PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tƣợng nghiên cứu
Dược liệu HĐRM được thu hái toàn cây vào tháng 10/2016 tại tỉnh Bạc Liêu, sau đó được cắt nhỏ và sấy khô ở nhiệt độ 50 – 60 độ C Sau khi sấy, dược liệu được xay thành bột thô Việc định danh dược liệu được thực hiện bằng cách so sánh hình thái thực vật, vi phẫu và soi bột với thông tin từ tài liệu tham khảo thực vật học chuyên ngành.
- Dung môi: cồn 96%, ethylacetat, ether dầu hỏa
- Hóa chất: DPPH, vitamin C, bản mỏngsilica gel 60 F 254 , một số hóa chất, thuốc thử thường quy dùng trong phòng thí nghiệm
3.1.3 Trang thiết bị nghiên cứu
- Máy quang phổ UV – Vis
Phương pháp nghiên cứu
Dựa vào hình dạng bên ngoài của mẫu tươi và mẫu khô, kết hợp với tài liệu mô tả hình thái thực vật, chúng ta có thể sơ bộ xác định loài cây cần khảo sát.
- Tiến hành cắt vi phẫu
- Nhuộm vi phẫu theo các bước:
Ngâm lát cắt vào nước Javel 15 – 20 phút cho đến khi lát cắt trắng, rửa nhiều lần với nước cất
Ngâm tiếp lát cắt vào dung dịch acid acetic 3 – 5 phút, rửa nhiều lần với nước cất
Nhuộm lát cắt bằng dung dịch son phèn lục iod 2 phút, rửa nhiều lần với nước cất
Ngâm lát cắt vừa nhuộm trong nước cất
- Tiến hành soi trên kính hiển vi
Rây bột dược liệu thô qua rây có kích thước 0,25 – 0,5 mm Phần bột còn lại sẽ được xay và rây tiếp cho đến khi tất cả bột dược liệu đạt độ mịn hoàn toàn.
- Lấy một lƣợng bột dƣợc liệu khoảng bằng đầu tăm cho lên lame, nhỏ 1 – 2 giọt nước cất, khuấy kỹ
- Đậy lamelle bằng cách đặt nghiêng một cạnh lamelle lên lame rồi hạ dần đầu kia của lamelle cho đến khi lamelle nằm ngang trên mặt lame
- Dùng ngón tay gì nhẹ trên lamelle cho bột phân tán đều
- Dùng giấy lọc thấm nhanh nước thừa ở mép lamelle
- Soi trên kính hiển vi lần lƣợt với các vật kính 10x, 40x để quan sát các đặc điểm của bột dƣợc liệu
3.2.2 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học
Quy trình chiết và định tính các nhóm hợp chất từ dược liệu bằng phương pháp phân tích sơ bộ thành phần hóa học Ciulei
Dịch chiết cồn thủy phân
Dịch chiết nước thủy phân
Hình 3.1 Sơ đồ chuẩn bị các dịch chiết
Dược liệu được chiết xuất bằng phương pháp ngấm kiệt với dung môi cồn 96 O
Quy trình chiết xuất theo sơ đồ sau :
Lắc phân bố với EtOAc
Cô thu hồi dung môi
Cao PE Cao cồn còn lại
Cao cồn còn lại Cao EtOAc
Ngấm kiệt với cồn 96%, tốc độ xả 10 – 15 giọt/phút
Cô thu hồi dung môi
Lắc phân bố với PE
Cô thu hồi dung môi
Hình 3.2 Sơ đồ quy trình chiết xuất dƣợc liệu HĐRM
Sau khi chiết xuất dƣợc liệu, tiến hành xác định độ ẩm của bột dƣợc liệu và các cao với sự hỗ trợ của cân xác định độ ẩm
3.2.4 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa trong từng phân đoạn
Phương pháp ức chế gốc tự do DPPH là một trong những phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa đơn giản và dễ thực hiện, đồng thời mang lại kết quả ổn định nhất.
Vì vậy, ta chọn phương pháp này để làm thực nghiệm trên cây HĐRM
3.2.4.1 Chuẩn bị thuốc thử và mẫu thử
Để chuẩn bị dung dịch DPPH 0,6 mM trong methanol, hòa tan 5,915 mg DPPH trong một lượng methanol tối thiểu, sau đó chuyển vào bình định mức và thêm methanol đến 25 ml Sau khi pha xong, dung dịch nên được sử dụng ngay và bảo quản trong chai thủy tinh màu.
- Mẫu thử: khảo sát hoạt tính quét gốc tự do DPPH của các mẫu cao toàn phần, cao
PE, cao EtOAc và cao cồn là các dạng chiết xuất từ mẫu nguyên liệu dược liệu HĐRM Các cao này được hòa tan trong methanol để đạt nồng độ 1 mg/ml cho dược liệu khô Nếu gặp khó khăn trong việc hòa tan, có thể sử dụng DMSO để hỗ trợ.
- Đối chứng dương sử dụng là vitamin C
3.2.4.2 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các cao bằng SKLM
Phương pháp hiện màu trực tiếp trên bản mỏng đã chạy sắc ký là một kỹ thuật đơn giản và tiết kiệm, dễ thực hiện với ít thiết bị cần thiết để phát hiện các thành phần có hoạt tính Phương pháp này rất quan trọng trong việc xác định và định vị các đặc tính của chất trong quá trình phân lập các chất có hoạt tính sinh học Tuy nhiên, nó chủ yếu có tác dụng phát hiện các chất mới có hoạt tính, thường đóng vai trò là các chất dẫn đường cho các nghiên cứu tiếp theo.
- Dung dịch thử: lấy 0,1 g cao hòa tan với 2 ml MeOH
- Dung môi khai triển: chloroform – methanol – nước (100:17:13)
Sau khi khai triển, bản mỏng được quan sát dưới ánh sáng UV 254 nm và sau đó được nhúng vào dung dịch thuốc thử DPPH 0,05 %/MeOH trong 5 giây Sau 2 phút nhúng, các thành phần có hoạt tính chống oxy hóa sẽ hiện lên màu vàng sáng trên nền tím của bản mỏng, do chất chống oxy hóa làm mất màu tím của thuốc thử DPPH.
So sánh bằng mắt thường giúp ta định hướng được những phân đoạn và vết chất nào thể hiện hoạt tính chống oxy hóa
3.2.4.3 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các cao bằng quang phổ UV – Vis Đây là phương pháp giúp khẳng định chính xác hơn về hoạt tính chống oxy hóa của các cao phân đoạn
Bảng 3.1 Phản ứng thử nghiệm DPPH Ống Dung dịch thử (ml) Dung dịch MeOH (ml) Dung dịch DPPH (ml)
Hỗn hợp sau khi pha để trong bóng tối, ở nhiệt độ phòng 30 phút Đo quang ở bước sóng 517 nm
Hoạt tính đánh bắt gốc tự do HTCO (%) đƣợc tính theo công thức:
HTCO (%) = [(Abs chứng – Abs thử )/Abs chứng ] x 100 Các số liệu kết quả thử nghiệm đƣợc biểu thị bằng trị số trung bình của 3 lần đo độc lập khác nhau
Từ HTCO (%) và nồng độ mẫu dựng được đường chuẩn Dựa vào đường chuẩn tính được
IC 50 (khả năng đánh bắt 50% DPPH của mẫu) bằng cách thay y = 50 vào phương trình hồi quy tuyến tính dạng y = ax + b
Giá trị IC 50 càng thấp thì HTCO càng cao và ngƣợc lại
Mô tả định danh
- Dây leo nhờ tua cuốn mọc đối diện với cuống lá Tua cuốn màu xanh, phân thành 2 nhánh
- Thân có tiết diện bầu dục, màu xanh
- Lá: hình tim, đơn, mọc cách
Rễ bất định có tiết diện gần tròn, mọc ở các nách lá và chạy dọc theo thân và cành Khi còn non, rễ có màu hồng, sau đó chuyển sang màu vàng xám khi già và phân nhánh nhiều.
- Cụm hoa: xim, nhiều ngã dạng tán
Hình 4.1 Các bộ phận của cây HĐRM
Phiến lá có cấu trúc gân hai mặt lồi, với mặt trên hơi nhọn và mặt dưới lồi tròn Biểu bì trên gồm hai lớp, trong khi biểu bì dưới chỉ có một lớp nhưng có vách dày hơn Mô dày góc ở mặt trên có hơn 10 lớp, tập trung tại phần chóp của chỗ lồi, đôi khi xuất hiện tinh thể calci oxalat Mô dày ở mặt dưới có từ 2 đến 4 lớp tế bào, trong khi mô mềm đặc chứa các tế bào hình đa giác với kích thước không đồng nhất Mô mềm giậu phát triển dày đặc hai bên phiến lá.
Bó libe là cấu trúc gỗ được xếp thành từng bó riêng biệt, tạo thành hình vòng tròn, trong đó mỗi bó bao gồm gỗ và libe liền kề Xung quanh các bó libe – gỗ có sự hiện diện của tinh thể calci oxalat hình cầu gai, trong khi tinh thể calci oxalat hình kim được sắp xếp thành từng bó riêng.
Hình 4.2 Vi phẫu phiến lá HĐRM và sơ đồ kèm theo
Tinh thể calci oxalat hình cầu gai
Tinh thể calci oxalat hình kim
Hình 4.3 Chi tiết các bộ phận trong phiến lá
Cuống lá có cấu trúc mô dày với 2 – 4 lớp, tạo thành các vùng dày mỏng khác nhau Mô mềm đạo chiếm ưu thế trong cấu trúc, mở rộng từ lớp vỏ vào vùng trung trụ, bao gồm các tế bào hình đa giác với kích thước không đồng nhất.
Bó libe – gỗ nằm rời rạc, bó libe gần nhƣ bao quanh lấy bó gỗ Xuất hiện nhiều tinh thể calci oxalat hình cầu gai
Hình 4.4 Vi phẫu cuống lá HĐRM và sơ đồ kèm theo
Tinh thể calci oxalat hình cầu gai
Hình 4.5 Chi tiết các bộ phận trong cuống lá
Tinh thể calci oxalat hình cầu gai
Thân già có tiết diện hình bầu dục với lớp biểu bì hóa bần Mô dày góc bao gồm 4 – 5 lớp tế bào hình bầu dục xếp thành vòng liên tục, trong khi tinh thể calci oxalat hình cầu gai xuất hiện rải rác khắp thân Mô mềm đạo ở phần vỏ và mô mềm đặc ở phần tủy, với mô mềm đặc ở tủy chủ yếu là những tế bào hình tròn chiếm phần lớn diện tích của thân.
Bó libe là phần gỗ không phát triển mạnh, với libe 1 nằm ở đỉnh và libe 2 ở dưới Bó gỗ 2 phát triển hơn, trong khi gỗ 1 vẫn tồn tại Ngoài gỗ 1 có lớp vòng mô cứng bao quanh Xung quanh bó libe, có sự hiện diện của các tinh thể calci oxalat hình cầu gai phân tán Đám mô cứng bao gồm các tế bào hình đa giác, xếp khít nhau với kích thước không đồng đều, nằm ngay trên đầu các bó libe.
Hình 4.6 Vi phẫu thân già HĐRM và sơ đồ kèm theo
Mô mềm vỏ Đám mô cứng
Hình 4.7 Chi tiết các bộ phận trong thân già
Tinh thể calci oxalat hình cầu gai
Cấu trúc vi phẫu của thân non HĐRM tương tự như thân già, nhưng lớp biểu bì của thân non chưa trải qua quá trình hóa bần Vòng mô cứng trong thân non dày và được sắp xếp thành các vòng bao quanh bó gỗ.
Hình 4.8 Vi phẫu thân non HĐRM và sơ đồ kèm theo
Mô mềm vỏ Vòng mô cứng
Hình 4.9 Chi tiết các bộ phận trong thân non
Rễ già bất định có tiết diện tròn với lớp bần dày từ 4 đến 6 lớp tế bào hình chữ nhật xếp sát nhau, có vách tẩm suberin dày Mô mềm khuyết ở vỏ chứa tinh thể calci oxalat hình cầu gai phân bố rải rác Đám trụ bì được tẩm mộc tố, tạo thành các tế bào hóa mô cứng Các bó libe và gỗ đan xen, xếp thành vòng tròn tại tâm rễ.
Hình 4.10 Vi phẫu rễ già bất định HĐRM và sơ đồ kèm theo
Tinh thể calci oxalat hình cầu gai
Mô mềm vỏ Đám mô cứng
Hình 4.11 Chi tiết các bộ phận trong rễ già bất định
Rễ non có cấu trúc lớp bần mỏng chỉ gồm 2-3 lớp tế bào, trong khi mô mềm ở vỏ và tủy được phân bố thành nhiều lớp với kích thước khác nhau Bó libe và gỗ được tổ chức với bó libe không phát triển xen kẽ với bó gỗ, trong đó bó gỗ 1 phát triển mạnh mẽ Đặc biệt, trong cấu trúc này không có sự hiện diện của tinh thể calci oxalat.
Hình 4.13 Chi tiết các bộ phận trong rễ non
Bó libe Hình 4.12 Vi phẫu rễ non bất định HĐRM và sơ đồ kèm theo
Bột lá có màu xanh đậm, mịn, có mùi thơm nhẹ.
- Tinh thể calci oxalat rất nhiều bao gồm 3 dạng: hình cầu gai, hình kim và hình hạt có thể xuất hiện rời rạc hoặc tụ thành bó, đám
- Mạch có nhiều dạng: mạch vạch, mạch xoắn
- Lông che chở đa bào bị gãy.
Tinh thể calci oxalat hình kim và hình cầu gai
Mạch xoắn Tinh thể calci oxalat hình cầu gai Đám tinh thể calci oxalat hình hạt
Hình 4.15 Các cấu tử trong bột lá HĐRM
Bột thân có màu nâu, hơi mịn có dạng sợi, mùi thơm nhẹ.
- Hạt tinh bột nhiều nằm rải rác khắp nơi
- Tinh thể calci oxalat rất nhiều bao gồm 2 dạng: hình cầu gai, hình kim có thể xuất hiện rời rạc hoặc tụ thành bó
- Xuất hiện khối màu có màu cam
Tinh thể calci oxalat hình kim Tinh thể calci oxalat hình cầu gai và tinh bột
Mạch vạch, khối màu và tinh bột
Bần Hình 4.17 Các cấu tử trong bột thân HĐRM
Bột rễ bất định có màu nâu nhạt, hơi mịn và có sợi, mùi thơm nhẹ.
- Trong sợi có tinh thể calci oxalat hình cầu gai
- Tinh thể calci oxalat rất nhiều bao gồm 2 dạng: hình cầu gai, hình kim có thể xuất hiện rời rạc hoặc tụ thành bó
Tinh thể calci oxalat hình cầu gai Tinh thể calci oxalat hình kim
Hình 4.19 Các cấu tử trong bột rễ HĐRM
Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học
Theo khảo sát sơ bộ bằng phương pháp Ciulei, cây HĐRM chứa nhiều hợp chất hóa học quan trọng như carotenoid, tinh dầu, flavonoid, tannin, saponin, chất khử và polyuronid Trong số đó, flavonoid là hợp chất phong phú nhất và đóng vai trò quan trọng nhất trong thành phần hóa học của cây.
( ): không thực hiện phản ứng (-): âm tính (+): dương tính (++): dương tính mạnh (+++): dương tính rất mạnh
Thuốc thử cách thực hiện Phản ứng hóa học Kết quả định tính trên dịch chiết Kết luận chung
Dịch chiết cồn Dịch chiết nước Không thủy phân
Thủy phân Không thủy phân
Chất béo Nhỏ dung dịch lên giấy Vết trong mờ - -
Carotenoid Carr – price Xanh chuyển sang đỏ - -
H 2 SO 4 Xanh dương hay xanh lục ngả sang xanh dương
Tinh dầu Bốc hơi đến cắn Có mùi thơm + +
Liebermann - burchard Đỏ nâu – tím, lớp trên có màu xanh lục
Alkaloid TT chung alkaloid Kết tủa - -
Coumarin Phát quang trong kiềm Phát quang mạnh hơn - - -
Anthraquinon NaOH 10% Dd kiềm có màu hồng đến đỏ - - -
Flavonoid Mg/HCl đậm đặc Dd có màu hồng đến đỏ ++
Tannin Dd FeCl 3 Xanh rêu hay xanh đen (polyphenol) + +
Dd gelatin muối Tủa bông trắng (tannin) - -
Liebermann – burchard Đỏ nâu – tím, lớp trên có màu xanh lục
Saponin TT Liebermann Có vòng tím nâu
Lắc mạnh dung dịch nước Bọt bền trong 15 phút + + +
Acid hữu cơ Na 2 CO 3 Sủi bọt - -
Chất khử TT Fehling Tủa đỏ gạch + +
Pha loãng với cồn 90% Tủa bông trắng – vàng nâu + +
Bảng 4.1 Kết quả khảo sát sơ bộ thành phần hóa học
Chiết xuất dƣợc liệu
Từ 3 kg dƣợc liệu HĐRM, sử dụng 1,6 lít cồn 96% để làm ẩm dƣợc liệu và 33 lít cồn
96% chiết ngấm kiệt với tốc độ xả 10 – 15 giọt/ phút
Rút đƣợc 1 lít dịch chiết, sau đó cô cạn trên bếp cách thủy thu đƣợc 330 g cao tổng
Tiến hành lắc phân bố lần lƣợt thu đƣợc:
Bảng 4.2 Kết quả xác định độ ẩm
Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa trong từng phân đoạn
4.4.1 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các cao bằng SKLM
Hình 4.20 SKLM thăm dò hoạt tính chống oxy hóa
UV 254 nm UV 365nm Nhúng với TT DPPH
Trong nghiên cứu về tác dụng chống oxy hóa của các cao phân đoạn, tất cả các mẫu đều làm mất màu tím của thuốc thử DPPH, tạo ra màu vàng sáng Tuy nhiên, cao EtOAc cho thấy hiệu quả cao nhất với sự hiện diện màu vàng rõ rệt nhất, chứng tỏ rằng cao EtOAc có khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ nhất trong số các mẫu được thử nghiệm.
4.4.2 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các cao bằng quang phổ UV – Vis Để khẳng định chính xác hơn khả năng chống oxy hóa của các cao, tiến hành đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa trên gía trị IC 50
Khảo sát 3 cao thu đƣợc ở nồng độ 1 mg/ml Tính HTCO (%) trung bình của mỗi cao
Sau đó, chọn ra cao có HTCO (%) cao nhất, tiến hành xây dựng đường chuẩn và tính IC 50 ở 5 nồng độ khác nhau
So sánh kết quả với IC50 của chất đối chứng vitamin C
Bảng 4.3 Kết quả thăm dò khả năng chống oxy hóa của 3 cao ở nồng độ 1 mg/ml
Cao PE Ống chứng 1,03 17,18% Ống thử 0,853
Cao EtOAc Ống chứng 1,245 64,98% Ống thử 0,436
Cao cồn Ống chứng 1,192 2,85% Ống thử 1,158
Bảng 4.4 Kết quả đo độ hấp thu của cao EtOAc ở 5 nồng độ
Bảng 4.5 Kết quả đo độ hấp thu của chất đối chứng vitamin C ở 5 nồng độ
0 500 1000 1500 Độ hấp thu độ hấp thu Linear (độ hấp thu) nồng độ (àg/ml) HTCO (%) y = 1.4706x + 30.064 R² = 0.9041
0 20 40 60 Độ hấp thu độ hấp thu Linear (độ hấp thu)
HTCO (%) nồng độ (àg/ml) Hình 4.21 Biểu đồ đường chuẩn của cao EtOAc
Hình 4.22 Biểu đồ đường chuẩn của vitamin C
Qua các thông số của bảng 3.4 và bảng 3.5, vẽ vào phần mềm Excel ta có phương trình tuyến tính hoạt tính dạng y = ax + b
Thay y = 50 ta đƣợc kết quả IC 50 nhƣ bảng sau:
Bảng 4.6 Kết quả xác định giá trị IC 50 của các mẫu
Mẫu Phương trỡnh hồi quy IC 50 (àg/ml)
Kết luận: giỏ trị IC 50 của cao EtOAc là 592,03 (àg/ml) (< 1 mg/ml) Từ đú cho thấy cao EtOAc có hoạt tính chống oxy hóa tương đối cao
Bàn luận
Trên thế giới, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện về HĐRM, nhưng tại Việt Nam, loại cây này còn mới mẻ và thiếu tài liệu nghiên cứu.
Dựa trên tài liệu tham khảo, việc xác định các đặc điểm cơ bản về hình thái và vi học là rất quan trọng để phân biệt các cây trong cùng chi và cùng họ Những đặc điểm này giúp nhận diện và phân loại chính xác các loài thực vật, từ đó hỗ trợ nghiên cứu và bảo tồn đa dạng sinh học.
Cây đã được xác định tên khoa học và các đặc điểm thực vật học đúng như tài liệu tham khảo Điểm nổi bật của cây là sự hiện diện của các tinh thể calci oxalat hình cầu gai và hình kim ở hầu hết các bộ phận như lá, rễ và thân, điều này tạo nên sự đặc biệt trong giới thực vật.
Theo nghiên cứu của Barbosa et al (2002) và Beltrame et al (2001), cây HĐRM chứa flavonoid với hai cấu trúc chính là kaemferol – 3 – O – rhamnosid và quercetin – 3 – O – rhamnosid Ngoài ra, luteolin, kaempferol và luteonin – 3 – sulfat cũng được chiết xuất từ dung dịch nước sau quá trình thủy phân.
Cây HĐRM chứa nhiều hợp chất hóa học quan trọng, bao gồm flavonoid, carotenoid, tinh dầu, tannin, saponin, chất khử và polyuronid Những thành phần này góp phần vào giá trị dinh dưỡng và tác dụng dược lý của cây.
Mặc dù không tiến hành xác định cấu trúc hóa học của các chất trong cây và cây được khảo sát tại một đất nước khác, nhưng flavonoid vẫn được xác định là thành phần hóa học chính trong cây.
Nhiều tài liệu đã chỉ ra rằng cây HĐRM có tác dụng hạ đường huyết và kháng viêm, nhưng chưa có nghiên cứu nào về hoạt tính chống oxy hóa của cây Việc thử nghiệm hoạt tính sinh học này là rất cần thiết Kết quả cho thấy cây HĐRM có hoạt tính chống oxy hóa tương đối cao, đạt 64,98%.
