Bộ khoa học và công nghệ Công ty Vaccin pasteur Đà lạt Báo cáo kết quả đề tài nhánh KC 10-10/ 06-10/03 Nghiên cứu quy trình Nuôi cấy mạt bụi nhà Acarien D.pteronyssinus gây các bệnh dị ứng: Hen phế quản, viêm mũi dị ứng, viêm kết mạc Chủ nhiệm đề tài nhánh: TS. Võ Thanh Quang. Thời gian thực hiện: 01/07/2007 - 30/03/2009 7598-3 20/01/2010 Hà nội , 05 2009 Bộ khoa học và công nghệ Công ty Vaccin pasteur Đà lạt Báo cáo kết quả đề tài nhánh KC 10-10/ 06-10/03 Nghiên cứu quy trình Nuôi cấy mạt bụi nhà Acarien D.pteronyssinus gây các bệnh dị ứng : Hen phế quản, viêm mũi dị ứng, viêm kết mạc . . . Chủ nhiệm đề tài nhánh: TS. Võ Thanh Quang. Cỏn b thc hin: GS.TSKH. V Minh Thc TS. Nguyn Vn Chõu Ths. Hunh Quang Thun BSCKI. Trn Quc Tun KS. inh Vn Minh KTV. Nguyn Th Oanh Hà nội , 05 - 2009 1 §Æt vÊn ®Ò  Hàng năm bệnh hen suyễn dị ứng và viêm mũi dị ứng không ngừng tăng cao, gây nguy hại đến sưc khoẻ cộng đồng. Tổ chức Y tế thế giới WHO đã đưa bệnh dị ứng đường hô hấp là một trong ba bệnh nguy hiểm để nghiên cứu và tìm biện pháp phòng trừ. Bệnh hen do dị ứng chiếm tỷ lệ 60% trong các bệnh hen suyễn và số người mắc bệnh từ khi còn nh ỏ đến khi trưởng thành chiếm từ 30-50%. Hen suyễn xuất hiện nhiều nhất trước khi trẻ bước vào tuổi lên 7. Với trẻ mắc bệnh hen trên 6 tuổi cần phải tính đến khả năng áp dụng liệu pháp miễn dịch. Nhất là khi biết rằng trên 80% các trường hợp suyễn của trẻ em có nguồn gốc dị ứng. Thường xuyên tái phát hen suyễn có thể gây ảnh hưởng lớn đến công việc, họ c tập, sinh hoạt hàng ngày và sự phát triển của trẻ nhỏ. Sự gia tăng bệnh viêm mũi dị ứng có hậu quả kinh tế lớn lao gây phí tổn trực tiếp về chi phí điều tri, gián tiếp về giảm số ngày công lao động và thời gian học hành. Ngoài ra triệu chứng nghẹt mũi, sổ mũi gây mất ngủ, làm giảm sự minh mẫn ảnh hưởng bất lợi đến phẩm chất đời sống, đến sự làm việc và giao tiếp. Ngày nay viêm mũi dị ứng được coi là biểu hiện tại chỗ của một bệnh dị ứng tổng quát vì quả thực viêm mũi dị ứng thường liên hệ với suyễn, 40% bệnh nhân viêm mũi dị ứng bị suyễn và 80% người bị suyễn cũng bị viêm mũi dị ứng. Điều này đưa đến quan niệm cho rằ ng viêm mũi dị ứng và suyễn là một bệnh của đường hô hấp. Nguyên nhân gây bệnh dị ứng đường hô hấp Các bệnh dị ứng đường hô hấp đã trở nên ngày càng phổ biến hơn do thời đại công nghiệp hoá: khói, bụi, hoá chất…lan toả nhiều trong không khí mà niêm mạc mũi của chúng ta lại quá mẫn cảm với các chất kích thích đó, y học gọi là dị nguyên. Ngoài ra, có những dị nguyên khác cũng có thể gây d ị ứng mũi như: mạt bụi nhà, phấn hoa, lông vật nuôi, nấm mốc, nước thơm xịt phòng… 2 Trong s ú d ng vi con mt l trng hp thng thy nht. Chỳng sng trong mụi trng m t v bi trong nh. Cú 55-90% cỏc trng hp d ng u liờn quan n con mt. Nú nh hng ln n sc kho con ngi, c bit l tr nh. Các loài đợc nghiên cứu nhiều nhất do sự phong phú và tầm quan trọng dị nguyên của chúng thuộc về họ Pyroglyphidae, đặc biệt là Dermatophagoides pteronyssinus, và D. farinae Mặc dù bằng chứng đầu tiên cho thấy mạt là nguồn dị nguyên chính trong bụi nhà đã có từ năm 1964, nhng sự hiểu biết của xã hội về tầm quan trọng của các động vật chân đốt này đã bị chậm. Có một số yếu tố khác nhau có vẻ đóng góp vào sự chậm trễ này: Mạt có chiều dài khoảng 1/3 mm, và do vậy không thể nhìn thấy đ ợc bằng mắt thờng; và nhiều ngời khó hiểu về khái niệm động vật chân đốt mà họ không thể nhìn thấy đợc Các triệu chứng, đặc biệt là hen, gây ra bởi mạt bụi là triệu chứng mạn tính và quanh năm, và do vậy bệnh nhân (hay thầy thuốc của họ) thờng không quy cho sự tiếp xúc trong nhà Trong vòng vài năm kể từ sau khi khám phá ra mạt, các chất phản ứng tét da cần thiết để làm chẩn đoán đặc hiệu tính mẫn cảm với mạt hoặc là chất lợng kém, hoặc là không đợc sử dụng rộng rãi Cho đến tận gần đây, vẫn cha có kỹ thuật chứng minh sự hiện diện của mạt trong nhà, hoặc để đo lợng dị nguyên mạt Các dị nguyên mạt có khả năng gây đáp ứng miễn dịch IgE. Những dị nguyên này có thể chiết và phân lập bằng các phơng pháp hóa sinh thông thờng, nhân bản phân tử, hoặc bằng cách sử dụng các phơng pháp phân tử. Dị nguyên mạt hiẹn diện ở cơ thể mạt, chất tiết và chất bài tiết của mạt. Các tiểu hạt phân cha một tỷ lệ lớn dị nguyên mạt. Sự hiểu biết bằng chứng hiện nay về vai trò của các dị nguyên mạt bụi nhà trong bệnh dị ứng là cơ sở tốt cho việc nghiên cứu vai trò của các dị nguyên D.pt 3 ngoài môi trờng cũng nh là cơ sở nghiên cứu, phân loại, giám định hình thái học, giám định phân tử, nuôi cấymạt bụi nhà D.pt để từ đó tạo nên một nguồn dị nguyên phục vụ cho công tác tạo nên một chế phẩm sinh học hay còn gọi là chế phẩm vaccin đặc trị dị ứng, nói một cách chính xác là đặc trị con mạt sinh vật chính gây nên các bệnh Hen phế quản, Viêm mũi dị ứng, viêm kết mạc . . . . Sử dụng chế phẩm vaccin này có thể điều tiết cân bằng Th1/Th2, thúc đẩy tính đề kháng IgG và từ đó có thể tăng tính miễn dịch của ngời bệnh với mạt bụi nhà. Xuất phát từ những ý tởng trên, nhóm nghiên cứu chúng tôi tiến hành nghiên cứu nhân nuôi mạt bụi nhà D.pteronyssinus với mục tiêu sau; 1. Nghiên cứu các loại môi trờng tối u để mạt bụi nhà sinh trởng và phát triển. 2. Xây dựng quy trình nhân nuôi mạt bụi nhà D.pteronyssinus trong phòng thí nghiệm. 4 Chơng 1 TNG QUAN TI LIU 1.1. Sự liên quan của mạt trong các dị ứng hô hấp Dekker (1928) là ngời đầu tiên đã cho rằng mạt sống trong bụi nhà và trong đệm giờng là nguyên nhân gây ra các dị ứng hô hấp. Tác giả đã thu đợc các phản ứng tét da dơng tính với các chiết xuất sản xuất từ mạt có trong bụi nhà Năm 1944, Carter, Webb và dAbrera, không biết đến bài viết của Dekker, đã mô tả ở Ceylon (Sri Lanka) một hội chứng hô hấp đặc trng bởi viêm phế quản, thờng theo kiểu hen, tăng bạch cầu ái toan trong máu ngoại biên và mờ nhất thời trong phổi nhìn thấy trên phim X quang. Hội chứng này đợc đặt tên là nhiễm mạt phổi. Trong đờm của những bệnh nhân này, các tác giả đã phát hiện một cách đều đặn mạt sống thuộc về một loài thờng thấy trong bụi nhà. Các tác giả này nghi ngờ rằng các triệu chứng phổi này gây ra bởi hít vô tình mạt vào phổi Những trờng hợp nhiễm mạt phổi mới đã đợc phát hiện ở một vài vùng khác trên thế giới, chủ yếu ở các nớc nhiệt đới Châu á, Châu Phi và Nam Mỹ Cần ly ý rằng hội chứng này đã cha từng đợc định nghĩa một cách rõ ràng từ quan điểm y học, nhng liên quan về mặt lâm sàng với một số bệnh tăng bạch cầu ái toan tơng tự, chủ yếu là các dạng nhiệt đới, ví dụ hội chứng Loeffler, bệnh tăng bạch cầu ái toan phổi hoặc bệnh tăng bạch cầu ái toan nhiệt đới Nguyên nhân thực của bệnh nhiễm mạt phổi vẫn còn cha rõ ràng. Sự hiện diện của mạt trong phổi của những bệnh nhân này cha bao giờ đợc chứng minh một cách chắc chắn và chẩn đoán chỉ dựa trên sự hiện diện của chúng trong đờm Vấn đề hen phế quản liên quan với bụi nhà đã đợc Voorhorst và Spieksma giải đáp năm 1964 ở Hà lan, chính xác là 1 thế kỷ sau khám phá đầu tiên của Bogdanov về loài mạt pyroglyphid. Những tác giả này đã chứng tỏ rằng bệnh này gây ra do hít 5 phải các dị nguyên nguồn gốc từ loài mạt Dermatophagoides, là mạt hiện diện với các số lợng lớn trong bụi nhà Hàng loạt các công trình nghiên cứu của các tác giả khác trên thế giới đã chứng minh chính MBN, đặc biệt là loài D. pteronyssinus - thành phần quan trọng nhất của bụi nhà quyết định hoạt tính KN của nó và cho rằng DNBN chỉ mang tính KN khi có mạt trong bụi . Ngoài 2 loài mạt gây dị ứng chủ yếu là D. pteronyssinus và D. farinae (còn gọi là mạt giờng), các loài MBN khác nh D. microseras, Euroglyphus maynei, E. longior, Blomia tropicalis v.v cũng có tác dụng gây dị ứng nhng hoạt tính yếu hơn. ở nớc ta, trong một công trình đã thông báo rằng D. pteronyssinus và Glycyphagus domesticus là 2 loài mạt phổ biến ở nớc ta có vai trò trong việc gây bệnh dị ứng nh HPQ và các bệnh dị ứng khác. Hình 1.1. Mạt D.pteronyssinus 1.2. Đặc điểm cấu tạo, sinh học và sinh thái của Mạt Bụi Nhà 1.2.1. Đặc điểm cấu tạo MBN thuộc ngành Chân khớp (Arthropoda), lớp Nhện (Arachnida). Chúng có kích thớc nhỏ (200 500 àm), hình oval. 6 MBN không phân chia một cách rõ ràng đầu, ngực, bụng nh các côn trùng mà đầu - ngực và bụng hợp thành một khối duy nhất gồm thể hàm và phần thân (hình 1.3). 1) Thể hàm: Gồm có miệng và bộ phận phụ. Đó là các chân xúc giác phát triển nhiều hoặc ít theo từng loài, chúng tơng ứng với râu và các kìm. Tùy theo từng loài mà các kìm có chức năng cầm nắm hoặc gộp lại với miệng thành vòi hút hay vòi châm đốt. 2) Phần thân: Ngực và bụng, gồm 3 phần: Hình 1.2. Cấu tạo mạt bụi nhà + Phần ngực: mang 2 cặp chân trớc + Thân giữa: mang 2 cặp chân sau + Thân sau: là phần sau cùng Phần thân nói chung có hình oval, có lông ở phần hông nhiều hơn phần lng và bụng. Độ dài và hình dạng lông thay đổi theo loài. 3) Vỏ (da): Có các kiểu khác nhau: + Mềm và mịn: có chức năng trao đổi nớc và hô hấp. Vỏ có thể trơn nhẵn hoặc có nếp nhăn hoặc gai rất nhỏ. + Cứng hoặc một lớp vỏ xơ cứng. 7 4) Chân: Con trởng thành có 8 chân, gồm nhiều đốt. Các lông ở chân đóng vai trò cơ quan xúc giác và đợc dùng để xác định loài. 5) Lỗ thở: Trên bề mặt thân của nhiều loài có các lỗ thở (stigmates) tơng ứng với các lỗ ống khí để hô hấp. Những lỗ này không có ở những loài hô hấp bằng da. Sự phân bố các lỗ thở cho phép xác định các bộ khác nhau. 6) Hậu môn và cơ quan sinh sản: ở mặt bụng, phần dới cùng là hậu môn. Cơ quan sinh sản nằm giữa các chân sau. MBN phân biệt đực cái. Con cái đẻ trứng. Con đực khác con cái ở hình dạng chung. 1.2.2. Đặc điểm sinh học Tuổi thọ của MBN rất khác nhau, trung bình là 3 tháng. Trong thời gian đó, con cái đẻ 1 2 lần, mỗi lần từ 20 40 trứng. Đến ngày thứ 6 trứng nở thành ấu trùng di chuyển với 3 đôi chân. Sau 6 ngày ấu trùng trở nên bất động và biến đổi thành tiền thiếu trùng (protonymphe), xuất hiện đôi chân thứ 4 và cơ quan sinh sản. Giai đoạn sau nữa là hậu thiếu trùng (tritonymphe) gần giống với mạt trởng thành. Giữa 2 giai đoạn tiền thiếu trùng và hậu thiếu trùng có thể có một giai đoạn trung gian là hypope hay deuteronymphe. Đây là giai đoạn tiềm tàng nếu nh môi trờng bên ngoài không thuận lợi cho chúng phát triển (nhiệt độ, độ ẩm, dinh dỡng ). Vòng đời từ trứng đến mạt trởng thành khoảng 1 tháng, mạt trởng thành sống thêm từ 1 đến 3 tháng. 1.2.3. Sinh thái học nói chung của các mạt bụi + Môi trờng sống của mạt bụi nhà Phần lớn mạt trong họ Pyroglyphidae sống trong tổ của các loài chim và động vật có vú, và do vậy mạt của nhóm này sống trong bụi nhà chắc đã tiến hóa từ các mạt sống trong tổ động vật, đã trở nên thích nghi với môi trờng hay tổ của ngời. Trong môi trờng này, mạt pyroglyphid thông thờng không tiếp xúc trực tiếp với ngời mà là chúng sống, phát triển và lấy thức ăn trong bụi nhà. Bụi nhà là một hỗn hợp đa dạng gồm các sợi tự nhiên và tổng hợp, da tạp động vật, các chất khoáng, muối, tro, phấn hoa, nấm và các mảnh côn trùng. Phân tích hóa học bụi nền nhà cho 8 thấy lợng chất khoáng cao và cũng có những lợng đáng kể protein và carbohydrate, ngợc lại trong đệm giờng, lợng protein cao hơn và vảy da là thành phần chính (Bronswijk, 1981). Thành phần chính của chế độ ăn của mạt bụi nhà nói chung là vảy da ngời. Do vậy, không có gì ngạc nhiên là trong nhà, mạt pyroglyphid thờng đông đảo nhất trong đệm giờng, và cũng ở ghế sofa và các đồ bọc đệm khác, vì những thứ này là những nơi mà con ngời thờng dành nhiều thời gian nghỉ ngơi và do vậy là những nơi tích lũy vảy da + Phân bố và mức độ phong phú của mạt trong bụi Mặc dù mạt bụi nhà pyroglyphid đợc phát hiện chủ yếu trong đệm giờng, nhng các nghiên cứu về sự phân bố của chúng bên trong đệm đã thu đợc các kết quả khác nhau. Maunsell và cộng sự (1968), Sesay và Dobson (1972) và Bronswijk (1973) đã phát hiện rằng các lớp trên của đệm chứa nhiều mạt, ngợc lại Mulla và ngời khác (1975), Dusbabek (1979) và Colloff (1988) đã phát hiện phần lớn mạt ở mặt bên của đệm. Sự phân bố của bụi trên bề mặt đệm bị ảnh hởng nhiều bởi kiểu của các đờng may nổi trên đệm, mép khuy và khuy cài, và ngời ta đã phát hiện thấy sự tập trung mạt ở những vị trí này (Blythe, 076) Bên cạnh đệm giờng và các đồ bọc đệm, mạt pyroglyphid còn đợc phát hiện, mặc dù ở số lợng tí hơn, trong bụi nền nhà, đặc biệt là khi nền nhà có phủ thảm. Đôi khi cũng phát hiện thấy các mạt này ở số lợng lớn trong các đồ chơi mềm của trẻ em (Hart và Young, các quan sát cá nhân), và đây có thể có tầm quan trọng trong bệnh hen ở trẻ em. Mạt ít đợc phát hiện trong gối, đồ ngủ, quần áo và rèm. Nghiên cứu gần đây của Eaton và cộng sự (1985b) đã phát hiện mạt bụi nhà pyroglyphid với số lợng đáng kể trong chỗ ngủ của động vật cảnh nuôi trong nhà Ngợc lại, mạt của họ Acaridae và Glycyphagidae phong phú hơn trong bụi nền nhà so với trong đệm, các đồ bọc v.v. Loài mạt sau có lẽ không liên quan một cách thực sự với ngời vì chúng không sống bằng nguồn vảy da mà sống dựa vào hạt ngũ cốc và các mảnh thực phẩm nhỏ khác có trong bụi nền nhà. Chỗ thích hợp chính của các mạt này là hạt ngũ cốc và các sản phẩm thực phẩm bảo quản khác, và các mạt này có thể chỉ sống nhất thời trong nhà, dù vậy trong một số hoàn cảnh mạt này có thể phát triển trong nhà (Cooreman, 1944) [...]... nhiên hai món ăn trên có lợng d nguyên thấp và do vậy đợc khuyên sử d ng để nuôi mạt d ng cho các thí nghiệm miễn d ch học D vậy, ủy ban giám T vấn Sản phẩm D nguyên gần đây khuyên rằng các chiết xuất d nguyên bụi nhà sử d ng trong các nghiên cứu lâm sàng cần không đợc chứa da ngời Chỉ d n này cũng có thể liên quan đến các chiết xuất mạt bụi nhà nuôi để sử d ng lâm sàng, do vậy cần phải tìm thức ăn... sót qua những điều kiện bất lợi này một cách tốt hơn so với ở thảm Mặc d số lợng mạt giảm xuống ở đầu mùa đông, nhng phân d nguyên do mạt thải ra vẫn còn trong môi trờng và giảm một cách từ từ hơn (Hình 1) Nh vậy, mặc d số lợng mạt cho thấy xu hớng thay đổi theo mùa, nhng các triệu chứng d ứng với d nguyên của mạt lại không thay đổi theo mùa, nh trong bệnh viêm mũi d ứng quanh năm do mạt Có thể... chúng trong việc sinh ra d nguyên Nuôi mạt trong phòng thí nghiệm có thể bằt đầu bằng chiết mạt sống từ các mẫu bụi nhà, đây có thể là một quá trình tinh xảo khéo léo 32 1.5.1 Chiết mạt từ bụi Khi cần tìm mạt bụi trong các mẫu bụi để bắt đầu nuôi trong phòng thí nghiệm, mẫu bụi đợc đặt vào trong đĩa thủy tinh petri lớn và kiểm tra d i kính hiển vi cắt đoạn Mọi mạt sống nhìn thấy cần đợc lấy ra bằng một. .. công hạn chế bằng cách sử d ng thuốc diệt nấm (Reiser và ngời khác, 1988) và do vậy, giá trị của phơng pháp này trong việc kiểm soát lâu d i sự phát triển mạt cần đợc chứng minh Các thuốc diệt nấm cũng là chất độc hại và đây chính là nhợc điểm chính cho việc sử d ng trong nhà (Saint Georges-Gridelet và ngời khác, 1988) + ảnh hởng của dinh d ng Trong môi trờng bụi nhà, mạt pyroglyphid d ng nh sống d a... tốc độ trao đổi khí ở các mạt d nguyên khác 1.4 Sinh sản và phát triển mạt bụi Các tác giả khác nhau đã nghiên cứu sự sinh sản và phát triển của mạt pyroglyphidae, chủ yếu là D pteronyssinus và D farinae Gần đây E maynei và E longior đã đợc nghiên cứu, nhng các loài khác của Pyroglyphidae cũng nh của Acaridae và Glycyphagidae đang chờ nghiên cứu Cho đến nay, các kết quả nghiên cứu thu đợc của các tác... d ng và định lợng Trong phần lớn nghiên cứu, mật độ mạt đợc thể hiện bằng số lợng mạt trong một đơn vị khối lợng bụi, tuy nhiên, cách này không tính đến tổng khối lợng bụi su tập Bảng 1 cho một ví d về những khó khăn trong việc định lợng mạt từ bụi có liên quan đến các biến số này Điều này có các ý nghĩa quan trọng không chỉ trong các nghiên cứu sinh thái học của mạt bụi, mà còn trong các nghiên cứu. .. phát tán mạt do kích thớc của chúng nhỏ d d ng vận chuyển trong không khí Bảng 2: Sự sinh sản và phát triển ở 250 C và 75% RH ở các loài mạt chính gây bệnh d ứng hô hấp và d ứng tiếp xúc Tiền Loài Sinh Tính Tốc độ Từ sinh sản (a) mắn đẻ sinh đến trởng (b) sản (c) thành (a) sản (a) trứng 9 34 58 1,79 14 - D pteronyssinus - - - 31-36; 36 Tham khảo Hart và Fain (1988) Blythe (1976); Gamal- Eddin (1983)... phụ d nguyên phóng xạ) hoặc ức chế RIA (xét nghiệm miễn d ch phóng xạ) đã đợc phát triển gần đây để định d ng và định lợng d nguyên mạt trong các mẫu bụi nhà (Lind, 1986; 17 Platts-Mills và ngời khác, 1986; Woods và ngời khác, 1986) Do các thí nghiệm này cung cấp sự đánh giá chính xác nồng độ d nguyên trong các mẫu bụi, nên chúng trở nên vô giá trong việc đánh giá lâm sàng các d nguyên mạt trong nhà. .. giản đến mức bệnh nhân có thể tự thực hiện đợc D vậy, phơng pháp này không cho thông tin về loài mạt hiện diện trong bụi và do không đo trực tiếp d nguyên, nên phơng pháp này vẫn bị hạn chế sử d ng trong các nghiên cứu lâm sàng 1.3 sinh lý học của mạt bụi 1.3.1 Dinh d ng và tiêu hóa Phần miệng của mạt bụi nhà đợc gọi là gnathosoma và chủ yếu gồm chelicera, pedipalps (chân xúc giác) và labrum (môi... cha rõ Do các d nguyên chính nhóm I đã đợc phát hiện trong phân của mạt pyroglyphid, nên các nghiên cứu thêm về sự bài tiết ở các mạt này có thể đóng góp vào hiểu biết của chúng ta về sự sản xuất d nguyên Điều tiết thẩm thấu Độ ẩm là yếu tố hạn chế chính sự phát triển và sống sót của mạt bụi và do vậy hiểu biết về quá trình điều tiết thẩm thấu có thể tạo d d ng cho các biện pháp kiểm soát mạt bằng . việc và giao tiếp. Ngày nay viêm mũi d ứng được coi là biểu hiện tại chỗ của một bệnh d ứng tổng quát vì quả thực viêm mũi d ứng thường liên hệ với suyễn, 40% bệnh nhân viêm mũi d ứng bị. học và công nghệ Công ty Vaccin pasteur Đà lạt Báo cáo kết quả đề tài nhánh KC 1 0-1 0/ 0 6-1 0/03 Nghiên cứu quy trình Nuôi cấy mạt bụi nhà Acarien D. pteronyssinus gây các bệnh d . học và công nghệ Công ty Vaccin pasteur Đà lạt Báo cáo kết quả đề tài nhánh KC 1 0-1 0/ 0 6-1 0/03 Nghiên cứu quy trình Nuôi cấy mạt bụi nhà Acarien D. pteronyssinus gây các bệnh d