ĐẶNG THANH DŨNG Học viên thực hiện : Hoàng Thị Phi Nhung Lớp : SH20DB01 Ngày sinh: 23/1/2002 Nơi sinh: Thành phố Hồ Chí Minh Tên đề tài: NGHIÊN CỨU TẠO SẢN PHẨM TRÀ HOÀ TAN TỪ ĐÔNG T
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN THỰC TẬP
1.1 Địa điểm Địa điểm : Phòng thí nghiệm Vi sinh ứng dụng tại Viện Sinh học Nhiệt Đới , 9/621 đường Xa Lộ Hà Nội, phường Linh Trung, Thành phố Thủ Đức
Thời gian : Từ tháng 3/2024 đến tháng 5/2024
Nguyên liệu chính : Đông Trùng Hạ Thảo (Cordyceps militaris) được cung cấp bởi Phòng Vi sinh ứng dụng - Viện sinh học nhiệt đới
Nguyên liệu phụ : La Hán Quả, Hoa Cúc
1.3.2 Dụng cụ và thiết bị
Dụng cụ: MicroPipette, erlen, ống falcon, đĩa petri, đầu típ, ống nghiệm, ống đong, eppendorf, giấy lọc, tăm bông, phễu, đèn cồn, bình cồn, kéo…
Trong phòng thí nghiệm, các thiết bị quan trọng bao gồm tủ cấy vô trùng Telstar từ Tây Ban Nha, máy đo quang phổ Hitachi của Nhật Bản, máy lạnh Panasonic 2hp, máy ly tâm Rotanta 46R từ Đức, nồi khử trùng, tủ sấy, cân, máy đo pH, water path, nhiệt kế, máy vortex, máy xay và máy đông khô Những thiết bị này đóng vai trò thiết yếu trong việc đảm bảo quy trình nghiên cứu và thí nghiệm diễn ra hiệu quả và chính xác.
1.3.3 Môi trường và hóa chất
The study examines the effects of various chemicals and environmental factors, including Luria-Bertani (LB) medium, DPPH, ABTS, ascorbic acid (Vitamin C), DMSO, ampicillin, glucose, 5% phenol, sulfuric acid (H2SO4), dinitrosalicylic acid, 2N NaOH, sodium potassium tartrate, Folin-Ciocalteu reagent, and gallic acid These substances play crucial roles in biochemical assays and research applications, highlighting their significance in understanding chemical interactions and biological processes.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Quy trình thực hiện Đông Trùng Hạ Thảo, Hoa Cúc và La Hán Quả đã được sử dụng như một loại thảo dược để cải thiện sức khỏe con người và điều trị nhiều bệnh trên thế giới Ở Việt Nam, đông trùng hạ thảo khô được dùng làm đồ uống chăm sóc sức khỏe Tuy nhiên, đối với một số người, cách dùng này có vị hơi hăng gây khó uống Vì vậy, việc bổ sung thêm hương thơm và chất làm ngọt tự nhiên từ hoa cúc và la hán quả có thể làm tăng thêm hương vị hấp dẫn của Đông Trùng Hạ Thảo
Hình 2.1 Quy trình nghiên cứu chung
Thuyết minh quy trình thực hiện : Đông Trùng Hạ Thảo được cung cấp bởi Phòng
Vi sinh ứng dụng tại Viện sinh học nhiệt đới bắt đầu bằng việc lựa chọn nguyên liệu La Hán Quả và Hoa Cúc đạt tiêu chuẩn chất lượng, không bị dập nát hay hư hỏng Nguyên liệu sau đó được xử lý, xay nhuyễn thành bột và sấy khô ở nhiệt độ 60°C để loại bỏ nước, giúp quá trình đông khô diễn ra nhanh hơn và bảo quản các hợp chất dễ bay hơi, giữ nguyên hương vị và màu sắc tự nhiên Sau khi sấy xong, bột nguyên liệu được ngâm trong nước cất và đánh sóng siêu âm trong 2 tiếng, sau đó lọc bằng giấy lọc định tính để thu được dịch chiết Cuối cùng, 25% maltodextrin được bổ sung vào dịch chiết Đông Trùng Hạ Thảo và Hoa Cúc.
La Hán Quả có khả năng hút ẩm cao, giúp trà không bị vón cục và hòa tan dễ dàng trong nước Sau khi thu được bột từ quá trình đông khô, cần nghiền thật mịn và trộn đều để đảm bảo sự đồng nhất cho trà thành phẩm Đây là bước quan trọng quyết định đến màu sắc và hương vị của trà, đồng thời cần thực hiện thử nghiệm và đánh giá cảm quan để đạt được chất lượng tốt nhất.
2.2 Phương pháp tách chiết Đông Trùng Hạ Thảo (Cordyceps militaris) được sấy khô ở nhiệt độ 50-60 0 C và được nghiền mịn thành dạng bột Bột Đông Trùng Hạ Thảo được chiết bằng nước cất ở nhiệt độ phòng Tiến hành đánh sóng siêu âm trong vòng 2 tiếng để giải phóng nhiều các hợp chất một cách hiệu quả Dịch chiết Đông Trùng Hạ Thảo sau đó được lọc qua giấy lọc, bằng phễu với giấy lọc định tính 102 Mẫu thu được ở dạng lỏng, bổ sung thêm 25% maltodextrin giúp bảo vệ mẫu không bị ẩm, sau đó đông khô Cao chiết Đông Trùng Hạ Thảo được sử dụng cho các thí nghiệm xác định hoạt tính sinh học và các thành phần hoá học
Bột sau khi thu nhận được bảo quản trong hũ thuỷ tinh kín và dán nhãn để phối trộn Việc phối trộn các nguyên liệu phụ với giá thành thấp giúp giảm giá thành sản phẩm cho người tiêu dùng và tăng hương vị hấp dẫn của trà Các mẫu được trộn theo tỷ lệ 70:15:15, 70:20:10, 70:10:20, 70:5:25, và 70:25:5 với 3 lần lặp lại, sau đó tiến hành đánh giá cảm quan theo TCVN-3215-79 Chất liệu bao bì trà hoà tan cần đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm, dễ phân huỷ và thân thiện với môi trường.
Bảng 2.1 : Nghiệm thức khảo sát hàm lượng nguyên liệu có bổ sung : La Hán Quả và Hoa Cúc
2.4 Phương pháp phân tích cảm quan
Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 3215-79 quy định phương pháp kiểm tra chất lượng sản phẩm thực phẩm thông qua đánh giá cảm quan, áp dụng cho việc kiểm tra tất cả các chỉ tiêu chất lượng.
Thành phần La Hán Quả ( % )
Đánh giá cảm quan NT5 70 25 5 bao gồm các chỉ tiêu như trạng thái, màu sắc, mùi và vị của từng loại sản phẩm Để thực hiện đánh giá này, cần tiến hành trong điều kiện phòng thí nghiệm yên tĩnh, thoáng mát, đủ ánh sáng và sạch sẽ Người tham gia đánh giá phải là những cá nhân đã được huấn luyện, có sức khỏe tốt, như giáo viên bộ môn hoặc sinh viên ngành công nghệ chế biến thực phẩm Mỗi thí nghiệm sẽ có 8 người tham gia đánh giá.
Bảng 2.2 Bảng cho điểm đánh giá cảm quan sản phẩm khi nghiên cứu tỉ lệ phối trộn nguyên liệu bổ sung
Vàng sẫm, sáng đặc trưng cho sản phẩm
Vàng sẫm đặc trưng sản phẩm Đạt tiêu chuẩn, kỹ thuật theo yêu cầu
Màu vàng nhạt, không đặc trưng cho sản phẩm
Màu nhạt hoặc nâu đậm
Không cho màu vàng, sản phẩm bị lỗi nặng
Thơm tự nhiên, hài hòa hấp dẫn, dễ chịu đặc trưng
Không có mùi, vị lạ
Thơm tự nhiên hài hòa hấp dẫn, đặc trưng sản phẩm Đạt tiêu chuẩn yêu cầu kỹ thuật, có mùi thơm
Kém thơm, có mùi lạ hoặc mùi do khuyết tật, không đặc trưng sản phẩm
Lộ rõ mùi lạ hoặc mùi do khuyết tật
Sản phẩm có mùi lạ, bị hư hỏng
Vị dễ chịu, có hậu vị ngọt hài hòa
Có vị ngọt, hài hòa không có khuyết tật Đạt tiêu chuẩn yêu cầu kỹ thuật, đắng dễ chịu và không có mùi vị lạ hay có khuyết tật
Vị nhạt không đặc trưng, vị lạ và vị do khuyết tật
Không có vị, vị lạ hay vị khó uống
Có vị lạ, vị do khuyết tật, hư hỏng
Rất trong, đặc trưng cho sản phẩm
Nước pha tương đối hấp dẫn, không có cặn Đạt tiêu chuẩn theo yêu cầu kỹ thuật, không cặn không bị đục
Nước bị đục, không đặc trưng cho sản phẩm, có cặn
Nước đục, nhiều cặn lơ lửng
Nước đục, nhiều cặn lơ lửng, tạp chất
Khi đánh giá chất lượng cảm quan của sản phẩm trà, hãy đặt cốc trà ở vị trí cân bằng và đủ ánh sáng để dễ dàng quan sát màu sắc và trạng thái của nó Tiếp theo, cầm cốc trà gần mũi, mở nắp bằng tay và ngửi mùi sản phẩm để đánh giá hương thơm Cuối cùng, nếm thử trà để xác định vị giác và cảm nhận hương vị của sản phẩm.
2.5 Phương pháp xác định tính chống oxy hóa
Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu Cao chiết Đông Trùng Hạ Thảo (Cordyceps militaris) được xác định bằng phương pháp DPPH Mẫu được hòa trong nước cất với các nồng độ khác nhau: 500, 1000, 2000, 3000, và 4000 µg/mL Hỗn hợp phản ứng gồm 100 µL mẫu và 100 µL dung dịch DPPH được ủ ở 37°C trong 30 phút Sau thời gian ủ, mẫu được đo quang phổ ở bước sóng 517 nm Khả năng chống oxy hóa được tính toán theo công thức % scavenging activity = ([Acontrol - Asample] / Acontrol) x 100.
Acontrol)*100 Acid ascorbic (mẫu đối chứng dương) được pha loãng theo các nồng độ 3,125:6,25:12,5:25:50 àg/mL với dung mụi là nước cất
Gốc tự do ABTS+ được tạo ra từ phản ứng giữa ABTS 7 mM và kali persulfate (K2S2O8) 2,45 mM với tỷ lệ 3:1, ủ trong tối ở nhiệt độ phòng từ 12-16 giờ Dung dịch ABTS+ được pha loãng với nước cất để đạt độ hấp thụ 1.00 ± 0.02 tại bước sóng 734 nm Sau đó, bổ sung 100 µl ABTS+ vào các nồng độ khác nhau và đo độ hấp thụ tại 734 nm sau 5 phút Khả năng chống oxy hóa được xác định theo công thức % hoạt tính scavenging = ([Acontrol-Asample]/ Acontrol)*100.
Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn của cao dược liệu bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch
Nguyên tắc đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết dựa vào sự hình thành vòng vô khuẩn quanh giếng thạch sau khi nhỏ dịch chiết hoặc sử dụng khoanh giấy tẩm cao chiết Đối tượng kiểm định bao gồm các chủng vi sinh vật, đặc biệt là vi khuẩn Gram âm (-).
Escherichia coli, Vi khuẩn Gram (+): Staphylococcus aureus
Để chuẩn bị dịch huyền phù nuôi cấy vi khuẩn, vi khuẩn được nuôi cấy trên đĩa thạch và sau đó pha loãng với dung dịch nước muối sinh lý đã được tiệt trùng cho đến khi đạt độ đục tương đương >0,5 McFarland.
Chuẩn bị cao chiết với nồng độ 5, 10, 15, 20 mg/mL bằng cách pha 0,200 ml cao phân đoạn với 0,1 ml DMSO 10% và thêm nước để đạt nồng độ mong muốn Các mẫu cao chiết được bảo quản lạnh và làm ấm trước khi sử dụng Môi trường khảo sát sử dụng LB broth, chuẩn bị bằng cách hòa tan bột trong nước cất, hấp tiệt trùng 30 phút ở 121°C Đảm bảo môi trường vô khuẩn và đĩa petri được tiệt trùng trước khi đổ thạch Sau khi đổ thạch và để nguội, đĩa được bảo quản lạnh và làm ấm trước thử nghiệm kháng khuẩn Nhỏ 100 µL huyền phù lên bề mặt thạch, tráng đều bằng que thủy tinh vô khuẩn, để khô trong 15 phút Tạo giếng thạch 6mm, nhỏ 100 µL dịch cao chiết vào mỗi giếng và ủ ở 37°C trong 24 giờ Chứng âm là DMSO 10%, chứng dương là Ampicilin 1 mg/ml Cuối cùng, chụp ảnh và đo đường kính vòng vô khuẩn, lặp lại thí nghiệm 3 lần để tính giá trị trung bình.
D là đường kính vòng vô trùng, tính từ tâm lỗ (mm) d là đường kính lỗ thạch (mm)
2.6 Định lượng hoạt chất cordycepin
2.6.1 Phương pháp sắc ký lỏng (HPLC) để định lượng Cordycepin
Cân 1g mẫu Đông Trùng Hạ Thảo vào ống ly tâm 50 mL chứa ethanol 96%, sau đó chiết bằng rung siêu âm trong 30 phút Tiến hành ly tâm trong 10 phút với tốc độ 10.000 vòng/phút và chuyển dịch chiết vào bình định mức 100 ml, lọc qua giấy lọc để loại bỏ tạp chất Dịch chiết được phân tích bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) tại Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm TP.HCM, với giới hạn định lượng (LOQ) là 3 mg/kg, nhằm xác định hàm lượng Cordycepin và so sánh kết quả.
2.6.2 Phương pháp định lượng Polysaccharide bằng phương pháp Phenol- sulfuric acid
- Phương pháp xác định đường hoà tan trong bột Polysaccharide
Pha dung dịch glucose chuẩn ở các nồng độ khác nhau : 10, 20, 30, 40, 50, 60,
70, 80 và 90 àg/ml Pha loóng mẫu Polysaccharide được pha ở nồng độ 200 àg/ml
Hút 1ml dung dịch glucose chuẩn và mẫu Polysaccharide đã pha loãng theo nồng độ quy định để thực hiện phản ứng với 0,5 mL phenol 5% Sau đó, cẩn thận thêm 2,5 mL H2SO4 đậm đặc vào hỗn hợp phản ứng và để dung dịch nguội ở nhiệt độ phòng.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT
Hình 3.1: Cao chiết Đông Trùng Hạ Thảo (Cordyceps militaris) trước
(trái) và sau (phải) khi đông khô
Cao chiết Đông Trùng Hạ Thảo được lọc qua nước cất trước khi đông khô, tạo ra dạng lỏng màu nâu sẫm với mùi thơm đặc trưng Mỗi 150ml cao chiết bổ sung 25% maltodextrin và sau quá trình đông khô, sản phẩm thu được là bột màu nâu nhạt, giảm mùi vị đặc trưng Để có bột mịn, cần dùng muỗng cạo và giã bằng cối, sau đó lọc qua rây để tránh vón cục Sản phẩm nên được bảo quản trong hũ thủy tinh ở nơi khô ráo, thoáng mát Hiệu suất thu hồi bột của Đông Trùng Hạ Thảo, La Hán Quả và Hoa Cúc lần lượt đạt 42,35g/90g; 42,41g/100g và 38,51g/80g.
KẾT QUẢ PHỐI TRỘN VÀ ĐÁNH GIÁ CẢM QUAN
Hình 3.2: Sản phẩm bột trà hoà tan
Bột được cân theo 5 nghiệm thức được trình bày trong bảng 2.1 Trích ly với
Trong quá trình đánh giá cảm quan trà, 100 ml nước sôi được sử dụng trong 5 phút để pha trà Thí nghiệm này được lặp lại ba lần dưới cùng một điều kiện nhằm đánh giá các yếu tố như màu sắc, mùi, vị và trạng thái của trà hòa tan Qua đó, chúng tôi lựa chọn được công thức thí nghiệm phù hợp nhất.
Kết quả thu thập dữ liệu được thực hiện dựa trên đánh giá cảm quan từ 30 sinh viên thuộc Khoa Công Nghệ Sinh Học và Khoa Đào Tạo Đặc Biệt tại Trường Đại học Mở TP.HCM.
10 anh/chị tại phòng Vi sinh ứng dụng - Viện Sinh học nhiệt Đới được trình bày ở bảng tóm tắt sau:
Bảng 3.1 trình bày ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn giữa Đông Trùng Hạ Thảo (C militaris), La Hán Qủa và Hoa Cúc đến chất lượng cảm quan của sản phẩm, bao gồm các yếu tố màu sắc, mùi, vị và trạng thái.
Tỉ lệ phối trộn Đông Trùng
Hạ Thảo/La Hán Qủa/Hoa Cúc(%) Điểm chất lượng Điểm Xếp loại
Màu sắc Vị Mùi Trạng thái
Khi đánh giá cảm quan sản phẩm thực phẩm theo TCVN 3215 - 79, các chỉ tiêu cảm quan được chấm điểm trên thang điểm 20, tạo thành hệ thống 6 bậc với 5 điểm từ 0 đến 5 Điểm 0 tương ứng với sản phẩm bị hỏng, trong khi điểm từ 1 đến 5 thể hiện mức độ khuyết tật giảm dần Điểm 5 cho thấy sản phẩm không có lỗi và có các tính chất tốt rõ rệt cho chỉ tiêu đang xét.
Dựa vào kết quả bảng 3.1 theo TCVN 3215 - 79, ba loại trà nghiệm thức 1, 2 và 5 đều mang lại mùi hương đặc trưng của trà đông trùng hạ thảo, với hương thơm vừa phải, không quá nồng và cũng không quá nhạt Trong khi đó, nghiệm thức 3 và 4 có mùi hương hòa lẫn giữa trà và thảo mộc, với hương thơm nhạt dần.
5 đạt tiêu chí tạo thành sản phẩm mang mùi hương đáp ứng nhu cầu thị trường
Theo tiêu chí về màu sắc, nghiệm thức 1 và 2 cho ra màu sắc đậm hơn so với các nghiệm thức còn lại, trong khi nghiệm thức 3, 4, 5 lại mang đến màu sắc nhạt hơn nhưng được đánh giá là chính xác nhất với màu của trà Dựa trên tiêu chí này, nghiệm thức 3, 4, 5 được lựa chọn là phù hợp nhất để đạt được màu trà tối ưu.
Vị trà ở nghiệm thức 1 và 3 bị ảnh hưởng nhiều bởi các thành phần phối trộn, khiến cho hương vị trà không được rõ ràng Nghiệm thức 2 có vị trà ngọt, nhưng không phù hợp cho sản phẩm trà hòa tan Trong khi đó, nghiệm thức 4 và 5 đều cho vị trà nhạt Tất cả các nghiệm thức bột đều hòa tan tốt và không bị vón cục.
Từ kết quả thu được khi xét về vị em thấy nghiệm thức 4 và 5 được đánh giá tốt nhất so với các nghiệm thức còn lại
Hình 3.3: Đánh giá cảm quan sản phẩm trà hòa tan
Dịch trà hòa tan có màu vàng nhạt và mang hương thơm nhẹ của La Hán Quả và Hoa Cúc Sản phẩm này kết hợp vị ngọt đắng của Hoa Cúc và vị ngọt thanh của La Hán Quả, tạo nên một hương vị hài hòa và hậu vị ngọt Mặc dù đã nhận được những đánh giá tích cực về mùi, màu và vị, nhưng quá trình phát triển sản phẩm vẫn cần thời gian và thử nghiệm thêm để đạt được kết quả tốt nhất Thông qua quá trình phối trộn và thử nghiệm, sản phẩm trà hòa tan và trà túi lọc đã chứng tỏ giá trị dinh dưỡng cao và chứa đựng những thành phần quý giá, đáp ứng nhu cầu và sở thích đa dạng của người tiêu dùng.
Nghiệm thức 5 đã cho ra sản phẩm tối ưu trong phạm vi nhỏ, nhưng kết quả chưa hoàn toàn hợp lý để đưa đến tay người tiêu dùng do mỗi người có cảm nhận khác nhau Chúng tôi mong muốn cung cấp sản phẩm không chỉ cải thiện sức khỏe từ nguồn gốc tự nhiên mà còn xây dựng uy tín và niềm tin của người tiêu dùng Do đó, cần thời gian để nghiên cứu lại tỷ lệ phối trộn giữa Đông Trùng Hạ Thảo và các nguyên liệu phụ nhằm tạo ra sản phẩm trà hòa tan chất lượng.
KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH SINH HỌC
3.1 Phương pháp xác định hoạt tính kháng oxi hoá Để kiểm tra khả năng kháng oxy hóa của cao chiết Đông trùng hạ thảo, thử nghiệm DPPH và ABTS được thực hiện Sau khi thu nhận được cao chiết Đông Trùng Hạ Thảo (Cordyceps militaris) tiến hành pha loãng với dung môi nước ở các nồng độ khỏc nhau 500, 1000, 2000, 3000, 4000 àg/mL Thờm 100 àL DPPH vào cỏc giếng và tiến hành đo OD Thí nghiệm được lặp lại 3 lần Kết quả được thể hiện trong bảng sau:
Hình 3.4: Đồ thị DPPH của cao chiết Đông Trùng Trùng Thảo
Theo kết quả quan sát ở đồ thị hình 3.4, cho thấy cao chiết Đông Trùng Hạ Thảo
Cao chiết Đông Trùng Hạ Thảo (Cordyceps militaris) có khả năng kháng oxy hóa mạnh mẽ, với hoạt tính chống oxy hóa tỷ lệ thuận với nồng độ chiết xuất Khi nồng độ cao chiết tăng, hoạt tính chống oxy hóa cũng gia tăng, cho thấy khả năng hiệu quả trong việc loại bỏ gốc tự do.
Cao chiết Đông Trùng Hạ Thảo có khả năng trung hòa gốc tự do DPPH với giá trị IC50 đạt 2438,68 µg/ml Khi so sánh với giá trị IC50 của vitamin C (đối chứng) là 24,23 µg/ml, cho thấy hiệu quả chống oxi hóa của cao chiết Đông Trùng Hạ Thảo thấp hơn rõ rệt.
Kết luận cho thấy giá trị IC50 của cao chiết Đông Trùng Hạ Thảo là 2438,68 µg/ml, cho phép ức chế 50% khả năng bắt gốc tự do, trong khi giá trị IC50 của vitamin C là 24,23 µg/ml, cũng ức chế 50% khả năng bắt gốc tự do.
Năm 2023, Girish Gawas và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu về nấm Cordyceps militaris, trong đó họ đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa thông qua phương pháp bắt gốc tự do DPPH, đạt giá trị 140,15 µg/ml theo Milanezi và các cộng sự Kết quả nghiên cứu cho thấy mối quan hệ tuyến tính với phương trình y = 0,0182x + 5,6161 và hệ số xác định R² = 0,9559.
Nồng độ (àg/ml) trong thử nghiệm DPPH cho thấy sự chênh lệch đáng kể, lên tới 17,39 lần, cho thấy khả năng kháng oxi hoá cao hơn so với mẫu cao chiết của đề tài nghiên cứu này.
Hình 3.5: Đồ thị đường chuẩn vitamin C
Tuy nhiên qua kết quả nghiên cứu, nhận thấy rằng sản phẩm có chứa Đông Trùng
Hạ Thảo có tiềm năng phát triển mạnh mẽ trên thị trường nhờ vào các hoạt tính sinh học quý giá đã được chứng minh Sản phẩm chứa Đông Trùng Hạ Thảo không chỉ mang lại giá trị sức khỏe cho con người mà còn mở ra những khám phá mới về công dụng của loại nấm này.
Nhận xét kết quả ABTS: y = 1,89x + 4,1967 R² = 0,941
Nồng độ (àg/mL) Đồ thị đường chuẩn vitamin C
Hình 3.6: Đồ thị ABTS của cao chiết Đông Trùng Hạ Thảo
Theo quan sát từ đồ thị hình 3.6, nồng độ cao chiết Đông Trùng Hạ Thảo tăng dần từ thấp đến cao, đồng thời hoạt tính chống oxi cũng tăng theo, cho thấy mối quan hệ tỷ lệ thuận giữa nồng độ và hoạt tính chống oxi hóa Kết quả nghiên cứu đạt 176,44 àg/ml cho thấy sự khác biệt rõ rệt trong giá trị của mẫu cao chiết Nguyên nhân dẫn đến sự chênh lệch này có thể do yếu tố môi trường nuôi, chất lượng mẫu không đảm bảo trong quá trình xử lý, và thao tác thực hiện thí nghiệm.
Hình 3.7 : Đồ thị đường chuẩn của vitamin C y = 0,2698x + 2,3973 R² = 0,988
Nồng độ (àg/ml) Đồ thị đường chuẩn vitamin C
Nghiên cứu cho thấy cao chiết Đông Trùng Hạ Thảo (Cordyceps militaris) có khả năng trung hòa gốc tự do ABTS, với hoạt tính chống oxi hóa tăng theo nồng độ cao chiết Đồ thị vitamin C cho thấy cao chiết Đông Trùng Hạ Thảo có hoạt tính kháng oxi hóa kém hơn, với giá trị IC50 đạt 176,44 µg/ml, cho thấy sự khác biệt lớn so với vitamin C có giá trị IC50 chỉ 1,55 µg/ml Giá trị IC50 càng thấp thì khả năng kháng oxi hóa càng cao, cho thấy Đông Trùng Hạ Thảo cần nồng độ cao hơn để đạt hiệu quả tương tự vitamin C.
3.2 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Đông Trùng Hạ Thảo
Mẫu cao chiết Đông Trùng Hạ Thảo được hòa tan với dung môi DMSO theo các tỷ lệ 5mg/ml, 10mg/ml, 15mg/ml và 20mg/ml, sau đó vortex kỹ để đảm bảo cao chiết hòa tan hoàn toàn Tiếp theo, mẫu được lọc qua đầu lọc vi sinh 0,22 µm nhằm loại bỏ tạp chất, đảm bảo độ chính xác cho kết quả thí nghiệm Cuối cùng, tiến hành xác định hoạt tính kháng khuẩn của mẫu cao chiết Đông Trùng Hạ Thảo.
(Cordyceps militaris) bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch trong môi trường
3.2.1 Xác định hoạt tính kháng khuẩn E.Coli bằng cao chiết Đông Trùng Hạ
Hình 3.8:Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn E.Coli của cao chiết Đông Trùng Hạ Thảo ở nồng độ 5mg/ml (trái) và 10mg/ml (phải)
Hình 3.9: Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn E.Coli của cao chiết Đông Trùng Hạ Thảo ở nồng độ 15mg/ml (trái) và 20mg/ml (phải)
Trong thí nghiệm, mẫu cao chiết được thực hiện trên 18 đĩa Petri với môi trường LB, bao gồm 12 đĩa E.Coli với các nồng độ 5mg/ml, 10mg/ml, 15mg/ml và 20mg/ml pha với dung môi DMSO Các đĩa thí nghiệm cũng có Ampicillin (đối chứng dương) với nồng độ 1 mg/mL và DMSO (đối chứng âm) Sau 24 giờ quan sát, kết quả cho thấy mẫu cao chiết Đông Trùng Hạ Thảo không có khả năng kháng khuẩn đối với E.coli ở tất cả các nồng độ đã thử nghiệm, trong khi kháng sinh Ampicillin thể hiện khả năng kháng khuẩn rõ rệt.
3.2.2 Xác định hoạt tính kháng khuẩn S.aureus bằng cao chiết Đông Trùng Hạ Thảo (Cordyceps militaris)
Hình 3.10: Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn S.aureus ở nồng độ mẫu cao chiết 5mg/ml và 10mg/ml ( trái ) và nồng độ mẫu cao chiết
15mg/ml và 20mg/ml ( phải )
Trong thí nghiệm, mẫu cao chiết được thử nghiệm trên 18 đĩa Petri với môi trường LB, bao gồm 6 đĩa S.aureus với các nồng độ 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml và 20 mg/ml, pha với dung môi DMSO Các đĩa cũng chứa huyền phù vi khuẩn, Ampicillin (đối chứng dương) với nồng độ 1 mg/ml và DMSO (đối chứng âm) Sau 24 giờ quan sát, kết quả cho thấy mẫu cao chiết Đông Trùng Hạ Thảo chưa có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn.
S aureus S aureus năng kháng khuẩn S.aures ở các nồng độ 5mg/ml, 10mg/ml, 15mg/ml và 20mg/ml nhưng kháng sinh có kháng khuẩn
Nguyên nhân có thể là do mẫu cao chiết và nồng độ lựa chọn để kháng còn thấp hơn so với các thí nghiệm trước đây Điều kiện môi trường phòng thí nghiệm cũng ảnh hưởng đến vi khuẩn và mẫu cao chiết Nếu tăng nồng độ cao hơn và sử dụng dung môi khác trong quá trình thực hiện kháng khuẩn, khả năng kháng chủng vi khuẩn vẫn có thể xảy ra.
ĐỊNH LƯỢNG HOẠT CHẤT CHÍNH
4.1 Phương pháp sắc ký lỏng (HPLC) để định lượng Cordycepin
Dịch cao chiết đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) đã được phân tích tại Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm TP.HCM bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng hoạt chất Cordycepin trong đông trùng hạ thảo đạt mức 2179 mg/kg.
Hình 3.11: Kết quả thử nghiệm định lượng hoạt chất Cordycepin tại trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm TP.HCM
Theo nghiên cứu của Huang, L., et al., (2009), hàm lượng của các thành phần hoạt tính sinh học chính gồm Cordycepin và Adenosine trong quả thể và sợi nấm từ
Nghiên cứu về Cordycepin militaris đã được thực hiện thông qua phương pháp HPLC cải tiến, cho thấy hàm lượng trung bình của cordycepin trong quả thể đạt 2,654 ± 0,02 và 2,45 ± 0,03 mg/g Kết quả này cho thấy hàm lượng hoạt chất cordycepin trong nghiên cứu cao hơn một chút so với các kết quả định lượng trước đó.
Nghiên cứu của Trần Thanh Thy và cộng sự (2020) đã tiến hành nuôi C militaris trên vật chủ trong điều kiện bán nhân tạo Kết quả cho thấy hàm lượng cordycepin trong quả thể sấy khô đạt 5,25 mg/g, 6,1 mg/g và 5,34 mg/g tương ứng với các vật chủ Brihaspa astrostigmella, Rhynchophorus ferrugineus và Bombyx mori.
Hàm lượng hoạt chất Cordycepin trong Đông Trùng Hạ Thảo có sự biến động lớn giữa các nghiên cứu, phụ thuộc vào nhiều yếu tố Nghiên cứu cho thấy môi trường nuôi cấy nấm ảnh hưởng đáng kể đến việc tích lũy các thành phần hoạt tính sinh học Đặc biệt, hàm lượng trung bình của cordycepin trong quả thể cao hơn so với giai đoạn trong hệ sợi nấm của C militaris, và nồng độ oxy trong điều kiện nuôi cấy đóng vai trò quan trọng trong sự tích lũy này.
4.2 Phương pháp định lượng Polysaccharide bằng phương pháp Phenol- sulfuric acid
4.2.1 Phương pháp xác định đường hoà tan trong bột polysaccharide
Dung dịch glucose chuẩn được pha ở các nồng độ khác nhau : 10, 20, 30, 40,
Để tiến hành thí nghiệm, chuẩn bị các mẫu Polysaccharide với nồng độ 200 àg/ml, sau đó pha loãng với dung dịch glucose chuẩn Mỗi ống nghiệm sẽ chứa 1ml dung dịch glucose, mẫu Polysaccharide đã pha loãng, 0,5ml phenol 5%, và 2,5ml H2SO4 đậm đặc.
Hình 3.12: Pha dãy nồng dộ
Hình 3.13: Đồ thị đường chuẩn glucose y = 0,0094x + 0,0076 R² = 0,9569
Nồng độ (àg/ml) Đường chuẩn glucose
Kết quả định lượng cho thấy hàm lượng đường hòa tan trong mẫu polysaccharide thô đạt 12,09%, với hiệu suất chiết cao là 0,03% Điều này cho thấy hàm lượng đường hòa tan trong nguyên liệu Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) đạt 0,40%.
4.2.2 Xác định hàm lượng đường khử trong bột polysaccharide
Pha loãng dung dịch glucose chuẩn theo các nồng độ khác nhau: 50, 100, 150,
200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 àg/ml Mẫu được pha loóng theo nồng độ 1000 và
1500 àg/ml Mỗi nồng độ hỳt 0,5ml dung dịch glucose chuẩn và mẫu Polysaccharide, bổ sung thêm 0,5ml thuốc thử DNS, 5ml nước cất
Hình 3.14: Dãy nồng độ pha loãng
Hình 3.15 : Đồ thị đường chuẩn của dung dịch glucose
Kết quả định lượng đường khử cho thấy hàm lượng đường khử trong mẫu
Polysaccharide thô chiếm 6,89 % Hiệu suất chiết cao polysaccharide thô là 0,03%, như vậy hàm lượng đường khử trong mẫu nguyên liệu Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) đạt 0,29%
4.3 Định lượng Polyphenol bằng phương pháp Folin-Ciocalteu
Hình 3.16: Mẫu cao chiết có thuốc thử Folin-Ciocalteu y = 0,0007x - 0,0283 R² = 0,9629
Nồng độ ( àg/ml ) Đường chuẩn glucose
Phương trình đường chuẩn của acid gallic được biểu diễn dưới dạng y = ax + b, cho phép chúng ta tính toán phần trăm hàm lượng Polyphenol có trong mẫu cao chiết Đông Trùng Hạ Thảo.
(Cordyceps militaris) Từ kết quả nghiên cứu được trong mẫu cao chiết Đông Trùng
Hạ Thảo (Cordyceps militaris) xác định được 12,67 mg GAE/g Polyphenol
Trong bài báo cáo về tổng hàm lượng Polyphenol của Cordyceps militaris,
Nghiên cứu của Kiratiya Eiamthaworn và cộng sự (2022) đã xác định tổng hàm lượng Polyphenol trong mẫu cao chiết Cordyceps militaris bằng phương pháp Folin-Ciocalteu Mẫu cao chiết Cordyceps militaris, được ký hiệu là A và nuôi tại Thái Lan, có hàm lượng Polyphenol đạt 49,04 mg GAE/g.
Năm 2020, nghiên cứu của Choi E và cộng sự đã chỉ ra rằng Cordyceps militaris chứa nhiều thành phần dinh dưỡng, đặc biệt là hàm lượng Polyphenol Cụ thể, trong dịch chiết nước từ mẫu cao chiết Đông Trùng Hạ Thảo, hàm lượng Polyphenol được ghi nhận là 19,79 mg.
Dựa trên kết quả thu thập, có thể thấy sự chênh lệch giữa các mẫu cao chiết từ Đông Trùng Hạ Thảo Nguyên nhân của sự chênh lệch này chủ yếu do các yếu tố như nhiệt độ, thành phần dinh dưỡng, độ pH và nồng độ oxy trong môi trường nuôi trồng, tất cả đều ảnh hưởng đến cấu trúc và hoạt tính của các hợp chất trong sản phẩm.
Kh ả n ăn g h ấp t h ụ án h s án g (OD= 765 n m )
Nồng độ (àg/ml) Đường chuẩn acid gallic
Đồ thị đường chuẩn acid gallic được chiết xuất cho thấy rằng điều kiện phòng thí nghiệm và thời gian bảo quản có thể ảnh hưởng đến chất lượng mẫu cao chiết Thao tác trong quá trình thực hiện thí nghiệm cũng đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo độ chính xác và tin cậy của kết quả.