Nghiên cứu chế tạo vacxin vô hoạt nhũ dầu nhị giá phòng bệnh newcastle và viêm phế quản truyền nhiễm ở gà

Biến động hiệu giá kháng thể kháng virus Newcastle ở gà chưa có miễn dịch cơ sở và gà đã được miễn dịch cơ sở được tiêm vacxin lô 1 .... Đồng thời với việc phát triển nghề chăn nuôi gà t

LỜI CẢM ƠN

Được sự phân công của Viện Công nghệ sinh học & Môi trường, Trường Đại

học Nha Trang, cùng với sự chấp thuận của ban lãnh đạo Phân viện Thú y miền

Trung, tôi được phép thực tập tại Phân viện từ ngày 20/02/2012 đến ngày

02/06/2012

Trong quá trình thực tập, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi luôn nhận được

sự giúp đỡ tận tình và hết lòng vì khoa học của Tiến sĩ Nguyễn Văn Duy và Thạc sĩ

Đỗ Văn Khiên, cùng các cán bộ Bộ môn Siêu vi trùng Tôi cũng xin cảm ơn ban

lãnh đạo Phân viện Thú y miền Trung, các thầy cô Viện Công nghệ Sinh học & Môi

trường, cùng toàn thể cán bộ công nhân viên đang công tác tại Phân viện đã tạo điều

kiện giúp đỡ tôi hoàn thành đợt thực tập này Tôi cũng gởi lời cảm ơn đến gia đình

đã luôn động viên và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa luận này

Mặc dù có nhiều cố gắng nhưng do kiến thức, năng lực, cũng như kinh

nghiệm nghiên cứu của bản thân còn nhiều hạn chế nên không thể không tránh khỏi

những thiếu sót Kính mong nhận được nhiều ý kiến đóng góp của các thầy cô giáo

cùng bạn bè đồng nghiệp

Nha Trang, tháng 06 năm 2012

Sinh viên

Phạm Văn Vị

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG viii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3

1.1 Virus Newcastle 3

1.1.1 Hình thái và các tính trạng lý, hóa 3

1.1.2 Cấu trúc hệ gen 3

1.1.3 Protein 4

1.1.4 Sức đề kháng 4

1.1.5 Đặc tính nuôi cấy 5

1.1.6 Độc lực 5

1.1.7 Sự nhân lên 6

1.1.8 Tính gây bệnh 7

1.1.9 Cơ chế sinh bệnh 8

1.2 Virus viêm phế quản truyền nhiễm gà (IBV) 8

1.2.1 Hình thái và các tính trạng lý, hóa 8

1.2.2 Cấu trúc hệ gen 9

1.2.3 Protein 9

1.2.4 Sức đề kháng 10

1.2.5 Đặc tính nuôi cấy 11

1.2.6 Độc lực 12

1.2.7 Sự nhân lên 13

1.2.8 Tính gây bệnh 13

1.2.9 Cơ chế sinh bệnh 13

1.3 Tình hình nghiên cứu sản xuất vacxin 14

1.3.1 Trên thế giới 14

1.3.2 Ở Việt Nam 15

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Vật liệu 17

2.1.1 Giống Virus 17

2.1.2 Động vật thí nghiệm 17

2.1.3 Môi trường và hóa chất 17

2.1.4 Thiết bị chuyên dụng 18

2.2 Phương pháp 18

2.2.1 Thử nghiệm HA (Haemagglutination Test) 18

2.2.2 Tiêm vào xoang niệu mô 19

2.2.3 Giám định đặc tính sinh học của virus Newcastle 19

2.2.3.1 Tiêm truyền giống virus Newcastle trên gà mẫn cảm 19

2.2.3.2 Xác định chỉ số EID50, MDT 19

2.2.3.3 Xác định chỉ số LD50 21

2.2.3.4 Xác định chỉ số ICPI 22

2.2.3.5 Xác định chỉ số IVPI 22

2.2.4 Giám định đặc tính sinh học của IBV 23

2.2.4.1 Tiêm truyền giống virus viêm phế quản truyền nhiễm trên gà mẫn

cảm 23

2.2.4.2 Xác định chỉ số EID50 23

2.2.5 Nhân giống và thu hoạch virus Newcastle và IBV trên trứng gà có phôi24 2.2.6 Xác định virus và chuẩn độ virus Newcastle và IBV trong nước trứng thu được 25

2.2.7 Xác định hiệu giá kháng thể kháng virus Newcastle và IBV trong huyết thanh gà được tiêm vacxin nhũ dầu 25

2.2.8 Vô hoạt virus 26

2.2.9 Kiểm tra vô hoạt 26

2.2.10 Sản xuất vacxin 26

2.2.11 Kiểm tra chất lượng vacxin 28

2.2.11.1 Vô trùng 28

2.2.11.2 Tiêu chuẩn về vật lý 28

2.2.11.3 Chỉ tiêu an toàn của vacxin trên gà 28

2.2.11.4 Hiệu lực 28

2.2.12 Xử lý số liệu 29

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Giám định đặc tính sinh học của virus Newcastle 30

3.1.1 Ổn định giống virus PV1 trên phôi gà 30

3.1.2 Tiêm truyền giống virus PV1 trên gà mẫn cảm 31

3.1.3 Chuẩn độ giống virus PV1 trên phôi gà 32

3.1.4 Chuẩn độ giống virus PV1 trên gà 34

3.1.4.1 Xác định chỉ số LD50 34

3.1.4.2 Tiêm não gà con 1 ngày tuổi 35

3.2 Giám định đặc tính sinh học của IBV 37

3.2.1 Ổn định giống virus MV trên phôi gà 37

3.2.2 Tiêm truyền giống virus MV trên gà mẫn cảm 38

3.2.3 Chuẩn độ giống virus MV trên phôi gà 39

3.3 Nhân giống và kiểm tra tiêu chuẩn giống 41

3.3.1 Với giống virus Newcastle cường độc 41

3.3.2 Với giống virus IB cường độc 41

3.4 Chuẩn độ virus trên phôi gà 43

3.5 Kiểm tra 2 giống virus (PV1 và MV) sau vô hoạt 43

3.6 Sản xuất vacxin 45

3.7 Kiểm tra vô trùng vacxin 45

3.8 Kiểm tra chỉ tiêu vật lý, an toàn của vacxin 45

3.9 Kiểm tra hiệu lực vacxin trên gà 2 tháng tuổi 47

3.9.1 Theo dõi sự biến động hàm lượng kháng thể kháng virus Newcastle và IB trên gà 2 tháng tuổi chưa được miễn dịch cơ sở 47

3.9.2 Theo dõi sự biến động hàm lượng kháng thể kháng virus Newcastle và IB trên gà 2 tháng tuổi đã được miễn dịch cơ sở 51

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ORF Open Reading Frame

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Chỉ số độc lực của một số chủng virus Newcastle 6

Bảng 2.1 Xác định chỉ số EID50 20

Bảng 2.2 Xác định chỉ số LD50 21

Bảng 2.3 Xác định chỉ số ICPI 22

Bảng 2.4 Xác định chỉ số IVPI 23

Bảng 2.5 Xác định chỉ số EID50 24

Bảng 3.1 Kết quả tiêm truyền giống PV1 trên phôi gà 30

Bảng 3.2 Kết quả tiêm truyền giống PV1 trên gà mẫn cảm 31

Bảng 3.3 Kết quả xác định chỉ số EID50 (log10) của giống PV1 lần 1 33

Bảng 3.4 Kết quả xác định chỉ số LD50 (log10) của giống PV1 lần 1 34

Bảng 3.5 Kết quả xác định chỉ số ICPI bằng giống virus PV1 36

Bảng 3.6 Kết quả xác định chỉ số IVPI bằng chủng virus PV1 37

Bảng 3.7 Kết quả tiêm truyền giống MV trên phôi gà 37

Bảng 3.8 Kết quả tiêm truyền giống MV trên gà mẫn cảm 39

Bảng 3.9 Kết quả xác định chỉ số EID50 (log10) của giống MV lần 1 40

Bảng 3.10 Kết quả kiểm tra virus sau vô hoạt trên phôi gà 44

Bảng 3.11 Kết quả sản xuất vacxin 45

Bảng 3.12 Kết quả kiểm tra vô trùng vacxin 45

Bảng 3.13 Kết quả kiểm tra tính ổn định của vacxin 46

Bảng 3.14 Kết quả kiểm tra an toàn của các lô vacxin nhũ dầu trên gà 46

Bảng 3.15 Biến động hiệu giá kháng thể kháng virus Newcastle ở gà 2 tháng tuổi chưa được miễn dịch cơ sở newcastle 48

Bảng 3.16 Biến động hiệu giá kháng thể kháng virus IB ở gà 2 tháng tuổi chưa được miễn dịch cơ sở IB 50

Bảng 3.17 Biến động hiệu giá kháng thể kháng virus Newcastle ở gà 2 tháng tuổi đã được miễn dịch cơ sở newcastle 52

Bảng 3.18 Biến động hiệu giá kháng thể kháng virus IB ở gà 2 tháng tuổi đã được miễn dịch cơ sở IB 54

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh của NDV được chụp dưới kính hiển vi điện tử .3

Hình 1.2 Hình ảnh của IBV được chụp dưới kính hiển vi điện tử 8

Hình 2.1 Tóm tắt quy trình sản xuất vacxin nhị giá ND & IB nhũ dầu 27

Hình 3.1 Bệnh tích do virus cường độc Newcastle gây ra ở phôi gà 42

Hình 3.2 Bệnh tích do virus cường độc IB gây ra ở phôi gà 42

Hình 3.3 Biến động hiệu giá kháng thể kháng virus Newcastle ở gà chưa được miễn dịch cơ sở 49

Hình 3.4 Biến động hiệu giá kháng thể kháng virus IB ở gà chưa được miễn dịch cơ sở 51

Hình 3.5 Biến động hiệu giá kháng thể kháng virus newcastle ở gà đã được miễn dịch cơ sở 53

Hình 3.6 Biến động hiệu giá kháng thể kháng virus IB ở gà đã được miễn dịch cơ sở 55

Hình 3.7 Biến động hiệu giá kháng thể kháng virus Newcastle ở gà chưa có miễn dịch cơ sở và gà đã được miễn dịch cơ sở được tiêm vacxin lô 1 56

Hình 3.8 Biến động hiệu giá kháng thể kháng virus IB ở gà chưa có miễn dịch cơ sở và gà đã được miễn dịch cơ sở được tiêm vacxin lô 1 56

MỞ ĐẦU

Ở Việt Nam hiện nay, chăn nuôi theo phương thức công nghiệp đang từng bước dần thay thế phương thức chăn nuôi nhỏ lẻ theo quy mô hộ gia đình Nuôi gia cầm trong đó nuôi gà là một trong những nghề được quan tâm hàng đầu, vì thời gian nuôi ngắn thu được sản phẩm nhanh Một trong những khâu quan trọng để đảm bảo chăn nuôi gà phát triển mạnh và có lãi là bảo vệ cho đàn gà tránh khỏi dịch bệnh

Đồng thời với việc phát triển nghề chăn nuôi gà theo phương thức công nghiệp, các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của gà cũng nảy sinh, gây thiệt hại cho ngành chăn nuôi, như các bệnh: Bệnh Newcastle, bệnh Gumboro, bệnh Viêm phế quản truyền nhiễm, bệnh hô hấp mãn tính (CRD), bệnh tụ huyết trùng…đặc biệt là bệnh Newcastle và bệnh Viêm phế quản truyền nhiễm đã được người chăn nuôi quan tâm rất nhiều

Bệnh Newcastle hay còn gọi là bệnh gà rù là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm cấp tính, lây lan rộng của loài gà do một loại virus thuộc nhóm Paramyxovirus gây ra (Bear & Hanson, 1980) Đặc điểm là gà ủ rũ, kém hoạt động, bỏ ăn, lông xù như khoát áo tơi, nền chuồng có nhiều bãi phân trắng; gà sốt cao 42 - 430C, chảy nước mũi, khó thở, rối loạn tiêu hóa; có triệu chứng thần kinh Ngoài ra, bệnh tích điển hình là niêm mạc dạ dày tuyến xuất huyết lấm tấm chấm màu đỏ, niêm mạc ruột xuất huyết; niêm mạc miệng hầu, khí quản xuất huyết[2] Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm gà do virus thuộc nhóm Coronavirus gây ra, là một bệnh truyền nhiễm cấp tính, dễ lây lan tiếp xúc với những triệu chứng đặc trưng ở đường hô hấp như

ho, chảy nước mũi, viêm hầu họng và dịch thẩm xuất tích tụ nhiều ở niêm mạc khí phế quản làm con vật khó thở, hắt hơi và có tiếng ran khí quản Bệnh tích điển hình

là niêm mạc mũi, khí quản, phế quản và lòng phế nang xung huyết, chứa dịch Ngoài ra, bệnh có thể ảnh hưởng lớn đến sản lượng và chất lượng trứng ở đàn gà đẻ[1],[2]

Các bệnh trên có tỷ lệ nhiễm cao và là một trong những nhân tố chính gây giảm hiệu quả kinh tế đối với ngành chăn nuôi gà Cho đến nay, bệnh chưa có thuốc trị Biện pháp tốt nhất để kiểm soát dịch bệnh là thực hiện an toàn sinh học trong chăn nuôi và sử dụng vacxin phòng bệnh[1],[2]

Tiêm phòng cho gà bằng vacxin nhược độc, đơn giá có ưu điểm là tạo miễn dịch nhanh, hiệu lực miễn dịch cao Tuy nhiên, khi sử dụng vacxin đơn giá để tiêm phòng cần phải bắt gà nhiều lần, tạo phản ứng stress gây bất lợi cho gà, ảnh hưởng tới năng suất sản xuất Vacxin đa giá là giải pháp hữu hiệu trong việc phòng bệnh cho gia cầm

Trong công tác phòng bệnh cho gia cầm thì việc chế tạo vacxin đa giá vô hoạt phòng bệnh cho gia cầm là xu thế hiện nay của các nhà sản xuất vacxin trên thế giới hiện nay và lâu dài Để giảm bớt những nhược điểm khi tiêm phòng bằng vacxin nhược độc, vacxin đơn giá, đại bộ phận các nhà sản xuất vacxin lớn trên thế

đã tập trung nghiên cứu và đưa vào sản xuất các loại vacxin đa giá vô hoạt dùng trong phòng bệnh cho gà Để đáp ứng yêu cầu của đợt thực tập tốt nghiệp cuối khóa

tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu chế tạo vacxin vô hoạt nhũ dầu nhị giá phòng bệnh Newcastle và viêm phế quản truyền nhiễm ở gà” Đề tài được thực hiện tại Bộ môn nghiên cứu Siêu vi trùng, Phân viện Thú y miền Trung - Km

4, Đường 2/4 - Vĩnh Hòa - Nha Trang - Khánh Hòa Với những nội dung nghiên cứu sau:

- Giám định một số đặc tính sinh học của hai giống virus cường độc NDV và viêm phế quản truyền nhiễm IBV

- Kiểm tra tiêu chuẩn giống cường độc Newcastle và IBV đưa vào sản xuất vacxin Nhân giống và chuẩn độ 02 giống virus trên phôi gà

- Vô hoạt và kiểm tra chỉ tiêu vô hoạt hai giống virus NDV và IBV

- Chế tạo vacxin vô hoạt nhũ dầu nhị giá phòng bệnh Newcastle và viêm phế quản truyền nhiễm gà với chất bổ trợ nhũ dầu

- Kiểm tra tiêu chuẩn về vật lý, vô trùng, an toàn và hiệu lực của vacxin

Chương 1 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

Khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử thấy

virion có đường kính 120 - 300 nm, thường

có dạng hình cầu hoặc hình que, hình sợi

Vỏ bọc có độ dày khoảng 10 nm Trên bề

mặt có hai loại gai (Spike) glycoprotein sắp xếp chặt chẽ

Do không bền vững, khi bị làm đông giá và tan giá hay khi được tinh vỏ bọc ngoài thường bị phá hủy dễ dàng, nên dưới kính hiển vi điện tử thường thấy nucleocapsid trần Nucleocapsid đối xứng xoắn dạng sợi thừng có chiều rộng 14 -

18 nm, chiều dài khoảng 1 µm[1] Virus có thể qua được màng lọc Berkerfeld,

Chamberland và màng lọc Seiz Virus gây ngưng kết hồng cầu gà, bò, vịt, chuột bạch, chuột lang và nhóm máu O của người nhưng không gây ngưng kết ở ngựa, lừa, la, thỏ[2]

1.1.2 Cấu trúc hệ gen

Genom virus là RNA 1 sợi âm đơn nhất Phân tử lượng khoảng 5 - 7 MDa, kích thước khoảng 15 kb và hệ gen chiếm 0,5% trọng lượng virion Hằng số sa lắng khoảng 50S - 57 S[3]

Hầu hết virus gây bệnh Newcastle cho gia cầm có trình tự 112

R/K-R-Q-K/R-R116 ở phần cuối C của F2 protein và F (phenylalanine) ở phần còn lại 117, N - phần

[12]

cuối của protein F1, trong khi virus có độc lực thấp hơn có trình tự ở phần tương ứng là 112G/E-K/R-Q-G/E-R116 và L (Leucine) ở phần còn lại 117[13]

1.1.3 Protein

Virus có 7 - 8 khung phiên mã ( ORF: Open Reading Frame - khung đọc mở:

là đoạn DNA đủ dài, không bị chặn bởi bộ ba mã dừng để mã hóa một polypeptide

có chức năng protein), trên đó miền P được sao mã trùng lặp hay có sự trùng lặp gen cho nên có thể phiên dịch được 10 - 12 loại protein

Có 7 loại protein cấu trúc:

 Nucleoprotein (NP): là một protein kiềm kết hợp với RNA tạo thành nucleocapsid, có tác dụng bảo vệ RNA virus

 Haemagglutinin - neuraminidaza (HN): có đặc tính ngưng kết hồng

cầu gà và có hoạt tính của men neuraminidaza có tác dụng cắt đứt các thụ thể hồng cầu

 Fusion protein (F, glycoprotein F, protein dung hợp): có hoạt tính dung hợp màng tế bào và hoạt tính dung huyết Protein F được tổng hợp ở dạng tiền thể (protein FO), dưới tác động của enzyme phân giải protein của tế bào ký chủ mà phân cắt thành hai phần là F1 và F2 Nó biểu hiện hoạt tính dung hợp màng và có hoạt động quan trọng trong việc xâm nhập của virus và hình thành các tế bào khổng

lồ đa nhân[4]

 Protein SH (Protein kỵ thủy ngắn): chưa rõ chức năng[3]

 Large protein (L): chưa rõ chức năng

 Matrice protein (M, protein màng): tồn tại mặt trong áo ngoài, có tác dụng gắn RNA của virus với vỏ bọc

 Phospho nucleoprotein: hình ống dài và xoắn ốc nhiều vòng, chưa rõ chức năng[4]

1.1.4 Sức đề kháng

Do virus có màng bọc ngoài là lipid nên rất dễ mẫn cảm với các chất hóa học như ether, chloroform, cồn, formol, phenol và làm mất khả năng gây nhiễm nhưng không ảnh hưởng đến tính miễn dịch của virus Ở nhiệt độ 560C virus bị tiêu diệt

trong 3 giờ, ở 600C là trong 3 phút, ở 1000C là 1 phút; từ 4 - 200C virus có thể tồn tại trong 1 tháng, ở nhiệt độ âm virus tồn tại hằng năm Khả năng chịu nhiệt của từng chủng virus là đặc tính di truyền Các chủng virus khác nhau có khả năng chịu nhiệt khác nhau, ở nhiệt độ 56oC có chủng virus chịu được đến 6 giờ mà còn khả năng gây nhiễm ví dụ như chủng virus Newcastle chịu nhiệt V4 Ở pH < 2 hoặc pH

> 10 virus mất khả năng gây nhiễm Virus dễ bị diệt bởi tia tử ngoại Dung dịch Glyxerin 50% có thể giữ virus trong bệnh phẩm được 7 ngày ở 370C[4]

1.1.5 Đặc tính nuôi cấy

Trên phôi gà: Cấy virus vào xoang niệu mô phôi thai gà ấp 10 - 12 ngày, tùy theo độc lực từng chủng virus mà phôi thai có thể chết 48 - 96 giờ Nói chung các chủng có độc lực cao và vừa gây chết phôi trong vòng 60 giờ, còn các chủng có độc lực thấp phải trên 100 giờ mới gây chết phôi, bệnh tích trên phôi chủ yếu là gây xuất huyết điểm ở đầu và cánh, có khi tụ máu và gây xuất huyết khắp phôi thai Phôi càng non thì khả năng gây nhiễm và thời gian gây chết phôi nhanh hơn, tỷ lệ gây chết phôi cũng cao hơn Đặc điểm quan trọng là sau khi cấy truyền đời qua phôi thai gà nhiều lần, người ta thu được giống virus Newcastle nhược độc dùng để chế tạo vacxin phòng bệnh

Trên tế bào nuôi cấy: có thể nuôi cấy virus Newcastle vào môi trường tế bào thận khỉ, thận lợn, hoặc tế bào xơ phôi thai gà 1 lớp sau 24 giờ gây nhiễm, virus làm hủy hoại tế bào, làm cho tế bào bị biến đổi hình thái, tế bào co tròn lại hay vỡ ra hoặc tạo thành các tế bào khổng lồ

Trên động vật: có thể dùng gà giò để tiêm truyền nuôi cấy, virus sẽ phát triển

và gây bệnh cho gà giống như gà mắc bệnh tự nhiên[4]

1.1.6 Độc lực

Các nghiên cứu gần đây cho thấy rằng trình tự nucleotide trên gen mã hóa trình tự acid amin tại thời điểm cắt protein F liên quan chặt chẽ với độc lực của

virus[7]

Virus Newcastle có nhiều chủng, các chủng này có độc lực khác nhau, căn

cứ vào tính độc và khả năng gây bệnh người ta chia làm 3 nhóm:

 Nhóm Velogen: gồm các chủng có độc lực cao, đó chính là virus cường độc tự nhiên

 Nhóm Mesogen: gồm các chủng có độc lực vừa, là những virus chỉ gây bệnh nhẹ cho gà trên 6 tuần tuổi như chủng H (Herfoshine), chủng M (Mukteswar), chủng này khi tiêm cho phôi gà 10 - 11 ngày, làm chết phôi thai và gây xuất huyết toàn phôi thai

 Nhóm Lentogen: là các chủng có độc lực thấp gồm những virus không

có khả năng gây bệnh hoặc chỉ gây bệnh nhẹ cho gà con mới nở như chủng B1, chủng Lasota, chủng F[2]

Bảng 1.1 Chỉ số độc lực của một số chủng virus Newcastle

Paramyxovirus nếu kết hợp với thụ thể có chứa axit sialic thì nhờ hoạt tính dung hợp màng của protein F mà gây dung hợp áo ngoài với màng tế bào, đưa nucleocapsid vào bên trong màng tế bào Trong nucleocapsid đã có sẵn enzyme RNA-polymerase phụ thuộc RNA, dưới tác động của enzyme này trên khuôn RNA virus diễn ra sự tổng hợp các mRNA đơn cistron (mRNA phiên chỉ 1 gen cấu trúc) dài ngắn khác nhau Trên ribosom, các mRNA đó tham gia tổng hợp hoàn toàn hình thành chuỗi RNA dương Trên khuôn chuỗi dương này RNA virus (chuỗi âm) được tổng hợp và kết hợp ngay với protein cấu trúc vừa được tổng hợp mà hình thành nucleocapsid Một mặt, các glycoprotein vừa được tổng hợp được chuyển từ màng lưới nội chất hạt sang màng lưới nội chất nhẵn, rồi bộ máy golgi rồi đến màng tế bào chất và tổ hợp vào trong màng tế bào Protein M được tổng hợp tương tự cũng chuyển động ra dưới màng tế bào chất và cố định với các glycoprotein ở màng Nucleocapsid di động đến dưới protein M, nhận áo ngoài nhờ nảy chồi qua màng đã biến đổi sẵn nêu trên mà thành thục Tuy nhiên, thông thường hầu hết các nucleocapsid ở lại bên trong tế bào chất ký chủ và được quan sát thấy dưới dạng các thể ẩn nhập trong tế bào chất Trong cảm nhiễm Paramyxovirus, ngoài sự khuếch tán cảm nhiễm theo cách nảy chồi qua màng còn đồng thời diễn ra hình thức lan truyền từ tế bào qua tế bào (cell to cell infection) Khi đó, nhờ cơ năng dung hợp màng của protein F, xuất hiện sự dung hợp ở bề mặt tế bào, qua đó từ tế bào đã nhiễm RNA virus lưu nhập sang các tế bào lân cận Vì vậy, cảm nhiễm kéo dài cũng

là đặc trưng khác của các virus thuộc họ này[3]

4 ngày, biểu hiện viêm kết mạc mắt, đôi khi có sốt và nhức đầu[4] Một số động vật

có vú như chó, chuột…cũng mắc bệnh này[2]

Trong phòng thí nghiệm: bào thai gà 9 - 12 thích nghi nhất với việc nuôi cấy virus Sau khi tiêm 36 - 48 giờ toàn bộ bào thai và nước trứng chứa virus[2] Dùng

gà giò để gây bệnh, sau khi tiêm truyền virus gà sẽ có triệu chứng và bệnh tích giống như gà mắc bệnh tự nhiên Có thể dùng chim bồ câu để gây bệnh bằng cách tiêm virus vào bắp thịt, sau 6 - 8 ngày bồ câu bị tê liệt và chết sau 15 - 16 ngày Ngoài ra cũng có thể tiêm vào óc hay xoang phúc mạc chuột bạch, chuột sẽ chết sau

3 - 6 ngày[4]

1.1.9 Cơ chế sinh bệnh

Thông thường căn bệnh theo đường tiêu hóa xâm nhập vào cơ thể Virus thường thâm nhiễm qua niêm mạc hầu - họng rồi vào máu Virus gây nhiễm trùng máu Cũng trong thời gian đó căn bệnh đi vào hầu hết cơ quan và tổ chức của cơ thể

và gây viêm hoại tử Nội mô thành huyết quản bị phá hoại gây xuất huyết và thâm nhiễm dịch xuất vào các xoang trong cơ thể Virus không trực tiếp gây viêm phổi song bệnh thường gây ra khó thở nghiêm trọng Nguyên nhân là do virus tác động gây rối loạn hệ tuần hoàn và trung khu hô hấp của hệ thần kinh trung ương

Phần lớn gà nhiễm bệnh thường chết ở thời kỳ nhiễm trùng huyết Đó là thể cấp tính Trường hợp bệnh kéo dài hơn, thường ở giai đoạn cuối dịch hay bệnh ở những loài ít cảm thụ như thủy cầm, virus sẽ biến mất khỏi máu rồi đi đến các cơ quan phủ tạng để vào ký sinh trong tổ chức thần kinh trung ương Kết quả dẫn đến thể bệnh mạn tính Phản ứng thuốc khi tiêm vacxin cũng là một trạng thái của bệnh này[2]

1.2 Virus viêm phế quản truyền nhiễm gà (IBV)

1.2.1 Hình thái và các tính trạng lý, hóa

IBV thuộc chi Coronavirus, họ Coronaviridae[3]

IBV có nhiều hình thái khác nhau nhưng chủ yếu là hình cầu Nó có lớp vỏ bọc, virion có đường kính 120 nm với các gai (spikes) hình dùi trên bề mặt với độ dài khoảng 20 nm Những gai này không xếp gần nhau như gai hình que của paramyxovirus Cấu trúc của ribonucleoprotein (RNP, core) được giải phóng một cách ngẫu nhiên từ những tiểu phần đã bị phân hủy có thể nhận ra từ

những tàn tích mà không phải bằng cách

nhuộm tiêu bản Hầu hết các đoạn RNP có

dạng sợi với đường kính chỉ 1 - 2 nm Cấu

trúc vòng xoắn với đường kính 10 - 15 nm

đôi lúc cũng được thấy[12]

Các chủng IBV khác nhau về mật

độ của chúng trong dung dịch đường, mật

độ lớn nhất thường trong khoảng 1,15 -

1,18 g/ml, nhưng các tiểu phần thấp hơn

(không có hoặc thiếu hụt RNP) và mật độ

cao hơn cũng có thể đạt được Tốc độ ly tâm lớn hơn 100.000 g thì cần phải tránh vì như thế sẽ làm mất những gai đó IBV chủng Beaudette dường như không ổn định đặc biệt; ấp trứng ở 37oC đôi khi làm mất một trong những thành phần của gai[12]

1.2.2 Cấu trúc hệ gen

RNA hệ gen có tính cảm nhiễm, là chuỗi một sợi phân bố thẳng, có cấu trúc

7 Me Gppp ở đầu 5’ và đoạn poly - A ở đầu 3’ Phân tử lượng của RNA hệ gen khoảng 9 - 11 MDa, kích thước 27 - 33 kb[3]

1.2.3 Protein

Virion có 4 protein cấu trúc là S, M, E và N

 Spike glycoprotein (S): yếu tố quy định đặc tính gây ngưng kết hồng cầu và đặc tính trung hòa của virus

 Protein màng (M)

 Protein vỏ (E): quan trọng đối với sự lắp ráp của virus

 Nucleoprotein (N): bao quanh và bảo vệ bộ gen RNA của virus[14] Glycoprotein S bao gồm hai tiểu đơn vị là S1 và S2, trình bày một loạt các yếu tố quyết định kháng nguyên có thể gây ra việc sản xuất kháng thể trung hòa cụ thể và cũng kích hoạt hệ miễn dịch tế bào Hầu hết các phương pháp phân loại huyết thanh được dựa trên các tiểu đơn vị S1 Cấu trúc protein này phụ thuộc vào các tiểu đơn vị

bổ sung cho S2 mà yếu tố này quy định hành vi neo đậu các protein S vào vỏ lipid

[15]

Ngoài protein S, protein nucleocapsid (N) là một protein cấu trúc quan trọng có thể góp phần gây bệnh của virus Các protein N nằm bên trong các virion, gắn liền với

hệ gen của nó và tương tác với protein nhân của virus và tế bào vật chủ Chức năng

sinh học quan trọng được quy định cho N - phosphoprotein, trong đó sự nhân lên

của virus, sự tương tác nhóm rRNA và bắt đầu nảy nở của các hạt virus trong tế bào vật chủ bị nhiễm bệnh Các gen mã hóa protein N được bảo toàn theo các chủng IBV khác nhau, cho phép tái tổ hợp giữa các chủng khác nhau[7]

1.2.4 Sức đề kháng

Đối với nhiệt độ: Hầu hết các chủng IBV đều bị bất hoạt sau 15 phút ở 560C

và sau 90 phút ở 450C Bảo quản IBV ở -200C sẽ tránh được điều đó Dịch niệu chứa virus không thay đổi sau khi bảo quản ở -300C trong nhiều năm Mô bào nhiễm virus bảo quản tốt trong glyxerol 50% và mô ở trong môi trường này có thể được đem đi chẩn đoán trong phòng thí nghiệm mà không cần làm lạnh Ở ngoài môi trường, vào mùa xuân nó có thể tồn tại được khoảng 12 ngày, còn vào mùa đông thì khoảng 56 ngày[12]

Đối với sự đông khô: Dịch niệu chứa virus được đông khô, bao gói trong

chân không và bảo quản trong phòng lạnh nó có thể sống được tối thiểu là 30 năm Hàm lượng glucose 10% đem lại cho IBV tính ổn định hiệu quả trong giai đoạn đông khô, cũng như đông lạnh[12]

Đối với pH: Các chủng virus khác nhau thì có tính bền vững khác nhau ở pH

= 3 Trong một nghiên cứu, sự giảm đi của hiệu giá virus ở nhiệt độ thường trong thời gian 4 giờ thay đổi từ 1 - 2 log10 cho hầu hết các phân lập, 5 log10 đối với những phân lập khác IBV khi nuôi cấy trong tế bào thì bền vững trong môi trường

ở pH = 6 và pH = 6,5 hơn ở pH = 7,0 - 8,0[12]

Đối với hóa chất: Thông thường các chủng IBV dễ mẫn cảm với ether,

nhưng một số chủng khác có thể tồn tại được ở nồng độ ether 20%, tất cả những virus đều bị tiêu diệt bởi chloroform 50% và sodium deoxycholate 0,1% IBV được xem là nhạy cảm đối với các chất sát trùng thông thường Khi xử lý bằng betapropiolactone (BPL) với nồng độ 0,05% hoặc 0,1% cũng như formalin 0,1% thì

sẽ tiêu diệt được IBV Khi chỉ xử lý bằng BPL sẽ không gây ảnh hưởng bất lợi đến khả năng gây ngưng kết hồng cầu của kháng nguyên IBV[12]

Sự thay đổi của phôi được thấy rõ sau khi gây nhiễm một vài ngày Chỉ những thay đổi nhỏ của phôi cũng có thể được thấy khi soi trứng Từ phía trên buồng hơi đến cuối trứng, phôi dường như bị xoắn vặn ở trong khối trứng với đôi chân bị biến dạng và bị ép phía trên đầu với màng ối dày dính chặt lên nó[12]

Nuôi cấy tế bào: Nuôi cấy tế bào một lớp rất được chú ý trong nghiên cứu virus IBV, tế bào thận phôi gà (CEK) và tế bào thận gà (CK) đã được sử dụng và hầu hết rất thành công Sự thích nghi của IBV đối với tế bào CEK đã được kiểm chứng và đánh giá bởi Gillette năm 1973 Đòi hỏi cần phải có nhiều lần cấy truyền

để tạo ra những tác động bệnh học tế bào một cách bao quát (CPE); biểu hiện rõ rệt trong nuôi cấy không nhuộm màu, hiệu giá lớn nhất của virus thay đổi theo từng chủng Mặc dù có những đốm hủy hoại tế bào nhưng sự biểu hiện qua sự nhuộm màu có thể được nhìn thấy sau lần cấy truyền đầu tiên Sự thích nghi của một số chủng đối với CEK được dễ dàng khi có sự cấy truyền phôi Kích thước của những đốm hủy hoại tế bào và hình dạng của nó thay đổi theo ảnh hưởng của từng chủng virus khác nhau Kích thước của những phần bệnh tích khi ảnh hưởng bởi hầu hết các chủng ở 400C lớn hơn ở 370C[12]

Giai đoạn tìm ẩn của virus IBV trong tế bào CEK hoặc CK là 3 - 4 giờ, với hiệu giá cực đại đạt được trong môi trường nuôi cấy đạt sau 13 - 14 giờ, phụ thuộc vào mức độ sinh sôi nảy nở của virus Tế bào gan phôi gà (CEL) cũng đã được chế

để xác định hiệu giá của IBV giống như từ tế bào CEK Việc chuẩn độ IB trong phôi gà thường cho hiệu quả cao hơn trong tế bào CEK hoặc CK từ 10 - 100 lần,

theo tuần tự nữa là nhạy cảm hơn tế bào CEL Hiệu giá lớn nhất của chủng Beaudette từ tế bào CK là không thay đổi trong khoảng pH từ 6 - 9 Khi pH tăng thì virus cũng giải phóng nhanh hơn nhưng nhanh chóng không hoạt động Độ pH thích hợp để virus đạt lớn nhất là pH = 6,5[12]

Nuôi cấy trên tổ chức: sự nhân lên của IBV khi nuôi cấy trong tổ chức khí quản và những mô khác đã được tiến hành bởi Durbyshire năm 1978 Những đoạn ống khí quản được lấy từ những phôi 20 ngày tuổi và được bảo quản trong ống nhỏ Sau đó gây nhiễm với IBV, thật dễ dàng quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại thấp những biến đổi xảy ra trong thời gian 3 - 4 ngày Việc nuôi cấy trên tổ chức khí quản đã được chứng minh rất thành công để phân lập, chuẩn độ và phân type IBV bởi vì không có sự thích nghi của những giống thực địa đối với yêu cầu phát triển

và dung nạp của IBV[12]

1.2.6 Độc lực

Các chủng IBV khác nhau thì có sự khác nhau về độc lực Việc cấy truyền IBV vào trong phôi gà sẽ dần dần giảm đi độc lực của virus Sự thích nghi cao trong trứng làm cho chủng Beaudette có tính sinh bệnh yếu, gây ra những thương tổn không nhìn thấy đối với phần thương tổn không nhìn thấy đối với phần biểu mô của

tổ chức khí quản và nhân lên một cách ưu thế ở trong các tế bào dưới biểu mô Sự miễn dịch của chủng này bị giảm đi Ngược lại chủng cường độc M41 phá hủy phần biểu mô trước khi định vị vào phần dưới biểu mô Chủng Australia T là chủng cường độc và được biết đến là chủng gây chết và tổn thương thận Các virus của các serotype khác cũng được biết đến là yếu tố gây bệnh lý ở thận nhưng ít gây bệnh dữ dội hơn chủng T, bao gồm các chủng như chủng Hoa Kỳ Gray và Holte, chủng

Mass - Holland 52 và Belgian B1648

Độc tính của virus đối với cơ quan sinh dục khác nhau theo các chủng IBV Các chủng IBV khác nhau có thể gây ra một khoảng ảnh hưởng ở nhưng gà đẻ mẫn cảm làm thay đổi màu của vỏ trứng và ảnh hưởng từ không giảm đẻ cho đến giảm

đẻ 10 - 15% Kể từ mùa đông năm 1990 - 1991, bệnh lý hiếm gặp đã được quan sát

thấy ở Anh, trùng hợp với sự xảy ra dịch bởi một serotype mới (793/B) của IBV Gà

đẻ Broiler biểu hiện sự nhợt nhạt bên ngoài, phần cơ ngực sâu phìn lên và có lúc xảy ra xuất huyết dạng dải và phù thủng sền sệt phía trên bề mặt của cơ Cơ ngực đã

bị ảnh hưởng cả ở bên trong và cả trên bề mặt[12]

1.2.7 Sự nhân lên

IBV được nhân lên trong tế bào chất, 6 mRNA được tạo ra bởi cơ chế sao chép không liên tục và điều đó có thể gây ra sự tái tổ hợp Virion được hình thành bởi quá trình nảy chồi ở màng nguyên sinh chất, không ở trên bề mặt tế bào Mặc

dù vậy protein S có thể di chuyển xuyên qua màng lên trên bề mặt tế bào, còn protein M thì không Virion được tích lũy trong những mụn nước trớn láng, nhưng

cơ chế giải phóng chúng từ tế bào thì chưa được biết Các virus mới bắt đầu xuất

hiện sau khi nhiễm từ 3 - 4 giờ, số lượng lớn nhất của virus trên một tế bào đạt được

sau 12 giờ ở 370C[12]

1.2.8 Tính gây bệnh

Gà là vật chủ tự nhiên quan trọng nhất của IB, mọi lứa tuổi của gà có thể bị

nhiễm IBV và các Coronavirus khác cũng đã được phân lập từ các loài khác như gà

tây, chim cút, chim trĩ và gà gô[8] Gà con dưới 6 tuần tuổi rất cảm thụ với bệnh Tuổi gà càng bé bệnh càng nặng và tỷ lệ chết càng cao Bệnh ở gà lớn thường nhẹ,

ít chết nhưng thời gian kéo dài nên làm giảm hiệu quả kinh tế chăn nuôi Nếu đàn

gà đang mắc một số bệnh truyền nhiễm đường hô hấp khác như mycoplasmosis, đậu…thì bệnh cũng ở thể nặng và tỷ lệ chết cao[5] Không có báo cáo nào cho thấy

IBV gây bệnh cho người[7]

IBV phát triển tốt trên phôi gà đang phát triển, số phôi chết và còi cọc tăng theo số lần cấy truyền Khi gây nhiễm trong phòng thí nghiệm đối với gà tây với IBV bằng phương pháp phun thì không tạo đáp ứng, nhưng khi gây nhiễm bằng đường tĩnh mạch thì sẽ thấy sự hiện diện của virus trong máu thời gian lên đến 48 giờ Chim trĩ và chim sáo đã có sự đề kháng được IBV khi gây nhiễm bằng cách tiêm vào khí quản Chuột sơ sinh rất mẫn cảm khi tiêm vào não đối với một số

chủng IBV chứ không phải toàn bộ các chủng[12]

1.2.9 Cơ chế sinh bệnh

Dù xâm nhập vào cơ thể bằng đường nào virus cũng đến ký sinh và sinh sản trong các tế bào biểu mô hô hấp làm các tế bào này bị thoái hóa và chết Virus phá hoại thành huyết quản làm tăng tiết dịch thẩm xuất và thâm nhiễm các tế bào lympho vào các xoang hô hấp Vì vậy gà trở nên khó thở Khi triệu chứng bệnh thể hiện rõ, bằng phương pháp kháng thể huỳnh quang có thể thấy virus gây bệnh trong nguyên sinh chất và nhân tế bào thượng bì niêm mạc mũi, phế quản, phế nang, túi hơi và cả trong một số phủ tạng như gan, lá lách…Kết quả của những biến đổi sâu

sắc của mô bào sẽ làm con vật chết trong thể cấp tính

Trong thể bệnh kéo dài, ngoài tế bào niêm mạc hô hấp, virus còn tác động và

tế bào cơ quan sinh dục làm biến đổi tổ chức của khí quan này, vì vậy sau khi đã khỏi bệnh con vật vẫn còn mang một số di chứng[2]

1.3 Tình hình nghiên cứu sản xuất vacxin

Dùng vacxin vô hoạt OVC-4 có chất nhũ dầu phòng tổng hợp 4 bệnh viêm phế quản truyền nhiễm, dịch tả, hội chứng giảm đẻ và hội chứng sưng đầu do công

ty Rhone Mérieux-Pháp sản xuất

Vacxin của hãng MBL & TRI BIO ngừa bệnh Newcastle và viêm phế quản truyền nhiễm Chủng ngừa theo lịch sau:

- Gà 3 ngày tuổi cho uống hay nhỏ mắt bằng vacxin Inacti/vac B1-M48

- Gà 21 ngày tuổi ngừa bằng vacxin BIO-SOTA Bron MM nhỏ mắt, cho uống hay phun sương

- Gà trên 3 tháng tuổi tái chủng bằng INACTI/VAC ND-BD-FC3 tiêm dưới da 0,5 ml/con

Vacxin AVINEW 1000ds, 2000ds là vacxin sống đông khô, phòng bệnh Newcastle chủng VG/GA trên gà

Vacxin vô hoạt GALLIMUNE ND phòng bệnh Newcastle trên gà

1.3.2 Ở Việt Nam

Ở Việt Nam việc nghiên cứu, sản xuất vacxin cũng quan tâm đặc biệt nhằm thúc đẩy hoạt động nghiên cứu, sản xuất vacxin đáp ứng nhu cầu về vacxin trong nước và hướng đến xuất khẩu vacxin Cụ thể nước ta đã nghiên cứu sản xuất được một số dạng vacxin sau đây

Vacxin Newcastle đông khô chủng F (hệ 2): Đây là vacxin sống làm bằng chủng F rất yếu, nuôi trên phôi trứng, chủng F không gây phản ứng, ngay cả ở đàn

gà con mới nở Nhưng nó có sức miễn dịch yếu và không bền Mỗi liều có ít nhất

107 EID50 virus Để dễ bảo quản vacxin được pha thêm chất bổ trợ và đông khô Thời gian miễn dịch 1 tháng Được sản xuất tại Trung tâm thú y Nam bộ (TP Hồ Chí Minh)

Vacxin đông khô Newcastle chủng Lasota: Đây là một chủng vacxin sống làm bằng chủng rất yếu Lasota Chủng Lasota rất yếu nhưng có độc lực cao hơn chủng F vì vậy chỉ nên dùng nó sau khi gà đã được miễn dịch với vacxin chủng F Tuy vậy cũng có nhiều trường hợp người ta dùng nó ngay từ lần miễn dịch thứ nhất cho gà Vacxin này bảo hộ gà từ 2 - 4 tháng tùy theo sức khỏe và tuổi gà Sản xuất tại xí nghiệp thuốc thú y Trung ương, Trung tâm Thú y Nam bộ, Phân viện thú y miền Trung

Vacxin Newcastle đông khô chủng Mukteswar (Hệ 1 hay chủng M): Sản xuất từ chủng yếu vừa Mukteswar (Mesogen) Mỗi liều chứa ít nhất 105 EID50 virus Chủng này gây miễn dịch bền nhưng nó có thể gây bệnh ở gà 2 tháng tuổi Vì vậy vacxin chỉ được sử dụng cho gà trên 2 tháng tuổi, khỏe mạnh Ở gà có bệnh hô hấp mãn tính (CRD), tiêm vacxin này có thể gây phản ứng làm trỗi dậy bệnh CRD và sức miễn dịch do vacxin sẽ yếu hoặc không có Trong trường hợp đó có thể sử dụng

một số kháng sinh như tylan cho gà độ một tuần trước khi dùng vacxin - ngoài ra khi tiêm cho gà mẹ đang nuôi con, gà mẹ có thể bài virus ra ngoài, gây miễn nhiễm vào gà con và gà con có thể chết Đối với gà sắp đẻ trứng hay đang đẻ trứng, vacxin

có thể giảm đẻ trứng Thời gian miễn dịch có thể suốt đời con gà Sản xuất tại Xí nghiệp thuốc thú y Trung ương; Trung tâm thú y Nam bộ (TP Hồ Chí Minh); Phân viện thú y miền Trung

Vacxin Newcastle chịu nhiệt: vacxin được chế tạo từ chủng virus V4 của Úc, cấy qua phôi trứng hay môi trường tế bào Virus nhược độc này có thể chịu nhiệt ở điều kiện thường kéo dài 30 - 60 ngày Vacxin tạo được miễn dịch cho gà với hiệu giá bảo hộ 60 - 70%, miễn dịch kéo dài 4 - 6 tháng Sản xuất tại Trung tâm nghiên cứu bệnh dại và bệnh động vật nhiệt đới

Ngoài ra để phục vụ cho công tác phòng và trị bệnh Newcastle và IB cho gà

ở mọi lứa tuổi, sản phẩm kháng thể Newcastle và IB ra đời để đáp ứng nhu cầu đó Chế phẩm này được sản xuất từ lòng đỏ trứng gà kháng virus Gumboro, Newcastle

và viêm phế quản truyền nhiễm Sản xuất tại Phân viện thú y miền Trung

Ở Việt Nam việc nghiên cứu IBV rất hạn chế Gần đây nhất là vào năm

2008, Trần Thị Liên và cộng sự đã nghiên cứu, sản xuất và thử nghiệm vacxin nhược độc đông khô phòng bệnh viêm phế quản truyền nhiễm ở gà

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 Vật liệu

2.1.1 Giống Virus

Giống virus dùng trong nghiên cứu là virus Newcastle (NDV) và virus viêm

phế quản truyền nhiễm (IBV) đang lưu lại tại Phân viện Thú y miền Trung

2.1.3 Môi trường và hóa chất

Bộ 4 ống môi trường dùng để kiểm tra vô trùng: môi trường thạch máu, môi trường thạch nấm, môi trường nước thịt, môi trường nước thịt gan yếm khí

Các dung dịch, hóa chất: NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, citrate natri 5%, nước cất hai lần, PBS, dung dịch formol 37 - 40%

Chất bổ trợ dầu Montanide ISA 70 VG của hãng SEPPIC Pháp

Hồng cầu gà 1%: Máu được lấy ở gà trống khỏe mạnh, không mắc bệnh

truyền nhiễm và ký sinh trùng, chưa được dùng vacxin Newcastle, IB Dùng syringe

vô trùng lấy dung dịch Citrat natri 5%, tiếp theo chọc vào tĩnh mạch cánh của gà để lấy lượng máu cần dùng ( tỷ lệ citrat natri : máu gà là 1:1) Chú ý hút từ từ cho khỏi

vỡ hồng cầu, sau đó lắc đều nhẹ nhàng và chuyển qua ống nghiệm Hồng cầu được rửa ít nhất 3 lần với nước sinh lý bằng cách ly tâm với tốc độ 2500 vòng/phút trong

5 phút Sau khi ly tâm lần 3 thì đổ nước mặt ở phía trên, hút hồng cầu pha với nước sinh lý để có huyễn dịch hồng cầu 1%

Dung dịch 10X PBS

CaCl2.2H2O 1,32 g MgCl2.6H2O 1,00 g

Na2HPO4 11,52 g

KH2PO4 2,00 g (Pha trong 1 lít nước cất Hấp cao áp tiệt trùng ở nhiệt độ 1210C trong 30 phút)

2.1.4 Thiết bị chuyên dụng

Máy ly tâm thường, máy trộn Ultra -Turrax T25, tủ ấm, tủ lạnh

2.2 Phương pháp

2.2.1 Thử nghiệm HA (Haemagglutination Test)

Cách tiến hành: Sẽ tiến hành phản ứng trên đĩa 96 giếng đáy hình chữ U

- Dung dịch PBS, hút 50 l nhỏ vào các giếng từ giếng 1 đến giếng 12

- Hút 50 l kháng nguyên nhỏ vào giếng 1 và trộn đều sau đó hút 50 l kháng nguyên pha loãng chuyển sang giếng 2, tiến hành theo trình tự cho đến giếng

12 rồi hút bỏ 50 l Trong các giếng vẫn còn 50 l kháng nguyên pha loãng

- Hút 50 l hồng cầu 1% nhỏ đều vào các giếng từ giếng 1 đến giếng 12

đáy giếng thì sẽ đọc kết quả hiệu giá ngưng kết ở giếng cuối của dãy ngưng kết đó

- Ở giếng đối chứng do không có mặt của kháng nguyên nên hồng cầu sẽ lắng xuống đáy tạo thành một vòng tròn đỏ So sánh với dãy phản ứng, nếu ở giếng

nào không còn kháng nguyên thì hồng cầu sẽ lắng xuống đáy thì sẽ đọc kết quả bên cạnh đó

2.2.2 Tiêm vào xoang niệu mô

Chọn trứng gà có phôi 9 - 11 ngày tuổi từ những gà mẹ chưa được tiêm chủng vacxin Newcastle, Viêm phế quản truyền nhiễm và không mắc bệnh truyền

nhiễm, ký sinh trùng, hình dạng trứng đồng đều

Soi trứng đánh dấu buồng hơi và vị trí tiêm cách xa thai và mạch máu lớn Đặt trứng lên giá trứng, sát trùng bằng cồn 700, sau đó sát trùng bằng cồn iod 10% vào đầu buồng hơi và vị trí tiêm Lấy dùi chọc thủng một lỗ ở vị trí tiêm, dùng ống tiêm nhỏ loại 1 ml đâm kim thẳng góc với quả trứng, rồi bơm huyễn dịch virus theo các nồng độ được pha loãng theo quy định của từng thí nghiệm vào xoang niệu Sau

đó dùng parafin lỏng gắn kín lỗ tiêm lại, để trứng nằm lên khay trứng cho vào tủ ấm

370C, duy trì độ ẩm 60%

2.2.3 Giám định đặc tính sinh học của virus Newcastle

2.2.3.1 Tiêm truyền giống virus Newcastle trên gà mẫn cảm

Chọn gà 3 tháng tuổi chưa được chủng vacxin Newcastle và không bị bệnh truyền nhiễm, ký sinh trùng; các con gà gần tương đương nhau về trọng lượng Sát trùng cơ ngực bằng cồn 700, tiêm bắp cho 6 con gà ( 0,5 ml/gà) huyễn dịch virus có

độ pha loãng 10-2 Theo dõi triệu chứng lâm sàng, mổ khám kiểm tra bệnh tích

Song song có lô đối chứng

2.2.3.2 Xác định chỉ số EID 50 , MDT

Xác định EID50 theo phương pháp Reed - Muench

Virus được pha loãng theo nồng độ từ 10-1 - 10-10 Mỗi nồng độ virus pha loãng tiêm cho 5 phôi gà 9 - 11 ngày tuổi, mỗi phôi 0,2 ml huyễn dịch virus Theo dõi và thu hoạch dịch niệu trứng chết sau 24 giờ, thời gian theo dõi trong 7 ngày, ghi rõ số lượng phôi chết theo các thời gian Sau khi hết thời gian theo dõi các phôi sống cũng được giết lạnh, tiến hành làm phản ứng HA nhằm xác định số phôi nhiễm Kết quả thu được tính toán theo Bảng 2.1

Số phôi không nhiễm

Số phôi nhiễm

Tổng không nhiễm

Tổng nhiễm

Tỷ lệ nhiễm (%)

Tỷ lệ % nhiễm = tổng nhiễm/(tổng nhiễm + tổng không nhiễm) x 100

logEID50 = LogA + x1Logf = LogB + x2Logf

x1 =

x2 =

A: Liều gây nhiễm phôi cận trên 50% tính theo độ pha loãng virus

B : Liều gây nhiễm phôi cận dưới 50% tính theo độ pha loãng virus A’: Tỷ lệ % phôi nhiễm cận trên 50%

B’: Tỷ lệ % phôi nhiễm cận dưới 50%

F : Hệ số pha loãng virus bậc 10

Xác định MDT

: Giá trị của MDT

h1…hn: Thời gian gây chết phôi

n: Số phôi nghiên cứu

Tổng sống

Tổng chết

Tỷ lệ chết (%)

A: Liều gây chết gà cận trên 50% tính theo độ pha loãng virus

B: Liều gây chết gà cận dưới 50% tính theo độ pha loãng virus

Bảng 2.3 Xác định chỉ số ICPI Ngày theo dõi

Biểu hiện

sau khi

Tổng cộng

Đơn vị nhân

Đơn vị nhân

Chỉ số IVBI được xác định theo công thức: IVBI =

2.2.4 Giám định đặc tính sinh học của IBV

2.2.4.1 Tiêm truyền giống virus viêm phế quản truyền nhiễm trên gà mẫn cảm

Chọn gà 28 ngày tuổi chưa được chủng vacxin viêm phế quản truyền nhiễm

và không bị bệnh truyền nhiễm, ký sinh trùng; các con gà gần tương đương nhau về trọng lượng Sát trùng cơ ngực gà bằng cồn 700, tiêm bắp cho 6 con gà (0,5 ml/gà) huyễn dịch virus có độ pha loãng 10-1, theo dõi triệu chứng lâm sàng, mỗ khám

kiểm tra bệnh tích Song song có lô đối chứng

2.2.4.2 Xác định chỉ số EID 50

Phương pháp xác định chỉ số EID50 được xác định theo phương pháp Reed - Muench Virus được pha loãng với nồng độ từ 10-1 - 10-10 Mỗi nồng độ pha loãng tiêm cho 5 phôi trứng 9 - 11 ngày tuổi, mỗi phôi 0,2 ml huyễn dịch virus Theo dõi

và thu hoạch dịch niệu trứng chết sau 24 giờ, thời gian theo dõi trong 7 ngày, ghi rõ

số lượng phôi chết theo thời gian Sau khi hết thời gian theo dõi các phôi sống cũng được giết lạnh, tiến hành làm phản ứng HA nhằm xác định số phôi nhiễm Kết quả thu được tính toán theo Bảng sau

Số phôi không nhiễm

Số phôi nhiễm

Tổng không nhiễm

Tổng nhiễm

Tỷ lệ nhiễm (%)

A: liều gây nhiễm phôi cận trên 50% tính theo độ pha loãng virus

B: liều gây nhiễm phôi cận dưới 50% tính theo độ pha loãng virus

A’: tỷ lệ % phôi nhiễm cận trên 50%

B’: tỷ lệ % phôi nhiễm cận dưới 50%

f: hệ số pha loãng virus bậc 10

2.2.5 Nhân giống và thu hoạch virus Newcastle và IBV trên trứng gà có phôi

* Nhân giống virus Newcastle

Tiêm 0,2 ml giống virus Newcastle nồng độ 10-2 vào xoang niệu trứng có phôi 10 ngày tuổi Theo dõi sự phát triển của phôi sau khi tiêm Những trứng có phôi chết trong khoảng 36 - 48 h được bảo quản 4 - 8oC trong 12 giờ trước khi mổ thu hoạch

* Nhân giống virus IB

Tiêm 0,2 ml giống virus IB nồng độ 10-2 vào xoang niệu trứng có phôi 10 ngày tuổi Theo dõi sự phát triển của phôi sau khi tiêm Thu hoạch những phôi có bệnh tích trong khoảng từ 48 đến 72 giờ được bảo quản 4 - 8oC trong 12 giờ trước khi mổ thu hoạch

* Thu hoạch virus trong nước trứng

Thu hoạch nước trứng theo phương pháp thường quy

Ly tâm nước trứng 6000 vòng/phút trong 5 phút

Thu dịch nổi kiểm tra vô trùng nước trứng chứa virus trên bộ 4 ống môi trường: nước thịt, nước thịt gan yếm khí, thạch máu, thạch nấm

Bảo quản nước trứng chứa virus ở điều kiện - 80oC

2.2.6 Xác định virus và chuẩn độ virus Newcastle và IBV trong nước trứng thu được

Xác định sự có mặt của virus Newcastle và IBV trong nước trứng thu được bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu gà (HA) theo quy trình của OIE (2008, 2009)

Chuẩn độ virus xác định hiệu giá virus Newcastle và IBV trên phôi gà 10 ngày tuổi theo phương pháp Reed - Muench

2.2.7 Xác định hiệu giá kháng thể kháng virus Newcastle và IBV trong huyết thanh gà được tiêm vacxin nhũ dầu

Gây miễn dịch cho gà bằng cách tiêm cho gà một liều vacxin theo quy định, định lấy máu gà sau khi tiêm vacxin

Xác định hiệu giá kháng thể kháng virus Newcastle và IBV trong huyết thanh gà được tiêm vacxin nhũ dầu bằng phương pháp ngăn trở ngưng kết hồng cầu

gà (HI) theo quy trình của OIE (2008, 2009)

2.2.8 Vô hoạt virus

Sử dụng các nồng độ formol 0,15%, 0,2%, 0,3% để vô hoạt 02 giống virus

ND và IB trong nước trứng bằng cách khuấy 12 giờ sau đó kiểm tra virus sau vô hoạt trên phôi gà 10 ngày tuổi

2.2.9 Kiểm tra vô hoạt

Đối với virus IB kiểm tra theo tiêu chuẩn vacxin vô hoạt của Asian (Asean Standard Requirement for Inactivated Infectious Bronchitis Vaccine) Sử dụng nước trứng chứa virus IB đã được vô hoạt tiêm vào xoang niệu phôi gà 10 ngày tuổi với liều 0,2 ml/ phôi Theo dõi sự phát triển của phôi 7 ngày sau tiêm Phôi gà phải không chết, không có bệnh tích Nước trứng không gây ngưng kết hồng cầu gà

Đối với virus ND kiểm tra theo tiêu chuẩn vacxin vô hoạt của Asian (Asean Standard Requirement for Inactivated Newcastle Disease Vaccine) Cách tiến hành tương tự như đối với virus IB

2.2.10 Sản xuất vacxin

Quy trình sản xuất vacxin nhị giá ND và IB nhũ dầu chế trên phôi gà được tóm tắt theo sơ đồ Hình 2.1