TUYỂN CHỌN, TCH DNG VÀ XC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN cry1C M HA PROTEIN TINH THỂ DIỆT CÔN TRÙNG BỘ CNH VẢY TỪ VI KHUẨN Bacillus thuringiensis subsp. aizawai PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ MẪU ĐẤT TỈNH THI NGUYÊN. TCH DNG VÀ XC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN cry1C M HA PROTEIN TINH THỂ DIỆT CÔN TRÙNG BỘ CNH VẢY TỪ VI KHUẨN Bacillus thuringiensis subsp. aizawai PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ MẪU ĐẤT TỈNH THI NGUYÊN . PCR 43 3.2. Tách dòng và đọc trình tự gen cry1C 44 3.2.1. Tách dòng gen cry1C 44 3.2.2. Xác định trình tự đoạn gen cry1C 49 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 Số hóa bởi Trung