Nhân giống hoa dạ yến thảo

Nhiệm vụ yêu cầu về nội dung và số liệu ban đầu: - Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Javel và thời gian khử trùng lên sự vô trùng củamẫu đế hoa cây Dạ Yến Thảo - Khảo sát ảnh hưởng của nồng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

THIẾT LẬP QUI TRÌNH VI NHÂN GIỐNG HIỆU QUẢ CÂY

DẠ YẾN THẢO (Petunia hybrida Hort.Ex Vilmor.)

Sinh viên thực hiện : Nguyễn Hoàng Huynh

Mã số sinh viên : 1933850

Giảng viên hướng dẫn: ThS Võ Thanh Truyền

ThS Võ Thanh Phúc

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

THIẾT LẬP QUI TRÌNH VI NHÂN GIỐNG HIỆU QUẢ CÂY

DẠ YẾN THẢO (Petunia hybrida Hort.Ex Vilmor.)

Sinh viên thực hiện : Nguyễn Hoàng Huynh

Mã số sinh viên : 1933850

Giảng viên hướng dẫn :ThS Võ Thanh Truyền

ThS Võ Thanh Phúc

TP.HCM, tháng 09 năm 2024

ÐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ÐH BÁCH KHOA

KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Số: /BKĐT

-CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

1 Đề tài luận văn: Thiết lập qui trình vi nhân giống hiệu quả cây Dạ Yến Thảo

(Petunia hybrida Hort.Ex Vilmor.)

2 Nhiệm vụ (yêu cầu về nội dung và số liệu ban đầu):

- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Javel và thời gian khử trùng lên sự vô trùng củamẫu đế hoa cây Dạ Yến Thảo

- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA, NAA lên khả năng tái sinh chồi cây Dạ YếnThảo

- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA, Kinetin và Meta topolin lên khả năng nhânnhanh cụm chồi cây hoa Dạ Yến Thảo

- Khảo sát ảnh hưởng của khoáng đa lượng và nồng độ NAA lên sự hình thành rễ ở

cây Dạ Yến Thảo

- Khảo sát ảnh hưởng của loại giá thể đến khả năng sống của cây mô giai đoạn vườnươm

3 Ngày giao nhiệm vụ luận văn: Tháng 06/2024

4 Ngày hoàn thành nhiệm vụ: Tháng 09/2024

5 Họ tên người hướng dẫn: ThS Võ Thanh Phúc Phần hướng dẫn: 50%

ThS Võ Thanh Truyền Phần hướng dẫn: 50%

Nội dung và yêu cầu LVTN đã được thông qua Bộ môn

Ngày tháng năm 2024

PHẦN DÀNH CHO KHOA, BỘ MÔN:

Người duyệt (chấm sơ bộ):

Đơn vị:

Ngày bảo vệ:

Nơi lưu trữ luận văn:

LỜI CÁM ƠN

Qua thời gian học tập và rèn luyện tại Trường Đại học Bách Khoa Tp Hồ ChíMinh, được sự giảng dạy nhiệt tình của quý thầy cô, đặc biệt là quý thầy cô bộ mônCông nghệ sinh học đã truyền đạt cho em những kiến thức lý thuyết và thực hànhtrong suốt thời gian học tập tại trường Trong thời gian tham gia nghiên cứu tạiTrường đại học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh, em đã có cơ hội được thực hành vàhọc hỏi nhiều kinh nghiệm trong lĩnh vực chuyên ngành mà mình theo đuổi Cùngvới sự cố gắng của bản thân, em đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp của mình

Nhân dịp này, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới cô giáo hướng dẫn ThS

Võ Thanh Phúc, đã truyền đạt cho em những kiến thức chuyên sâu giúp em hoànthành luận văn tốt nghiệp đúng hạn Em cũng rất cảm ơn quý thầy cô bộ môn lànhững người đã truyền cho em kinh nghiệm và kiến thức quý giá đi theo em trêncon đường phát triển sau này

Cám ơn anh ThS Võ Thanh Truyền, cán bộ khu Ứng dụng công nghệ sinhhọc tỉnh Bến Tre, đã hỗ trợ và tạo điều kiện về mặt vật chất và truyền đạt cho emnhững kinh nghiệm nghiên cứu của bản thân, qua đó giúp em có thêm nhiều kiếnthức thực tiễn để hoàn thành luận văn tốt nghiệp của mình

Đồng thời xin cảm ơn sự giúp đỡ về mặt vật chất và tinh thần từ bạn bè vàgia đình, những người đã sát cánh bên em trong suốt quãng thời gian học tập tạitrường ĐH Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh

Do kiến thức chuyên môn còn hạn hẹp nên em không tránh khỏi những thiếusót trong cách trình bày báo cáo Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến củaquý thầy cô để luận văn tốt nghiệp của em hoàn chỉnh hơn

Tp Hồ Chí Minh, tháng 09 năm 2024

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Hoàng Huynh

MỤC LỤC

LỜI CÁM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC BẢNG vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Cây Dạ Yến Thảo 3

1.1.1 Đặc điểm hình thái 4

1.1.2 Đặc điểm sinh thái 4

1.1.3 Kỹ thuật nhân giống và chăm sóc hoa Dạ Yến Thảo 5

1.1.4 Giá trị kinh tế 7

1.2 Vi nhân giống 7

1.2.1 Các giai đoạn của quá trình vi nhân giống 7

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng 9

1.2.1.1 Các yếu tố vật lý 9

1.2.2.2 Các yếu tố hóa học 10

1.2.3 Ưu và nhược điểm giữa hai phương pháp truyền thống và nuôi cấy mô .12

1.3 Tình hình nghiên cứu vi nhân giống Dạ Yến Thảo 13

1.3.1 Trong nước 13

1.3.2 Ngoài nước 14

1.4 Meta topolin 16

1.5 Giá thể 19

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 22

2.1 Vật liệu 22

2.2 Phương pháp 22

2.2.1 Điều kiện thí nghiệm 22

2.2.2 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ Javel và thời gian khử trùng

lên sự vô trùng của mẫu cây Dạ Yến Thảo 23

2.2.3 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ BA, NAA lên khả năng tái sinh chồi cây Dạ Yến Thảo 23

2.2.4 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ BA, Kinetin và mT lên khả năng nhân nhanh cụm chồi cây hoa Dạ Yến Thảo 24

2.2.5 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của khoáng đa lượng và nồng độ NAA lên sự hình thành rễ ở cây Dạ Yến Thảo 24

2.2.6 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của loại giá thể đến khả năng sống của cây mô giai đoạn vườn ươm 24

2.2.7 Phương pháp đo và tính các chỉ tiêu 25

2.2.8 Phân tích thống kê 26

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27

3.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ Javel và thời gian khử trùng lên sự vô trùng của mẫu cây Dạ Yến Thảo 27

3.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ BA, Kinetin và Meta Topolin lên khả năng nhân cụm chồi cây hoa Dạ Yến Thảo 31

3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của khoáng đa lượng và nồng độ NAA lên sự hình thành rễ ở cây Dạ Yến Thảo 34

3.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của loại giá thể đến khả năng sống của cây mô giai đoạn vườn ươm 36

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40

4.1 Kết luận 40

4.2 Kiến nghị 41

PHỤ LỤC 1: QUY TRÌNH NUÔI CẤY MÔ CÂY HOA DẠ YẾN THẢO CỦA KHU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC CÁI MƠN 47

PHỤ LỤC 2: XỬ LÍ SỐ LIỆU 48

IAA : 3-Indol acetic acid

IBA : Indole-3-butyric acid

MemT : [6-(3-methoxybenzylamino)purine]

MemTR: [6-(3-methoxybenzylamino)-9- b-D-ribofuranosylpurine]

MS : Môi trường Murashige and Skoog (1962)

mT : Meta topolin

NAA :α-Naphthaleneacetic acid

NT : Nghiệm thức

TDZ : 1-phenyl-3 (1,2,3-thiadianozol-5-yl)

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hoa Dạ Yến Thảo cánh đơn (a) và cánh kép (b) 3

Hình 1.3 Ảnh hưởng của các loại cytokinin khác nhau đến sự phát triển của chồi và

Hình 3.1 a Mẫu vô trùng sau 7 ngày nuôi cấy, b Mẫu sau 14 ngày nuôi cấy 28

Hình 3.2 Hình thái mẫu chồi tái sinh trên các môi trường bổ sung các chất điều hòa

sinh trưởng với nồng độ khác nhau sau 14 ngày nuôi cấy 30

Hình 3.3 Hình thái mẫu trên các nghiệm thức bổ sung các loại cytokinin khác nhau

Hình 3.4 Mẫu cấy Dạ Yến Thảo trên môi trường ra rễ sau 21 ngày nuôi cấy 35

Hình 3.5 Ảnh hưởng của các loại giá thể lên khối lượng cây Dạ Yến Thảo ở giai

Hình 3.6 Mẫu cây Dạ Yến Thảo sau 30 ngày nuôi cấy ngoài vườn ươm 38

DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ Javel và thời gian khử trùng trên

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA, NAA lên khả năng tái sinh

chồi cây Dạ Yến Thảo sau 2 tuần nuôi cấy 29

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ BA, Kinetin và meta topolin lên khả năng nhân

cụm chồi cây hoa Dạ Yến Thảo sau 2 tuần nuôi cấy 31

Bảng 3.4 Ảnh hưởng hàm lượng khoáng và nồng độ NAA lên sự hình thành rễ cây

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của loại giá thể lên khả năng sống của cây Dạ Yến Thảo ở

giai đoạn ra vườn ươm sau 4 tuần nuôi cấy 36

MỞ ĐẦU

Petunia hybrida hay còn gọi là Dạ Yến Thảo là một loại cây bản địa của vùng

nhiệt đới và cận nhiệt đới Nam Mỹ Nó là một loại cây cảnh phổ biến được sử dụng

để trang trí nhà cửa, công viên và vườn Đây là cây hoa đẹp, sang trọng và đa dạng vềmàu sắc cũng như hình dáng của hoa Dạ Yến Thảo được trồng trong chậu dùng trangtrí trong nhà, công viên, vườn hoa, Sản xuất hoa Dạ Yến Thảo đã đem lại mộtnguồn lợi lớn đối với một số vùng chuyên trồng hoa như: Đà Lạt, Sa Đéc - ĐồngTháp, Tiền Giang, Chợ Lách - Bến Tre,.…

Nhu cầu thị trường về cây Dạ Yến Thảo ngày càng tăng vì tính phổ biến củaloại cây trồng này trong việc trang trí cho các dịp lễ hội hay dùng để trang trí tronggia đình Mặc dù ngày nay nhiều giống hoa mới đã được nhập trồng tại Việt Namnhưng thị trường hoa Dạ Yến Thảo vẫn khá ổn định và tiếp tục được mở rộng Gầnđây, một số tổ chức và cá nhân đã đứng ra nhập một số giống Dạ Yến Thảo mới vềtrồng phục vụ nhu cầu trong nước Tuy nhiên giá thành nhập cây giống khá cao, câycon dễ bị ảnh hưởng do tác động điều kiện môi trường khó có thể sản xuất trên diệnrộng

Nhiều phương pháp nhân giống cây hoa Dạ Yến Thảo đã được công bố Tuynhiên, phương pháp nhân giống qua nuôi cấy mô chồi nách cho kết quả tốt và nhanhchóng Cây Dạ Yến Thảo nhân giống bằng hạt cho tỉ lệ nảy mầm thấp (<60%) nhưngnhu cầu trồng với số lượng lớn vào dịp tết cao Để đáp ứng nhu cầu này, khu ứngdụng công nghệ sinh học Cái Mơn đơn vị thuộc Trung tâm Ứng dụng tiến bộ khoahọc và công nghệ tỉnh Bến Tre đã tiến hành nghiên cứu qui trình kỹ thuật nhân giốngcây Dạ Yến Thảo bằng phương pháp nuôi cấy mô Nghiên cứu được công bố ở báoĐồng Khởi tháng 8/2014 [phụ lục 1]

Meta topolin là một loại cytokinin mới được quan tâm trong những năm gầnđây Việc sử dụng hợp chất này trong nuôi cấy mô thực vật ngày càng tăng Metatopolin (mT) làm tăng tốc độ nhân chồi, cải thiện các đặc điểm sinh lý, hóa học vàsinh hóa, ra rễ thành công và dễ dàng thích nghi ở một số loài thực vật

Kết quả nghiên cứu của trung tâm ứng dụng tiến bộ khoa học và kỹ thuật tỉnhBến Tre chỉ mang tính thử nghiệm và so với hiện tại đã trở nên kém hiệu quả vì hiệnnay đã có nhiều nghiên cứu sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật mới cho

khả năng nhân nhanh chồi và tạo rễ nhanh, giúp rút ngắn thời gian nuôi cấy hơn như:Kinetin, Meta topolin (mT),…

Để cải tiến và hoàn thiện qui trình nhân giống cây hoa Dạ Yến Thảo, chúng tôithực hiện đề tài: “Thiết lập qui trình vi nhân giống hiệu quả cây Dạ Yến Thảo

(Petunia hybrida Hort.Ex Vilmor.)”, nhằm tạo ra số lượng lớn cây giống Dạ Yến

Thảo trong thời gian ngắn, với chất lượng đồng đều để cung cấp cho người trồng hoavới giá thành thấp

Luận văn tiến hành khảo sát và tìm ra chế độ khử trùng mẫu phù hợp; các chấtđiều hòa sinh trưởng phù hợp cho sự tái sinh và nhân nhanh chồi cây hoa Dạ YếnThảo; khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng khoáng đa lượng và chất điều hòa sinhtrưởng thực vật lên khả năng ra rễ của cây Dạ Yến Thảo Bên cạnh đó, luận văn cũngtiến hành khảo sát và đánh giá loại giá thể phù hợp cho cây khi ra vườn ươm

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây Dạ Yến Thảo

Dạ Yến Thảo (Petunia hybrida Hort.Ex Vilmor.) là cây bản địa của các nước

có khí hậu nhiệt đới hoặc cận nhiệt đới ở khu vực Nam Mỹ Phần lớn Dạ Yến Thảo

chúng ta trồng ngày nay đã được lai tạo từ Petunia axillaris, Pentunia violacea và

Pentunia inflata [1].

Phân bố - phân loại

Nguồn gốc phân loại

Tên khoa học : Petunia hybrida Hort.Ex Vilmor

Tên thông thường : petunia

Tên tiếng việt : Dã Yên Thảo, Dạ Yến Thảo [1]

Hình 1.1 Hoa Dạ Yến Thảo cánh đơn (a) và cánh kép (b)

1.1.1 Đặc điểm hình thái

Dạ Yến Thảo là cây thân cỏ mềm, là loại cây dễ trồng, nở nhiều hoa và rấtphong phú về màu sắc Cây phù hợp trồng trong chậu treo trang trí trước thềm nhàhoặc trồng trong các bồn hoa trong sân vườn Loại Dạ Yến Thảo cánh kép có thểtrồng trong các chậu để trang trí, chậu hoa treo trong nhà, trong vườn vì là thân leo,

sẽ thả rũ xuống rất đẹp Đặc biệt, nét đẹp và đặc sắc nhất là thân cây và hoa có mộtlớp lông tơ bao phủ thật mềm mại, ấn tượng và tao nhã Hoa Dạ Yến Thảo gốc cóhình phễu, nhưng các loại Dạ Yến Thảo lai tạo có hình dáng đa dạng và phong phúhơn nhiều Cánh có thể đơn lớp hoặc đa lớp, dạng gợn sóng Hoa có thể có sọc, đốmhoặc viền quanh cánh với nhiều màu sắc khác nhau như đỏ tía, màu hoa cà, màu oảihương, hồng, đỏ, trắng, vàng Khi chạm vào lá và cuống hoa thấy hơi dính và có mùithơm rất đặc biệt [2]

Thân: Có lông mịn bao quanh, một nách lá có thể phân nhiều nhánh

Lá: đơn, mọc đối, mặt trên và dưới của lá có phủ lớp lông mịn, lá hình oval,mềm mại, mép nguyên không có răng cưa

Hoa: Hoa lưỡng tính gồm 5 tiểu nhụy gắn ở phần dưới của ống vành Hoa Dạyến thảo hình phễu, tuy nhiên sự lai tạo đã cho nhiều dạng hoa khác nhau như hoacánh đơn, hoa cánh kép với mép có viền và gợn sóng Màu sắc hoa đa dạng như đỏ,cam, tím đến tím nhạt có mùi thơm dịu dàng

Quả: Quả thuộc loại quả nang 2 mảnh, nhiều hạt có lông tơ khi chín có màunâu sậm [2]

1.1.2 Đặc điểm sinh thái

Ánh sáng: Dạ Yến Thảo là cây ưa sáng, sẽ trở nên mảnh khảnh và ít hoa nếutrồng trong tối Cây thích hợp với điều kiện độ ẩm vừa phải, có thể sống trong điềukiện hơi khô nhưng không thích ứng với điều kiện ngập úng

Gió, nhiệt độ, độ ẩm: Cây thích hợp với khí hậu nóng và ẩm, không chịu đượcnhiệt độ quá lạnh hay quá nóng Rễ Dạ Yến Thảo rất nhạy cảm dễ bị héo úa khi nhiệt

độ môi trường cao Vì vậy nên che mát cho cây và tránh để ánh sáng chiếu trực tiếplên cây Tránh đặt chậu cây nơi gió lớn, cây hoa dễ bị tổn thương

Đất: Dạ Yến Thảo trồng được trên hầu hết các loại đất, nhưng tốt nhất là đấtmàu mỡ, đất có pH từ 6.0 – 7.0

Nước: Dạ Yến Thảo thường bị chết vì úng nước, vì vậy cần tưới nước đúngliều lượng, không tưới nước lên lá và nụ tránh làm thối lá và nụ Ngoài ra, Dạ YếnThảo thường bị héo rũ do nấm, bị thối nhũn do vi khuẩn cũng như sâu, sên, rệp cắnphá Một số bệnh virus cũng ảnh hưởng nhiều đến cây như làm biến dạng lá, câychậm phát triển, hình dạng thay đổi, thân tàn lụi liên tục, thối đỉnh, lá bị lốm đốm vàhéo, có khi kết dính thành cụm [2].

1.1.3 Kỹ thuật nhân giống và chăm sóc hoa Dạ Yến Thảo

Đối với nhân giống bằng hạt: Chuẩn bị hạt giống hoa có chất lượng tốt nhất,làm đất kỹ trước khi gieo hạt, nên bổ sung thêm xơ dừa vào đất để tạo nên độ thôngthoáng cho đất Sau khi hạt nảy mầm (7 – 10 ngày sau gieo) nên để cây hút nước từđáy chậu, chú ý không nên để cây bị thiếu nước, thiếu ánh sáng Sau khi cây ra 5 – 6

lá nên chuyển cây từ khay ươm trồng sang chậu cố định Lúc đầu nên đặt chậu tại nơimát, đợi cây đâm chồi mới và bén rễ thì chuyển cây ra chỗ có ánh nắng Đất trồngphải tơi xốp, phải thoát nước và giữ ẩm tốt Lúc này cần bón bổ sung đạm cho câyphát triển Tuy nhiên, giá cho mỗi hạt giống tương đối đắt (từ 1000 - 5000 đồng/hạttùy vào giống cây và màu sắc hoa), kích cỡ hạt rất nhỏ, tỉ lệ nảy mầm chỉ khoảng 60 -65% và chất lượng cây giống sẽ giảm dần ở mỗi thế hệ tiếp theo [3] [4]

Nhân giống bằng cách giâm cành: Cần chuẩn bị đất trồng chất lượng tốt, chậu

có lỗ thoát nước Cây Dạ Yến Thảo dùng để giâm cành thì cần sử dụng những cànhkhỏe, không bị bệnh, không thối thân Không nên lựa chọn cây Dạ Yến Thảo quá già

để giâm cành sẽ ảnh hưởng đến sức sống của cây và chất lượng của cây sau này Tiếnhành cắt cành và giâm cành vào lúc trời mát như vậy sẽ tránh làm cho cây bị héo, ảnhhưởng đến sự phát triển của cây sau này Nên bổ sung thêm xơ dừa và trấu vào trongđất dùng để giâm cành cũng như đất để trồng cây Dạ yến thảo Sau 5 - 7 ngày là rễ đãphát triển tốt có thể đưa ra trồng Tuy nhiên, phương pháp giâm cành cần có lượngcây mẹ lớn, hệ số nhân giống thấp, cây con sinh trưởng kém và dể bị ảnh hưởng bởicác yếu tố môi trường (độ ẩm cao gây thối chồi), dịch bệnh (thối nhũn, héo xanh,…)[3] [4]

Kỹ thuật trồng và chăm sóc Dạ Yến Thảo

Thời vụ trồng: Trồng hoa dạ yến thảo quanh năm, nhưng tốt nhất là vào mùaxuân, nắng nhiều cho hoa rực rỡ, năng suất và chất lượng tốt nhất, nâng cao giá trịkinh tế

Chuẩn bị nhà che: Để nâng cao chất lượng và hiệu quả kinh tế, trồng hoa DạYến Thảo có thể dùng nhà lưới hiện đại, nhà lưới đơn giản hoặc nhà che tạm tuỳ theođiều kiện Đảm bảo cung cấp đủ ánh sáng cho cây

Giá thể trồng: Yêu cầu giá thể phải tơi xốp, thoáng khí, khả năng giữ nước vàthoát nước tốt, được xử lý thuốc trừ nấm bệnh và vi khuẩn Giá thể trộn với lượng1m3 theo tỉ lệ mụn dừa, cát hoặc tro, phân chuồng (3:1:1) và bổ sung 8 kg phân hữu

cơ, 2 kg phân Super lân Tất cả hỗn hợp trộn đều, và sử dụng Ridomil (nồng độ3g/Lít) để xử lý nấm bệnh trong giá thể Giá thể sau khi trộn cần để 10 ngày cho hoai

Cây giống: Sử dụng cây cấy mô đã được ươm 1 tháng tuổi, tiêu chuẩn cây cóchiều cao cây 5-7 cm, có 4-6 lá

Cách trồng: Tuỳ thuộc vào kích thước, kiểu dáng khác nhau mà lựa chọn sốcây để trồng trong chậu cho phù hợp Hiện nay, chậu có đường kính 20 - 25 cm được

sử dụng phổ biến và trồng 1 cây/ chậu Cho giá thể đã trộn và xử lý nấm bệnh vàochậu, mặt giá thể cách miệng chậu 2-5 cm Nên trồng cây vào buổi chiều, sau khitrồng tưới đẫm nước

Bón phân: Dạ Yến Thảo cần rất nhiều chất dinh dưỡng nên phải thường xuyênbón phân, phân bón thích hợp cho Dạ Yến Thảo có thể sử dụng các loại phân hữu cơ

vi sinh,… và các loại phân NPK tổng hợp Giai đoạn bón lót (giai đoạn cây con) sửdụng NPK 30-10-10 Giai đoạn bón thúc (giai đoạn sinh trưởng, phát triển) sử dụngNPK 20-30-30 Trong trường hợp cây đã tốt mà chưa có hoa thì có thể bón NPK 10-30-30 thời gian bón 5-7 ngày/ 1 lần Ngoài ra để giúp hoa dạ yến thảo tăng sức đềkháng nên phun thêm Vitamin B1, phân bón lá loại dùng dưỡng hoa, hoặc KNO3 kíchthích ra hoa, hoa lâu tàn và bền màu hơn

Chăm sóc: Thường xuyên nhặt bỏ lá già, lá khô, lá bị sâu bệnh Ngắt bỏ nhữngcuống hoa tàn, hoa tàn giúp cho cây phát triển đẹp và cho hoa bền hơn

Một số sâu bệnh hại chính: Hoa Dạ Yến Thảo có 2 loại sâu hại chính là bọ trĩ

và sâu vẽ bùa Bệnh hại phổ biến là bệnh thối gốc (héo xanh), cháy lá, lở cổ rễ [5]

1.1.4 Giá trị kinh tế

Hoa Dạ Yến Thảo được rất nhiều người mua về trang trí ở ban công nhà, cáckhu resort, biệt thự, nhà hàng, trưng bày tại các sự kiện, hội nghị,… Ngoài ra, hoacòn xuất hiện ở các đại lý, quầy hàng hoa tươi trên khắp cả nước Có thể dễ dàng tìmmua cây hoa Dạ Yến Thảo loại chậu nhỏ với giá chỉ từ 20.000 – 30.000 đồng/chậu và80.0000 - 180.000 đồng cho một chậu lớn [6] Hiện nay, cây giống nuôi cấy mô hoa

Dạ Yến Thảo trở nên phổ biến với số lượng cây con lớn nhưng vẫn không đủ để cungứng cho thị trường Trung tâm Ứng dụng nông nghiệp công nghệ cao tỉnh Đồng Tháptrong năm 2017 vừa cung ứng trên 10.000 cây Dạ yến thảo cấy mô cho nông dân lànghoa Sa Đéc trồng phục vụ thị trường hoa Tết Nguyên đán Đinh Dậu Đầu ra hoa treo

Dạ Yến Thảo khá ổn định, khách hàng đến thu mua tận nhà, trồng lứa nào ra hoa làbán hết lứa đó cải thiện đời sống của người nông dân [7]

1.2 Vi nhân giống

Vi nhân giống (micropropagation) hay còn gọi là nhân giống in vitro, được xem

là một trong những kỹ thuật hữu hiệu nhất dùng để nhân nhanh các giống cây trồngsạch bệnh đã được tuyển chọn hoặc các nguồn gen thực vật quý hiếm [3]

1.2.1 Các giai đoạn của quá trình vi nhân giống

Vi nhân giống các cây trồng thường trải qua các bước sau:

Nuôi cấy mẫu ban đầu

Tạo thể nhân giống in vitro

Nhân giống in vitro

Tái sinh thành cây hoàn chỉnh in vitro

Huấn luyện thích nghi in vivo [3].

Nuôi cấy mẫu ban đầu

Mẫu được đưa vào nuôi cấy thường nuôi cấy vô trùng đang ở giai đoạn non,quá trình phân chia và phân hoá mạnh, đỉnh sinh trưởng và chồi bên được sử dụng ở

hầu hết các loại cây trồng, ngoài ra chóp đỉnh và chồi non nảy mầm từ hạt cũng được

sử dụng [2]

Tạo thể nhân giống in vitro

Mẫu nuôi cấy được cấy trên môi trường chọn lọc đặc biệt nhằm mục đích tạo

thể nhân giống in vitro Có 2 thể nhân giống in vitro, thể chồi (multiple shoot), thể cắt đốt (cutting), ngoài ra còn có thể giò (protocorm) Tạo thể nhân giống in vitro dựa

vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng Tuy nhiên có những loại câytrồng không có khả năng nhân giống, người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụmchồi từ mô sẹo Để tạo thể nhân giống, trong môi trường nuôi cấy thường được bổsung cytokinin, auxin, GA3 hay các chất hữu cơ khác [2]

Nhân giống in vitro

Đây là giai đoạn quan trọng trong việc nhân giống cây trồng bằng phươngpháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhằm mục đích tăng sinh thể nhân giống Vật liệunuôi cấy là những thể chồi Môi trường nuôi cấy thông thường giống với môi trườngtạo thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trìnhnhân giống kéo dài Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh được

diễn ra nhanh hơn Cây nhân giống in vitro có trạng thái sinh lý trẻ, và được duy trì

trong thời gian vô hạn [2]

Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro

Đây là giai đoạn tạo cây non hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá và rễ chuẩn bịchuyển ra vườn ươm cây Cây con phải khoẻ mạnh nhằm nâng cao sức sống khi rangoài môi trường bình thường Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào

đó là những chất kích thích quá trình ra rễ Điều kiện nuôi cấy tương tự với điều kiện

tự nhiên bên ngoài, một bước thuần hoá trước khi được tách ra khỏi điều kiện in

vitro Thường dùng các chất thuộc nhóm auxin kích thích ra rễ [2].

Huấn luyện thích nghi và chuyển cây ra vườn ươm

Đây là giai đoạn khó khăn nhất trong quá trình nhân giống vô tính Cây in

vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn định về dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt đột, độ

ẩm,… Khi chuyển ra đất, với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn như dinh dưỡngthấp, ánh sáng có cường độ mạnh, nhiệt độ cao, độ ẩm thấp,… Cây con dễ dàng bịstress, dễ mất nước và mau bị héo Để tránh tình trạng này vườn ươm cây cấy mô

phải mát, cường độ chiếu sáng thấp, nhiệt độ không khí mát, ẩm độ cao,…Cây nonthường được cấy trong luống ươm cây có cơ chất dễ thoát nước, tơi xốp giữ được ẩm,trong những ngày đầu cần được phủ nilon để giảm quá trình thoát hơi nước ở lá( thường 7- 10 ngày kể từ ngày cấy) Rễ được tạo ra trong quá trình cấy mô sẽ dần lụi

đi và rễ mới xuất hiện, cây con được xử lý với chất kích thích ra rễ bằng cách ngâmhay phun trên lá để rút ngắn thời gian ra rễ [2]

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng

1.2.1.1 Các yếu tố vật lý

* Nhiệt độ

Nhiệt độ thích hợp cho nuôi cấy mô là 20 - 27oC Theo Murashighe (1974)

nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến sự sinh trưởng và phát triển của cây in vitro qua

những tiến trình sinh lý như hô hấp hay hình thành tế bào và cơ quan

Xử lý nhiệt cây mẹ trước khi đưa vào nuôi cấy in vitro là một phương pháp xử

lý cơ bản để sản xuất cây sạch bệnh (Morel,1952, 1955) Xử lý nhiệt Dahlia trước khi

nuôi cấy in vitro cho thấy đỉnh sinh trưởng đã được khử virus (Read, 1989) Đỉnh

sinh trưởng có kích thước nhỏ, nhưng có thể nuôi cấy được, tạo ra stock mẹ sạch

bệnh in vitro đầu tiên trước khi tiến hành nhân giống xa hơn [2].

*Ánh sáng

Cường độ ánh sáng là một nhân tố quan trọng trong quang hợp, ảnh hưởng

đến khả năng nuôi cấy in vitro cây có lá xanh Chất lượng ánh sáng ảnh hưởng trực tiếp đến cây in vitro , vì ánh sáng cao hơn ánh sáng đỏ hay ánh sáng đỏ có ảnh hưởng

đến những biến đổi sinh lý trên cây như ra hoa, chế độ dinh dưỡng và những hiện

tượng khác như tăng sinh chồi in vitro bằng cách xử lý cây mẹ với ánh sáng đỏ (Read

et al 1978) Ánh sáng đỏ và ánh sáng có bước sóng cao hơn ánh sáng đỏ ảnh hưởng

đến khả năng ra rễ của cành cắt in vitro ở Azela, bằng cách xử lý hai tuần với ánh

sáng cao hơn ánh sáng đỏ sau đó xử lý hai tuần với ánh sáng đỏ cho thấy hiệu quảhơn ánh sáng trắng (Economou, 1982) Ánh sáng xanh cho thấy khả năng kích thích(Ward & Vance, 1967) và ức chế ( Seibert et al 1975) Hơn nữa có nhiều báo cáo

còn ghi nhận ảnh hưởng của bước sóng ánh sáng đến phản ứng cây in vitro (Kadkade

& Jopson, 1978) và tương tác giữa bước sóng ánh sáng và môi trường dinh dưỡng

(Villalobos et al 1984) Điều này cho thấy chất lượng ánh sáng ảnh hưởng đến nhiều

thay đổi ở cây in vitro [2].

* Các chất khí

Thành phần chất khí trong bình nuôi cấy ảnh hưởng đến sinh trưởng cây in

vitro O2, CO2 và ethylene là những thành phần chất khí được khảo sát nhiều trongmôi trường nuôi cấy Ẩm độ cũng được quan tâm đến, do ảnh hưởng đến quá trìnhlàm khô mẫu nuôi cấy Debergh et at, (1981) ghi nhận ẩm độ trong khoảng khôngbình nuôi cấy trong môi trường lỏng cao hơn môi trường agar 1% [2]

1.2.2.2 Các yếu tố hóa học

* Đa lượng :

Nhu cầu muối khoáng của mô và cơ quan thực vật được nuôi cấy về cơ bảngiống như cây trồng trong tự nhiên Các nguyên tố đa lượng cần có trong môi trườngnuôi cấy là: N, P, K, Ca, Mg và Lưu huỳnh (S) Nồng độ các yếu tố trên trong môitrường thường trên 30 mg/L dung dịch Môi trường giàu Kali xúc tiến quá trình traođổi chất mạnh mẽ, môi trường giàu Nitơ và Kali thích hợp cho sự hình thành chồimới

Nguồn Nitơ có thể được sử dụng dưới dạng muối khoáng như Amon và Nitrathoặc dạng hữu cơ như các axit amin Các muối khoáng có Nitơ thường dùng là:Ca(NO3)2 4H2O, KNO3, NaNO3 hoặc NH4NO3 Các muối Amon thường dùng là:(NH4)2SO4 hoặc NH4NO3.

Hai dạng Photpho thường dùng là: NaH3PO4.7H20 và KH2PO4

Kali được cung cấp cho môi trường dưới dạng KNO3, KCl, KH2PO4

Nguồn Canxi trong môi trường được cung cấp dưới dạng muối Ca (NO3)2.4H2P, CaCl2.6H2O hoặc CaCl2.2H2O

Magie và Lưu huỳnh được cung cấp dưới dạng MgSO4.7H2O hoặc (NH4)2SO4

Có nhiều loại môi trường có thành phần và tỷ lệ các chất thay đổi cho phù hợpvới đối tượng nuôi cấy: môi trường Knop (1959), Murashige và Skoog (1962),Gamborg (1968)…[2]

* Vi lượng

Các nguyên tố vi lượng như sắt, đồng, kẽm, mangan, molypden, bo, iod,coban cũng được cung cấp vào môi trường nuôi cấy như các muối khoáng đa lượngnhưng với nồng độ thấp hơn nhiều Các nguyên tố này tham gia vào các hoạt độngxúc tác của các enzyme.

Sắt thường được sử dụng dưới dạng Chelate: Fe-NaEDTA (Ethylene diaminetetra acetate), sắt dưới dạng Chelate có ưu điểm là không bị kết tủa trong môi trường

và sẽ được giải phóng dần ra theo nhu cầu của mô nuôi cấy Tuy nhiên các nghiêncứu cụ thể và chính xác về nhu cầu vi lượng của các mô nuôi cấy chưa được nhiều, vìvậy trong một số trường hợp chúng được cung cấp vào môi trường theo kinh nghiệm[2]

* Các Vitamin :

Các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy cũng tự tổng hợp được vitamin, nhưngkhông đáp ứng đủ nhu cầu của chúng, vì vậy cần cung cấp thêm các loại vitamin vàomôi trường Các vitamin thường được sử dụng chủ yếu thuộc nhóm B :B1 (Thiamine.HCl), B2 (Riboflavin), B5 (Pantothenic axit), B6 (Pyridoxin,Adermin) Những vitamin này thường được sử dụng với nồng độ thấp (0,01 – 0,1 mgtrong 1lít dung dịch) Myo-inositol (Bios I) là chất bền vững khi khử trùng bằngnhiệt, thường sử dụng với nồng độ cao: 50 – 500 mg cho 1 lít dung dịch

Trong một số trường hợp có thể sử dụng vitamin C ở nồng độ 1 – 10 mg/1 lítdung dịch với tư cách là chất chống oxy hoá

Các vitamin cần được bảo quản trong tủ lạnh trước khi đem sử dụng [2]

* Các chất tự nhiên

Trong nhiều thí nghiệm, việc thêm vào môi trường các hợp chất hữu cơ tựnhiên như dịch chiết nấm men, dịch chiết của quả, dịch thuỷ phân casein hay pepton,nước dừa… cũng như các amino acid tự do, các acid hữu cơ… có hiệu quả rõ rệt [2]

* Các chất điều hòa sinh trưởng

Trong thành phần môi trường nuôi cấy mô và tế bào, các chất điều hòa sinhtrưởng có vai trò quyết định nhất đến kết quả nuôi cấy Có 5 nhóm các chất điều hòasinh trưởng: Auxin, cytokinin, Gibberellin, Ethylene và Acid abscisic

Auxin có tác dụng kích thích sự dãn tế bào, kích thích sự hình thành rễ bấtđịnh và mô sẹo Trong môi trường nuôi cấy, các loại auxin thường được sử dụng

ở nồng độ 0,1 – 5,0 mg/1 lít tuỳ theo đối tượng nuôi cấy và từng loại chất được sửdụng Có 4 loại auxin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô và tế bào: Indole-3-Acetic Acid (IAA), Indole-3-Butyric Acid (IBA), Naphthaleneacetic Acid (NAA) và2,4 - dichlorophenoxyacetic acid (2,4 D) Trong đó IAA là chất có trong tự nhiên, cácchất còn lại được tổng hợp nhân tạo

Cytokinin: Các chất thuộc nhóm này có tác dụng kích thích sự phân chia tếbào và hình thành chồi Kinetin là cytokinin tự nhiên lần đầu tiên được Skoog pháthiện ra vào khoảng năm 1950 Tỷ lệ giữa Auxin và cytokinin quyết định sự phân hóacủa mô nuôi cấy theo hướng tạo chồi, tạo rễ hay hình thành mô sẹo Các chất thườngđược sử dụng là Kinetin (K), benzyladenine (BA) và benzylaminopurin (BAP)

Gibberellin (GA3): Giúp vươn thân chồi, nảy mầm hạt

Acid abscisic (ABA): Ảnh hưởng đến sự tăng trưởng (phát sinh hình thái),tăng trưởng ở phôi soma

Ethylene (C2H4): Ảnh hưởng đến sự tăng trưởng (phát sinh hình thái) nhưngkhi bổ sung với nồng độ cao sẽ khiến mẫu biểu hiện bất bình thường [2]

* Nguồn carbon

Nguồn carbon: khi nuôi cấy in vitro thì các tế bào thực vật không có khả năng

quang hợp nên đòi hỏi phải cung cấp nguồn carbon để tạo năng lượng cho các quátrình sinh lí, sinh hóa diễn ra bình thường trong tế bào Đường sucrose là nguồncacbon tốt nhất thường được sử dụng với nồng độ 2 – 3% Đường có thể bị caramenhóa nếu bị hấp khử trùng quá lâu và sẽ ức chế phản ứng với các hợp chất melanoidin,một chất sẫm màu có phân tử lượng cao, ức chế sự phát triển của tế bào [2]

* Chất làm đông

Chất làm đông đặc môi trường thường được sử dụng là Agar (thạch), có bảnchất là polysaccharide được sản xuất từ một số loài tảo ở biển Thạch được đưa vàomôi trường với liều lượng 6 – 12g/1 lít, sau khi đun sôi cho tan hết thạch, để nguộiđến 40oC thì hỗn hợp sẽ chuyển sang dạng gel, là môi trường cấy mẫu vật thuận tiện.Các hóa chất trong môi trường này vẫn có thể chuyển vận tương đối linh hoạt đếnnuôi mẫu cấy [2].

*Độ pH của môi trường

Độ pH của môi trường không những ảnh hưởng đến mẫu cấy mà còn trực tiếpảnh hưởng đến quá trình hấp thụ các chất dinh dưỡng từ môi trường nuôi cấy vàomẫu cấy Cần xác định và điều chỉnh độ pH cho từng loài cây, từng loại mô nuôi cấycho phù hợp trước khi khử trùng môi trường Nhìn chung pH biến động từ 5.6 - 5.8[2]

1.2.3 Ưu và nhược điểm giữa hai phương pháp truyền thống và nuôi cấy mô

Hoa Dạ Yến Thảo có thể nhân giống bằng cách gieo hạt nhưng hệ số nhânthấp, thời gian ra hoa từ 5 tháng trở lên Chất lượng cây giống không đồng nhất, khó

có thể sản xuất được ở quy mô công nghiệp và việc tạo cây giống phải cần nhiều diệntích [2]

Phương pháp nuôi cấy in vitro mang nhiều ưu điểm vượt trội so với các phương

pháp nhân giống cổ điển Các ưu điểm đó có thể liệt kê như cho hệ số nhân giốngcao, thời gian ra hoa ngắn khoảng 3 tháng, chất lượng cây giống đồng đều, sạch bệnh

và có thể sản xuất ở quy mô công nghiệp Sử dụng cây giống từ nuôi cấy mô tạo ra sựđồng nhất về chất lượng cây, tạo thuận lợi cho khâu tiêu thụ và cung ứng sản phẩm[2]

1.3 Tình hình nghiên cứu vi nhân giống Dạ Yến Thảo

1.3.1 Trong nước

Năm 2017, Bùi Thị Cúc và cộng sự tiến hành nghiên cứu “Nhân giống in vitro

cây Dạ Yến Thảo hoa hồng sọc tím” đã xác định được môi trường thích hợp nhất choviệc tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ là môi trường MS bổ sung sucrose 30 g/

L, agar 6 g/L và TDZ 0,25 mg/L, cho đường kính cụm chồi đạt 1,95 cm Môi trường

MS bổ sung sucrose 30 g/L, agar 6 g/L, BA 0,75 mg/L, NAA 0,1 mg/L thích hợp đểnhân nhanh chồi với hệ số nhân chồi đạt cao nhất là 73,11 lần sau 5 tuần nuôi cấy.Môi trường MS bổ sung NAA 0,1 mg/L cho tỷ lệ ra rễ đạt 100% với số rễ trung bìnhđạt 51,87 rễ /chồi [3].

Theo Phạm Phương Thu 2020, công thức khử trùng đạt hiệu quả cao nhất khi

xử lý mẫu đỉnh sinh trưởng Dạ Yến Thảo là dung dịch Javel 7,5% trong 10 phút chohiệu quả khử trùng đạt 53,23% Môi trường MS + BAP 0,1 mg/L cho tỉ lệ nhân chồi

cao nhất, đạt 67,5 chồi/mẫu Môi trường thích hợp để tạo cây in vitro hoàn chỉnh là

MS + 0,1 mg/L NAA Cây mô được chuyển sang nhà lưới và theo dõi trong 4 tuần,giá thể trồng gồm đất thịt, cát, tro trấu và phân xanh đạt tỉ lệ sống 45% [10]

Năm 2021, Nguyễn Tiến Long đã nghiên cứu vi nhân giống cây Dạ Yến Thảo.Kết quả cho thấy đoạn thân mang mắt ngủ được khử trùng bằng HgCl2 nồng độ 1%với thời gian là 10 phút cho tỉ lệ mẫu sạch đạt 60% Môi trường thích hợp cho táisinh chồi là MS bổ sung BAP 1 mg/L + NAA 0,1 mg/L + agar 6,5 g/L + saccharose

30 g/L cho ra tỉ lệ tạo chồi đạt 100%, số chồi đạt 2,73 chồi/mẫu Môi trường MS +

BA 1 mg/L + IBA 0,2 mg/L + agar 6,5 g/L + saccharose 30 g/L dùng để kích thíchtăng trưởng chồi với số chồi trung bình đạt 19,53 chồi/mẫu [11]

Năm 2022, Võ Thanh Phúc đã khảo sát ảnh hưởng của nano bạc lên sự hìnhthành chồi và rễ của cây hoa Dạ Yến Thảo Kết quả cho thấy, môi trường BA 0,75mg/L + nano bạc 5 mg/L là phù hợp cho quá trình nhân chồi Dạ Yến Thảo (5,29chồi/ mẫu, chiều cao chồi trung bình là 1,81 cm) Môi trường có NAA 0,1 mg/L+nano bạc 5 mg/L là phù hợp cho giai đoạn ra rễ của Dạ Yến Thảo (chiều cao cây 8,67cm; 17,43 rễ/ mẫu) Các cây trong nghiệm thức này có bộ rễ khoẻ mạnh, rễ nhiều, dài

và có nhiều rễ thứ cấp [12]

Năm 2024, Phạm Thị Huyền Trang đã nghiên cứu quy trình nhân giống in

vitro cây hoa Dạ Yến Thảo hoa tím Kết quả đã xác định được môi trường Murashige

and Skoog (MS) bổ sung BA 0,5 mg/L là thích hợp nhất để nhân chồi Dạ Yến Thảohoa tím với 19,78 chồi/mẫu, chiều cao chồi đạt 2,36 cm sau 6 tuần nuôi cấy Môitrường phù hợp nhất để dưỡng chồi là MS + sucrose 40 g/L, cho chồi to, xanh, lá to.Kết quả cũng cho thấy môi trường phù hợp cho giai đoạn ra rễ và thích nghi ngoàivườn ươm là MS + than hoạt tính 0,1 g/L, với tỷ lệ ra rễ đạt 100%, cây ra ngôi có

12,83 rễ/cây, chiều dài rễ đạt 2,28cm, rễ trắng, dài Sau 2 tuần thích nghi ngoài vườnươm, cây con có nguồn gốc từ môi trường ra rễ MS bổ sung than hoạt tính có tỷ lệsống đạt 100% với chiều cao cây đạt 6,47cm, số lá đạt 15,07 lá/cây [13].

1.3.2 Ngoài nước

Năm 2010, Hassan, Anas Yousef, Abu-Rayya và cộng sự đã nghiên cứu táisinh chồi từ mẫu lá của Dạ Yến Thảo Kết quả cho thấy việc kết hợp nồng độ BA (0;0,1; 0,4; 0,8 mg/L) với nồng độ NAA (0,0; 0,1 mg/L) trên môi trường MS cơ bản thuđược tỷ lệ chồi tái sinh từ lá là cao nhất Chiều cao chồi cao nhất (1,7 cm) thu đượctrên môi trường MS bổ sung BA 0,4 mg/1 và NAA 0,1 mg/L Trên môi trường MS +

BA 2,0 mg/L thu được kết quả tỉ lệ mẫu tái sinh chồi đạt 45% Tuy nhiên số chồi táisinh cao nhất thu được ở môi trường MS + BA 0,8 mg/L + NAA 0,1 mg/L [14]

Shuqin, W (2010) Thực nghiệm việc đưa và tái sinh chồi ngọn Petunia

hybrida trong 5 môi trường và nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến tỷ lệ

sống của cây Petunia hybrida Môi trường tái sinh thích hợp nhất là MS + NAA 0,5mg/L + 6-BA 0,3 mg/L + agar 8 g/L + sucrose 30 g/L [15]

Kết quả nghiên cứu của Danuta Kulpa và cộng sự (2011) ở giai đoạn nhânnhanh chồi Dạ Yến Thảo đã thu được kết quả tốt trên môi trường MS được bổ sungGA3 0,5 mg/L Các cây Dạ Yến Thảo trong môi trường này đã kích thích sự pháttriển của chồi chính cao với một số lượng lá lớn Đối với giai đoạn ra rễ, cây conđược nuôi trên môi trường MS bổ sung IAA 0,5 và 1,0 mg/L [16]

Habas và cộng sự (2019) nhận thấy khi sử dụng đỉnh chồi của Petunia hybrida

được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung BAP 1 mg/L + NAA 1 mg/L cho sốlượng chồi cao nhất (3 chồi/mẫu cấy) Các chồi được chuyển sang môi trường cơ bản

MS bổ sung các nồng độ GA3 khác nhau từ 0,05, 0,2, 0,5 và 1 mg/L để kéo dài chồi.Chiều dài chồi cao nhất (5,75 cm) được ghi nhận từ môi trường MS bổ sung GA3 0,2mg/L + BAP 0,2 mg/L Sự ra rễ của chồi trên môi trường MS bổ sung IBA 0,1-1 mg/

L và NAA Các chồi có rễ phát triển tốt đã được huấn luyện thích nghi thành công vàphát triển trong chậu chứa rêu than bùn đã khử trùng và được trồng trong điều kiệnthí nghiệm với tỷ lệ sống sót là 70% [17]

Iqra Farroq và cộng sự (2021) đã tiến hành vi nhân giống cho Petunia

hybrida Vilm Các đốt thân được khử trùng với thuốc diệt nấm (Carbendazim 0,02%)

trong 30 phút sau đó lắc với HgCl2 0,1% trong 5 phút, tiến hành lắc lại với cồn 70%trong 10 giây Khả năng tái sinh chồi tốt nhất trên môi trường MS có bổ sung BAP1,5 mg/L và IBA 0,5 mg/L Ở giai đoạn nhân nhanh chồi, sự kết hợp giữa BAP 0,1mg/L với 2,4-D 1,5 mg/L hoặc Kinetin 2 mg/L kết hợp với IBA 0,5 mg/L cho tỉ lệ táisinh chồi đạt 97,9%, số chồi tạo thành đạt 20,5 chồi với chiều dài chồi tối đa đạt 2,7

cm Sự hình thành rễ đạt tốt nhất khi sử dụng môi trường MS bổ sung IBA 1mg/L[18]

Firdous và cộng sự (2023) đã tiến hành vi nhân giống các loài Petunia hybrida

có giá trị kinh tế cao Kết quả cho thấy, chồi nách của Petunia hybrida Vilm được

nuôi cấy trên môi trường MS + 2,4 - D 2 mg/L + sucrose 30 g/L với điều kiện đượckiểm soát (độ ẩm 92%; nhiệt độ phòng ở 23oC; pH 5,8; chu kỳ chiếu sáng 16giờ/ngày) cho kết quả tốt nhất trong việc hình thành các phôi soma sau 4 tuần Songsong đó, tác giả đã tiến hành khảo sát giữa các nồng độ chất điều hòa sinh trưởng đến

sự phát triển của mô sẹo Kết quả cho thấy mô sẹo tăng trưởng và phát triển tốt khiđược nuôi cấy trên môi trường MS và các chất điều hòa sinh trưởng ở các nồng độsau: MS + BAP 2,5 mg/L; MS + BAP 2 mg/L + 2,4D 2,5 mg/L; MS + NAA1,5mg/L; MS + 2,4D 2mg/L + NAA 1,5 mg/L; MS + BAP 2,5 mg/L + NAA 1,5 mg/

L [19]

1.4 Meta topolin

Hình 1.2 Công thức hóa học của meta topolin [20]

Nhu cầu về việc sử dụng cytokinin tổng hợp có tác dụng tương tự nhưcytokinin tự nhiên đang ngày càng tăng Một nhóm cytokinin mới, gọi là topolin(C12H11N5O), hiện đang được sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật Về mặt hóa học,chúng được coi là cytokinin thơm (ARCKs), và các nghiên cứu cấu trúc cho thấytopolin bao gồm một benzyl có nhóm hydroxyl gắn tại vị trí N6 của adenine (Aremu

et al 2012a) Meta-topolin (mT) lần đầu tiên được phân lập từ lá của cây dương

(Populus canadensis).

Meta topolin (mT) có thể là một thay thế tiềm năng cho các cytokinin khác

Hợp chất này có thể tăng cường tỉ lệ sản xuất chồi in vitro và cải thiện các vấn đề

trong vi nhân giống mT ngăn cản sự phân hủy nhanh chóng của các phân tử diệp lục

tố và protein trong quá trình già đi của các loài thực vật khác nhau mT đã được ghinhận là một cytokinin có hiệu quả cao trong cảm ứng hình thành chồi ở nhiều loàicây dược liệu, cây cảnh và cây hương liệu Hiệu quả của mT so với các cytokininkhác là do sự khác biệt trong cấu trúc phân tử của nó mT được phân biệt với BA bởi

sự có mặt của một nhóm hydroxyl bổ sung trên vòng benzyl tại vị trí meta Nhómhydroxyl từ chuỗi bên của mT cho phép hình thành các chất chuyển hóa O-glucoside,một dạng dự trữ cytokinin không độc hại [47]

Kể từ khi phát hiện ra topolin, chúng đã trở thành lựa chọn thay thế cho cáccytokinin như benzyladenine, zeatin và kinetin trong nuôi cấy mô thực vật Những

năm gần đây, topolin đặc biệt là meta-topolin và các dẫn xuất của nó đã được sử

dụng để nuôi cấy và tối ưu hóa quy trình nhân giống giúp hạn chế các rối loạn sinh lýnhư đột biến, thủy tinh thể, Các nghiên cứu khác nhau cho thấy, các topolin có hiệuquả hơn nhiều so với các cytokinin khác [21]

Khi nuôi cấy Spathiphyllum floribundum, các chồi được nhân trong môi

trường với BA và meta - topolin cho thấy hiệu quả nhân chồi của mT cao và nhữngcây phát triển trên môi trường có 10 µM mT trở lên ra rễ tốt hơn trong quá trình thíchnghi so với những cây phát triển trên môi trường BA có cùng nồng độ [20] Việc sử

dụng meta - topolin (mT) đã làm tăng tốc độ nhân chồi và tạo rễ trên cây Aloe

polyphylla (Bairu et al 2007), cải thiện các đặc điểm sinh lý, hóa học và sinh hóa (

Aremu et al.2012) Malá và cộng sự 2013, ra rễ thành công và dễ dàng thíchnghi (Gentile và cộng sự, 2014) [20]

Michael W Bairu và cộng sự (2007) đã sử dụng meta topolin như một chấtthay thế cho BA và zeatin Meta topolin cho hiệu quả cao trong việc tăng tốc quá

trình nhân nhanh và tạo rễ trên cây Aloe polyphylla Nồng độ tối ưu cho sự tái sinh

Hình 1.3 Ảnh hưởng của các loại cytokinin khác nhau đến sự phát triển của

chồi và rễ cây Aloe polyphylla Các mẫu được xử lý với mT phát triển chồi tốt và

nhiều rễ, các mẫu trên môi trường có BA có hình thái bất thường, các mẫu trên môi

trường có zeatin không thể ra rễ [22]

Khanam và cộng sự (2020) đã khảo sát ảnh hưởng của mT và các cytokinin

lên quá trình vi nhân giống cây Allamanda cathartica L Trong số các cytokinin khác

nhau được thử nghiệm, số lượng chồi cao hơn (10,5 ± 0,16) với chiều dài chồi caohơn (6,1 ± 0,09 cm) đã được quan sát trên môi trường Murashige và Skoog (MS,

1962) bổ sung mT 3,0 μM M Tác động kết hợp của cytokinin - auxin (mT 3,0 μM M +NAA 0,5 μM M) dẫn đến việc tạo ra 26,2 ± 0,32 chồi trung bình trên mỗi mẫu cấy [24].

Manokari và cộng sự (2021) đã thử nghiệm 2 loại cytokinin là mT và BAP

trên cây Vanilla planifolia Sự phát triển và tăng trưởng chồi khỏe mạnh về số lượng

chồi (5,0 ± 0,20 / mẫu) với chiều dài chồi (4,3 ± 0,17 cm) được ghi nhận trên môitrường MS được bổ sung mT 1,0 mg/L Các chồi tái sinh được nhân lên trong môitrường lỏng bằng phương pháp nuôi cấy lắc liên tục tạo ra 62,0 ± 0,31 chồi (chiều dài3,8 ± 0,11 cm) trên mỗi mẫu cấy sau lần cấy chuyền thứ 3 [25]

Jayaprakash (2021) đã nuôi cấy đốt thân Oxystelma esculentum trên môi trường

MS bổ sung các loại cytokinin khác nhau (BA và mT) Kết quả cho thấy mẫu cấy tạochồi tốt nhất trên môi trường có mT 4,14 µM (7,25 chồi/ mẫu cấy) [26]

Manokari và cộng sự (2021) đã thử nghiệm mT trên cây Santalum album L.

Mẫu cấy phát triển và tăng trưởng với 8,2 chồi/cụm và chiều cao chồi đạt 4 cm Trênmôi trường MS + mT 0,5 mg/L + 0,25 mg/L NAA cho khả năng nhân nhanh chồi đạtcao nhất với 135 chồi/mẫu và chiều dài chồi 7,9 cm Hơn thế nữa việc kết hợp nữa

mT và NAA dẫn đến việc sản xuất ra hàm lượng acid amin tự do cao hơn so với kếthợp giữa BA và NAA Hiệu quả của mT cũng được thể hiện dựa trên hình thái giảiphẫu lá Ở lá có sự kết hợp giữa BA và NAA cho thấy lớp biểu bì lá kém phát triển,

hệ thống mô chưa phân hóa, mô cơ quan và mạch lá kém phát triển khi quan sát dướikính hiển vi Ngược lại khi kết hợp giữa mT và NAA lớp biểu bì tương đối dày, môphân hóa đồng đều Rễ được xử lý bằng IBA 500 mg/L trong 10 phút sau đó nhữngcây con sẽ được nuôi trong hỗn hợp soilrite® và xơ dừa (1:1) với tỉ lệ sống đạt 100%[27]

Dolker và cộng sự (2024) đã tiến hành nuôi cấy cây Rhodiola imbricata trong

môi trường lỏng có sử dụng mT Cây con trong ống nghiệm được đưa vào hộpchuyên dụng cho nuôi cấy lỏng Kết quả khảo sát cho thấy khi sử dụng môi trường

MS 20 mL + mT 5 µM cho số lượng chồi đạt cao nhất Môi trường MS + IBA 10 µM+ mT 5 µM cho tỉ lệ ra rễ đạt 95% và khi chuyển cây ra vườn ươm tỉ lệ cây sống đạt85% [28]

Neama Abdalla và cộng sự (2024) đã tiến hành nuôi cấy cây táo bằng phươngpháp vi nhân giống Kết quả cho thấy, meta-topolin đã được chứng minh là cytokinin

hiệu quả nhất trong giai đoạn nhân nhanh với 3,28 chồi/mẫu cấy và chiều dài chồi là1,46 cm khi sử dụng mT ở nồng độ 4 μM M Tuy nhiên, việc sử dụng thidiazuron(TDZ) hoặc benzyladenine (BA) làm nguồn cytokinin trong môi trường dẫn đến cácchồi có chất lượng thấp, chẳng hạn như các chồi còi cọc và dày với lá nhỏ Trongtrường hợp của benzyladenine riboside, nồng độ 8 μM M là hiệu quả nhất trong việcnhân nhanh chồi (4,76 chồi/mẫu cấy) nhưng lại gây ra sự phát triển thân dày với lánhỏ [29].

1.5 Giá thể

Giá thể trồng cây là môi trường mà thực vật sinh sống Nó được phối trộn đặcbiệt để hỗ trợ sự phát triển của cây trồng Nó có thể là chất rắn hoặc chất lỏng Nóicách khác, giá thể trồng cây là các thành phần khác nhau được phối trộn để tạo ramôi trường sống cho cây

Trong các vườn ươm thực vật tự nhiên, giá thể trồng cây bao gồm các nhiềuloại khác nhau Thông thường họ sẽ dùng đất trộn với các nguyên liệu như phân hữu

cơ, xơ dừa, xơ gỗ, hoặc rêu, than bùn Trong đó, phân hữu cơ thường được chế biến

từ vỏ cây, chất thải xanh [30]

A Xơ dừa

Xơ dừa là một loại giá thể trồng trọt phổ biến nhất trên thế giới Xơ dừa vốnđược xem là chất thải của ngành công nghiệp dừa Tuy nhiên, xơ dừa lại sớm đượcngành trồng trọt nhận định là môi trường hữu cơ hàng đầu Với những ưu điểm nhưtạo môi trường thoáng khí, có khả năng giữ nước vượt trội, tốc độ phân hủy nhanh[31] Thành phần dinh dưỡng trong mụn xơ dừa chưa xử lý có độ ẩm 45 - 55%; độdẫn điện (EC) > 2,5; độ pH dao động từ 5,5 - 6,5 [32] Tuy nhiên, do trong xơ dừacòn chứa tanin và lignin Hai chất này ảnh hưởng tới dự phát triển của bộ rễ của câytrồng Để làm giá thể, xơ dừa cần phải xử lý để làm giảm độ chát Có thể xử lý bằngcách xé nhỏ và ngâm xơ dừa trong nước vôi trong từ 1 đến 3 ngày [30]

B Vỏ trấu

Trấu là nguyên liệu có sẵn ở các nước sản xuất lúa gạo chứa khoảng 30% –50% cacbon hữu cơ Vỏ trấu chiếm khoảng 20% trọng lượng của gạo Nó gồm cácthành phần xenlulose (50%), lignin (25% –30%), silica (15% –20%), và độ ẩm (10%–15%) Vỏ trấu nhẹ, xốp được sử dụng làm giá thể sạch, có tác dụng giữ ấm, tạo ramôi trường giá thể thông thoáng cho cây, ủ gốc cây Ngoài ra, vỏ trấu ủ mục có tácdụng như một loại phân bón, làm đất tơi xốp, cung cấp chất hữu cơ cho cây trồng tốt.

Vỏ trấu được trộn với than và một số giá thể hữu cơ khác như xơ dừa, bã mía,… thaycho giá thể đất Vỏ trấu có thể sử dụng trực tiếp làm giá thể Để tăng thêm giá trị dinhdưỡng, vỏ trấu nên được ủ mục chung với phân chuồng, chế phẩm vi sinh để làmphân bón tốt cho cây trồng [33]

C Phân bò

Phân trâu, bò là một trong những loại phân chuồng cực kỳ quen thuộc trongsản xuất nông nghiệp Trâu, bò là loài ăn cỏ, do đó trong phân của chúng chứa mộtlượng lớn hữu cơ dao động từ 40 - 60% trong đó bao gồm các chất: acid humic, acidfulvic, các chất đạm, chất xơ, vi sinh vật,… giúp tăng độ mùn làm đất trở nên tơi xốp.Chất hữu cơ trong phân bò ủ mục còn giữ độ pH của đất ít thay đổi dao động từ 6,5 -7,5 và giữ chất khoáng trong đất, giữ độ ẩm cho cây, giúp cây trồng tránh hạn tốt,đồng thời giảm khả năng thất thoát phân bón do bay hơi hoặc rửa trôi Phân bò cungcấp dinh dưỡng tự nhiên giúp mọi loại cây trồng sinh trưởng và phát triển tốt Phân

bò có tác dụng làm giảm hiện tượng thối rễ cây, làm tăng độ dinh dưỡng cho câytrồng và giúp cây trồng sinh trưởng phát triển tốt [34] Tuy nhiên, phân bò cần được

ủ hoai mục trước mới có thể sử dụng vì trong đó còn chứa nhiều loại nấm bệnh gâyhại

Mụn sơ dừa Vỏ trấu Phân bò

Hình 1.4 Các loại giá thể

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu

Mẫu cây Dạ Yến Thảo được cung cấp bởi Khu ứng dụng công nghệ sinh họcCái Mơn, Bến Tre

2.2 Phương pháp

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm chung 2.2.1 Điều kiện thí nghiệm

Môi trường nuôi cấy cơ bản là môi trường MS (Murashighe-Skoog, 1962) [35]

bổ sung myo inositol 100 mg/L, agar 7 g/L, pH 5,8

Điều kiện nuôi cấy: mẫu được đặt trong phòng nuôi cây có nhiệt độ 25 ± 20C,cường độ chiếu sáng là 3000 lux 12 giờ/ngày, ẩm độ là 70-80%

Ra vườn ươm

Xơ dừa, xơ dừa+trấu, xơ

dừa+ phân bò

Đế hoa

Điều kiện vườn ươm: nhà lưới thái độ che phủ (độ cắt nắng): 85%, nhiệt độ banngày 32 ± 20C, nhiệt độ ban đêm 23 ± 20C

2.2.2 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ Javel và thời gian khử trùng lên sự

vô trùng của mẫu cây Dạ Yến Thảo

Mẫu cấy: đế hoa Dạ Yến Thảo đơn màu hồng phấn được trồng tại nhà lưới củakhu ứng dụng công nghệ sinh học Cái Mơn, Bến Tre

Hình 2.2 Mẫu hoa và đế hoa của cây Dạ Yến Thảo

Đế hoa được thu nhận từ vườn ươm trong nhà lưới, sau đó được rửa dưới vòinước máy trong 10 phút Mẫu được lắc với cồn 70% trong 1 phút, sau đó được rửa lạivới nước cất vô trùng 3 lần Tiếp đến, mẫu được lắc với Javel nồng độ 20, 25, 33%trong thời gian 10, 15, 20 phút và rửa lại với nước cất vô trùng 3 lần

Sau đó, mẫu cấy được cấy lên môi trường cơ bản có bổ sung BA 0,5 mg/L

Chỉ tiêu theo dõi sau 1 tuần:

Tỷ lệ mẫu sống vô trùng (%) = x 100

Mỗi nghiệm thức được tiến hành trên 3 mẫu và được lặp lại 3 lần

2.2.3 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ BA, NAA lên khả năng tái sinh chồi cây Dạ Yến Thảo

Sau 14 ngày nuôi cấy, các mẫu đế hoa đã vô trùng được cấy chuyển sang môitrường MS có bổ sung BA (0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3 mg/L) và NAA (0; 0,1 mg/L) +sucrose 30g/L Môi trường không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng được sử dụnglàm môi trường đối chứng

Chỉ tiêu theo dõi sau 14 ngày:

Số chồi tạo thành, đường kính mô sẹo và hình thái mẫu cấy (quan sát mẫu saumỗi 7 ngày)

Mỗi nghiệm thức được tiến hành trên 3 mẫu và được lặp lại 3 lần

2.2.4 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ BA, Kinetin và mT lên khả năng nhân nhanh cụm chồi cây hoa Dạ Yến Thảo

Cụm chồi được cắt thành những cụm nhỏ (đường kính 1 cm) được cấy vàomôi trường nhân chồi Môi trường được sử dụng là môi trường MS + sucrose 30g/L+ agar 7 g/L, BA, kinetin, mT có nồng độ khác nhau (0,5; 1; 1,5 mg/L) Môi trường

MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng làm môi trườngđối chứng Thời gian giữa 2 lần cấy chuyền là 3 tuần (21 ngày)

Chỉ tiêu theo dõi: chiều cao chồi (cm), số chồi

và hình thái chồi sau 14 ngày nuôi cấy

Thời gian theo dõi mẫu: sau 5, 10, 14 ngày

Mỗi nghiệm thức được tiến hành trên 3 mẫu, và được lặp lại 3 lần

2.2.5 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của khoáng đa lượng và nồng độ NAA lên sự hình thành rễ ở cây Dạ Yến Thảo

Các chồi có chiều cao 2,5 cm được tách ra và cấy trên môi trường MS và ½

MS (nồng độ các khoáng đa lượng NH4NO3, KNO3, CACl2, MgSO4, KH2PO4 giảmlần lượt còn 1/2, khoáng vi lượng giữ nguyên) bổ sung myo inositol 100 mg/L, agar 7g/L, NAA 0; 0,5; 1 mg/L, pH 5,8; than hoạt tính 0,5g/L

Chỉ tiêu theo dõi sau 21 ngày nuôi cấy:

Chiều cao cây (cm), số rễ, chiều dài rễ (cm), tỉ lệ tạo rễ và hình thái rễ

Thời gian theo dõi mẫu: sau 7, 14, 21 ngày

Mỗi nghiệm thức được tiến hành trên 3 mẫu, và được lặp lại 03 lần

2.2.6 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của loại giá thể đến khả năng sống của cây mô giai đoạn vườn ươm

Các cây con được chọn lọc và được rửa sạch phần rễ, loại bỏ agar, ngâm rễtrong dung dịch diệt nấm COC 85 trong 5 phút Sau đó, cây con được cắt bỏ ngọn

dừa, mụn xơ dừa + trấu, mụn xơ dừa + phân bò (tỉ lệ 1:1) Cây được bọc kín với túinilon trắng trong 15 ngày đầu, cách 2 - 3 ngày kiểm tra và tưới bằng bình xịt phunsương Sau 15 ngày, cây con còn sống sẽ được chuyển vào chậu nhựa với cùng loạigiá thể ban đầu nuôi trong nhà lưới của khu ứng dụng công nghệ sinh học Cái Mơn.

Điều kiện trồng

Ánh sáng được che bằng lưới thái giảm 85%, nhiệt độ ban ngày 32 ± 2oC, nhiệt

độ ban đêm 23 ± 2oC Các cây con tiếp tục được tưới phun sương 2 - 3 ngày/lần vàobuổi chiều mát

Chuẩn bị giá thể

Giá thể mụn xơ dừa và phân bò được ủ hoai bằng chế phẩm nấm Trichodermađược cung cấp bởi công ty TNHH Thủy Kim Sinh

- Giá thể xơ dừa loại bao 25 kg được trộn với 200 gam nấm Trichoderma

- Giá thể phân bò loại bao 50 kg được trộn với 500 gam nấm Trichoderma

- Tưới nước ướt đều và dùng bạt nhựa phủ lên ủ trong 1 tháng

- Sau 1 tháng ủ hoai giá thể, dùng rây lỗ 0,25 mm rây lấy hạt mịn để dùng làm giá thểcho thí nghiệm

Chỉ tiêu theo dõi sau 30 ngày nuôi cấy

Tỉ lệ sống (%), chiều cao cây (cm), số lá, chiều dài rễ (cm), số rễ, trọng lượngtươi, trọng lượng khô và hình thái cây

Thời gian theo dõi mẫu: 30 ngày

Nghiệm thức được tiến hành trên 90 mẫu

2.2.7 Phương pháp đo và tính các chỉ tiêu

Số rễ: đếm số rễ chính hình thành trên mỗi mẫu (vì Dạ Yến Thảo là cây rễ chùm nên chỉ đếm các rễ chính)

Số lá/cây: số lá mở hoàn toàn có trên cây

Số chồi tái sinh/mẫu cấy: đếm tất cả số chồi tái sinh trên từng mẫu

Chiều cao chồi: đo từ gốc đến đỉnh lá cao nhất của chồi bằng thước đo (mm).Chiều dài rễ: đo từ gốc cho đến chóp rễ bằng thước đo đơn vị là (mm)