Phân lập một số flavonoid và khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của cây Cỏ lào Đề tài phân tích hình thái thực vật và khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của lá cây Cỏ lào, phân lập và xác định cấu trúc của một số flavonoid từ lá cây Cỏ lào. Nghiên cứu khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của lá cây Cỏ lào
TổngquanvềHỌCÚC(ASTERACEAE)
VịtríphânloạicủahọCúc(Asteraceae)
Họ Cúc (Asteraceae) là một trong những họ lớn nhất của ngành Ngọc lan với khoảng
23000 loàiđ ư ợ c c h i a t h à n h 2 p h â n h ọ v à 1 3 t ô n g , p h â n b ố ở h ầ u h ế t k h ắ p n ơ i t r ê n t h ế g i ớ i Ở V i ệ t N a m h ọ C ú c c ó 1 2 t ô n g [ 2]. Tông Eupatorieae được xếp trong phân họ Hoa hình ống (Asteroideae), được chia thành 103 chi với nhiều đặc điểm hình thái và cấu tạo khác nhau Phân bố chủ yếu ở vùngnhiệt đới châu Mỹ và châu Á, châu Phi có ít loài [8]. Ở Việt Nam có 6 chi, nhưng mỗi chi không có nhiều loài, đặc biệt ở chi Chromolaena chỉ có 1 loài - Cỏ lào (Chromolaena odorata (L.) King et Robinson, Asteraceae) Phân bố rộng rãi từ núi thấp xuống đồng bằng [8].
TổngquanvềchiChromolaena
Đặcđiểmhìnhthái
Cỏ hoặc cây bụi Lá mọc đối, đôi khi mọc vòng, phiến lá hình tam giác thuôn tới bầu dục, viền nguyên hoặc có thùy Cụm hoa đầu hợp thành ngù, dày đặc; mỗi cụm có 10 đến 40 hoa Tất cả hoa lưỡng tính, quảkết, màu trắng, xanh nhạt hay tím nhạt Lá bắc ở tổngbao hìnhtrứngthuôn tới mũi mác, gồm4-6hàng, xếp lợp khôngbằngnhau Đế hoa phẳng tới phồng lên, không lông Tràng hình trụ, mặt ngoài có tuyến, đỉnh 5 thùy, mặt trong và ngoài phủ lông tơ dày Nhị 5; gốc bao phấn có tai hình dải, đôi khi phủ lông Gốc vòi nhụy có mấu Quả bế, hình lăng trụ, 5 cạnh, rất hiếm 3, đôi khi mặt vỏc ó t u y ế n ; m à o l ô n g t r ê n đ ỉ n h g ồ m n h i ề u l ô n g t ơ , c ứ n g , x ù x ì [ 2].
Phânbố
Có165loài, phânbốtậptrungở vùngchâuMỹnhiệtđới,châuÁ.ViệtNamcó1loài.
TổngquanvềthànhphầnhóahọccủachiChromolaena
Các nghiên cứu về chiChromolaenacho thấy có các nhóm chất tập trung chủ yếu là dẫn xuất thymol và flavon Ngoài ra còn có thêm một loạt sesquiterpen lacton, trongđ ó c h ủ y ế u l à g e r m a c r o l i d , m ộ t s ố s e s q u i t e r p e n v à t r o n g v à i t r ư ờ n g h ợ p c ó d i t e r p e n [10].
TổngquanvềtácdụngdượclýcủachiChromolaena
Theo Dodomaeus xuất xứ tên Eupatorium là Hepatorium (hepar tiếng latinh là gan)b ở i v ì h o ạ t t í n h c ủ a l o à i t h ự c v ậ t n à y l à c h ữ a c á c b ệ n h v ề g a n N h i ề u l o à i t h ự c v ậ t t r o n g c h i n à y đ ư ợ c d ù n g đ ể c h ữ a c á c b ệ n h v ề g a n , l á l á c h , c h ố n g k h ố i u , l à m l i ề n v ế t t h ư ơ n g , l à m t h u ố c l ợ i t i ể u , h ạ s ố t v à n h i ề u ứ n g d ụ n g k h á c [ 10].
TỔNGQUANVỀCHROMOLAENAODORATA
TổngquanthựcvậtcủaCỏlào
Tên khoa học:Eupatorium odoratum(L.) King et Robinson, Asteraceae (hiện nay làt ê n đ ã đ ư ợ c c ô n g b ố v à s ử d ụ n g c h í n h t h ứ c ) [ 1]. Tênđồngnghĩa:ChromolaenaodorataL.,Asteraceae[1].
Tênk h á c : C â y c ộ n g s ả n , b ớ p b ớ p , b ù x í c h , y ê n b ạ c h , c h ù m h ô i , n h ả N h ậ t ( T à y ) , muống mung phia (Dao) [1].
Theohệthốngphânloạithực vậtcủaTakhtajan2009 [25]thìCỏlàocó vịtríphânloại như sau:
Cỏ lào thân thảo, cây nhỏ, cao 1 – 2 m, mọc thành bụi, phân nhiều cành nằm ngang.Thân tròn, màu rất nhạt, có rãnh và lông nhỏmịn.Lá mọc đối, hình gần tam giác,dài6 –9cm,rộng2–4cm,gốcthuônvát,đầunhọn,mépcórăngcưato,vòracómùi hăng hắc, hai mặtlá cùngmàu có lôngmịn, dàyhơn ở mặt dưới, gân chính 3, cuốnglá dài
Cụm hoa mọc ở đầu cành thành ngù kép, gồm nhiều hoa có mùi thơm, tụ hợp thành hìnhdấudài1cm, màu vànglục;lábắcxếpthành3 –4hàng, hơicólông, màolôngcó sợi đều; tràng hoa loe dần từ gốc, bao phấn không có tai.
Quảbế, hìnhthoi,có5cạnh, cólông[1].
Bộphậndùng:lávàrễ,thuháiquanhnăm,dùngtươi [11] Phân bố và sinh thái:
EupatoriumL là một chi lớn trong họ Asteraceae Trên thế giới có hơn 1200 loàit r ư ớ c khi đượctáchra bởiKingvàRobinson vàonăm1970 ChiChromolaenahiện có hơn 165 loài, đa số là cây bụi, cây bụi nhỏ hoặc cây thảo Phân bố tập trung ở vùng nhiệtđớichâuMỹ,châuPhivàchâuÁ,vùngônđớiấmởchâuÂuchỉcómộtítloài
[27]. ỞViệtNam, chinày có khoảng10loài Trong đó, Cỏlàocó lẽlàcây quen thuộcnhất, có nguồn gốc ở đảo Antilles, sau đó phát tán sang nhiều nước nhiệt đới khác, đặc biệt là các nước ở Đông Nam và Nam châu Á. Ở Việt Nam, Cỏ lào thường gặp ở nhiều nơi, bao gồm ở các tỉnh ở vùng đồng bằng, trung du và vùng núi thấp Cây ưa sáng, chịu được hạn và có thể sống được trên mọi loại đất, mọc tương đối tập trung trên những diện tích lớn ở đồi, nhất là đất nương rẫy đã bỏ hoang Do đó, có thể coi Cỏ lào là loài cây tiên phong số một trong quá trình diễn thế thứ sinh trên đất sau canh tác [8].
Thànhphầnhóahọc Đã phân lập được một số hợp chất từ các bộ phân củaChromolaena odoratavà được xác định là odoratin; kaempferol; kaemferol-4’-methyl ether; quercetin; dillenetin;isorhamnetin; luteolin-4’-methyl ether; 3,4’dihydroxy-5,6,7-trimethoxy flavon;…[15].
TổngquanvềflavonoidtronglácâyCỏlào
Tổngquanvềflavonoid
Flavonoid là một nhóm lớn của các hợp chất phenol thực vật, chúng đa dạng về cấu trúc hóa học và tác dụng sinh học Flavonoid có mặt ở hầu hết các bộ phận của cây,đ ặ c b i ệ t l à t r o n g c á c t ế b à o t h ự c v ậ t , c ó k h u n g h ó a h ọ c l à
C6- C3- C6 Có màu vàngnhạt, màu ngà đỏ, xanh, tía và các dạng không màu như:isoflavon, catein và leucoanthocyanidin, là các chất tan trong nước và thường nằm trong không bào.
FlavonoidcócấutrúcmạchC6-C3-C6đ ềucó2vòng thơm.Tùythuộcvàocấutạo của mạch C trong bộ khung C6- C3- C6, flavonoid được phân thành các nhóm sau: Euflavonoidlà cácflavonoidcó gốcaryl ở vịtríC2g ồ m :anthocyanidin, flavan, flavan3 - ol, flavan 4 - ol, flavan 3,4 - diol, flavanon, 3 - hydroxy flavanon, flavon, flavonol, dihydrochalcon, chalcon, auron.
Ngoàirangườitacònphânbiệtbiflavonoidlà nhữngflavonoiddimer, triflavonoidcấu tạo bởi
3 monomer flavonoid, flavolignan là nhữngflavonoid mà phân tử có một phần cấu trúc lignan.
CácnghiêncứuvềflavonoidtronglácâyCỏlào
NguyễnThịDiễmTrangvàcộngsự(1993)đãtáchđược2chalcon và1flavanon được nhận danh là odoratin; 2,4-dihydroxy-4,5,6,-trimethoxy chalcon; 4’-hydroxy-5,6,7- trimethoxy flavanon [10].
Năm 2006, Ngô Quốc Luân đã phân lập và được nhận danh một flavon là ombuin (3,5,3′-trihydroxy-7,4′- dimethoxy flavon) [6].
Năm2012, Ngô Quốc Luân đã phân lập được thêm một flavon mới có côngthức phântử là C17H14O6, phân tử khối là 314 đvC (5,7-dihydroxy-3’-4’-dimethoxy flavon) [5].
Năm 2008, Odunbaku OA, Ilusanya OA, Akasoro KS đã phân lập 3,5,4’ -Trihydroxy- 7-methoxyflavanon; 5,7,3’’’-Trihydroxy-50 –methoxyflavanon; 3,5,7-Trihydroxy-4’ – methoxyflavanon từ dịch chiết nước của hoa [28].
Năm 2008, Pan CH, Kim ES, Jung SH và cộng sự đã phân lập được tamarixetin, trihydroxymonomethoxyflavanon;pentaethoxyflavanon;dihydroxytrimethoxychalcon; eupatilin; 5,6,7,4’ –tetramethoxyflavanon; 5-hydroxy 6,7,3’,4’ –tetramethoxyflavon;kaempferid; sinensetin; rhamnetin; tetrahydroxymonomethoxyflavanon từ dịch chiết cồn của lá[28].
Tácdụngdượclý
Cao chiết cồn của cả cây Cỏ lào trừ rễ có tác dụng chống co thắt cơ trơn gây bởi histamin và acetylcholin trên hồi tràng cô lập chuột lang Đã nghiên cứu xác minh tác dụng cầm máu và làm liền sẹo của Cỏ lào [1].
Cao chiết cồn của lá cây Cỏ lào được sử dụng trong y học cổ truyền Ấn Độ trong điều trị bệnh tiểu đường và các vấn đề về mắt [19]. Đã nghiên cứu sử dụng cao lá Cỏ lào để điều trị tại chỗ vết thương phần mềm nhiễm khuẩn và vết thương phần mềm lâu liền đối với 86 bệnh nhân (trong đó có 82 bệnh nhân đã được phẫu thuật mở rộng cắt lọc tổ chức dập nát và hoại tử, lấy bỏ dị vật, cắt cụt chi cấp cứu, để hở hoàn toàn vết thương), và đã chứng minh Cỏ lào có những tác dụng sau:
Làm giảm tiết dịch, giảm mùi hôi, hoại tử rụng nhanh hơn hẳn nhóm đối chứng; tuy nhiênkhidùngtạichỗtrong3 –5phútđầuthuốcgâycảmgiácnóngxóttại vếtthương ở mức độ chịu đựng được [1].
Làm rút ngắn thời gian điều trị vết thươngdo thúc đẩy nhanh quá trình loại bỏ hoại tử, tân tạo mô hạt và liền sẹo Sẹo hình thành mềm, mịn, không thấy có sẹo co kéo, sẹol ồ i
M à u s ắ c s ẹ o h ồ n g h o ặ c n â u n h ạ t , k h ô n g t h ấ y s ẹ o b ạ c m à u [ 1]. Ức chế sự sinh trưởngin vitrovàin vivocủa các chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn vết thươngnhư tụ cầu khuẩn vàng,Escherichia coli, Proteus,trực khuẩn mủ xanh Những chủng này được phân lập từ các bệnh phẩmlâmsàngđều nhờn với các loại khángsinh thông dụng [1].
Nhữngnghiên cứu về nồngđộ hydroxyprolin và về hình ảnh siêu cấu trúc cho thấy tại các vết thương điều trị với Cỏ lào, quá trình tổng hợp collagen tiến triển tốt, tốc độ tổng hợp collagen tăng nhanh, đặc biệt tăng cao nhất trong 7 ngày đầu [1].
Nghiên cứu tiềm năng hạ đường huyết của dịch chiết ethanol của lá Cỏ lào trên chuột bị tiểu đường do alloxan gây ra [13].
Năm 2003, Rungnapa Ongkana đã nghiên cứu dịch chiết chloroform của lá Cỏ lào có khả năng chống lại chủng K1 củaPlasmodium falciparumtrong môi trường nuôi cấyi n v i t r ovới giỏ trị EC50ở 9,5àg/ml [18].
Năm 2005,Owoyele và cộng sự đã nghiên cứu về khả năng kháng viêm trên chuột bị gây phù bằng phương phápCarrageenan [20].
Nhân dân ta dùng Cỏ lào để chữa tiêu chảy, kiết lỵ, đau nhức xương, ghẻ lở, phòng và trị đỉa cắn Một số chế phẩmtừ cao lá Cỏ lào chữa một số bệnh về răng miệng Cỏ lào còn được dùng để chữa bỏng và vết thương phần mềm [1].
Nhân dân Campuchia và Haiti uốngnước sắc lá Cỏ lào chữa ho, cảmlạnh, cúm Nhân dân Dominic, Trinidad dùng lá Cỏ lào đắp chữa mụn nhọt và vết loét lâu liền. ỞBờ BiểnNgà và Nepal, lá Cỏ lào giãnát hoặcéplấy dịchđắp trị vết đứt, vết thương chảy máu và làm liền sẹo [1]. Ở Nigeria, nước sắc Cỏ lào trị sốt, cúm và cảm lạnh Cao lá Cỏ lào được dùng làm thuốc cầm máu vết thương Dịch ép lá là một thuốc sát trùngtốt và được dùngbangbó vết thương và trị nhiễm khuẩn Cao toàn cây là thuốc chống loét [1].
Chữa đỉa cắn, máu chảy không ngừng: Vò lá Cỏ lào xát vào chỗ đỉa cắn, máu sẽ cầm ngay [1].
Lỵ và ỉa chảy: Lá Cỏ lào pha dưới dạng sirô từ nước hãm: Lá non rửa sạch, vò nát,h â m t r o n g n ư ớ c n ó n g , 5 g l á l ấ y 1 5 m l n ư ớ c h ã m , s a u đ ó đ e m p h ố i h ợ p v ớ i đ ư ờ n g , c ứ 5 0 0 m l n ư ớ c h ã m h ò a v ớ i n ư ớ c p h a 9 0 0 g đ ư ờ n g đ ã đ u n s ô i [ 3]. Đaunhứcxương:Nướcsắccủaládùnguống[3].
Ghẻ: Lá non sau nấu nước tắm, sau khi tắmdùngbã xát vào mụn ghẻ trong vòng5 - 6 ngày là khỏi [3].
Chữa phụ nữ bịrong kinhsaukhisinh: 30-50g lá,giã nhỏ,chếthêm nước,vắtlấy nước cốt uống [3]
Viêm xoang dị ứng hayviêm tai: Giã lávắt lấy nước, tẩm bông bôivàomũi bên đau hoặc ngoáy trong lỗ tai Có thể dùng cành, lá khô sắc nước xông mũi và uống [3].
Phươngphápđánhgiáhoạttínhchốngoxyhóa
- Cơ chế chuyển nguyên tử hydro (HAT- Hydrogen Atom Transfer): đánh giá khả năngloạibỏgốc tựdocủacácchấtchốngoxyhóabằngcáchchuyểnhydrobấtkỳ,bao gồmcácthửnghiệm:TEAC(Trolox equivalentantioxidant capacity), ORAC (Oxygen radical absorbance capacity), β -caroten/acid linoleic.
- Cơ chếchuyểnelectronđơnđộc(SET- SingleElectronTransfer): pháthiện khảnăng chống oxy hóa bằng cách chuyển một electron để một hợp chất bất kỳ như kim loại, carbonyl và các gốc tự do Các thử nghiệm theo cơ chế này bao gồm DPPH, FRAP.
+H3O+→XH+H2OM(III) +H→H+M(II) Ngoài ra còn có các thử nghiệmtheo cơ chế khác nhau: thử nghiệmđánh giá khả năng kết hợp với ion sắt II (Ion chelating activity), thử nghiệm theo cơ chế đánh giá khả năng đánh bắt gốc superoxide𝑶 𝟐• − [11,16,23].
DPPH là chất tạo ra gốc tự do được dùng để thực hiện phản ứng mang tính chất sàng lọc tác dụngchốngoxyhóa của các chấtnghiêncứu HTCOthể hiệnqua việc đánh bắt gốc tự do, làm giảm màu của DPPH, sự thay đổi màu đó sẽ được xác định bằng cách đo ở bước sóng λ = 517 nm.
Các chất có khả năng chốngoxy hóa sẽ trunghòa gốc DPPH bằngcách cho nguyên tử hydrogen, làm nhạt dần màu tím của DPPH:
HTCO(%)=[(Abschứng–Absthử)/(Abschứng–Abstrắng)]x100
Thử nghiệm DPPH được dùng phổ biến do đơn giản, nhanh chóng, cho kết quả chính xác và lặp lại, phát hiện được các chất chống oxy hóa thân dầu và thân nước, thiết bị đơn giản.
Hạn chế của DPPH là do hợp chất DPPH có một gốc tự do không giống với gốc tự do hiện diện trong cơ thể sống là các peroxid, có thể phản ứng chậm hoặc trơ toàn gốc DPPH Ngoài ra đối với nhữngchất đỉnh hấp thu cực đại ở 517 nmnhưcarotenoid xảy ra sự trùng lặp phổ.
Khả năng tiếp cận về không gian là yếu tố quyết định quan trọng của các cơ chế phản ứng, các phân tửnhỏ sẽ có khả năngchốngoxyhóa cao hơndotiếpcậndễ hơnvớicác vị trí gốc DPPH.
- Thử nghiệm đánh giá khả năng khử ion sắt III (Phương pháp FRAP- Ferric ion Reducing Antioxidant Power).
- Thử nghiệm đo lường các chất chốngoxy hóa bẫy hoàn toàn các gốc TRAP (Total Radical-Trapping Antioxidant Paramether).
Đốitượng
Nguyênliệu
Lá củacây Cỏlào đượcthu háitại tỉnhĐồng Nai vàotháng11/2019 Lá tươiđượcthu hái, rửa sạch, phơi khô, xay nhỏ đến kích thước 1 – 2 mm để chiết xuất.
Dungmôivàhóachất
Dung môi chiết và phân lập flavonoid:ethanol, cloroform, ethyl acetat, methanol doT r u n g Q u ố c s ả n x u ấ t
Thiếtbịvàdụngcụ
Silica gelsắckýlớpmỏng:bảnnhômtrángsẵnsilicagelGF254 Merck-Đức
KýnhhiểnviOlympus Merck-Đức ĐènsoiUVvớibướcsóng254và365nm Nhật
Phươngphápnghiêncứu
Nghiêncứuthựcvậthọc
2.2.1.1 Khảosátđặcđiểmhìnhtháicủabộphậndùng Chọn mẫu: dùng mẫu tươi.
Các đặc điểm như dạng sống, thân, lá, hoa được quan sát bằng mắt thường, kính hiển vi quang học, kính soi nổi, kính lúp.
CácchỉtiêuđượcxácđịnhtheocácphụlụctrongDĐVNV Xác định tro toàn phần theo phụ lục 9.8 [7]. Độ ẩm của dược liệu được thực hiện bằng phương pháp xác địnhmấtkhối lượng dol à m k h ô b ằ n g c á c h d ù n g c â n v à t ủ s ấ y á p s u ấ t t h ư ờ n g t h e o p h ụ l ụ c 9 6 [ 7].
Tất cả các chỉ tiêu thử tinh khiết nói trên đều được lấy kết quả là giá trị trungbình của 3 lần thử ở cùng điều kiện.
Nghiêncứuvềthànhphầnhóahọc
Phân tích sơ bộ thành phần hóa học của lá cây Cỏ lào theo quy trình mô tả trong giáo trình “Phương pháp nghiên cứu dược liệu” của bộ môn Dược liệu, Khoa Dược, Đạih ọ c Y D ư ợ c T P H C M , n ă m 2 0 1 3
Tiếnhành:chiếttrên20g dượcliệu,chiếtlầnlượtvớicácdungmôisauđócôcách thủycòn50mlether,50mlethanol,50mlnước,thuđượccácdịchchiếtphânđoạn.
Xác định các nhóm hoạt chất trong từng dịch chiết bằng các phản ứng hóa học đặctrưng.
Chiết cao ethanol: Cân 7 kg dược liệu, làm ẩm bằng ethanol 70% trong 1 giờ Cho dược liệu đã được làm ẩm vào bình ngấm kiệt, cho ethanol 70% ngập dược liệu 1 - 2 cm, ngâm24 giờ Sau đó rút dịch chiết với tốc độ dòng1 ml/phút Gộp các dịch chiết, cô cách thủy ở 80 o C đến cao lỏng.
Cao toàn phần đượch ò a t a n t r o n g n ư ớ c c ấ t , s a u đ ó đ ư ợ c l ắ c p h â n b ố l ầ n l ư ợ t v ớ i c l o r o f o r m , c ô t h u h ồ i d u n g m ô i đ ư ợ c p h â n đ o ạ n c l o r o f o r m D ị c h n ư ớ c đ ã l ắ c v ớ i c l o r o f o r m t i ế p t ụ c l ắ c v ớ i e t h y l a c e t a t C ô t h u h ồ i d u n g m ô i đ ư ợ c c a o p h â n đ o ạ n e t h y l acetat.
Các cao phân đoạn được khảo sát bằng SKLM để chọn ra các cao có nhiều chất, các chất thể hiện trên bảng SKLM tách tốt có tiềm năng tiến hành phân lập.
Phânlậpcácphânđoạnbằngsắcký
Nguyên tắc: Dựa trên tính chất hấp phụ khác nhau của các cấu tử trong hỗn hợp cần tách với chất hấp phụ (pha tĩnh), dùng dung môi thích hợp (pha động) chạy qua pha tĩnh để giải hấp phụ, từ đó tách riêng được từng cấu tử trong hỗn hợp.
Chiết ngấm kiệt với EtOH
Làm lạnh (loại chlorophyll), thêm nước
Lắc với CHCl 3 , cô giảm áp
Dịch nước đã lắc với CHCl 3
Lắc với EtOAc, cô giảm áp
Dịch nước đã lắc với EtOAc
Phần dịch nước Cao nước
Bột lá Cỏ làoDịch cồn 70%
+ Mục đích: khảo sát, định tính, phát hiện chất trong cao, bên cạnh đó thăm dò hệ dung môi phân tách tốt các chất, tiến hành áp dụng cho chạy cột sắc ký. +Cáchlựachọnhệdungmôi:
Khảosát vớicác dungmôi có độ phân cực từthấpđếncao sau đóđiềuchỉnhđộ phân cực bằng cách tạo tổ hợp dung môi từ các dung môi khác nhau, để tạo ra hệ có khả năng tách tốt các chất trên SKLM.
Mụcđích:phânlậpcáchợpchấttinh khiếttừ cácphânđoạnsau khiđã khảo sát bằng sắc ký lớp mỏng.
+ Chuẩn bị mẫu: Mẫu (cao dược liệu) được trộn đều với silica gel, sấy khô, nghiền mịn.
+ Nhồi cột: Hòa pha tĩnh (silica gel) trongdung môi nền, sau đó vừa khuấy đều vừa rót hỗn dịch này vào cột, mở khóa cột tối đa Dùng dung môi đưa hết chất hấp phụ đang dính trên thành cột vào hẳn trong khối chất hấp phụ trong cột Cho dung môi chảy qua cột nhiều giờ để ổn định cột.
+Nạp mẫu(phươngphápnạp mẫudạngbột khô):rắcđềumẫulênlớpsilica gel vừa đủ nằm trên đỉnh cột Sau khi nạp mẫu xong phủ lên trên bằng một lớp silica gel để bảo vệ Thêm dung môi chạy cột vào đầy cột.
Tinhchếhợpchấtflavonoid
Tinh chế: Sử dụng các loại dung môi thích hợp để loại tạp, kết tinh và rửa tinh thể flavonoid thu được.
Xác định độ tinh khiết bằng phương pháp SKLM: sản phẩm được chấm trên 3 bản mỏng riêng biệt, khai triển với 3 hệ dung môi có thành phần và tỷ lệ khác nhau, phát hiện bằng UV dưới hai bước sóng 365 nm, 254 nm, thuốc thử VS, thuốc thử FeCl3. Phát hiện bằng thuốc thử VS: sau khi nhúng thuốc thử, để bản mỏng khô tự nhiên và hơ nóngđểhiện màu, chụpảnhsắc kýđồbằngmáy ảnh kỹthuậtsố Trongmọitrường hợp, chất thu được đều cho duy nhất 1 vết gọn trên sắc ký đồ.
Phát hiện bằng thuốc thử FeCl3: sau khi nhúng thuốc thử, để bảng mỏng khô, chất kếttinh cho duy nhất 1 vết gọn trên sắc ký đồ.
Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC: Tiến hành kiểm tra tinh khiết các chất phân lập được bằng HPLC theo điều kiện sắc ký đã khảo sát Được thực hiện tại Bộ môn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm, trường Đại học Lạc Hồng.
Xácđịnhcấutrúcchấtphânlậpđược
Phương pháp khối phổ (MS)
PhổkhốicủacáchợpchấtphânlậpđượcđophổMStrên máy LC -MS Tínhiệuđược ghi nhậntheo số khối (m/z) và cườngđộ tươngđối(relative intensity, %), thực hiệntại viện Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam [9].
300 Mẫu được hòa trong dung môi, ghi nhận đỉnh hấp thu cực đại (λmax, nm), thực hiện tại Bộ môn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm, trường Đại học Lạc Hồng.
Phổ NMR được đo với các kỹ thuật 1-D và 2-D ( 1 H-NMR, 13 C-NMR, DEPT, HSQC,COSY, HMBC) Mẫu được hòa trong CDCl 3 , DMSO-d6h o ặ c M e O D Đ ộ d ờ i h ó a h ọ c t í n h t h e o t h a n g δ ( ppm) với δTMS= 0 , 0 0 ppmvà tín hiệu đo dung môi DMSO (δH=
2 , 5 0 ppm(s); δC= 3 9 , 5 ppm(t)), tín hiệu đo dung môi MeOD (δH= 3 , 3 1 ppm(s); δC=49,0ppm(t))thựchiệntrênmáy AVANCE500BrukertạiPhòngNMR,ViệnHóahọc
Kết hợp các dữliệu ghi nhận được với các dữ liệu trongcác tài liệu tham khảo để định hướng, biện giải, xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được [9].
Xácđịnhkhảnăngchốngoxyhóa
Pha dung dịch mẹ đối chiếu (acid ascorbic) 50 àg/ml trong MeOH và pha cỏc dãyn ồ n g đ ộ g i ả m d ầ n đ ể x á c đ ị n h I C50v à s o s á n h k ế t q u ả v ớ i m ẫ u t h ử
Mẫu: Cao toàn phần (TP), cao chloroform (CF), cao ethyl acetat (EA), cao nước, chấtCO1, chất CO2 Các mẫu cao được pha ở cùng một nồng độ 1 mg/ml trong MeOH và pha loãng theo nồng độ giảm dần Mẫu chất được pha ở cùng một nồng độ 0.5 mg/ml trong MeOH và pha loãng theo nồng độ giảm dần Nếu mẫu khó tan, trợ tan bằngDMSO với tỷ lệ xác định.
Tiến hành: trộnmẫu theoBảng 2.1,thực hiện phản ứng trong lọmàu nâu.Các phảnứ n g p h ả i t h ự c h i ệ n t r á n h á n h s á n g , s a u 3 0 p h ú t t h ì đ o q u a n g ở b ư ớ c s ó n g 5 1 7 n m
Bảng2.1.CáchphamẫuđocủaphươngphápDPPH Ống Dungdịchthử(ml) DungmôiMeOH(ml) DungdịchDPPH(ml)
Tínhtoánkếtquả:HTCOcủadungdịchthửđượctínhtheocôngthức:HTCO (%) (Abschứng- Absthử)/Abschứngx 1 0 0
Abs:độhấpthuđođượcở517nmCách tính giá trị IC50
Từ giai mẫu có ít nhất 5 nồng độ, trong đó phải bao hàm nồng độ cho HTCO 50%, vẽ đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của HTCO (%) theo nồng độ chất khảo sát bằng phầnmềm excel Giá trị IC50đ ư ợ c s u y r a t ừ p h ư ơ n g t r ì n h h ồ i q u y t u y ế n t í n h ŷ = a x + b
NGHIÊNCỨUTHỰCVẬTHỌC
ĐặcđiểmhìnhtháicủaláCỏlào
Cây bụi nhỏ, cao 50 – 150 cm; thân và lá có mùi hôi.Thândạnghình trụ tròn, đường kýnh 0,3 – 0,5 cm, màu xanh lá cây, thỉnh thoảng có ánh tím (thân già), có lông che chở màutrắng.Láđơn, mọcđốichéochữthập Phiếnlámàuxanhđậmở mặttrênhơn mặtdưới, dạnggần hìnhtamgiác, mũinhọndài, đáycắtngangvàhơithuôn ở gốc, dài 6 – 8 cm, rộng 3 – 5 cm, bìa phiến ở đoạn giữa có khoảng 2 – 5 răng, lông che chởm à u t r ắ n g ở h a i m ặ t ; 3 g â n c h í n h n ổ i r õ ở m ặ t d ư ớ i C u ố n g l á h ì n h l ò n g m á n g , m à u x a n h l á , d à i 0 , 8 – 1 , 5 c m , k h ô n g c ó l á k è m T h ờ i đ i ể m m ô t ả c â y , c â y c h ư a r a h o a
Nhậnxét:Đặcđiểmhìnhtháicó tương đồngvớimôtả thực v ậ t trong Từđiểncây thuốc Việt Nam của tác giả Võ Văn Chi [ 3], [9].
Đặcđiểmviphẫulá
Mô mềm đạo Nội bì
D.Lôngchechở đabào E.Lôngtiếtchânđabào,đầu đa bào
MôdàyphiếntrênM ô dày gócMô mềm đạo trên
A.Viphẫulá B.Lôngtiếtchânđabào,đầu đa bào
Kết luận: vi phẫu có các đặc điểm giống với mô tả về cây Cỏ lào của HoàngVân Nga
Soibộtládượcliệu
Đặc điểm bột lá: màu xanh, mịn, vị hơi đắng, mùi hôi Quan sát dưới kính hiển vi có các thành phần sau: Mảnh biểu bì dưới, vách uốn lượn mang nhiều lỗ khí; mảnh biểub ì t r ê n , t ế b à o v á c h u ố n l ư ợ n ; m ả n h b i ể u b ì g â n l á c á c t ế b à o d à i h ì n h c h ữ n h ậ t h a y đ a g i á c , v á c h t h ẳ n g ; l ô n g c h e c h ở đ a b à o t h ư ờ n g b ị g ã y ; l ô n g t i ế t v ớ i đ ầ u t r ò n c h ứ a c h ấ t t i ế t m à u v à n g ; m ả n h m ô m ề m c ó n h i ề u h ạ t l ụ c l ạ p ; m ả n h m ạ c h v ạ c h v à m ạ c h x o ắ n
Thửtinhkhiết
Cânk h o ả n g 2g bộtd ượ cl iệ u, đ o đ ộẩ m bằngtủ sấ y M E M M E R T , t h ự c h iệ n3 l ần ri ên g b iệ t, lấ y k ết quả tr un g bì nh Kết qu ả t rì nh bà y ởBảng 3.1.
Cân khoảng2 gbộtdược liệu, tiếnhành xác địnhđộ trotoàn phần, thực hiện 3lần, lấy kết quả trung bình Kết quả trình bày ởBảng 3.1.
Lần1 Lần2 Lần3 Trungbình ĐộẩmH% 5,22 5,26 4,86 5,11 Độtrotoànphần% 15,75 15,68 15,76 15,73
KHẢOSÁTQUYTRÌNHCHIẾTVÀTÁCHFLAVONOID
Phântíchsơbộthànhphầnhóathựcvật
Kết luận: Kết quả phân tích cho thấy lá Cỏ lào có chứa tinh dầu, carotenoid, triterpenoid, alcaloid, coumarin, anthraquinon, flavonoid, saponin, các chất khử,polyuronid Trong đó đáng chú ý là flavonoid và alcaloid.
Kếtquảquytrìnhchiếtxuất
Từ 7 kg bột dược liệu (độ ẩm 5.11%), chiết ngấm kiệt với 120 lít cồn 70%, cô thu hồi dung môi, thu được 5.8 kg cao toàn phần (độ ẩm 13.73%) Hiệu suất chiết 75.33% Hòacaocồnvớinước,lắc phânbốvớicácdungmôicloroform,ethylacetat,côthu hồi dung môi thu được các cao như sau:
Phânđoạn Khốilượng(g) Độẩm(%) Hiệusuất(%) Ghichú
Hình3.6.SKLMkiểmtracáccaophânđoạnCỏlàoKết luận:Cao EA cho nhiều vết lên màu với TT FeCl3v à V S , c h o t h ấ y t i ề m n ă n gchiết xuất và phân lập flavonoid Cao EA được chọn để thực hiện quá trình phân lập, xác định cấu trúc của chất phân lập được.
Kếtquảtáchphânđoạnflavonoidbằngsắckýcột
Cột sắc ký: cột thủy tinh đường kính 8 cm, dài 60 cm.Phatĩnh:silica gelcókíchthướchạt40-
63àm(Merck).Mẫu phõn tớch: 48 g cao EtOAc.
Dungmôikhaitriển:cloroform, cloroform-ethylacetat (tăngdầntỉlệEAtừ0 , 5 - 1%) Thể tích mỗi lọ hứng: 100ml
HCOOH (9:1:0,3) phát hiện bằng UV 254 nm, UV 365 nm, thuốc thử VS,thuốc thửFeCl 3 Gộpchungcác ốngcó thành phầntươngtựnhau thànhcác phânđoạnnhỏ tương ứng.
Kết quả từ 48 g cao EA sauk h i c h ạ y s ắ c k ý c ộ t t h u đ ư ợ c 8 p h â n đ o ạ n c h í n h , đ ư ợ c t r ì n h b à y ởBảng 3.4.
EA3 71 -136 CHCl3 1,85 Màuvàngđậm,xuấthiệntủa màuvàng
EA4 137-236 CHCl3 1,05 Màuvàng,xuấthiệntủamàu vàng
EA EA1 EA2 EA3 EA4 EA5 EA6 EA7 EA8
EA EA1 EA2 EA3 EA4 EA5 EA6 EA7 EA8
Tủa phân đoạn EA3 được rửa nhiều lần bằng chloroform để loại tạp Sau đó hòa tan hoàntoànvàkếttinhlạinhiềulầntrongmethanol KếtquảthuđượchợpchấtCO1(70mg).
EA EA2 EA3 EA4 EA5 EA6 EA7 EA8
EA EA4 EA5 EA6 EA7 EA8
Xácđịnhđộtinhkhiếtcủacácchấtphânlậpđược
Nhận xét:Trên cả 3 hệ dung môi, CO1 và CO2 đều cho một vết gọn trên sắc ký đồ.
CO1, CO2phátquangvớiUV365nm và tắtquangvớiUV 254nm, cho vết màu vàngvới thuốc thử VS, cho màu xanh đen với thuốc thử FeCl3.
Tốcđộdòng:1ml/phút Đầu dò: PDA (bước sóng 367 nm với CO-1 và bước sóng 371nm với CO-2) ĐộtinhkhiếtcủaCO1đượcxácđịnhkhoảng99,2%;củaCO2khoảng98,9%.
Xácđịnhcấutrúc
CO1 được phân lập từ cao ethyl acetat, ở dạng bột vô định hình màu vàng nhạt; tan trong methanol, tan trong cloroform, không tan trongn-hexan SKLM cho thấy CO1t ắ t quangdướiUV 254nm, phátquangdướiUV365nm, hiện màu vàngvớithuốc thửVS, hiện màu xanh đen với thuốc thử FeCl 3
PhổUV:Trên phổ UV, CO1cho đỉnhhấpthu cực đại ở bước sóng211,00nm;255,00 nm;
Quan sát phổ 13 C- CPD kết hợp phổ DEPT cho nhận định cấu trúc hợp chất CO1 như sau: có 16 tín hiệu carbon, trong đó có 10 carbon bậc IV, 5 nhóm methin (-CH), 1nhómmethyl -CH 3, t í n hiệumethylthườngở khoảng0–30ppm, nhưngnhómmethyl ở đây có độ dịch chuyển 55,5ppm, chứng tỏ -OCH3 Tín hiệu carbon ở δC1 7 5 , 9 ppml à d ấ u h i ệ u đ ặ c t r ư n g c ủ a n h ó m c a r b o n y l C - 4 f l a v o n o l Ở v ị t r í δ C9 8 , 1 ppmvà 93,3ppmlà hai tín hiệu đặc trưng của C-6 và C-8 flavonoid.
Phổproton1H-NMRkếthợp vớiphổHSQC:tạiH3 8 ppmcó3tínhiệuHsingletsắc nhọncủa-
OCH3, protonbenzentạiδH7 ,6 5 ppm(d,d;J1=2Hz,J2=8,5Hz)ghépcặpmetavới proton benzen δH 7,07ppm(d,J= 8,5 Hz) và ghép cặporthovới proton benzen tại δH 7,66ppm(d,J= 1,5 Hz).
Từ phổ NMR kết hợp với khối phổ suy ra công thức phân tử là C16H12O7.Tiến hànhgiải phổ và đối chiếu với tài liệu tham [12], xác định được CO1 là tamarixetin.
CO1,DMSO– d 6 ,500 MHz Tamarixetin,DMSO– d 6 ,600MHz STT C
CO2đượcphânlập từcao ethyl acetat, ở dạngbột kết tinh vô định hình màu vàng; tan trong methanol nóng, tan ít trong cloroform và không tan trongn-hexan SKLM cho thấyCO2tắtquangdướiUV254nm, phátquangdướiUV365nm, hiện màu vàngvớithuốc thử
VS, hiện màu xanh đen với thuốc thử FeCl3.
PhổUV:Trên phổ UV, CO2cho đỉnhhấpthu cực đại ở bước sóng211,00nm;256,00 nm;
Phổ MS:Trên phổ MS (ESI-), CO2 cho phân mảnh chính [M-H] - với m/z 315.09 tương ứng với phân tử khối là 316 đvC.
Quan sát phổ 13 C- CPD kết hợp phổ DEPT cho nhận định cấu trúc hợp chất CO2 như sau: có 16 tín hiệu carbon, trong đó có 10 carbon bậc IV, 5 nhóm methin (-CH), 1nhóm methyl -CH 3 , tín hiệu methyl thườngở khoảng0 – 30ppm, nhưngnhóm methyl ở đây có độ dịch chuyển 55,9ppm, chứng tỏ -OCH3 Tín hiệu carbon ở δC1 7 5 , 9 ppml à d ấ u h i ệ u đ ặ c t r ư n g c ủ a n h ó m c a r b o n y l C - 4 f l a v o n o l Ở v ị t r í δ C9 7 , 3 ppmvà 91,8ppmlà hai tín hiệu đặc trưng của C-6 và C-8 flavonoid.
Phổ proton1H-NMR kết hợp với phổ HSQC: tạiH3 8 ppmcó 3 tín hiệu H singlet sắcnhọncủa-OCH3, protonbenzentạiδH7 ,5 7 ppm(d,d;J1=2Hz,J2=8.5Hz)ghépcặpmetavới proton benzene tại δH 6,89ppm(d,J= 8,5 Hz) và ghép cặporthovới proton benzen tại δH 7,72ppm(d,J= 2 Hz).
Từ phổ NMR kết hợp với khối phổ suy ra công thức phân tử là C16H12O7.Tiến hànhgiải phổ và đối chiếu với tài liệu tham khảo đối chiếu với tài liệu tham khảo [14] , xác định được CO2 là rhamnetin.
CácdữliệuphổNMRcủaCO2đượcsosánhvớidữliệuphổNMRcủarhamnetin[14] được trình bày ởBảng 3.6.
CO2,DMSO– d6 ,500MHz Rhamnetin,DMSO– d6 ,500
KHẢOSÁTHOẠTTÍNHCHỐNGOXYHÓA
Tiến hành khảo sát HTCO in vitro và xác định IC50c ủ a c a o E A t h e o p h ư ơ n g p h á p đ ãtrình bày ở mục2.2.6.Chất đối chiếu sử dụng là acid ascorbic Kết quả đo độ hấp thuở b ư ớ c s ó n g 5 1 7 n m K ế t q u ả đ o đ ư ợ c g h i n h ậ n t r o n gBảng 3.7.
STT Mẫu Phươngtrỡnhhồiquy R 2 IC 50 (àg/ml)
Cao TP Cao CF Cao EACao nước Tamarixetin Rhamnetin Acid ascorbic
Bànluận
Thựcvậthọc
Đề tài đã tiến hành khảo sát đặc điểm vi học của cây Cỏ lào, góp phần vào việc xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cho dược liệu và chế phẩm sau này Cỏ lào có nhữngđ ặ c đ i ể m t h ự c v ậ t đ ặ c t r ư n g c ủ a h ọ C ú c ( A s t e r a c e a e )
M ầ n t ư ớ i ( E u p a t o r i a e ) ( L ê K i m B i ê n , 2 0 0 7 ) v à t ư ơ n g đ ồ n g v ớ i c á c đ ặ c đ i ể m c ủ a c h i C h r o m o l a e n a [ 8] Từ những đặc điểm thực vật, quat h a m k h ả o t à i l i ệ u đ ã x á c đ ị n h đ ư ợ c t ê n k h o a h ọ c c ủ a c â y
Vềmặthóahọc
Tiến hành phân tích sơ bộ thành phần hóat h ự c v ậ t c h o t h ấ y c â y C ỏ l à o t h u h á i t ạ i B i ê n H ò a , Đ ồ n g N a i c ó c h ứ a t i n h d ầ u , f l a v o n o i d , a l c a l o i d K ế t q u ả n à y p h ù h ợ p v ớ i c á c c ô n g b ố t r ư ớ c đ â y v ề t h à n h p h ầ n t i n h d ầ u , f l a v o n o i d , a l c a l o i d [ 10], [3], [1] Tuy nhiên, mẫu dược liệu không cho phản ứng với thuốc thử tannin như công bố của từ điển cây thuốc Việt Nam của tác giả
Từ 7 kgdược liệu khô tiến hành chiết xuất và phân lập được trongcao ethyl acetat có hai flavonoid là CO1 (tamarixetin – 70 mg) và CO2 (rhamnetin – 50 mg).
Tamarixetin và rhamnetin đã được phân lập trong nhiều loại thực vật khác nhau và trong loài Chromolaena odorata [28] ở các nước khác nhưng chưa thấy có báo cáo phân lập được từ loài Chromolaena odorata ở Việt Nam Tamarixetin và rhamnetin là những flavonoid tự nhiên, có tác dụng thúc đẩy làm lành vết thương [22]; chống oxy hóa[26]; khángviêm và làmgiảmsự phát triểncủa vi khuẩn [21], [29]; ngăn ngừa sự phát triển các tế bào ung thư bạch cầu, ung thư gan [24], [17].
Vềmặttácdụngsinhhọc
Về khả năng chống oxy hóa của các mẫu đo, cho thấy cao CF có hoạt tính chống oxy hóa thấp nhất; cao nhất là CO-2 (rhamnetin), rhamnetin có hoạt tính chống oxy hóag ầ n b ằ n g m ộ t n ử a a c i d a s c o r b i c
Kếtluận
Khảo sát đặc điểm thực vật của cây Cỏ lào tại Biên Hòa, Đồng Nai có những kết quả: đặc điểm hình thái, soi bột dược liệu và đặc điểm vi học phù hợp với họ Cúc(Asteraceae).
Sơ bộ thành phần hóa học: có chứa flavonoid, saponin, alcaloid, coumarin, saponin và các chất khử.
Từ cao cồn 70% tổng thu được 712,14 g cao cloroform; 145,70 g cao ethyl acetat; 1010,05 g cao nước Trong đó có 2 phân đoạn của cao ethyl acetat có kết tinh sạch,x á c đ ị n h l ầ n l ư ợ t l à t a m a r i x e t i n ( C O 1 ) v à r h a m n e t i n ( C O 2 ) Đ ế n n a y , t h e o n h ữ n g t à i l i ệ u g h i n h ậ n đ ư ợ c t h ì đ â y l à l ầ n đ ầ u t i ê n n h ữ n g c h ấ t đ ư ợ c p h â n l ậ p t ừ c a o E A c ủ a l á c â y C ỏ l à o ( Chromolaena odorata(L.) King et Robinson) Xác định được khả năng chống oxy hóa của hai chất phân lập được.
Đềnghị
Quathờigianthựchiện,đềtàiđãđạtđượcnhững kếtquảnhư trên.Nếuđềtàiđược tiếp tục, chúng tôi có một số đề nghị như sau:
- Đánhgiátácdụngdượclý(hạđườnghuyết,khángviêm,làmlành vếtthương)của cây Cỏ lào để phát triển chế phẩm chăm sóc sức khỏe.
[1] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương (2006),Cây thuốc và độngvật làm thuốc ở Việt Nam (tập 1)Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
[5] Luân, NgôQuốcPhongetal(2012),Phânlập, nhậndanhcấutrúcvàthửhoạttínhkháng oxy hóa một số flavone từ dịch chiết ethyl acetate của cây Cỏ lào (Eupatorium odoratum L.), Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, pp 172-176.
[6] Luân, Ngô Quốc Phong, Lâm Thanh Hạnh, Nguyễn Ngọc (2006), "Một số kết quả nghiên cứu thành phần hóa học của tinh dầu và flavonoid trong cây Cỏ Lào",Tạp chíKhoa học Trường Đại học Cần Thơ, 103-110.
[8]Hoàng Vân Nga(2018), "Khảo sát đặc điểm hình thái và cấu tạo giải phẫu của một số loài trong tông Mần tưới (Eupatorieae)",Khóa Luận Tốt Nghiệp Dược Sĩ Đại Học.
[9] Võ Thị Thu Nga (2018), "Nghiên cứu thành phần hóa học của cao phân đoạn ethyl acetat rau Ngót Nhật (Asystasia gangeticae)",Khóa Luận Tốt Nghiệp Dược Sĩ Đại Học.
[10] Nguyễn Thị Diễm Trang (1993),Đóng góp vào việc nghiên cứu hoá học một sốcây thuốc chi EUPATORIUM (họ cúc) ở Việt Nam., ĐHTH HN, pp 5-9.
[11] Badarinath A., Rao K M., Chetty C M S.et al.(2010), "A review on in-vitro antioxidant methods: comparisions, correlations and considerations",InternationalJournal of PharmTech Research.2(2), 1276-1285.
[12] Demirtas I., Lemoui R., Benyahia S.et al.(2018), "Isolation of phytoconstituents and evaluation of biological potentials of Berberis hispanica from Algeria",|||
[13] Ijioma S., Okafor A., Ndukuba P.et al.(2014), "Hypoglycemic, hematologic and lipid profile effects of Chromolaena odorata ethanol leaf extract in alloxan induced diabetic rats",Ann Biol Sci.2, 27-32.
[14] Kim K E., Ko K.-H., Heo R W.et al.(2016), "Artemisia annua leaf extract attenuates hepatic steatosis and inflammation in high-fat diet-fed mice",Journal ofmedicinal food.19(3), 290-299.
[15] NA Zhi, FENG Yu-long, You-kai X (2012), "Chemical constituents from aerial parts of Eupatoriumodoratum Chinese Traditional and Herbal Drugs".43(10), 1896- 1900.
[16] Ndhlala A R., Moyo M., Van Staden J (2010), "Natural antioxidants: fascinating or mythical biomolecules?",Molecules.15(10), 6905-6930.
[17] Nicolini F., Burmistrova O., Marrero M T.et al.(2014), "Induction ofG2/M phase arrest and apoptosis by the flavonoid tamarixetin on human leukemia cells",Molecular carcinogenesis.53(12), 939-950.
[18] Ongkana R (2003),Phytochemistry and Anti-malarial Activity of
[19] Onkaramurthy M., Veerapur V., Thippeswamy B.et al.(2013), "Anti-diabetic and anti-cataract effects of Chromolaena odorata Linn., in streptozotocin-induced diabetic rats",Journal of ethnopharmacology.145(1), 363-372.
[20] OwoyeleV.B.,AdedijiJ.O.,SoladoyeA.O.(2005),"Anti-inflammatoryactivity of aqueous leaf extract of Chromolaena odorata",Inflammopharmacology.13(5-6),479- 484.
[21] ParkH J., Lee S J., Cho J.etal.(2018),"Tamarixetinexhibitsanti-inflammatory activity and prevents bacterial sepsis by increasing IL-10 production",Journal ofnatural products.81(6), 1435-1443.
[22] Phan T.-T., Wang L., See P.et al.(2001), "Phenolic compounds of Chromolaena odorata protect cultured skin cells from oxidative damage: implication for cutaneous wound healing",Biological and Pharmaceutical Bulletin.24(12), 1373-1379.
[23] Prior R L., Wu X., Schaich K (2005), "Standardized methods for the determinationofantioxidantcapacityandphenolicsinfoodsanddietarysupplements",Journal of agricultural and food chemistry.53(10), 4290-4302.
[24] Shen J., Jia Q., Huang X.et al.(2019), "Study on Pharmacokinetic and Bioavailability of Tamarixetin after Intravenous and Oral Administration to Rats",Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine.2019.
[26] Thang P T., Teik L S., Yung C S (2001), "Anti-oxidant effects of the extracts from the leaves of Chromolaena odorata on human dermal fibroblasts and epidermal keratinocytes against hydrogen peroxide and hypoxanthine–xanthine oxidase induced damage",Burns.27(4), 319-327.
[27] Zachariades C., Day M., Muniappan R.et al.(2009), "Chromolaena odorata (L.) king and robinson (Asteraceae)",Biological control of tropical weeds usingarthropods.
[28] Ali-Seyed M., Vijayaraghavan K (2019), "Nutraceuticals for Wound Healing: A Special Focus on Chromolaena odorata as Guardian of Health with Broad Spectrumof Biological Activities",Nutraceuticals in Veterinary Medicine, Springer, p.^pp.N u m b e r o f 5 4 1 - 5 6 2
[29] Goda Y., Hoshino K., Akiyama H.et al.(1999), "Constituents in watercress:inhibitors of histamine release from RBL-2H3 cells induced by antigen stimulation",Biological and Pharmaceutical Bulletin.22(12), 1319-1326.
Phụlục3.Phổ13C-NMRcủaCO-1(DMSO-d 6 ,125MHz) 2
Phụlục4.Phổ1H-NMRcủaCO-1(DMSO-d 6 ,500MHz) 2
Phụlục12.Phổ1HcủaCO-2(DMSO-d 6 ,500MHz) 6
Phụlục15.Phổ13C-NMRcủaCO-2(DMSO-d 6 ,125MHz) 8
Phụlục3.Phổ13C-NMRcủaCO-1(DMSO-d 6 ,125MHz)
Phụlục4.Phổ1H-NMRcủaCO-1(DMSO-d 6 ,500MHz)
Phụlục9.PhổHSQCcủaCO1(DMSO-d6,500MHz) (vùngC
Phụlục12.Phổ1HcủaCO-2(DMSO-d 6 ,500MHz)
Phụlục15.Phổ13C-NMRcủaCO-2(DMSO-d 6 ,125MHz)