0528HỖ TRỢ ĐỊNH DANH NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG DỰA TRÊN PHÂN TÍCH PHẢ HỆ VÙNG GEN TEF1

NGHIểN C U NH DANH VÀ PHÁT SINH LOÀI

Gi i thi u v gen Tef1

Hình 1.5 C u trúc gen Tef1 vƠ v trí m i khu ch đ i c a H Jecorina [12]

TỊNH HỊNH NGHIểN C U TRONG N C

Tại Việt Nam, nghiên cứu về các loài nấm Cordyceps đã được công bố từ năm 1996 đến 2001, bao gồm ba loài chính: Cordyceps sinensis, Cordyceps militaris và Cordyceps sabrolifera Ngoài ra, hai loài nấm mới được phát hiện tại khu vực miền núi Việt Nam là Cordyceps nutans và Cordyceps gunnii.

Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã tiến hành thu thập 24 loài nấm trùng hợp độc giá, thuộc họ Clavicipitaceae, bộ Hypocriales, lớp Sordariomycetes, ngành phấn nấm túi Ascomycota Hiện tại, nguồn gen các loài nấm này đang được lưu trữ tại Trung tâm Nghiên cứu bảo vệ rừng, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam Trên cơ sở nguồn gen thu thập được từ Trung Quốc và Nhật Bản, Trung tâm Nghiên cứu bảo vệ rừng đã nghiên cứu nuôi trồng thành công nấm trùng hợp trên giá thể nhân tạo Một số loài đã có quy trình công nghệ sản xuất chuyển giao cho các cơ sở sản xuất, như quy trình nuôi trồng nấm Nhộng trùng hợp (Cordyceps militaris), nấm trùng hợp bông tuyết (Isaria tenuipes) và nấm trùng hợp b xít (Cordyceps nutans).

NGHIểN C U PH H PHỂN T

Các nghiên c u phát sinh loƠi

PH M XUỂN XINH 14 là một phương pháp tiên tiến trong việc tích hợp các quá trình tinh hóa của đắc tính thành mô hình xác suất Hôm nay, chúng tôi sẽ trình bày cách thức mà phương pháp này cho phép quan sát và phân tích hiệu quả các dữ liệu liên quan.

Phương pháp hợp lý của các quyết định là cơ sở để tối đa hóa xác suất khi quan sát các dữ liệu trong một mô hình nào đó có xác suất tối đa Đối với mô hình, phương pháp này sẽ tính toán khả năng xác suất dựa trên một cơ sở tối ưu có thể có chuỗi trình tự phân tích Cơ sở tối ưu có xác suất cao nhất là cơ sở cuối cùng được chọn Ngoài ba phương pháp trên, còn có phương pháp Bayes.

1.4.2.7 Phân tìch giá tr bootstrap

Phân tích bootstrap được thực hiện nhằm kiểm tra tính chính xác và độ tin cậy cho từng nhánh trong quá trình tối ưu hóa Đầu tiên, các vị trí trong chuỗi trình tự được sắp xếp ngẫu nhiên để tạo ra nhiều mẫu phục (gọi là lặp lại bootstrap) Như vậy, các mẫu phục có kích thước giống nhau nhưng vị trí thành phần không giống nhau Sau đó, các mẫu phục sẽ được trải qua quá trình phân tích thống kê để ước lượng giá trị support (độ tin cậy) cho một nhánh Giá trị support được biểu diễn bằng tỷ lệ phần trăm, vì vậy ít nhất phải có 100 lần lặp lại, tức là 100 lần tạo mẫu phục Thông thường, người ta thực hiện với 1000 lần lặp lại.

N u m t nhóm taxa (clade) cho giá tr support t 95% tr lên thì nhƠnh c a nhóm nƠyđ ccho lƠ ng h m nh m

CÁC K THU T TRONG SINH H C PHỂN T

K thu t hi u ch nh trình t

Th i gian: t tháng 11/2013 - 5/2014 a đi m: Phòng thí nghi m Sinh H c Phơn T Tr ng i H c M Tp HCM,

68 Lê Th Trung, Tp Th D u M t, Bình D ng.

V T LI U

V t li u s d ng trong kh o sát in sillico

Annhyb: phiên b n 4.946 (Olivier Friard, 2012) lƠ ph n m m mi n phí giúp lƠm vi c vƠ qu n lý các trình t nucleotide d i nhi u đ nh d ng.

Chromas Lite phiên bản 2.1.1 của Technelysium là phần mềm miễn phí mạnh mẽ, cho phép chỉnh sửa và lưu các tập tin trình tự từ nhiều định dạng khác nhau như Fasta, text, EMBL, và SwissProt Phần mềm này đặc biệt hỗ trợ các trình tự được giải bằng hệ thống ABI, giúp người dùng dễ dàng biểu diễn và phân tích dữ liệu quang học.

Sea View: phiên b n 4.2.12 (Manolo Gouy) Sea View lƠ ph n m m mi n phí có các tínhn ng h tr cho các phơn tích t ng đ ng, s p gióng c t các trình t

MEGA: phiên b n 6.06 (Kumar, 2013) Ph n m m mi n phí dùng đ xơy d ng cơy phát sinh loƠi theo các ph ng pháp Maximum Parsimony, Maximum Likelihood, Neighbor-Joining

2.2.1.2 Các ph n m m tr c tuy n và trang web

BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/): v i các thông s m c đ nh s n trên NCBI: nh m xác đ nh đ đ c hi u c a b m i thi t k

IDT Analyzer (www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/) là công cụ hữu ích giúp xác định các thông số quan trọng của mồi như kích thước, thành phần GC, nhiệt độ tan chảy, khả năng hình thành cấu trúc hairpin loop, primer-dimer, và hetero-dimer.

NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov): giúp khai thác d li u

V t li u s d ng trong th c nghi m

Các mẫu sinh vật thu thập được từ các mụn ký sinh côn trùng trong chuyến đi thực địa tại vùng núi Langbiang đã được Học viện Sinh học TP HCM cung cấp.

2.2.2.2 D ng c , thi t b và hóa ch t

Pipetman vƠ đ u tip t ng ng Eppendorf ng đong

Máy vortex (Vortex ZX3, Velp ụ)

Máy ly tơm l nh (Hettich Universal 320R, c)

T nhi t (Multitemp III) Cơn k thu t (Satorious, c)

T hút khí đ c (Ascent Max) Máy quang ph k (Scanning UV/VIS, Smart Spec, BioRad) Máy luơn nhi t (My-Cycler Thermal, BioRad)

Máy ch p nh gel (Gel Doc XR System, BioRad)

100mM Tris-HCl pH 1M 10mM EDTA 0.5M

1% -mercaptoethanol 99.9% dd H 2 O (đƣ h p) 100àg/ml proteinase K 1mg/ml PCI Phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1 v/v/v)

Thu th p m u n m ký sinh côn trùng

Tách chi t DNA t t ng s các m u n m ký sinh côn trùng

Khuy ch đ i vùng gen Tef1 v i các c p m i t ng ng.

Gi i trình t s n ph m PCR đƣ khuy ch đ i vƠ hi u ch nh trình t

Ki m tra đ t ng đ ng b ng Blast

Xơy d ng b d li u DNA (g m các m u đƣ gi i trình t vƠ các m u s n có trên Genbank)

Dò tìm mô hình ti n hóa

Xơy d ng cơy phát sinh loƠi (b ng ph ng pháp MP, NJ, ML)

Phơn tích cơy phát sinh loƠi vƠ so sánh k t qu gi a các cơy d ng đ c vƠ v i cơy phát sinh loƠi đƣ công b c a nghiên c u tr c (Sung et al., 2007)

K t lu n tên loƠi cho m u phơn tích

PH NG PHÁP

K hai thác vƠ thu th p tƠi li u

Các cơ sở dữ liệu toàn cầu nhằm mục đích hỗ trợ các nhà sinh học trong việc trao đổi thông tin, quản lý và khai thác nghiên cứu về sinh học trên hành tinh này Những nghiên cứu này được định danh và phân loại bằng sinh học phân tử, với nhu cầu tham khảo và chia sẻ thông tin là rất cần thiết Các nghiên cứu cần tập hợp dữ liệu mẫu lẫn, có độ tin cậy cao, từ đó cung cấp thống kê chính xác để so sánh và đưa ra kết quả đúng nhất Tiêu chuẩn là chọn báo cáo thống kê dữ liệu từ các tạp chí uy tín, đặc biệt là những báo cáo có thực nghiệm liên quan đến gen Tef1 và cordyceps Việc tìm kiếm thông tin hiệu quả nhất khi sử dụng các tạp chí khoa học chuyên ngành trên Internet hoặc các cơ sở dữ liệu thông tin về Sinh học như NCBI và PubMed.

Kh o sát in sillco

Trong nghiên cứu sinh học phân tử, việc phân tích các đoạn nucleic acid (DNA) và protein là rất quan trọng Đây là những dữ liệu sinh học đặc trưng, giúp hiểu rõ hơn về các quy trình sinh học Hiện nay, thông tin này được lưu trữ chủ yếu trong các cơ sở dữ liệu lớn trên thế giới, phục vụ cho các nghiên cứu và ứng dụng trong lĩnh vực sinh học.

GenBank (NCBI, USA) vƠ m t s h th ng c s d li u khác trên th gi i Trình t nucleotide vƠ c u trúc c a gen Tef1 đ c thu nh n t ngơn hƠng gen NCBI

(www.ncbi.nlm.nih.gov) b ng các mƣ s truy c p (Accession number) c a các loƠi n m ký sinh côn trùng

2.3.2.2 Thu th p và đánh giá m i

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng công cụ BLAST, Annhyb và IDT để thu thập và đánh giá các đoạn gen Tef1 của nấm Cordyceps Sau đó, chúng tôi tiến hành so sánh, nhận xét và đánh giá các đoạn gen của nhóm tác giả Sung và cộng sự Cuối cùng, chúng tôi đã chọn ra các đoạn gen phù hợp nhất để sử dụng trong thực nghiệm.

Th c nghi m

2.3.3.1 Tách chi t D theo ph ng pháp Phenol: Chloroform không b sung ho c b sung -mercaptoethanol

2.3.3.1.1 y gi i t bào v i lysis buffer không b sung -mercaptoethanol

Sử dụng que c y vòng (vô trùng) ti n hƠnh l y m t ph n h s i n m (kho ng 1,5g) hũa tan trong ng eppendorf ch a s n 700àl dung d ch lysis buffer Công thức dung dịch lysis buffer bao gồm 70àl Tris-HCl pH 1M, 14àl EDTA 0,5M, 140àl SDS 10%, 140àl NaCl 0,5M và 266àl dd H2O.

70 àl Proteinase K 1mg/ml), đ o ng đ u Cỏc m u đ c ti n hƠnh qua đờm nhi t đ 65 o C

2.3.3.1.2 y gi i t bào v i lysis buffer có s d ng -mercaptoethanol

Dùng que c y vòng (vô trùng) ti n hƠnh l y m t ph n h s i n m (kho ng 1,5g) hũa tan trong ng eppendorf ch a s n 700àl dung d ch lysis buffer (70àl Tris-HCl

SVTH: PH M XUỂN XINH 22 pH 1M, 14àl EDTA 0,5M, 140àl SDS 10%, 140àl NaCl 0,5M, 7àl - mercaptoethanol 99,9%, 259àl dd H2O, 70àl Proteinase K 1mg/ml), đ o ng đ u. Các m u đ c ti n hƠnh qua đêm nhi t đ 65 o C

Việc tách chiết DNA bao gồm các bước cơ bản sau: (1) phá vỡ tế bào, (2) loại bỏ protein, và (3) tách DNA Để thu nhận DNA tinh khiết, người ta cần loại bỏ thành phần tạp nhiễm, trong đó protein là yếu tố quan trọng nhất Sự tách chiết dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các phân tử (acid nucleic/protein) trong hai pha không hòa tan (phenol:chloroform/nước).

Mùn ký sinh côn trùng có khả năng sinh sản mạnh mẽ, với tốc độ lên tới 13.000 vũng/phút chỉ trong 10 phút Loại bột này cần được thu dọn cẩn thận và bổ sung 700 ml dung dịch PCI (phenol/chloroform/isoamyl alcohol theo tỷ lệ 25:24:1) để đảm bảo chất lượng và hiệu quả trong quá trình xử lý.

Quá trình thực hiện bao gồm việc ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 10 phút để thu dịch nổi Tiếp theo, bổ sung 1V chloroform và tiếp tục ly tâm ở 13000 vòng/phút Sau đó, thêm 1/10V dung dịch NaOAc 3M và 1V isopropanol, ủ ở nhiệt độ 4°C trong 2 giờ Tiến hành ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 20 phút để thu dịch nổi, sau đó bổ sung thêm 1ml ethanol 70% Cuối cùng, ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C, loại bỏ dịch nổi và làm khô ethanol ở 50°C trước khi bổ sung 50µl TE 1X.

Ki m tra s n ph m DNA đƣ tách chi t

Ki m tra n ng đ DNA b ng ph ng pháp đo m t đ quang b c sóng 260nm Xác đ nh đ tinh s ch thông qua t s OD 260 /OD 280

PCR

2.3.5.1 Thành ph n ph n ng PC

B ng 2.1 ThƠnh ph n ph n ng PCR

ThƠnh ph n N ng đ Th tích

2.3.5.2 Chu k nhi t cho ph n ng PC

Hình 2.1 Chu k nhi t cho ph n ng PCR v i c p m i 983F/ 2218R

Trong đó, X lƠ nhi t đ b t c p đ khu ch đ i vùng gen Tef1

i n di

Trên gel agarose 1,5%, đ m TBE 1X, đi n th 70V, trong 50 phút Xem k t qu b ng máy ch p nh gel.

Gi i trình t

Các s n ph m khu ch đ i vùng Tef1 đ c đi gi i trình t công ty Nam Khoa.

Hi u ch nh trình t

2.3.8.1 o i b nh ng tìn hi u không chình xác hai đ u trính t kh o sát i v i các tín hi u 2 đ u mƠ m i khuy ch đ i, tín hi u th ng l n vƠ có biên đ không n đ nh, các đ nh tín hi u không r rƠng V i các tin hi u g n cu i trình t , c ng đ th ng r t th p vƠ không th phơn bi t r rƠng các đ nh Vi c đ c base vùng nƠy hoƠn toƠn không đ m b o đ c đ tin c y vƠ c n đ c lo i b

2.3.8.2 i m tra các sai l ch gi a hai k t qu gi i trính t

Đoạn DNA khớp sát giữa hai trình tự (mới xuôi và mới ngược) giúp giảm thiểu sai sót trong quá trình đọc, nhưng tín hiệu không rõ ràng có thể ảnh hưởng đến kết quả Do đó, một trong hai kết quả cần được đảo ngược (reverse-complement) trước khi so sánh Việc xác định sự khác biệt giữa hai kết quả trình tự (mới xuôi và mới ngược) được thực hiện bằng công cụ Dot plot và Alignment của Sea View Hai trình tự sau khi được sắp xếp cần phải tương đồng nhau, nhưng sự sai lệch thu được cho thấy các sai sót trong quá trình đọc base bằng máy tự động, cần được kiểm tra tiếp trên biểu đồ phát huỳnh quang bằng phần mềm Chromas Pro.

So sánh tín hiệu huỳnh quang tại vị trí sai lệch giữa hai ký tự quang giải trình có thể xác định được đúng loại dựa trên ngôn ngữ vị trí đó Trong một số trường hợp, các tín hiệu này không thể phân biệt, nhưng vị trí này sẽ được ghi nhận và xác nhận lại với việc sử dụng ký hiệu chung theo mẫu IUPAC (mã nucleotid mơ hồ IUPAC).

V i nh ng k t qu mƠ s khác bi t khi s p gióng c t quá l n (s t ng đ ng d i 50%) do tín hi u hu nh quang r t nhi u v trí không th phơn bi t đ c

Sự khác biệt trong DNA có thể dẫn đến nhiều trình tự xác định trên một thí nghiệm, khiến cho các trình tự này không được sử dụng để phân tích Việc hiểu chính xác các trình tự này trở nên vô nghĩa và không còn giá trị trong nghiên cứu.

Sau khi xác định các sai lệch, trình tự bộ gen (consensus) được rút ra từ hai kết quả giải trình tự nhằm kiểm tra các sai lệch Trình tự consensus là phương pháp đáng tin cậy để xác định DNA khảo sát Tuy nhiên, kết quả này cần được kiểm tra một lần nữa trên các cơ sở dữ liệu nucleotide như Genbank bằng Blastn Các sai lệch nổi bật có trong trình tự trên cơ sở dữ liệu và trình tự truy vấn cần được xem xét và kiểm tra tín hiệu huỳnh quang tại các vị trí đó để xác nhận kết quả giải trình tự Ngoài ra, việc thực hiện BLAST còn giúp kiểm tra sự nhiễm mẫu và đánh giá quá trình thu nhận và bảo quản mẫu.

Xơy d ng b c s d li u DN A

Ngoài các mẫu nấm độc trực tiếp thu nhận trình tự, trình tự của các loài nấm thuộc chi Cordyceps và các chi họ hàng trong họ Clavicipitaceae đã được tham khảo trên GenBank và sau đó được đưa vào phân tích phát sinh loài.

2.3.11 Dò tìm m hình ti n hóa

Xác định mô hình tối ưu hóa phù hợp nhất với dữ liệu bằng phương pháp Maximum Likelihood thông qua chức năng Find Best DNA/Protein Models (ML) trong phần mềm Mega 6.06 Mô hình có điểm số BIC thấp nhất được coi là mô hình tối ưu cho dữ liệu Các phương pháp Neighbour-Joining và Maximum Parsimony cũng sử dụng mô hình tối ưu hóa theo mục đích cụ thể của chương trình Mega.

Xơy d ng cơy phát sinh loƠi

Theo ph ng pháp Maximim Likelihood: đ c t o b ng ph n m m MEGA 6.06 s d ng các thông s mô hình ti n hóa t ch c n ng Test Models.

Theo ph ng pháp Neighbor Joining: đ c th c hi n b ng MEGA 6.06 Cơy ti n hóa đ c suy ra v i thu t toán Neighbor-Joining

Theo ph ng pháp Maximum Parsimony: đ c th c hi n b ng MEGA 6.06 v i thi t l p ch y v i giá tr bootstrap lƠ 1000 l n.

Việc khai thác dữ liệu từ các công bố trên thế giới giúp mở rộng cái nhìn tổng quát về vấn đề nghiên cứu, đặc biệt là trong vùng Tef1 của nấm Cordyceps Đồng thời, điều này cũng cho thấy sự cần thiết trong việc nghiên cứu về nấm ký sinh côn trùng tại Việt Nam.

Chúng tôi đã thu thập 62 trình tự gen Tef1 để phục vụ cho việc phân tích phát sinh loài Để đảm bảo tính chính xác, các trình tự gen Tef1 được tham khảo từ GenBank với nguồn gốc rõ ràng, bao gồm các tổ chức như CBS (Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Utrecht, Hà Lan), AREF (Agricultural Research Service Collection of Entomopathogenic Fungal Cultures, Hoa Kỳ) và ATCC (American Type Culture Collection Center).

B ng 3.1.Th ng tin trình t gen Tef1 đ c s d ng đ thi t l p cơy phát sinh loƠi.

6 Cordyceps cf acicularis OSC 128580 DQ522326

62 Viridispora diparietispora ATCC MYA 627 AY489630

3.2 K T QU XỂY D NG CỂY PH H PHỂN T T C S

Sau khi thu th p c s d li u c c b t GenBank, chúng tôi ti n hƠnh xơy d ng cơy ph h phơn t b ng 3 ph ng pháp NJ (Neighbor-Joining), ML (Maximum

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng phương pháp MP (Maximum Parsimony) để phân tích 62 trình tự gen từ ba loài khác nhau Tất cả các trình tự này được căn chỉnh bằng phần mềm Clustal, đảm bảo sự chính xác trong việc xác định các vị trí chứa thông tin di truyền Sau đó, chúng tôi đã sử dụng phần mềm Mega 6.06 để xây dựng cây phát sinh loài, với 1000 lần bootstrap để tăng cường độ tin cậy của kết quả.

Hình 3.1 Cơy ph h phơn t đ c xơy d ng b ng ph ng pháp NJ c a gen Tef1 v i b d li u 62 trình t

Hình 3.2 Cơy ph h phơn t đ c xơy d ng b ng ph ng pháp ML c a gen

Hình 3.3 Cơy ph h phơn t đ c xơy d ng b ng ph ng pháp MP c a gen

K t qu so sánh cơy ph h phơn t c a gen Tef1 b ng 3 ph ng pháp pháp NJ

Cơ sở phát sinh loài của Sung và côn trùng được nghiên cứu bằng các phương pháp như Neighbor-Joining, Maximum Likelihood và Maximum Parsimony Những phương pháp này đều có đặc điểm hình học tương đồng, vì vậy chúng tôi đã chọn cách tiếp cận phù hợp để xây dựng bảng phân loại cho nghiên cứu này.

ML lƠm m u phơn tích đ i di n.

Nhóm Clavicipitaceae Clade A (Clavicipitacease s.s) bao g m m t s phơn nhóm: Hypocrella clade, Shimizuomyces clade, Claviceps clade, C taii clade,

Phơn nhóm C taii, hay còn gọi là nhóm Metacordyceps, được xác định dựa trên kết quả nghiên cứu của Sung et al (2007) Nhóm Metacordyceps bao gồm một số nhóm chính như C subg Cordyceps, C subg Neocordyceps và C subg Ophiocordyceps Đặc biệt, phơn nhóm C subg Ophiocordyceps chứa Cordyceps chlamydosporia (Pochonia), được công nhận là Metacordyceps chlamydosporia theo nghiên cứu của Evans và các cộng sự.

2001) NgoƠi ra phơn nhóm C taii nƠy còn có m t s các loƠi khác nh Pochonia gonioides, Metarhizium anisopliae, Cordyceps taii, Rotiferophthora agustispora…

K t qu nƠy phù h p v i k t qu c a Sung et al., (2007)

Phơn nhóm Claviceps clade bao g m các loƠi Balanisa henningsiana, Balansia pipulaeformis, Epicholoe typhina Phơn nhóm Shimizuomyces clade g m

Shimizuomyces paradoxus EFCC 6279, Shimizuomyces paradoxus EFCC6564 vƠ phơn nhóm Hypocrella clade g m Hypocrella sp., Aschersonia planceta, Aschersonia badia, Hypocrella

Trong nhóm clade A, các phơn nhánh nh có taxa với giá trị bootstrap cao như Cordyceps chlamydosporia và Pochonia chlamydosporia đạt 99% Cordyceps taii và Metarhizium anisopliae có giá trị bootstrap 98%, trong khi Balansia henningsiana và Balansia pilulaformis đạt 94% Aschersonia badia và Hypocrella sp có giá trị 59% Những kết quả này phù hợp với phơn nhóm C taii clade theo nghiên cứu của Sung et al (2007).

Nhóm Clavicipitaceae Clade B (Ophiocordycipitaceae ) bao g m 5 phơn nhóm chính: C unilateralis clade, C ophioglossoides clade, C.gunnii clade, P lilacinus clade, C sphecocephala clade theo Sung vƠ c ng s Tuy nhiên, phơn tích c a

Chúng tôi đã sử dụng bộ dữ liệu 62 trình tự để xây dựng cây phát sinh chủng loại cho hai nhóm chính: C.gunni clade và C.ophioglossoides clade Nhóm C.gunni clade cho thấy sự đồng nhất cao với kết quả của Sung (2007), bao gồm các loài như Haptocillium balanoides và Cordyceps gunnii, với giá trị bootstrap đạt 50 Trong khi đó, nhóm C.ophioglossoides clade bao gồm các loài Cordyceps fracta và Cordyceps japonica, với giá trị bootstrap là 54%.

Nhóm Clavicipitaceae Clade C (Cordycipitaceae) có đ a hình hình h c khá t ng đ ng v i các cơy mƠ Sung đƣ d ng v i giá tr bootrap 66% Nhóm nƠy g m

2 phơn nhóm chính lƠ Simplicillium clade vƠ Cordyceps clade

Phơn nhóm Cordyceps clade g m m t s phơn nhóm chính lƠ (C subg

Ophiocordyceps, C subg Cordyceps, và C subg Bolacordyceps được xếp chung vào nhóm giới Cordyceps s s Trong đó, nhóm C subg Cordyceps bao gồm các loài như Isaria tenuipes và Cordyceps militaris, trong khi nhóm C subg Bolacordyceps có loài Cordyceps pruinosa Nhóm C subg Ophiocordyceps chứa loài Cordyceps cardinalis Tất cả các nhánh trong nhóm Cordyceps clade đều có giá trị bootstrap trên 60%.

Phơn nhóm Simplicillium clade g m các loƠi Simplicillium lamellicola,

Simplicillium lanosoniveum mƠ chúng tôi xơy d ng đ c r t t ng ng vƠ phù h p v i cơy mƠ Sung vƠ c ng s th c hi n vƠ đ t giá tr bootstrap 100%.

NgoƠi ra, các nhóm Bionectriaceae, Nectriaceae, Hypocreaceae vƠ nhóm ngo i đ u có giá tr bootstrap trên 50% vƠ cho k t qu t ng đ ng v i Sung.

Sau khi xây dựng cơ sở dữ liệu cho 62 trình tự của các loài nấm ký sinh côn trùng, chúng tôi tiến hành sử dụng các phân tích trên lâm sàng nhằm xác định các mẫu nấm sau này.

K T QU ÁNH GIÁ M I

ánh giá m i trên IDT

B ng 3.2 Th ng s đánh giá c p m i 983F/2218R khu ch đ i vùng gen Tef1

Trong đó, Tm lƠ nhi t đ nóng ch y c a m i, L lƠ chi u dƠi đo n m i, (1) lƠ m c n ng l ng liên k t t do cho kh n ng hình thƠnh c u trúc hairpin dimer, (2) lƠ m c n ng l ng liên k t t do cho kh n ng hình thƠnh c u trúc self dimer.

Liên kết giữa các nucleotide tạo thành cấu trúc hetero dimer, trong đó F-m là xuôi và R-m là ngược, với các ký hiệu base trong trình tự: R đại diện cho A hoặc G, còn Y đại diện cho C hoặc T.

Trong quá trình phân tích IDT, chúng tôi đã tiến hành đánh giá các thông số quan trọng của các cặp mồi tham khảo như chiều dài mồi, thành phần GC, nhiệt độ nóng chảy và khả năng hình thành cấu trúc kẹp tóc, cũng như primer dimer của hệ thống mới với một số tiêu chí như sau: chiều dài mồi là một yếu tố quan trọng trong phản ứng PCR, chiều dài thông thường dao động từ 18bp đến 25bp; mỗi thiết kế với hàm lượng GC không dưới 50-60% Các vùng với hàm lượng GC cao hơn có thể không biện chứng tính ổn định trong quy trình PCR, dẫn đến phản ứng kém hiệu quả Cần tránh lặp lại các base G hay.

Cấu trúc của đoạn văn có thể được viết lại như sau: Trong quá trình PCR, nhiệt độ chênh lệch giữa hai mồi xuôi và mồi ngược không nên vượt quá 5 độ C, lý tưởng là từ 2-3 độ C Để đảm bảo hiệu quả, cần duy trì nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các mồi trong khoảng 50-65 độ C Mồi thiết kế cần có nhiệt độ bắt cặp (lai) khoảng 55 độ C.

60 o C đ tránh s n ph m khu ch đ i không đ c hi u; C u trúc th c p bao g m c u trúc k p tóc (hairpin dimer ậ t b t c p gi a các base trong cùng m t oligonucleotide), self dimer (hai oligonucleotide gi ng nhau t b t c p) vƠ hetero

SVTH: PH M XUỂN XINH 35 dimer là các oligonucleotide khác nhau có thể tương tác với nhau Cấu trúc mới công bố và độ hiệu quả của phản ứng PCR sẽ phụ thuộc vào sự góp phần của các mồi vào quá trình tái tổ hợp DNA Để xác định độ bền vững của các liên kết này, người ta sử dụng khái niệm năng lượng tự do Gibbs (G) Theo hướng dẫn của IDT, giá trị tối thiểu của G liên kết cần đạt khoảng 9 kcal/mole để đảm bảo liên kết có độ bền vững đủ để không ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng PCR Do đó, việc điều chỉnh vị trí mồi, đặc biệt là ở đầu 3’, là rất quan trọng.

Qua quá trình bày các thông số đánh giá, cặp mối 983F/2218R đã thể hiện khả năng đáp ứng các tiêu chí vật lý và đánh giá một cách chính xác, đồng thời tránh được cấu trúc thô cứng, nhiệt độ nóng chảy và %GC Do đó, chúng tôi nhận thấy cặp mối 983F/2218R là cặp mối phù hợp để tiến hành thực nghiệm.

Ki m tra m i b ng B LAST

Hình 3.4 K t qu ki m tra m i b ng BLAST

Theo k t qu BLAST thì c p m i 983F/2218R khu ch đ i đ c vùng gen Tef1 c a các loƠi n m Trtirachiun sp, Veluticeps abitina, Coniophora ceregella, T đó, cho th y c p m i lƠ c p m i ph quát (universal), có đ t ng đ ng khá cao

SVTH: PH M XUỂN XINH 36 gi a trình t Tef1 vƠ trình t truy v nv i các đi m s (E =7,0; Score 3,4; Query coverage = 52%; Max ident y%).

K t qu ki m tra Annhyb c p m i 983F/2218R v i trình t gen Tef1

Hình 3.5 K t qu Annhyb c p m i 983F/2218R v i trình t gen Tef1

Kết quả phân tích gen Tef1 và Cordyceps militaris cho thấy trình tự 983F nằm ở vị trí 283bp - 305bp, trong khi trình tự 2218R nằm ở vị trí 1300bp - 1322bp, với tổng chiều dài đoạn gen thu được là 1040bp Kích thước đoạn gen này nằm trong khoảng từ 900bp đến 1200bp, như đã được tham khảo trong tài liệu trước đó [25].

T k t qu ki m tra c p m i b ng IDT, BLAST, Annhyb, chúng tôi nh n th y r ng c p m i 983F/ 2218R lƠ c p m i t i u đ dùng cho quá trìnhth c nghi m sau nƠy.

3.4 XỂY D NG QUY TRỊNH TH C NGHI M KHU CH I

VỐNG GEN TEF1 CHO CÁC M U N M Kụ SINH CỌN TRỐNG

Quy trình tách chi t phenol:chloroform đ c kh o sát đ u tiên K t qu đo m t đ quang 2 m u tiêu bi u đ c trình bƠytrong b ng 3.3

B ng 3.3 K t qu ki m tra DNA b ng quang ph k kh o sát trên 3 m u n m ký sinh c n trùng đ c tách chi t theo ph ng pháp phenol:chloroform

Theo b ng 3.3, giá tr OD A260/A280 c a các m u kh o sát nh h n so v i tiêu chu n (1,8 -

Sản phẩm tách chiết có chứa nhiều chất dinh dưỡng khác nhau, đặc biệt là protein Việc nồng độ các chất gây nhiễm cao có thể làm sai lệch kết quả kiểm tra bằng quang phổ kế Tuy nhiên, đã kiểm tra sự hiện diện của gen Tef1, phản ứng PCR và thực hiện trên các mẫu DL0038B, DL0075.

Hình 3.6 K t qu đi n di s n ph m PCR đ c tách chi t theo ph ng pháp phenol: Chloroform

Trong k t qu đi n di, ch có m u DL0075 xu t hi n b ng v i kích th c kho ng

Trong quá trình tách chiết DNA từ mẫu 1000bp, chúng tôi gặp khó khăn với mẫu DL0038B do không xuất hiện kết quả như mong đợi Điều này dẫn đến việc chúng tôi quyết định bổ sung -meracptoathanol vào quy trình tách chiết nhằm cải thiện hiệu quả thu nhận DNA.

B ng 3.4 K t qu ki m tra DNA b ng m t đ quang ph k các m u n m tách chi t có b sung -mercaptoethanol

Theo kết quả đo quang tại OD A 260/A 280 nm trong khoảng (1,6-2), tất cả các mẫu DNA thu được từ phương pháp tách chiết bằng phenol:chloroform có chất lượng cao hơn khi bổ sung -mercaptoethanol Việc sử dụng -mercaptoethanol không chỉ nâng cao độ tinh khiết của DNA mà còn mang lại kết quả đo quang chính xác hơn Kết quả cho thấy các chất theo phương pháp có bổ sung -mercaptoethanol có sự gia tăng đáng kể về chất lượng, với nồng độ giảm từ 2-10 lần.

Hình 3.7 K t qu đi n di s n ph m PCR đ c tách chi t theo ph ng pháp phenol: Chloroform có b sung -mercaptoethanol

Kết quả nghiên cứu cho thấy DNA được chiết tách từ nhiều mẫu khác nhau có độ tinh khiết cao Mẫu DL0075 cho kết quả sáng hơn so với mẫu DL0038B với kích thước sản phẩm không vượt quá 1000bp Việc sử dụng -mercaptoethanol đã giúp cải thiện đáng kể hiệu suất trong quá trình tách chiết DNA Sau khi xây dựng quy trình thí nghiệm, chúng tôi đã thành công trong việc khuếch đại vùng gen Tef1 từ các mẫu nấm ký sinh côn trùng bằng phương pháp tách chiết bằng phenol:chloroform có bổ sung -mercaptoethanol Chúng tôi cũng đã tối ưu hóa nhiệt độ và điều kiện phản ứng cho cặp mồi 983F/2218R nhằm nâng cao hiệu quả tách chiết.

B ng 3.5 K t qu ki m tra DNA b ng m t đ quang ph k các m u n m tách chi t có b sung -mercaptoethanol

Qua quá trình tham kh o tƠi li u, chúng tôi đƣ k th a nhi t đ b t c p Ta= 55 o C đ khu ch đ i vùng gen Tef1 c a n m ký sinh côn trùng [42]

Hình 3.8 K t qu đi n di s nph m PCR v i 4 m u n m

Tổ hợp gen Tef1 đã được phát hiện với kích thước khoảng 1000bp, phù hợp với kích thước sản phẩm khuếch đại khoảng 1020bp, như đã được nghiên cứu trước đó [14] Kết quả phân tích cũng cho thấy sự xuất hiện của các mẫu mục tiêu sáng với bốn mẫu DL006, DL0038B, DL0069 và DL0077A Dựa trên kết quả thực nghiệm, chúng tôi đã xác định nhiệt độ ủ thích hợp là 55 độ C cho quá trình khuếch đại vùng gen Tef1 cho hai mẫu tiếp theo là DL0015 và DL0075.

Hình 3.9 K t qu đi n di s n ph m PCR v i 2 m u n m

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng hai mồi DL0015 và DL0075 để khuếch đại vùng gen Tef1 với kích thước sản phẩm khoảng 1020bp Kết quả cho thấy, TaU ở 0°C đã cho hiệu suất khuếch đại tốt cho các vết sáng với kích thước dưới 1000bp.

Nh v y, chúng tôi đƣ xơy d ng đ c quy trình th c nghi m vƠ t i u hóa nhi t đ b t c p đ khu ch đ i vùng gen Tef1 c a n m ký sinh côn trùng

Hình 3.10 K t qu thi t l p chu k nhi t PCR khu ch đ i vùng gen Tef1 c a n m ký sinh c n trùng ki m tra quy trình tách chi t DNA theo ph ng pháp phenol:chloroform có

SVTH: PH M XUỂN XINH 41 b sung -mercaptoethanol vƠ t i u hóa nhi t đ b t c p c ng nh s n ph m khu ch đ i, chúng tôi ti n hƠnh ch y đi n di v i 6 m u DL006, DL0038B, DL0069D, L0077A, DL0015, DL0075

Hình 3.11 K t qu đi n di s n ph m PCR v i 6 m u n m

Kết quả nghiên cứu cho thấy, tất cả 6 mẫu đầu của các băng rRNA có kích thước 1000bp phù hợp với kích thước sản phẩm khuếch đại (~1020bp) theo báo cáo của Sung và cộng sự [14] Ngoài ra, các giống ơm cũng không xuất hiện băng nơ.

Do đó, chúng tôi ti n hƠnh g i m u t i công ty Nam Khoađ gi i trình t

3 5 K T QU HI U CH NH TRỊNH T

K t qu hi u ch nh trình t v i SeeView vƠ Chromas Pro

Trình t sau khi đ c xác đ nh b ng h th ng máy t đ ng (nh ABI…) ch a th s d ng ngay cho vi c phơn tích Vi c đ c base t đ ng do các máy th c hi n

Gọi là base-calling tự động, quá trình này có thể gặp phải sai sót trong việc xác định các tín hiệu huỳnh quang, dẫn đến việc máy tính nhận diện không chính xác Khoảng cách không đồng đều giữa các tín hiệu có thể làm cho việc nhận diện trở nên khó khăn, ảnh hưởng đến kết quả cuối cùng Mặc dù đã có nhiều tiến bộ trong thuật toán nhằm cải thiện độ chính xác, nhưng tỷ lệ sai sót vẫn có thể xảy ra, gây ra những sai lầm nghiêm trọng trong phân tích sau này Do đó, việc áp dụng các biện pháp hiệu chỉnh là cần thiết để tối ưu hóa quá trình xác định các base Kết quả của nghiên cứu này đã trình bày 6 mẫu ký sinh côn trùng được phân tích.

SVTH: PH M XUỂN XINH 42 là phần mềm mới nhất trên nền tảng Chromas Lite 2.1.1, cùng với các phần mềm khác như Seeview và Annhyb Nghiên cứu này sẽ trình bày chi tiết về việc hiện chỉnh nh m u DL0077 trên máy xuôi.

Chiều dài trình tự Tef1 mRNA DL0077 trước khi hiển thị chính xác có chiều dài 1026bp và mRNA ngược có chiều dài 1093bp Hai mRNA này có các đỉnh rõ ràng, ngoại trừ một số tín hiệu không rõ ràng ở đầu và cuối, cho thấy sự tồn tại của mismatch trong trình tự.

Hình 3.12 Hi u ch nh tín hi u nhi u t i vùng (1) đ u m ch xu i (5’-3’)

Tín hiệu huỳnh quang trong vùng 1 không rõ ràng và có hai mặt Các tín hiệu chồng lấp lên toàn bộ trình tự, dẫn đến khó khăn trong việc xác định các cơ sở Do đó, trong vùng này, không thể thực hiện phân tích chính xác và cần được loại bỏ.

Hình 3.13 Hi u ch nh tín hi u nhi u t i vùng (2), (3), (4) đ u m ch xu i (5’-3’)

Khu vực (2) và (4) là những vùng tín hiệu sử dụng mạng di động mạnh mẽ Tín hiệu trong khu vực này được truyền tải một cách liên tục và ổn định, giúp đảm bảo chất lượng cuộc gọi và dữ liệu Do đó, kết quả hiển thị trên mạng di động sẽ chính xác hơn, mang lại trải nghiệm người dùng tốt hơn.

Hình 3.14 V trí sai l ch vùng (2) đ u m ch xu i (5-3’)

Hình 3.15 V trí sai l ch vùng (4) đ u m ch xu i (5-3’)

Vùng (2) và (4) không có sự kết nối giữa hai mạch chính tại vị trí (58), dẫn đến tín hiệu mạch xuôi rời rạc Do đó, cần phải xác định chính xác vị trí của ch thành ch g, từ đó hiểu rõ tín hiệu mạch bằng cách sử dụng ký tự chữ cái thường.

B ng 3.6 Hi u ch nh các nucleotide t i v trí vùng (2), (4)đ u m ch xu i

V trí m ch F Nu g c Nu hi u ch nh

Vùng hiu ch nh t i (3) xuất hiện hai vị trí mismatch nằm giữa Nu (61) và Nu (62) của mạch xuôi Tại vị trí này, mạch ngược có các tín hiệu không rõ ràng và bị trùng lặp lên nhau, dẫn đến việc hai vị trí này mạch ngược sẽ được loại bỏ.

K T QU SO SÁNH V I C S D LI U GENBANK

B ng 3.10 K t qu so sánh trình t Tef1 đƣ h u ch nh v i các trình t trên

Tái kiểm tra vị trí các sai lệch trên biểu đồ tín hiệu huỳnh quang là rất quan trọng Việc chấp nhận các sai lệch và ghi nhận các kết quả hiển thị trong quá trình tái kiểm tra giúp đảm bảo độ chính xác và đáng tin cậy của tín hiệu huỳnh quang tại những vị trí này.

K T QU XỂY D NG CỂY PH H PHỂN T

Lý thuy t

Chúng tôi đã xây dựng thành công quy trình khảo sát in silico nhằm xác định các mẫu năng lượng sử dụng dữ liệu từ 62 trình tự tham khảo Sử dụng các công cụ như IDT, BLAST và Annhyb để đánh giá, chúng tôi cũng phát triển được một cơ sở dữ liệu phong phú từ 62 trình tự bằng ba phương pháp NJ (Neighbor Joining), ML (Maximum Parsimony) và ML (Maximum Likelihood).

Th c nghi m

Chúng tôi đã xây dựng quy trình thực nghiệm nhằm khuếch đại vùng gen Tef1 của sáu mẫu nấm ký sinh côn trùng, bao gồm quy trình tách chiết DNA và tối ưu hóa nhiệt độ cho khuếch đại vùng gen này Bài viết trình bày chi tiết về sáu mẫu nấm ký sinh côn trùng và cung cấp cơ sở khoa học để xác định tên loài của các mẫu nấm này.

NGH

Trong th i gian t i, m t s h ng nghiên c u ti p t c th c hi n cho đ tƠi nh :

Chúng tôi đã tiến hành định danh thêm các mẫu nấm ký sinh côn trùng khác bằng cách kết hợp kỹ thuật phân tích gen Tef1 Kết quả cho thấy danh sách các loài nấm được xác định có độ chính xác cao, đặc biệt là những mẫu nấm chưa được xác định trước đây Ngoài ra, chúng tôi dự kiến sẽ kết hợp thêm một hoặc hai vùng gen khác để mở rộng việc định danh các loài nấm này.

TÀI LI U TI NG VI T

[1] Bùi Chí B u, Nguy n Th Lang, (1999), "Di truy n phơn t - Nh ng nguyên t c c b n trong chon gi ng cơy tr ng", hà xu t b n ông nghi p, thành ph H Chì Minh.

[2] L i HƠ T Hoa, (2006), “ nh danh n m Trichoderma d a vƠo trình t vùng ITS ậ rDNA vƠ vùng Tef1”

[3] Nguy n D ng Khuê, 2005 “S d ng n m Metarhizium anisopliae Sorok phòng tr m i nhƠ (Coptotetrmes formosanus Shiraki) theo ph ng pháp lơy nhi m”, H i ngh côn trùng h c toàn qu c l n th 5 HƠ N i 11-12/04/2005

Phạm Quang Thùy (2013) đã trình bày nghiên cứu về ông trùng hạ thổ trong nuôi trồng thủy sản tại hội thảo quốc tế về công nghệ sản xuất nông nghiệp công nghệ cao tại Việt Nam.

[5] Tr nh Tam Ki t (2001), “Danh l c các loƠi th c v t Vi t Nam (ph n N m)”, hà xu t b n ông nghi p, Hà i.

TÀI LI U TI NG ANH

[6] Baldauf, S.L., Doolittle, W.F (1997), “Origin and evolution of slime molds (Mycetozoa)” Proc Natl Acad Sci USA 94, pp 12007-12012

[7] Berkeley, M.J., Broome, C.E (1875), “On the fungi of Ceylon”, Journal Linnean Society 14, pp 110

[8] Buyck B, Hofstetter V (2011), “The contribution of tef-1 sequences to species delimitation in the Cantharellus cibarius species complex in the southeastern USA”, Fungal Diversity 49, pp 35-46

[9] Castlebury L A., Rossman A Y., Sung G H., Hyten A S., Spatafora J W

(2004), “Multigene phylogeny reveals new lineage for Stachybotrys chartarum, the indoor air fungus”, Mycol Res 108, pp 864-872

[10] Cho S, Mitchell A, Regier JC, Mitter C, Poole RW, Friedlander TP, Zhao S,

(1995), “A highly conserved nuclear gene for low-level phylogenetics:

SVTH: PH M XUỂN XINH 57 elongation factor-1 alpha recovers morphology-based tree for heliothine moths”, Mol Biol Evol 12 (4), pp 650

[11] Dowell K (2008), “Molecular Phylogenetics: an introduction to computation methods and tools for analyzing evolutionary relationship”, Math 500, pp

[12] Druzhinina I., Kubicek C P (2005), “Species concepts and biodiversity in Trichoderma and Hypocrea: from aggregate species to species clusters”, Journal of Zhejiang University SCIENCE 6B(2), pp 100-112

[13] Hajek, A.E and R.J St Leger.( 1994), “Interactions between fungal pathogens and insect hosts” Annu Rev Entomol 39, pp 293-322

[14] Hodge K T., Krasnoff S B., Humber R A (1996), “Toiypocladium injatum isthe anamorph of Cordyceps subsessilis”, Mycologia 88(5), pp 715-719

A study by Itoh et al (1994) published in Archives of Biochemistry and Biophysics investigates how iron ions can cause damage to mitochondrial DNA in HTC rat hepatoma cell cultures The research highlights the critical role of antioxidants in protecting mitochondrial DNA from oxidative stress, underscoring the importance of these protective agents in cellular health.

[16] Kobayasi Y (1982), “Keys to the taxa of the genera Cordyceps and Torrubiella”, Transactions of the Mycological Society of Japan 23, pp 329-

[17] Kuo H C.,Su Y L., Yang H L., Chen T Y (2005), “Identification of Chinese Medicinal Fungus Cordyceps sinensis by PCR- Single-Stranded Conformation Polymorphism and Phylogenetic Relationship” J gris Food

[18] Li SP, Li P, Dong TTX, Tsim KWK, (2001), “Anti-oxidation activity of different types of natural Cordyceps sinensis and cultured Cordyceps mycelia’’, Phytomedicine, 8 (3), pp 207-212

[19] Linz JE, Lira LM, Sypherd PS (1986),"The primary structure and the functional domains of an elongation factor-1 alpha from Mucor racemosus" J Biol Chem 261(32), pp 15022ậ15029

[20] Liu, Z.Y., Liang, Z.Q., Whalley, A.J.S., Liu, A.Y and Yao, Y.J (2001), “A new species of Beauveria, the anamorph of Cordyceps sobolifera”, Fungal Diversity 7, pp 61-70

[21] Mao X.L.(2000), “The macrofungi in China”, Henam Technical and Science Publication House

[22] Matheny, P B., Wang Z., Binder M., Curtis, J M., Lim, Y W., Nilsson, H R.,

Hughes, K W., Hofstetter, V., Ammirati, J F., Schoch, C., Langer, E., Langer, G., McLaughlin, D J., Wilson, A W., Frứslev, T., Ge, Z W., Kerrigan, R W., Slot, J C., Yang, Z L., Baroni, T J., Fischer, M., Hosaka,

K., Matsuura, K., Seidl, M T., Vauras, J., and Hibbett, D S (2007)

“Contributions of rpb2 and tef1 to the phylogeny of mushrooms and allies (Basidiomycota, Fungi)”, Molecular Phylogenetics and Evolution 43, pp 430-

[23] McCoy, C.W.(1990), “Entomogenous fungi as microbial pesticides”, pp 139-

159 In R.R Baker, and P.E Dunn (eds.), New Directions in Biological Control Alan R Liss, New York pp 139-159

[24] Moldave, K (1985), “Eukaryotic protein synthesis”, Annual review of biochemistry 54, pp 1109-1149

[25] Pokalsky A R, Hiatt W R, Ridge N, Houck C M and Shewmaker C K (1989),

“Structure and expression of elongation factor 1 alpha in tomato”, Nucleic Acids Res 17 (12), pp 4661- 4673

[26] Rehner.S.A, Buckley.E, (2005), “A Beauveria phylogeny inferred from nuclear ITS and EF1-a sequences: evidence for cryptic diversification and links to Cordyceps teleomorphs”, Mycologia 97(1), pp 84ậ98

[27] Shah, P.A and J.K Pell.,(2003), “Entomopathogenic fungi as biological control agents” Appl Microbiol Biotech.61, pp 413-423

[28] Sun, Y.J., Lü, P., Ling, J.Y., Zhang, H.X., Chen, C., Zhang, C.K (2003),

“Nucleosid from Cordyceps kyushuensis and the distribution of two active components in its different parts”, Yao Xue Xue Bao, 38(9), pp 690 ậ 694

[29] Sung G H., Sung J M., Hywel-Jones N L., Spatafora J W (2007), “A multi- gene phylogeny of Clavicipitaceae (Ascomycota, Fungi): Identification of

SVTH: PH M XUỂN XINH 59 localized incongruence using a combinational bootstrap approach”, Molecular

Phylogenetics and Evolution, in press

[30] Sung Gi-Ho, Hywel-Jones Nigel L., Sung Jae-Mo, Luangsa-ard J Jennifer, Shrestha Bhushan, Spatafora Joseph W (2007), “Phylogenetic classification of Cordyceps and the clavicipitaceous fungi”, Stud Mycol 57 (1), pp 5ậ59

[31] Sung Jae Mo ,(2000) “Insect-born fungus of Korea”, Kangwon National Univ., Korea

[32] Waddington M, (2009),”Identification of Fungi Using Ribosomal Internal Transcribed Spacer (ITS) DNA Sequences”, Pharmaceutical Technology

[33] Wang BJ, Won SJ, Yu ZR, Su CL, (2005), “Free radical scavenging and apoptoric effects of Cordyceps sinensis fractionated by supercritical carbon dioxide”, Food chem toxicol 43 (4), pp 543-552

[34] Wang, S.Y., Shiao, M.S (2000), “Pharmacological functions of Chinese medicinal fungus Cordyceps sinensis and related species”, Journal of Food and Drug Analysis 8 (4), pp 248 ậ 257

In their 1990 study, White et al presented a method for amplifying and directly sequencing fungal ribosomal RNA genes, which is essential for phylogenetic analysis This work is detailed in the book "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications," edited by Innis et al., and published by Academic Press in San Diego The findings, spanning pages 315 to 322, contribute significantly to the field of molecular biology by enhancing the understanding of fungal taxonomy through improved sequencing techniques.

[36] Xie, J.W., Huang, L.F., Hu, W., He, Y.B., Wong, K.P (2010), “Analysis of the main nucleosids in Cordyceps sinensis by LC/ESI-MS”, Molecules 15, pp 305 ậ 314

[37] Yoshikawa, N., Nakamura, K., Yamaguchi, Y., Kagota, S., Shinozuka, K.,

Kunitomo, M (2007), “Reinforcement of antitumor effect of Cordyceps sinensis by 2’ ậDeoxycoformycin, an adenosin deaminase inhibitor”, in vivo

[38] Yu, H.M., Wang, B.S., Huang, S.C., Duh, P.D (2006), “Comparison of protective effects between cultured Cordyceps militaris and natural Cordyceps sinensis against oxidative damage”, ational Science Council of the epublic of China, China.