Cndt2_Đặng Thị Bảo Quyên_21126482_Thứ 2_789.Pdf

Có nghiên cứu cho rằng thực phẩm biến đổi gen gây ra những ảnh hưởng không tốt đến cây trồng bị biến đổi gen và sức khỏe con người như gây hại không chủ định cho sinh vật khác, giảm hiệu

BÁO CÁO THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN II

KIỂM TRA HẠT GIỐNG BIẾN ĐỔI GEN

Ngành học

Môn học

Giảng viên hướng dẫn

Sinh viên thực hiện

: KHOA KHOA HỌC SINH HỌC : CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN II : TS PHẠM ĐỨC TOÀN

: ĐẶNG THỊ BẢO QUYÊN Nhóm thực hiện

MSSV

: THỨ 7 : 21126482 Niên khoá : 2021 – 2025

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN II

KIỂM TRA HẠT GIỐNG BIẾN ĐỔI GEN

Giảng viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện MSSV

TS PHẠM ĐỨC TOÀN ĐẶNG THỊ BẢO QUYÊN 21126482

TP Thủ Đức, 06/2024

MỤC LỤC

Trang

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT i

DANH SÁCH CÁC HÌNH ii

DANH SÁCH CÁC BẢNG iii

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 4

1.1 Đặt vấn đề 4

1.2 Mục tiêu 4

1.3 Nội dung thực hiện 4

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

2.1 Sinh vật biến đổi gene (GMO) 5

2.2 Ly trích DNA thực vật 5

2.3 Định lượng DNA bằng kỹ thuật đo mật độ quang 6

2.4 PCR (Polymerase Chain Reaction) 6

2.5 Điện di 6

1.6 Mồi phát hiện vùng 35S promoter 7

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 8

3.1 Thời gian và địa điểm nghiêm cứu 8

3.2 Vật liệu và phương pháp thực hiện 8

3.2.1 Vật liệu nghiêm cứu 8

3.2.1.1 Đối tượng nghiêm cứu 8

3.2.1.2 Vật liệu và thiết bị 8

3.3 Hóa chất sử dụng và quy trình ly trích DNA hạt bắp 8

3.3.1 Quy trình thực hiện 9

3.4 Điện di sau li trích DNA 11

3.5 Đo OD 12

3.6 Thực hiện phản ứng PCR 12

3.6.1 Thành phần phản ứng PCR 12

3.7 Điện di sản phẩn PCR 13

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 15

4.1 Kết quả 15

4.1.1 Điện di sau ly trích 15

4.1.2 Kết quả OD 15

4.1.3 Điện di sản phẩn PCR 16

4.2 Thảo luận 16

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DNA : axit deoxyribonucleic

GMO : Geneticly Modified Organisms

Non – GMO: Non-Geneticly Modified Organisms

PCR : Polymerase Chain Reaction

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 3.1 Thêm 600 µL SDS và mẫu nghiền số 4 9

Hình 3.2 Điện di sau ly trích trên gel agarose 0,8% 10

Hình 3.3 Điện di sản pẩm PCR trên gel agarose 0,8% 13

Hình 4.1 Kết quả điện di sau ly trích DNA hạt giống bắp mẫu số 4 16

Hình 4.2 Kết quả đo OD trước khi thực hiện phản ứng PCR 16

Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR (4) là mẫu số 4, (L) là ladder 1 kp 17

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Hóa chất dùng trong ly trích DNA 8

Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR 12

Bảng 3.3 Chu trình nhiệt độ 12

Bảng 3.4 Primer 13

Bảng 4.1 Kết quả đo OD 16

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Hiện nay dư luận chia ra hai luồng ý kiến ủng hộ và phản đối sử dụng thực phẩm biến đổi gen Có nghiên cứu cho rằng thực phẩm biến đổi gen gây ra những ảnh hưởng không tốt đến cây trồng bị biến đổi gen và sức khỏe con người như gây hại không chủ định cho sinh vật khác, giảm hiệu quả của thuốc trừ sâu, gây dị ứng, gây rối loạn sinh sản ở người, ảnh hưởng tới hệ thần kinh, gây ung thư,… Mặt khác theo tổ chức WHO, những thực phẩm biến đổi gen trên thị trường quốc tế hiện nay phải trải qua giai đoạn đánh giá an toàn rất nghiêm ngặt và thường sẽ không gây ra nguy cơ gì với sức khỏe con người Tại các quốc gia chấp nhận sử dụng thực phẩm biến đổi gen, cũng chưa quan sát được ảnh hưởng nào lên sức khỏe con người do tiêu thụ thực phẩm biến đổi gen cả

Vì vậy, cần phải kiểm tra thực phẩm có GMO hay Non - GMO, để đưa ra những quyết định và sự lựa chọn đúng đắn nhất Xuất phát từ thực tế những mối lo ngại về các tác hại tiềm tàng của sản phẩm chuyển gen lên môi trường và sức khỏe cộng đồng, việc tìm

ra phương pháp nhận diện các sản phẩm chuyển gen đang được lưu hành trên thị trường

là cần thiết

1.2 Mục tiêu

Phát hiện và định lượng gen (GMO) có trong các loại sản phẩm có nguồn gốc từ các loại hạt giống

1.3 Nội dung thực hiện

Năm vững và thực hiện được các bước tách chiết DNA theo phương pháp dùng dịch trích SDS

Định lượng nucleic acid bằng phương pháp đo mật độ quang

Phương pháp thu nhận mẫu acid nucleic phân tích, định tính và định lượng DNA Thực hiện điện di và quan sát miếng gel dưới tia UV

Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiện phát hiện GMO ở vùng 35S promoter

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sinh vật biến đổi gene (GMO)

Sinh vật biến đổi gen (GMO), sinh vật có bộ gen đã được thiết kế trong phòng thí nghiệm để tạo điều kiện cho sự phát triển của các đặc điểm sinh lý mong muốn hoặc tạo

ra các sản phẩm sinh học mong muốn Trong chăn nuôi gia súc, trồng trọt thông thường

và thậm chí cả nhân giống vật nuôi, từ lâu đã là phương pháp nhân giống chọn lọc cá thể của một giống loài để sản xuất ra đời con cháu mang những đặc tính mong muốn Tuy nhiên, trong chỉnh sửa gen, các công nghệ di truyền tái tổ hợp được sử dụng để tạo

ra các sinh vật có bộ gen đã bị thay đổi chính xác ở cấp độ phân tử, thường là bao gồm các gen từ các loài sinh vật không liên quan, mã hóa các tính trạng không dễ dàng có được thông qua nhân giống chọn lọc thông thường Các sinh vật biến đổi gen (GMOs) được sản xuất thông qua các công nghệ di truyền đã trở thành một phần của cuộc sống hàng ngày, tác động đến xã hội thông qua nông nghiệp, y học

Thực phẩm biến đổi gen là thuật ngữ chỉ những thực phẩm loại thực phẩm có thành phần từ thực vật và động vật biến đổi gen Thực vật và động vật biến đổi gen nhằm tạo

ra giống thực vật và động vật có những đặc tính tốt như mong muốn của con người như tăng khả năng chống cỏ dại, chống sâu bệnh hay tăng hàm lượng dưỡng chất Vì thế, giống cây trồng biến đổi gen thường cho vụ mùa bội thu, những vụ mùa tồn tại ngay cả

ở trong điều kiện sâu bệnh và khí hậu khắc nghiệt Vẫn có những phương pháp khác để tạo ra giống cây trồng có đặc tính mong muốn như phương pháp nhân giống nhưng phương pháp này thường rất tốn thời gian và kết quả thường không chính xác

2.2 Ly trích DNA thực vật

DNA là phân tử có kích thước lớn, do đó trong quá trình thao tác cần tránh những tác nhân cơ học hay hóa học quá mạnh có thể là đứt gãy phân tử này Quá trình tách chiết DNA gồm các bước cơ bản như sau:

Phá vỡ tế bào, giải phóng DNA: Vật lý, hóa chất

Loại bỏ các thành phần không mong muốn

Thu hồi DNA

2.3 Định lượng DNA bằng kỹ thuật đo mật độ quang

Dựa vào mức hấp thụ ánh sáng của các phân tử vật chất trong môi trường lỏng người ta có thể tính được nồng độ của chúng Mỗi phân tử có một đỉnh hấp thụ (nơi chúng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất) ở một độ dài bước sóng nhất định tùy thuộc vào cấu trúc của chúng Sự hấp thụ này là do sự tương tác giữa các proton với các electron của vòng purin và pyrimidin Đỉnh hấp thụ của nucleic acid là 260 nm trong vùng tử ngoại

Sự hấp thụ được tính bằng giá trị OD Một đơn vị OD ở bước sóng 260 nm tương ứng với :

50 µg/ml DNA sợi đôi

40 µg/ml DNA sợi đơn hay ARN

20 µg/ml oligonucleotide sợi đơn

Dung dịch acid nucleic được xem là sạch khi tỉ lệ OD260/OD280 nằm trong khoảng 1,8 – 2,2 Nếu mẫu nhiễm protein hay phenol tỉ lệ này sẽ thấp hơn, sự hiện diện của guanidine sẽ làm tăng giá trị OD260

2.4 PCR (Polymerase Chain Reaction)

Xét nghiệm PCR được thiết kế để phát hiện vật liệu di truyền (DNA hoặc RNA) Quá trình bắt đầu bằng việc tách chiết DNA hoặc RNA từ mẫu, sau đó được đưa qua các chu kỳ khuếch đại nhiệt Các chu trình nhiệt nhằm tạo ra một quy trình 3 bước gồm: Biến tính, bắt cặp, kéo dài dẫn đến sự nhân đôi của vật liệu DNA có trong mẫu

2.5 Điện di

Quá trình điện di sử dụng gel agarose thường được dùng để phân tích nucleic acid dựa vào kích thước Kỹ thuật điện di đơn giản nhất và được sử dụng rộng rãi nhất là kỹ thuật điện di theo phương ngang Để quan sát DNA, cần phải nhuộm phân tử này, Gel red sẽ chèn vào giữa các cặp base đối diện nhau trên phân tử DNA và tạo huỳnh quang cam/đỏ khi được chiếu UV (300 nm)

Gel agarose có thể được sử dụng để phân tách các phân tử lớn hơn khoảng 100 bp Agarose là một dạng polymer có thể được đun hòa tan, đổ khuôn và tạo thành miếng gel Các giếng được định hình bằng lược gel (comb) sau khi đổ gel vào khuôn Miếng gel sẽ được đặt chiềm trong dung dịch điện di và DNA được thêm vào các giếng Dòng điện đi qua bồn điện di, theo chiều dài gel làm các phân tử DNA tích điện âm di chuyển

về phía cực dương Agarose gel là một ma trận gồm các lỗ và các phân tử DNA có kích thước nhỏ sẽ di chuyển qua dễ dàng hơn các phân tử DNA có kích thước lớn hơn Thuốc

nhuộm GelRed có thể được trộn trực tiếp với mẫu DNA trước khi điện di hay hòa tan vào gel agarose khi chuẩn bị gel Sau khi điện di, đặt gel dưới tia UV để quan sát

1.6 Mồi phát hiện vùng 35S promoter

Promoter là một thành phần quan trọng trong cấu trúc của tất cả các gen và đóng vai trò trong hoạt động của gen Trong công nghệ chuyển gen thực vật, các promoter được sử dụng rất rộng rãi để điều khiển các gen ngoại lai trong cây trồng biến đổi gen nói riêng và thực vật nói chung Trong đó, promoter 35S và terminator NOS là hai cấu trúc thường được sử dụng phổ biến nhất

Vì vậy, phát hiện cây trồng biến đổi gen bằng kỹ thuật PCR là dựa vào các cặp mồi đặc hiệu cho vùng promoter Kết quả điện di sản phẩm PCR sẽ giúp xác nhận nguồn gốc của vật liệu đánh giá (mẫu phân tích) Trong đó, 35S promoter là một promoter được sử dụng phổ biến trong các sản phẩm chuyển gen đang được lưu hành trên thị trường

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiêm cứu

Thời gian nghiêm cứu: Ngày 1 tháng 6 năm 2024 và ngày 3 tháng 6 năm 2024 Địa điểm nghiêm cứu: Tòa A2, trường đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu và phương pháp thực hiện

3.2.1 Vật liệu nghiêm cứu

3.2.1.1 Đối tượng nghiêm cứu

3.3 Hóa chất sử dụng và quy trình ly trích DNA hạt bắp

Bảng 3.1 Hóa chất dùng trong ly trích DNA

STT Hóa chất Tác dụng

1 Dung dịch đồng nhất mẫu

(Homogenization Buffer) gồm:

Hỗ trợ phá vỡ tế bào, bất hoạt những enzyme phân giải DNA, bảo vệ DNA

2 Tris HCL pH 8 (1 M): 0,1 M Duy trì pH 8, ức chế hoạt động của những

enzyme nuclease (hoạt động ở khoảng pH 7)

3 EDTA pH 8 (0,5 M): 0,05 M Kết tủa các ion kim loại như Ca2+, Mg2+

và ức chế hoạt động của các enzyme cần ion kim loại (DNase)

4 NaCl (5M): 0,1 M Kết hợp với Isopropanol để tránh cho

Isopropanol làm hại DNA; giúp DNA kỵ nước hơn, dễ kết tủa, cân bằng môi trường đẳng trương

5 SDS (10%): 1% Kết hợp với protein màng và các phân tử

phospholipid giúp phá vỡ cấu trúc màng

6 PCI (Phenol / Chloroform/

Isoamyl alcohol tỉ lệ 25:24:1)

+ Phenol biến tính protein mạnh (độc) + Chloroform biến tính protein yếu hơn Phenol giúp tăng tỉ trọng dung dịch + Isoamyl alcohol giúp phân lớp tốt hơn, giảm tạo bọt

Bước 2: Đem tube đã nghiền đều đi ly tâm 10000 vòng/phút trong vòng 5 phút

Bước 3: Sau ly tâm hút 500 µl phần dịch nổi sang tube mới

Bước 4: Cho 1V PCI (500 µl) trộn đều rồi đem đi ly tâm 10000 vòng/phút trong vòng 5 phút

Bước 5: Hút 300 µl bỏ dịch nổi sang tube mới sau đó thêm 1V CI (300 µl) vào trộn đều

Bước 6: Ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút

Bước 7: Hút dịch nỗi 300 µl sang tube mới sau đó thêm 180 µl Isopropanol, đảo nhẹ, ủ lạnh ở -20oC trong 30 phút

Bước 8: Đem đi ly tâm 10000 vòng/phút, và bỏ dịch nổi

Bước 9: Thêm 500 µl Ethanol 70%, sau đó ly tâm 10000 vòng/phút trong 3 phút Lặp lại bước này 2 lần

Bước 10: Thêm vào 50 µl TE (nước khử ion) vào bảo quản ở -20 oC

3.4 Điện di sau li trích DNA

Bước 1: Pha gel Agarose 0,8% Để gel nguội đỗ gel ra khuôn, trên khuôn có lượt định hình giếng điện di Đem miếng gel sau khi đông để chiềm vào bồn điện di chứa dung dịch điện di (TAE hoặc TBE)

Bước 2: Hỗn hợp 10 µl gelred + loading dye với 10 µl DNA mẫu mix đều hỗ hợp, bơm vào giếng Mục đích kiểm tra ly trích DNA có thành công hay không Nên bước này chưa cần đối chứng am, dương, Ladder

Bước 3: Điện di sau ly trích trên gel agarose 0,8%, điện di trong 25 phút ở 100V

Kéo dài 720C 30 giây

Hậu kéo dài 720C 7 phút 1

Bảo quản 40C - 1

Bước 2: Chuẩn bị Eppendorf 0,5 thêm lần lượt các thành phẩn phản ứng PCR, 0,25

µl Primer xuôi, 0,25 µl Primer ngược, 6,25 µl Dream Taq Lưu ý: trộn thật đều mẫu bằng micropipette, mẫu 1 µl DNA, 4,75 µl H2O (Nuclease-Free Water)

Bước 3: Cho vào máy PCR để tiến hành khuếch đại trình tự đặc hiệu, với chu trình nhiệt độ, thời gian, chu kỳ

3.7 Điện di sản phẩn PCR

Bước 1: Pha gel Agarose 0,8% Để gel nguội đỗ gel ra khuôn, trên khuôn có lượt định hình giếng điện di Đem miếng gel sau khi đông để chiềm vào bồn điện di chứa dung dịch điện di

Bước 2: Ladder 1 kp Nên bơm mẫu trước khi bơm Ladder, đối chứng âm, dương,

để tránh hiện tượng sai kết quả, nhiễm chéo Bơm 5 µl DNA sản phẩm PCR, 10 µl loading dye,gelred Nhận diện đoạn gene 195 bp

Bước 3: Diện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8%, điện di trong 35 phút ở 100V

Hình 3.2 Điện di sản pẩm PCR trên gel agararo 0,8%

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả

4.1.1 Kết quả điện di sau ly trích

Hình 4.1 Kết quả điện di sau ly trích DNA hạt giống bắp mẫu số 4

Kết quà thu nhận ly trích thành công có band sáng, định tính có DNA sau li

trích mẫu số 4 Tuy nhiên, vệt band bị kéo dài có thể do DNA bị đứt gãy hoặc nhiễm

chéo

4.1.2 Kết quả OD

Hình 4.2 Kết quả đo OD trước khi thực hiện phản ứng PCR

Bảng 4.1 Kết quả đo OD trên thiết bị đo của các mẫu DNA sau khi đã được ly trích

4

Kết quả dựa vào bảng 4.1, nếu 1,8< OD260/280 < 2,2 là mẫu tinh sạch (hay mẫu đạt):

Mẫu DNA tổng số đạt 2,009 nằm trong khoảng giá trị của OD 260/280. Tiến hành

thực hiện phản ứng PCR

Có một số nguyên nhân khác khiến mẫu không đạt như sau:

Do thao tác trong quá trình ly trích, có thể đã hút phải protein lắng ở đáy của tube Mẫu chưa được sạch: protein trong mẫu có khả năng còn sót bám vào bề mặt quan sát ảnh hưởng đến sự sai lệch trong đo lường OD

Hướng xử lý: Loại tạp protein bằng Phenol, luyện tập các kỹ năng thao tác 4.1.3 Điện di sản phẩn PCR

Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR (4) là mẫu số 4, (L) là Ladder 1 kp

Quan sát kết quả điện di ở giếng số 6 từ trái sang, thấy có xuất hiện band sáng đậm

195 bp, chứng tỏ rằng mẫu số 4 là GMO, với đã khuếch đại được đoạn gene chuyển

mang gene 35S promoter

Điều này cho thấy hiệu quả nhận diện và độ tin cậy khi sử dụng cặp mồi nhận diện 35S promoter Phản ứng còn tạo các sản phẩm phụ

Về ladder, phân tách khá đều dễ quan sát và đo lường

trình độ chuyên môn cao, nên việc trau dồi thêm kiến thức lý thuyết lẫn thực hành là cực kỳ quan trọng, cần được tiếp tục phổ biến và chỉ dẫn kỹ càng ở từng bước

Trong quá trình tách chiết DNA, hạn chế lắc quá mạnh sẽ làm đứt gãy DNA DNA

dễ bị tạp nhiễm nên trong quá trình hút phần nổi phía trên sau khi cho Chlorofrom phải hút cẩn thận lớp trên cùng vì bên lớp dưới cần loại bỏ, các tạp chất từ dung dịch Tạp nhiễm có thể do quá trình kết tủa DNA bằng Isopropanol thì có thể các tạp chất khác cũng lắng theo hoặc khi dùng Ethanol 70% để rửa các dấu vết của Isopropanol nhưng vẫn còn sót lại trong mẫu, từ đó dẫn đến việc ly trích mẫu không thành công DNA có thể không bắt được màu gelred, dẫn đến các dải không phản ứng Để khắc phục điều này, có thể tính toán và sử dụng một lượng thuốc nhuộm vừa đủ để bắt màu Ngoài ra, nguồn lây nhiễm có thể xuất phát từ việc dụng cụ dùng để thao tác và thực hiện thí nghiệm không được rửa sạch hoặc do thao tác của kỹ thuật viên còn nhiều sai sót, hạn chế cũng dẫn đến việc tách chiết mẫu DNA Vì vậy khi chiết mẫu cần chú ý rửa dụng

cụ, đồng thời đảm bảo thao tác của kỹ thuật viên phải cẩn thận, đúng quy trình Mẫu này không phù hợp với quy trình thao tác này cần có quá trình xử lý khác để ly trích