Cndt2_Trang Thị Tường Vi_21126236_Thứ 2_789.Pdf

THỰC HIỆN PHẢN ỨNG PCR KHUẾCH ĐẠI ĐOẠN GENMỤC TIÊU NHẬN DIỆN GMO .... Giếng số 3: mẫu bắp số 2 Hình 1.6 cho thấy band ở giếng số 3 mẫu bắp số 2 sáng rõ không bị đứt gãy hay kéo vệt nên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN 2

Sinh viên thực hiện

Mã số sinh viên

: Trang Thị Tường Vi : 21126236

TP Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2024

MỤC LỤC

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ CÁC BẢNG ii

BÀI 1 LY TRÍCH VÀ KIỂM TRA DNA 1

Nội dung thực hiện: 1

1.1 Vật liệu và phương pháp 1

1.1.1 Vật liệu 1

1.1.2 Phương pháp nghiên cứu 1

1.1.2.1 Ly trích DNA 1

1.1.2.2 Kiểm tra chất lượng DNA 4

1.2 Kết quả và thảo luận 4

1.2.1 Kết quả đo OD 4

1.2.2 Kết quả điện di tổng số 5

1.3 Kết luận 5

BÀI 2 THỰC HIỆN PHẢN ỨNG PCR KHUẾCH ĐẠI ĐOẠN GENMỤC TIÊU NHẬN DIỆN GMO 6

Nội dung thực hiện: 6

1.1 Vật liệu và phương pháp 6

1.1.1 Vật liệu 6

1.1.2 Phương pháp thực hiện 6

1.1.2.1 Thông tin primer 6

1.1.2.2 Thực hiện phản ứng PCR 7

1.2 Kết quả và thảo luận 8

1.3 Kết luận 8

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ CÁC BẢNG

A DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Thông tin primer nhận diện GMO ii

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR nhận diện GMO 7

Bảng 2.3 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR 7

B DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Mẫu bắp số 2 2

Hình 1.2 Sau khi hút bỏ dịch nổi 2

Hình 1.3 Sau khi ly tâm 3

Hình 1.4 Sau khi hút dịch nổi 3

Hình 1.5 Kết quả đo OD của mẫu bắp số 2 4

Hình 1.6 Kết quả điện di tổng số trên gel agarose 0,8% với hiệu điện thế 100V trong 40 phút 5

Hình 2.1 Kết quả điện di trên gel agarose 1% với hiệu điện thế 100V trong 45 phút 8

BÀI 1 LY TRÍCH VÀ KIỂM TRA DNA

Nội dung thực hiện:

- Nội dung 1: Ly trích DNA từ mẫu chuẩn bị sẵn

- Nội dung 2: Kiểm tra chất lượng DNA sau ly trích

1.1 Vật liệu và phương pháp

1.1.1 Vật liệu

- Đối tượng nghiên cứu: Mẫu bắp số 2

- Hoá chất dùng trong ly trích DNA bằng phương pháp SDS:

+ SDS (10%)

+ Phenol/CHCl3/Isoamyl (25:24:1)

+ CHCl3

+ Isopropanol 0,6 V

+ TE buffer pH = 8

- Hoá chất dùng trong điện di kiểm tra DNA bao gồm:

+ Agarose

+ Dung dịch đệm TAE 0.5X

+ Gel red và Loading dye

- Các thiết bị được bố trí sẵn tại phòng thí nghiệm bao gồm: Máy ly tâm, Bộ điện di

và máy chụp gel, Máy đo OD…

- Và một số dụng cụ khác như: Microppette 0.5 – 20 𝜇𝐿, ống eppendoft, chai Duran, khay lạnh chứa mẫu

1.1.2 Phương pháp nghiên cứu

1.1.2.1 Ly trích DNA

Ly trích DNA từ mẫu bắp số 2 theo quy trình SDS

Bước 1 Lựa chọn mẫu, nghiền mẫu và lấy một lượng vừa đủ cho vào tube 1.5 mL

Thêm 400 𝜇𝐿 SDS và tiếp tục nghiền và xoay cho mẫu hoà tan Thêm vào 200 𝜇𝐿 SDS (Tổng thể tích SDS cho vài là 600 𝜇𝐿)

Hình 1.1 Mẫu bắp số 2

Tiến hành ly tâm 10.000 rpm trong 5 phút

Bước 3 Hút phần dịch nổi ở trên chuyển sang tube 1.5 mL mới (tránh lớp protein

ở giữa) Thêm vào 500 𝜇𝐿 CHCl3, tiếp tục ly tâm với 10.000 rpm trong 5 phút

Hình 1.2 Sau khi hút bỏ dịch nổi

Bước 4 Sau ly tâm, xuất hiện 1 lớp ván mòng tách 2 lớp Hút dịch nổi phía trên

(khoảng 300 𝜇𝐿) chuyển sang tube mới

Hình 1.4 Sau khi hút dịch nổi

phút Ly tâm 10.000 rpm trong 5 phút

Bước 6 Quan sát có thể thấy hoặc không thấy vệt trắng ở đáy tube, đổ bỏ dịch chừa

lại vệt trắng Thêm vào 500 𝜇𝐿 ethanol (70o) (thao tác bơm phải nhẹ nhàng), đóng nắp xoay ngang Ly tâm 10.000 rpm trong 5 phút

Bước 7 Rửa lần 2 bằng cách thực hiện lại Bước 6 một lần nữa

Bước 8 Phơi khô tube, thêm vào 30 𝜇𝐿 TE buffer để bảo quản DNA, trữ lạnh đến

khi dùng

1.1.2.2 Kiểm tra chất lượng DNA

Chất lượng DNA được kiểm tra bằng cách tiến hành đo mật độ quang OD260/280 và điện di tổng số trên gel agarose 0,8%:

- Đo mật độ quang OD260/280, ghi nhận kết quả đồ thị và nồng độ DNA (ng/ 𝜇𝐿)

- Điện di tổng số trên gel agarose 0,8% với hiệu điện thế 100V trong 40 phút

Trong đó 1 giếng gồm 10 𝜇𝐿 (gồm Gel red + Loading dye) + 10𝜇𝐿mẫu Chụp gel và ghi nhận kết quả bằng hình ảnh dưới UV của máy chụp gel

1.2 Kết quả và thảo luận

1.2.1 Kết quả đo OD

Sau khi đo OD260/280 thu được kết quả nồng độ DNA và biểu đồ OD như Hình 1.5

Hình 1.5 Kết quả đo OD của mẫu bắp số 2

Hình 1.5 cho thấy nồng độ DNA là 66,19 ng/ 𝜇𝐿 nằm trong khoảng phù hợp để thực hiện phản ứng PCR Độ tinh sạch của DNA nằm trong khoảng cho phép là 2,056 và biểu

đồ có đỉnh tại 280 chứng tỏ trong quá trình ly trích không bị nhiễm protein hay RNA

1.2.2 Kết quả điện di tổng số

Tiến hành điện di tổng số trên gel agarose 0,8% với hiệu điện thế 100V trong 40 phút, kết quả hiển thị ở Hình 1.6

Hình 1.6 Kết quả điện di tổng số trên gel agarose 0,8% với hiệu điện thế 100V trong 40

phút Giếng số 3: mẫu bắp số 2

Hình 1.6 cho thấy band ở giếng số 3 (mẫu bắp số 2) sáng rõ không bị đứt gãy hay kéo vệt nên DNA không bị đửt gãy trong quá trình ly trích Sản phẩm ly trích đủ điều kiện

để thực hiện phản ứng PCR khuếch đại

1.3 Kết luận

Từ kết quả đo OD260/280 kết hợp cùng kết quả điện di tổng số, kết luận rằng sản phẩm

ly trích từ mẫu số bắp số 2 không bị tạp nhiễm và đủ điều kiện để thực hiện phản ứng PCR

nhận diện GMO

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

BÀI 2 THỰC HIỆN PHẢN ỨNG PCR KHUẾCH ĐẠI ĐOẠN GEN MỤC TIÊU NHẬN DIỆN GMO

Nội dung thực hiện:

Thực hiện phản ứng PCR, biện luận và đưa ra kết quả

1.1 Vật liệu và phương pháp

1.1.1 Vật liệu

Đối tượng nghiên cứu: DNA đã được ly trích và kiểm tra chất lượng từ mẫu bắp số 2 Hóa chất được dùng trong thí nghiệm bao gồm:

+ Master Mix 2X (Thermo Scientific, Mỹ)

+ H2O nuclease – free water

+ Agarose (Bioline, Anh)

+ GelRed

+ Ladder 1000bp

+ Dung dịch đệm TAE 0.5X

+ Gel Loading Dye Purple

- Các thiết bị được bố trí sẵn tại phòng thí nghiệm bao gồm: Máy PCR, Bộ điện di và máy chụp gel

- Và một số dụng cụ khác như: Microppette 0.5 – 20 𝜇𝐿, ống eppendoft, chai Duran, khay lạnh chứa mẫu

1.1.2 Phương pháp thực hiện

1.1.2.1 Thông tin primer

Bảng 2.1 Thông tin primer nhận diện GMO

sản phẩm

Tham khảo

1.1.2.2 Thực hiện phản ứng PCR

Thành phần phản ứng PCR được nêu cụ thể trong Bảng 2.2

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR nhận diện GMO

Trộn đều các thành phần PCR với nhau trong tube PCR, sau đó đặt vào máy PCR khuếch đại đoạn gen mục tiêu với chu trình nhiệt như sau:

Bảng 2.3 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR

40

Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1% với thang chuẩn 1000

bp ở hiệu điện thế 100 V trong 45 phút Mỗi giếng trên gel agarose bao gồm 5 𝜇𝐿 sản phẩm PCR

và 10 𝜇𝐿 hỗn hợp gồm GelRed 0,6X và Gel Loading Dye Purple được trộn chung với nhau Dùng 1 giếng chứa đối chứng âm (có đầy đủ các thành phần phản ứng PCR nhưng không có DNA, thay DNA bằng H2O nuclease – free water) Đối với giếng làm thang chuẩn thì chứa 1,5 𝜇𝐿 ladder và 1 GelRed Sau đó miếng gel được chụp và quan sát trên máy chụp gel

1.2 Kết quả và thảo luận

Khuếch đại đoạn gen mục tiêu với kích thước sản phẩm dự kiến là 195 bp Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% với hiệu điện thế là 100

V trong 45 phút Kết quả sản phẩm PCR và đối chứng âm được thể hiện như Hình 2.1

Hình 2.1 Kết quả điện di trên gel agarose 1% với hiệu điện thế 100V trong 45 phút Giếng

số 2: mẫu bắp số 2; (-): đối chứng âm; M: Ladder 1000 bp; Giếng số 11: mẫu số 4 được xem như

là đối chứng dương - chắc chắn là GMO

Kết quả ở Hình 2.2 cho thấy ở giếng đối chứng âm không xuất hiện band chứng tỏ hóa chất không bị nhiễm Có xuất hiện dimer primer ở các giếng, có thể thao tác hút primer

bị dư thể tích hoặc hụt thể tích DNA

Ở giếng số 2 (mẫu bắp số 2) có xuất hiện band mục tiêu là 195 bp, bên cạnh đó cũng

có xuất hiện thêm 1 band có kích thước khoảng 400 - 500 bp

1.3 Kết luận

Sau khi tiến hành PCR và điện di kiểm tra, kết quả cho thấy DNA từ mẫu bắp số 2

có GMO (có thể có 2 loại GMO) Đưa ra kết luận rằng mẫu bắp số 2 (bắp trồng cho thức

ăn gia súc) có GMO

(-) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M

 200 bp

195 bp 