0355HỖ TRỢ ĐỊNH DANH CÁC LOÀI NẤM THUỘC CHI NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG DỰA TRÊN PHÂN TÍCH PHẢ HỆ VÙNG GEN NRLSU

N M KÝ SINH CÔN TRÙNG

c đi m chung và thành ph n loài

Cordyceps là một chi nấm ký sinh thuộc họ Clavicipitaceae, bộ Hypocreales, lớp Pyrenomycetes, ngành nấm túi Ascomycota Chi này có nguồn gốc từ tiếng Latin, với "cord" nghĩa là "sợi" và "ceps" nghĩa là "đầu", mô tả hình dáng đặc trưng của nấm Nấm ký sinh côn trùng có giá trị dược liệu cao, trong đó loài đầu tiên được biết đến là Cordyceps sinensis, sống ký sinh trên ấu trùng của các loài sâu thuộc chi Thitarodes Giá trị dược liệu của loài nấm này đã được ghi nhận từ hơn 2000 năm qua tại Trung Quốc, và đến năm 1726, nó được giới thiệu trong một hội nghị khoa học tại Paris Nghiên cứu cho thấy Cordyceps sinensis có hoạt tính chống phát triển tế bào khối u, chống oxy hóa và kích thích hệ miễn dịch, giúp điều trị nhiều bệnh liên quan đến thận, huyết áp, tim mạch, miễn dịch, nội tiết và ung thư Hiện nay, nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng không chỉ Cordyceps sinensis mà còn nhiều loài khác trong chi Cordyceps và các chi liên quan cũng mang lại tiềm năng dược liệu cao.

Cordyceps là một loại nấm sinh trưởng chủ yếu trong các khu rừng ôn đới và nhiệt đới, thường ký sinh trên nhiều loài côn trùng khác nhau Sau khi xâm nhập vào cơ thể côn trùng, bào tử của nó phát triển thành hình thái nấm, xâm chiếm và thay thế các mô của vật chủ Quá trình này dẫn đến sự hình thành qu thể nấm, mà thường được tìm thấy trên xác của côn trùng sau một thời gian nhiễm bệnh Qu thể nấm có hình dạng đa dạng, có thể phân nhánh hoặc có hình dáng phức tạp, và thuộc nhiều chi khác nhau trong hệ thống phân loại.

Chơu Á, đ c bi t lƠ vùng ông Á, ngoƠi ra còn có Châu Úc và m t s n c tìm th y đ cao t 4000-

5000m so v i m t n c bi n trên các cao nguyên Himalaya, Tây T ng, T Xuyên, Thanh H i, c miêu t [39]

Nấm thuộc bộ Hypocreales chủ yếu được phân loại vào chi Cordyceps thuộc họ Clavicipitaceae Phân loại này dựa trên các đặc điểm như túi dày, túi dày và sự hình thành bào tử Năm 2007, Sung và cộng sự đã đề xuất phân loại hệ thống nhóm nấm Cordyceps và Clavicipitaceae thành ba họ: Clavicipitaceae s.s., Cordycipitaceae và Ophiocordycipitaceae.

Vi c phân lo i phát sinh loài hi n t i c a n m Hypocreleales [46] nh sau:

Clavicipitaceae s.s: Conoideocrella, Hypocrella, Metacordyceps, Moelleriella, Orbiocrella, Regiocrella, Samuelsia, Shimizuomyces, Villosiclava, …

Cordycipitaceae: Ascopolyporus, Cordyceps, Hyperdermium, Torrubiella, …

Ti m n ng ng d ng

1.1.2.1 Các thành ph n dinh d ng chung c a Cordyceps ậ các thành ph n hoá h c

Phân tích hóa học của Cordyceps sinensis cho thấy loại nấm này chứa nhiều thành phần dinh dưỡng quan trọng, bao gồm các amino acid và vitamin như E, K, B1, B2, B12, C Ngoài ra, Cordyceps sinensis còn chứa đa dạng các loại đường như mono-, di-, oligosaccharide, cùng với polysaccharide, protein, sterol, nucleoside và các nguyên tố vi lượng khác.

(K, Na, Ca, Mg, Fe, Cu, Mn, Zn, Pi, Se, Al, Si, Ni, Sr, Ti, Cr, Ga, V, và Zr) [21]

1.1.2.2 Các ho t ch t chính c a Cordyceps và ng d ng trong y d c

Cordyceps militaris n m 1950 [21] Cordycepin có tác d ng kháng ung th [42], ng n c n quá trình t ng h p RNA c a t bào HeLa [36], c ch t ng h p protein và s bám dính t bào [45]

Polysaccharide trong Cordyceps bao gồm d-mannitol (acid cordycepic), beta-glucan, beta-mannan và nhiều loại polysaccharide khác Chúng có khả năng chống ung thư, điều hòa huyết áp, cải thiện chức năng hệ miễn dịch, bảo vệ gan và có hoạt tính chống oxy hóa.

Các sterol trong Cordyceps đ c tìm th y g m: ergosterol, delta-3 ergosterol, ergosterol peroxide, 3-sitosterol, daucosterol, campesterol a nó có ho t tính kháng virus, đi u hoà tim m ch, đi u tr b nh th n [46]

D ng glycosyl hoá c a ergosterol peroxide có tác d ng c ch s t ng sinh các dòng t bƠo ung th K562, Jurkat, WM-1341, HL-60 và RPMI-8226 [12]

1.1.2.2.4.Protein, acid amin và các h p ch t khác

Cordyceps contains a protein content ranging from 29.1% to 33%, which includes 18 essential amino acids such as aspartic acid, threonine, serine, glutamate, proline, glycine, and valine Notably, it has a high concentration of glutamate, arginine, and aspartic acid, contributing to its significant nutritional value.

Các protein, peptide, polyamine, amino acid và dipeptide vòng trong Cordyceps có hoạt tính chống ung thư, đặc biệt là trong việc điều trị các bệnh liên quan đến miễn dịch Nấm Hypcrealean AP và một số loài trong chi Cordyceps có khả năng sản xuất các chất chuyển hóa thực vật có hoạt tính sinh học, cung cấp nguồn tiềm năng cho sản phẩm và thuốc điều trị Chẳng hạn, Cyclosporin A, một thuốc ngăn chặn miễn dịch, được chiết xuất từ cyclosporin, có tác dụng ức chế hệ miễn dịch, hỗ trợ trong việc ghép các bộ phận cơ thể Cyclosporin là sản phẩm chuyển hóa của Cordycepin, được phân lập từ nấm Tolypocladium inflatum Gần đây, nấm Elaphocordyceps subsessilis (Cordyceps subsessilis) cũng được biết đến với khả năng sinh sản vô tính.

1.1.2.3 ng d ng ki m soát côn trùng

Cordyceps không chỉ được biết đến với tác dụng trong y dược mà còn đóng vai trò quan trọng trong kiểm soát sinh học Loài nấm này ký sinh trên côn trùng, trở thành thiên địch của các loài gây hại Chính vì vậy, nhiều loại Cordyceps đã được sử dụng rộng rãi trong cuộc chiến sinh học để kiểm soát dịch bệnh, đặc biệt là các loài như Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae và Normurea rileyi.

Các tiêu chí quan trọng để lựa chọn các loài nấm có khả năng sử dụng làm thuốc trừ sâu sinh học bao gồm tính kháng ngừa cao, tác động nhanh chóng và hiệu quả.

SVTH là một phương pháp nuôi cấy và bảo quản có tính nhất định, dễ dàng thực hiện với khả năng lên men chìm, giúp kiểm soát và phân tích số lượng vi sinh an toàn cho con người.

Metarhizium anisopliae lần đầu tiên được sử dụng để chống lại sinh vật gây hại vào năm 1888 bởi Krassilstchik Hiện nay, sản phẩm sinh học Green Muscle, chứa Metarhizium anisopliae var acridum, đang được sử dụng để kiểm soát châu chấu ở Châu Phi Tại Việt Nam, nhiều nghiên cứu đã thành công trong việc ứng dụng nấm ký sinh như Metarhizium anisopliae và Beauveria bassiana để phòng trừ các loại côn trùng và sâu hại cây trồng, bao gồm sâu khoang hại cây xanh, sâu hại đậu xanh, rầy mầm, và các loài sâu hại lúa.

NGHIểN C U NH DANH VÀ PHÁT SINH LOÀI

1.2.1 c đi m nh n d ng và đnh danh

Gần đây, việc phân loại hệ thống họ nấm Clavicipitaceae chủ yếu dựa trên phân tích hình thái học Các đặc điểm nhận diện bao gồm th túi dày, đỉnh túi dày và các bào tử túi dày, có thể phân chia thành nhiều bào tử khác nhau Năm 1982, Kobayashi đã công bố kết quả phân tích 282 loài Cordyceps, 59 loài Torrubiella và 75 loài thuộc các chi liên quan khác, từ đó xây dựng khóa phân loại cho các loài này.

Ophiocordyceps sinensis và Ophiocordyceps variabilis là những loài nấm ký sinh trên côn trùng, nổi bật với khả năng thích nghi tuyệt vời trong môi trường sống khắc nghiệt Chúng phát triển thông qua mycelium, đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái và có tiềm năng ứng dụng trong y học và nghiên cứu sinh học.

1.2.2 nh danh phân t nh danh phân t i sinh v t m c đ phân t d a trên c s so sánh trình t nucleotide và axit amin c a các phân t DNA, RNA, protein

Trong nghiên cứu định danh phân tử, việc lựa chọn vùng trình tự DNA, RNA và protein là rất quan trọng để khẳng định mối quan hệ giữa các loài Trình tự này cần đảm bảo tính bảo tồn cao trong cùng một loài nhưng lại có sự biến đổi lớn giữa các loài khác nhau Đối với định danh một số loài, vùng gen nhà (house-keeping gene) thường được sử dụng phổ biến trong nhiều nghiên cứu.

SVTH: Ngày 8 tháng 11, định danh phân tử đang trở thành ngành khoa học mới mẻ trong phân loại học, bổ sung vào phân loại học truyền thống những phương pháp nghiên cứu hiện đại.

1.2.3.DNA ribosome và trình t nrLSU trong đnh danh phân t n m nh danh phân t là m t trong các ph ng pháp phơn lo i sinh v t, s d ng d li u là các trình t DNA đ phân tích Trong nghiên c u đnh danh phân t , vi c l a ch n vùng trình t DNA đ kh o sát gi a các loài là m t b c quan tr ng, trình t này c n đ m b o tính b o t n cao trong cùng m t loƠi nh ng bi n đ ng l n gi a các loài khác nhau i v i nhóm Cordyceps vùng gene mã hoá cho RNA ribosome (DNA ribosome, rDNA) đƣ đ c s d ng ph bi n đ nghiên c u trong nhi u n m g n đơy rDNA (ribosomal DNA) là nhóm gene mã hóa rRNA c a ribosome, có nhi u b n sao và không mã hóa cho b t k protein nƠo ơy lƠ vùng gen b o t n nên đ c xem lƠ c s chính xác đ tìm ra s t ng đ ng và các khác bi t c a các sinh v t cùng loài hay khác loƠi, đóng vai trò quan tr ng trong các nghiên c u quá trình ti n hóa, phát sinh loài, phân lo i n m vƠ xác đ nh tính đa d ng di truy n c a sinh v t c ng nh các dòng n m do vi c phân lo i n m d a vƠo đ c đi m hình thái, đ c đi m sinh hóa có k t qu phân lo i th ng không chính xác và c n kho ng th i gian dài [23]

Ribosome là bào quan có mặt trong tất cả các tế bào của sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân thực, đóng vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp protein Ribosome được cấu tạo từ tRNA và protein ribosome, bao gồm hai tiểu phần: tiểu phần nhỏ và tiểu phần lớn Hai tiểu phần này kết hợp với nhau để tạo ra một ribosome hoạt động, thực hiện nhiệm vụ tổng hợp protein Ribosome có thể tự do trong tế bào chất hoặc bám trên màng của mạng lưới nội chất RNA ribosome là một trong hai thành phần chính của ribosome, trong đó tiểu phần nhỏ (40S) chứa 18S RNA, còn tiểu phần lớn (60S) chứa 28S, 5.8S và 5S RNA RNA ribosome được phiên mã từ DNA ribosome, trong đó DNA ribosome bao gồm nhiều đoạn lặp lại, với vùng LSU (ribosomal large subunit - 25-28S).

SVTH includes regions 9, 18S, ITS (internal transcribed spacer), 5.8S, 5S RNA, and the IGS (intergenic spacer) The IGS region comprises the ETS (external transcribed spacer) and the NTS (non-transcribed spacer), as illustrated in Figure 1.2.

NGHIÊN C U NH DANH VÀ PHÁT SINH LOÀI

nh danh phân t

nh danh phân t i sinh v t m c đ phân t d a trên c s so sánh trình t nucleotide và axit amin c a các phân t DNA, RNA, protein

Trong nghiên cứu định danh phân tử, việc lựa chọn vùng trình tự DNA, RNA và protein để khảo sát giữa các loài là rất quan trọng Trình tự này cần đảm bảo tính bảo tồn cao trong cùng một loài, nhưng lại có sự biến đổi lớn giữa các loài khác nhau Đối với định danh một số loài, vùng gen nhà (house-keeping gene) đã được sử dụng phổ biến trong nhiều nghiên cứu.

SVTH: Ngày 8 tháng 11 năm nay, định danh phân tử đang trở thành ngành khoa học mới mẻ trong phân loại học, bổ sung vào phân loại học truyền thống những phương pháp nghiên cứu hiện đại.

DNA ribosome và trình t nrLSU trong đ nh danh phân t n m

Nhận dạng phân tử là một trong những phương pháp phân loại sinh vật, sử dụng dữ liệu là các trình tự DNA để phân tích Trong nghiên cứu xác định phân tử, việc lựa chọn vùng trình tự DNA để khảo sát giữa các loài là một bước quan trọng, vì vùng này cần đảm bảo tính bảo tồn cao trong cùng một loài nhưng lại biến đổi lớn giữa các loài khác nhau Đối với nhóm Cordyceps, vùng gene mã hóa cho RNA ribosome (DNA ribosome, rDNA) đã được sử dụng phổ biến trong nhiều nghiên cứu gần đây rDNA là nhóm gene mã hóa rRNA của ribosome, có nhiều bản sao và không mã hóa cho bất kỳ protein nào Đây là vùng gen bảo tồn nên được xem là công cụ chính xác để tìm ra sự tương đồng và khác biệt của các sinh vật cùng loài hay khác loài, đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu quá trình tiến hóa, phát sinh loài, phân loại nấm và xác định tính đa dạng di truyền của sinh vật, giúp tránh các kết quả phân loại không chính xác và tiết kiệm thời gian nghiên cứu.

Ribosome là bào quan có mặt trong tất cả các tế bào của sinh vật nhân thực, đóng vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp protein Ribosome được cấu tạo từ rRNA và protein ribosome, bao gồm hai tiểu phần: tiểu phần nhỏ (40S) chứa 18S RNA và tiểu phần lớn (60S) chứa 28S, 5.8S và 5S RNA Hai tiểu phần này kết hợp với nhau để tạo ra một ribosome hoạt động, thực hiện chức năng tổng hợp protein RNA ribosome được phiên mã từ DNA ribosome, trong đó DNA ribosome bao gồm nhiều đoạn lặp lại và vùng LSU (ribosomal large subunit-25-28S) Ribosome có thể nằm tự do trong tế bào chất hoặc bám trên màng của mạng lưới nội chất.

SVTH includes the 9 regions of 18S, ITS (internal transcribed spacer), 5.8S, 5S RNA, and the IGS (intergenic spacer) The IGS region consists of the ETS (external transcribed spacer) and the non-transcribed spacer (NTS).

Vùng IGS2-18S (SSU)-ITS1-5.8S-ITS2-28S (LSU)-IGS1-5S-IGS2 chứa thông tin di truyền cho rRNA, là thành phần cấu trúc chính của ribosome Vùng 18S-28S là khu vực phiên mã chính, đóng vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp rRNA Bằng cách khuếch đại vùng này, các nghiên cứu đã thu được nhiều đoạn DNA có kích thước lớn, phục vụ cho việc phân tích di truyền Các trình tự mã hóa cho rRNA có tính bảo tồn cao, làm cho chúng trở thành công cụ hữu ích trong các nghiên cứu phân loại sinh học.

Trình t nrLSU-rRNA là vùng gen mã hóa RNA 25S-28S của ribosome, bao gồm các vùng bảo tồn và các vùng biến động như domain D1/D2/D3 Các domain này chứa thông tin quan trọng cho việc so sánh các cấp phân loại cao, đặc biệt là trong nghiên cứu phân loại nấm Vùng DNA D1/D2 mã hóa cho tiểu phần ribosome, được coi là hữu ích trong việc phân loại các loài nấm có giá trị dược liệu.

Hình 1.4 S đ v trí các vùng domain thu c trình t nrLSU [50]

Nghiên cứu phân tích vùng gen mã hóa RNA của ribosom (nrSSU, nrLSU) là một lĩnh vực quan trọng do những vùng gen này chứa nhiều thông tin di truyền ổn định và phổ biến trên toàn cầu Chúng có khả năng thiết kế các cặp mồi phổ quát giúp khuếch đại và giải trình tự của nhiều loài nấm Cặp mồi LR0R/LR5 được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu phân tích nấm gần đây Cặp mồi này được thiết kế để khuếch đại vùng D1-D2, cho kết quả khuếch đại trong khoảng 800-1300 bp Vùng D1 và D2 là các miền khác nhau nằm trên vùng gen LSU, có khả năng quyết định việc xác định các loài có mối liên quan gần gũi với nhau, nhờ vào việc chứa nhiều thông tin di truyền và tính biến động.

Tại Việt Nam, nghiên cứu về thành phần loài nấm ký sinh côn trùng đang được chú trọng, nhưng hiện tại vẫn chưa có công bố đầy đủ nào về các loài nấm này Việc thiếu thông tin về thành phần loài đã gây khó khăn trong việc khai thác các loại nấm trong tự nhiên, cũng như trong nghiên cứu, xây dựng quy trình nuôi trồng nấm và sản xuất dược liệu.

Tại Việt Nam, nghiên cứu về thành phần loài nấm ông trùng đã được công bố vào những năm 1996 và 2001, với ba loài thuộc chi Cordyceps: Cordyceps sinensis, Cordyceps militaris và Cordyceps sabrolifera Đặc biệt, hai loài mới được phát hiện tại khu vực này là Cordyceps nutans và Cordyceps gunnii.

Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã tiến hành thu mẫu ông trùng hạ thảo tại các Vườn quốc gia và Khu bảo tồn, ghi nhận 24 loài nấm ông trùng hạ thảo quý hiếm Các loài này thuộc họ Clavicipitaceae, bộ Hypocriales, lớp Sordariomycetes Hiện tại, các loài nấm này đang được lưu trữ tại Trung tâm Nghiên cứu bảo vệ rừng, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam Dựa trên nguồn gen thu thập từ Trung Quốc và Nhật Bản, Trung tâm đã nghiên cứu nuôi trồng quần thể nấm đông trùng hạ thảo trên giá thể nhân tạo Một số loài đã có quy trình công nghệ sản xuất chuyển giao cho các cơ sở sản xuất nấm như nấm nhộng trùng thảo (Cordyceps militaris), ông trùng hạ thảo bông tuyết (Isaria tenuipes) và ông trùng hạ thảo bạch xít (Cordyceps nutans).

Vào năm 2009, lần đầu tiên tại Việt Nam, các nhà khoa học uy tín, bao gồm Ái Duy Ban, đã thành công trong việc nuôi trồng đông trùng hạ thảo Họ đã thực hiện nghiên cứu phát hiện một loài mới của đông trùng hạ thảo, Isaria cerambycidae, và xác định một số hoạt động sinh học trong loài này.

TỊNH HỊNH NGHIểN C UTRểN TH GI I

Nghiên cứu phân loại và đánh giá các loài nấm ký sinh côn trùng đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học, đặc biệt là trong các khu vực như Đông Á, Đông Nam Á và phương Tây Việc hiểu rõ về hệ thống phân loại này không chỉ giúp nâng cao kiến thức sinh học mà còn có ý nghĩa quan trọng trong việc bảo vệ sinh thái và phát triển nông nghiệp bền vững.

Hàn Quốc, Trung Quốc, Nhật Bản, Malaysia, Thái Lan Trong những năm gần đây, số lượng công trình nghiên cứu về hệ thống phân loại của nấm ký sinh côn trùng đã tăng đáng kể Cụ thể, số lượng nghiên cứu đã gấp đôi chỉ sau 2 năm, và số lượng các loài trong mỗi nghiên cứu cũng đang gia tăng nhanh chóng.

Năm 2003, Trung Quốc đã tiến hành nghiên cứu phân tích phân loại dựa vào vùng gen nrLSU để xác định gen mục tiêu trong các loài nấm Jeewon đã thực hiện nghiên cứu này với sự tập trung vào các loài thuộc họ Amphisphaeriaceae, sử dụng dữ liệu từ vùng gen 28S Tiếp theo, vào năm 2006, M Dentinger đã tiến hành nghiên cứu xây dựng hệ thống phân loại cho các loài nấm thuộc họ Clavariaceae, dựa trên vùng gen tương tự.

SVTH: Nguy n Th H i Ng c 12 gen nrLSU [13] N m 2006, Hàn Qu c, Ji Seon Lee nghiên c u nh m phát tri n ph ng pháp đnh danh phân t m t s loài n m y d c d a vào vùng gen nrLSU [27]

G n đơy, nghiên c u ph h d a trên nhi u vùng gen lƠ xu h ng m i, n m

Năm 2007, Sung và cộng sự đã tiến hành phân loại nhóm nấm Cordyceps và Clavicipitaceae, chia các loài trong nhóm này thành ba họ: Clavicipitaceae s.s., Cordycipitaceae và Ophiocordycipitaceae Dựa trên phân tích phân tử từ bảy vùng gen nrSSU, nrLSU, rpb1, rpb2, tef1, tub, atp6, nghiên cứu đã sử dụng dữ liệu của 162 loài nấm kết hợp với việc định danh bằng hình thái.

1.5.1.Ph h phân t trong nghiên c u phát sinh loài

Ph h phân t là nghiên c u v m i quan h ti n hóa c a t p h p các trình t gen, d

Dựng cây phả hệ phân tử là một quá trình phức tạp, đòi hỏi phải xây dựng một cây đúng nhất Tập hợp dữ liệu phát sinh loài có thể bao gồm nhiều hướng tiếp cận khác nhau, trong đó có thể thay đổi tùy theo đặc điểm biến đổi của các loài Do đó, có rất nhiều mô hình tiến hóa khác nhau và các phương pháp phân tích phát sinh chủng loài, nhằm tìm kiếm cây tiến hóa phù hợp cho một phân tích phát sinh loài.

1.5.2.Nh ng b c c b n trong nghiên c u phát sinh ch ng loài

1.5.2.1 Ch n l a marker phân t và s p x p b d li u

B c đ u tiên là c n xác đnh protein hay trình t DNA s là d li u đ c ch trình t quan tâm có th l y t trang NCBI hay các công c tìm ki m t ng đ ng khác, đ t o ra m t c s d li u cuc b [14]

1.5.2.2 c và hi u ch nh trình t

PH H PHÂN T

Ph h phân t trong nghiên c u phát sinh loài

Ph h phân t là nghiên c u v m i quan h ti n hóa c a t p h p các trình t gen, d

Dựng cây phả hệ phân tử là một quá trình phức tạp bởi thực tế không thể xây dựng một cây đúng nhất Tập hợp dữ liệu phát sinh loài có thể bao gồm nhiều hướng khác nhau, một trong số đó có thể dẫn đến việc thay đổi cách biểu diễn dần dần Do đó, có rất nhiều mô hình tiến hóa khác nhau và các phương pháp phân tích phát sinh chủng loài, nhằm dò tìm cây tiến hóa tối ưu cho một phân tích phát sinh loài.

Nh ng b c c b n trong nghiên c u phát sinh ch ng loài

1.5.2.1 Ch n l a marker phân t và s p x p b d li u

B c đ u tiên là c n xác đnh protein hay trình t DNA s là d li u đ c ch trình t quan tâm có th l y t trang NCBI hay các công c tìm ki m t ng đ ng khác, đ t o ra m t c s d li u cuc b [14]

1.5.2.2 c và hi u ch nh trình t

Các phân tích phát sinh chủng loài dựa trên những số liệu khác biệt khi quan sát các trình tự DNA có thể dẫn đến việc xây dựng cây phát sinh không chính xác Nếu vùng DNA có độ bảo tồn cao và nhà phân tích chọn mô hình phát sinh phức tạp, thì kết quả thu được có thể sai lệch rất lớn Để tránh tình trạng này, người ta cần thực hiện việc chỉnh sửa các trình tự DNA và đảm bảo tính khách quan trong quá trình phân tích.

1.5.2.3 S p c t th ng hàng các trình t

Việc sửa đổi gen hoặc vùng DNA có thể gây ra sự phát sinh các lỗi trong quá trình sao chép thông tin di truyền Do đó, những gene hoặc vùng DNA có biến thể cao cần được theo dõi chặt chẽ trong quá trình sao chép thông tin di truyền Đối với những vùng không có khả năng sao chép thông tin di truyền, cần phải được phân tích kỹ lưỡng để hiểu rõ hơn về chức năng và ảnh hưởng của chúng.

1.5.2.4 Ch n l a mô hình ti n hoá i d li u ph i tr i qua quá trình ki m tra dò tìm mô hình ti n hóa thích h p

Trong mô hình tiểu hóa đơn giản nhất, tất cả các biến đổi đều được coi là bằng nhau cho mọi điểm biến đổi Khi đó, số lượng các dạng biến đổi trong mô hình tiểu hóa này được xác định là 1.

Mô hình ti n hóa ph c t p nh t hiện nay là mô hình có khả năng hồi quy biên t ng quát theo thời gian (General time reversible model) Mô hình này bao gồm 6 kiểu khác nhau.

M t vài mô hình ti n hóa ng u nhiên ph bi n g m Jukes-Cantor, Kimura 2- parameter (K2P), Tamura 3-parameter, Hasegawa-Kishino-Yano (HKY), Tamura Nei, General Time Reversible (GTR)…

M t s ch ng trình ph n m m, nh PAUP *, s t đ ng s d ng m t mô hình m c đ

1.5.2.5 Phân tích s phát sinh ch ng loài [28]

Với phương pháp nhắm suy luận cây phát sinh, hiện nay có nhiều phương pháp kết hợp thu hút và một nhóm tiêu chuẩn tiêu chí trục Tiến trình thực hiện của nó bao gồm việc dò tìm những cây tiểu hóa tối ưu, sau đó đánh giá những cây tiểu hóa này dựa trên tiêu chuẩn tiêu chí trục để tạo ra cây tiểu hóa tốt nhất.

1.5.2.5.1.Dò tìm cây ti n hoá t i thích

Trong th c nghi m ng n hai ph ng pháp dò tìm cơy ti n hóa đó lƠ ph ng pháp branch-and-bound vƠ ph ng pháp heuristics.

Trong phương pháp branch-and-bound, một cây đệ quy được coi là tối ưu khi nó đạt được một tiêu chuẩn nhất định Cây này sẽ được đánh giá dựa trên các tiêu chí đã được thiết lập trước Nếu cây này có giá trị thấp hơn điểm chuẩn, nó sẽ bị loại bỏ, trong khi nếu có giá trị cao hơn, nó sẽ trở thành cây tối ưu mới với điểm chuẩn mới Quá trình này có thể tiếp tục cho đến khi không còn cây nào để xem xét Thuật toán này cho phép tìm kiếm cây tối ưu một cách hiệu quả, tiết kiệm thời gian trong việc giải quyết bài toán.

Phương pháp heuristics, mặc dù không mang lại kết quả chính xác cao như các phương pháp khác, vẫn thường được áp dụng trong nhiều lĩnh vực Một trong những ứng dụng nổi bật của nó là trong phương pháp phơn rừ hình ngôi sao.

Phương pháp này dựa trên nguyên lý đầu tiên của một cây quyết định, được tạo thành từ các taxa liên quan, nhằm xác định vị trí tốt nhất Quy trình thực hiện diễn ra nhiều lần cho đến khi cây tối ưu hình thành.

Tiêu chuẩn tối ưu hóa dữ liệu là một phương pháp quan trọng trong việc xử lý thông tin chưa hoàn chỉnh Quy trình này bao gồm hai bước chính: bước đầu tiên là xác định các mục cần cải thiện trong dữ liệu, và bước thứ hai là tìm kiếm một tiêu chuẩn thay thế cho những mục đó Quá trình tối ưu hóa này giúp tạo ra nhiều giải pháp thay thế hiệu quả cho các tiêu chuẩn hiện có.

Nguyên lý của phương pháp maximum parsimony là tìm kiếm một cây phát sinh loài sao cho số lượng thay đổi tối thiểu, nhằm tối ưu hóa độ dài tổng của cây Phương pháp này tập trung vào việc giảm thiểu số lượng biến đổi cần thiết để giải thích sự khác biệt giữa các loài.

Phương pháp khoáng cách là một kỹ thuật quan trọng trong việc tối ưu hóa khoảng cách giữa các cặp đối tượng đang được so sánh Nguyên tắc chính của phương pháp này là xác định một cây phân loại phù hợp dựa trên ma trận khoảng cách gen của các cặp trình tự Khi tất cả các khoảng cách giữa các trình tự được tính toán, điều này giúp xây dựng một mô hình đa hình học cho cây phân loại Phương pháp khoáng cách cũng áp dụng cho các mô hình không chừng minh, nhằm xác định khoảng cách chính xác giữa các gen, vì một số vị trí nucleotide có thể ảnh hưởng đến quá trình phát triển.

Phương pháp "neighbour joining" là một kỹ thuật quan trọng trong xây dựng cây tiến hóa với ít nhánh nhất Nguyên tắc của phương pháp này là xác định các cấp hàng xóm (neighbour) hợp lý nhất để giảm thiểu độ dài của cây tiến hóa.

Phương pháp hợp lý hóa là nhóm phương pháp mới dựa trên một hàm toán học tính toán xác suất, nhằm tối ưu hóa các dữ liệu thu thập được từ quá trình quan sát Phương pháp này cho phép tích hợp các quá trình tối ưu hóa của đạc tính thành mô hình xác suất hiệu quả.

Ph ng pháp h p lý c c đ i ch n l a cây ti n hóa t i đa mƠ khi quan sát các d li u d i m t mô hình nƠo đó có xác xu t t i đa [18 au.

1.5.2.6 K t h p phân tích giá tr bootstrap

K THU T PCR VÀ GI I TRÌNH T T NG

K thu t PCR

Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) được phát triển bởi Kary Mullis vào năm 1980, là một phương pháp sinh hóa quan trọng trong việc sao chép DNA Quy trình này sử dụng các thành phần như DNA khuôn, dNTP, mồi, enzyme polymerase, MgCl2 và dung dịch đệm PCR được thực hiện trong máy chu kỳ nhiệt, hay còn gọi là máy PCR, với nhiều chu kỳ khác nhau Mỗi chu kỳ bao gồm ba bước: biến tính (DNA được biến tính ở nhiệt độ cao 94-95°C), bắt cặp mồi (nhiệt độ cần cho sự bắt cặp giữa mồi và mạch khuôn là Ta, với Ta < Tm không quá 5°C, Tm là nhiệt độ nóng chảy của mồi), và kéo dài (nhiệt độ được tăng lên 72°C để enzyme polymerase hoạt động) Sau n chu kỳ, một lượng lớn bản sao DNA được tạo ra, có thể được sử dụng cho các ứng dụng như giải trình tự, lập bản đồ di truyền hoặc sản xuất mẫu dò.

PCR suy bi n là k thu t PCR d a trên đo n m i suy bi n đ khu ch đ i m t đo n trình t DNA ch a xác đnh, d a trên m i liên h v i trình t DNA xác đ nh

SVTH: Nguy n Th H i Ng c 18 o n m i suy bi n lƠ đo n m i không chuyên bi t nh trong các k thu t PCR thông th ng, v i m t s nucleotide (nu) có th b t v i hai ho c nhi u h n.

Gi i trình t t đ ng

Nguyên lý hoƠn toƠn đ c thi t k d a trên nguyên t c s d ng ddNTP do

Sanger và các đồng nghiệp đã phát minh ra phương pháp đánh dấu huỳnh quang cho dNTP, giúp phân biệt các loại dNTP khác nhau qua màu sắc trong quá trình PCR Sau khi phản ứng PCR diễn ra, các sản phẩm có độ dài khác nhau sẽ phát tín hiệu tại các thời điểm khác nhau Máy sẽ tự động ghi lại kết quả dựa trên tín hiệu này.

V T LI U VÀ PH NG PHÁP NGHIểN C U

B m u n m ký sinh côn trùng

D ng c - thi t b - hoá ch t

1% -mercaptoethanol 99.9% dd H 2 O (đƣ h p) 100àg/ml proteinase K 1mg/ml PCI (Phenol/chloroform/isoamylalcohol) (25:24:1 v/v/v)

Bio Rad Bio Rad Bio Rad

Danh m c các ph n m m s d ng

Annhyb: phiên b n 4.946 (Olivier Friard, 2012) là ph n m m mi n phí giúp làm vi c và qu n lý các trình t nucleotide d i nhi u đ nh d ng

Clustalw2: là m t ph n m m mi n phí (giao di n window) dùng cho vi c so sánh s t ng đ ng c a hai hay nhi u trình t sinh h c

Chromas Lite phiên bản 2.1.1 (Technelysium) là phần mềm miễn phí mạnh mẽ, cho phép chỉnh sửa và lưu trữ các tập tin trình tự thuộc nhiều định dạng khác nhau như Fasta, text, EMBL, SwissProt Đặc biệt, phần mềm này hỗ trợ các trình tự được giải bằng hệ thống ABI, giúp người dùng dễ dàng biểu diễn hình ảnh quang học.

Sea View: phiên b n 4.2.12 (Manolo Gouy) Sea View là ph n m m mi n phí có các tính n ng h tr cho các phơn tích t ng đ ng, s p gióng c t các trình t

TreeView: phiên b n 1.6.6 (Roderic, 2001), ph n m m mi n phí dùng đ xem và hi u ch nh cây ti n hoá

Fig Tree: phiên b n 1.3.1 (Andrew Rambaut Group) Fig Tree là ph n m m mi n phí, dùng đ h tr đ h a nh m xu t b n cây ti n hoá rõ rƠng h n.

MEGA: phiên b n 6.06 (Kumar, 2013) Ph n m m mi n phí dùng đ xây d ng cây phát sinh loƠi theo các ph ng pháp Maximum Parsimony, Maximum Likelihood, Neighbor-Joining.

TI N TRÌNH NGHIÊN C U

Ki m tra s n ph m DNA đƣ tách chi t

PCR

2.3.3.1 Trình t m i s d ng cho ph n ng PCR

Ký hi u M i Trình t Ngu n tham kh o

LR0R M i xuôi 5‟-GTACCCGCTGAACTTAAGC-3‟ Vilgalys & Sun, 1994

LR5 M i ng c 5‟-ATCCTGAGGGAAACTTC-3‟ Vilgalys & Sun, 1994

2.3.3.2 Thành ph n ph n ng PCR

T ng th tớch ph n ng PCR lƠ 15 àl, trong đú g m 7,5 àl Master mix, 0,5 àl m i xuụi 10àM, 0,5 àl m i ng c 10 àM, 5,5 àl dd H 2 O.

2.3.3.3 Chu k nhi t cho ph n ng PCR

Giai đo n Bi n tính Bi n tính M i b t c p Kéo dài Kéo dài cu i cùng

Th i gian 5 phút 30 giây 30 giây 2 phút 5 phút

V i X: nhi t đ m i b t c p đ khu ch đ i ng v nrLSU

i n di

Gi i trình t

Hi u ch nh trình t

2.3.6.1 Lo i b nh ng tín hi u không chính xác hai đ u trình t kh o sát

2.3.6.2 Ki m tra các sai l ch gi a hai k t qu gi i trình t

So sánh v i c s d li u Genbank

Dò tìm mô hình ti n hoá

Xây d ng cây phát sinh loài

Nghiên cứu phân tích vùng gen mã hóa RNA của ribosome (nrLSU) đã chỉ ra rằng đây là vùng gen mục tiêu quan trọng nhờ chứa nhiều thông tin di truyền ổn định, phổ biến toàn cầu và khả năng thiết kế các cặp mồi phân tử giúp khuếch đại và giải trình tự gen của nhiều loài nấm Cặp mồi LR0R/LR5, được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu phân tích nấm gần đây, đã được thiết kế để khuếch đại vùng D1-D2 với kết quả khuếch đại từ 800-1300bp và 950 bp theo nghiên cứu của Sung và cộng sự Các vùng D1 và D2 là những domain khác nhau nằm trên vùng gen nrLSU, có khả năng giải quyết việc xác định các loài có mối liên quan gần gũi nhờ chứa nhiều thông tin di truyền và tính biến động cao.

Sau đây là phân tích hệ thống LR0R/LR5 được thực hiện bằng phần mềm Clustal2w và các công cụ hỗ trợ trên website như idtdna.com và BLAST (NCBI) Mục tiêu là kiểm tra lại tính tương thích của các phân mảnh này trước khi tiến hành thí nghiệm chính thức.

Ki m tra c p m i v i các thông s v t lý trên IDT

B ng 3.1 B ng đánh giá m i khu ch đ i vùng gen nrLSU n m ký sinh côn trùng

Ký hi u TRÌNH T L %GC Tm Ấ G

K t qu phân tích h m i trên IDT cho th y ẤG (kcal/mole) c a h m i đ u l n h n -9 kcal/mole, đ ng th i Tm gi a hai m i chênh l ch nhau không quá 5 0 C,

%GC n m trong kho ng 45-55 o C do v y các đ c tính c a h m i phù h p v i ph n ng PCR

Ki m tra m i b ng BLAST trên NCBI

Hình 3.1 K t qu ki m tra m i b ng BLAST trên GenBank

Theo kết quả từ phân tích BLAST, cặp mồi LR0R/LR5 đã được xác định là phù hợp để khuếch đại vùng trình tự 18S-ITS-5.8S-28S của các loài nấm chân nấm như Bionectria ochroleuca, Lindgomyces lemonweirensis, Cochliobolus sp., Glomus geosporum và nhiều loài nấm khác do tính chất phổ quát của nó Đặc biệt, mồi này cũng đã khuếch đại thành công vùng gen 28S của Bionectria ochroleuca, một loài nấm có mối quan hệ gần gũi với Cordyceps Do đó, cặp mồi LR0R/LR5 là lựa chọn thích hợp cho việc nghiên cứu khuếch đại vùng gen nrLSU thuộc 28S của các loài nấm ký sinh côn trùng.

Ki m tra m i b ng s p gióng c t v i Clustal2w

Hình 3.2 V trí m i xuôi LR0R đ c s p gióng c t v i các trình t d li u.

Hình 3.3 V trí m i ng c LR5 đ c s p gióng c t v i các trình t d li u

Kết quả phân tích cho thấy cặp mồi LR0R có khả năng bắt lên trình tự vị trí 2050-2068, trong khi cặp mồi LR5 có thể bắt tại vị trí 3042-3026, tạo ra một vùng gen dài 959bp Sự tương đồng giữa kết quả phân tích 959bp và các tài liệu nghiên cứu trước đây (~ 954 bp theo Sung và cộng sự [39]) cho thấy cặp mồi này phù hợp cho các thí nghiệm sau này.

K t qu Annhyb c p m i LR0R/LR5 v i trình t gen nrLSU

Hình 3.4 K t qu Annhyb c p m i LR05/LR5 v i trình t gen nrLSU

Dựa trên phân tích kết quả của nhóm chúng tôi, vị trí bắt cặp của mồi LR0R và mồi LR5 trên trình tự gen nrLSU của Cordyceps militaris cho thấy kích thước sản phẩm khuếch đại khoảng 928 bp, phù hợp với chiều dài sản phẩm khuếch đại 954 bp mà Sung và cộng sự đã nghiên cứu trước đó Do đó, chúng tôi tiến hành sử dụng cặp mồi LR0R/LR5 cho các thí nghiệm tiếp theo.

XỂY D NG QUY TRỊNH TH C NGHI M NH M KHU CH I VỐNG

GEN LSU CHO CỄC M U N M Kụ SINH CÔN TRÙNG

Chúng tôi tiến hành thực nghiệm tách chiết DNA từ 3 mẫu nấm ký sinh có ký hiệu DL0038, DL0067, DL0075 do Hội Sinh Học Tp.HCM cung cấp Quy trình tách chiết sử dụng phương pháp phenol:chloroform đã được khẳng định Đã đo quang OD và điển hình của 3 mẫu DL0038B, DL0067, DL0075 sau khi tách chiết thành công.

B ng 3.2 K t qu ki m tra DNA b ng quang ph k kh o sát trên 3 m u n m ký sinh côn trùng đ c tách chi t theo ph ng pháp phenol:chloroform.

Theo b ng trên hi u qu tách chi t theo quy trình phenol:chloroform ch a t t, các m u còn l n protein do t s OD 260/280 th p h n 1,8 vƠ n ng đ DNA khá th p

Hình 3.5 K t qu đi n di s n ph m c p m i LR0R/LR5 tách chi t theo ph ng pháp phenol: chloroform

Trong nghiên cứu về khu vực gen nrLSU, mẫu DL0075 cho kết quả khả quan, trong khi các mẫu DL0038B và DL0067 không cho ra sản phẩm DNA Điều này cho thấy việc tách chiết DNA từ Cordyceps gặp khó khăn do cấu trúc tế bào dày với thành phần kitin và polysaccharide Để cải thiện quy trình tách chiết DNA, chúng tôi đã thực hiện thí nghiệm sử dụng phương pháp phenol: chloroform kết hợp với -mercaptoethanol Chất này có khả năng phá vỡ liên kết disulfide giữa hai nhóm cysteine trong protein, từ đó hỗ trợ trong việc tách chiết DNA hiệu quả hơn.

SVTH: Nguyễn Thị Hòa Ngọc 31 đã kết hợp SDS và proteinase K trong dung dịch lysis để tách chiết DNA một cách hiệu quả Kết quả này được thể hiện qua đo OD (bảng 3.3) và biểu đồ di (hình 3.6).

B ng 3.3 K t qu ki m tra DNA b ng m t đ quang ph các m u n m tách chi t có b sung -mercaptoethanol

Phương pháp tách chiết bằng phenol:chloroform có bổ sung beta-mercaptoethanol cho kết quả OD260/280 cao hơn so với phương pháp không bổ sung Điều này cho thấy hiệu quả tách chiết DNA của phương pháp có bổ sung beta-mercaptoethanol tốt hơn Ngoài ra, so với mẫu không có bổ sung, mẫu có beta-mercaptoethanol cho nồng độ DNA thu được cao hơn, trong khi mẫu không bổ sung thường cho kết quả thấp hơn và chứa tạp chất gel.

Hình 3.6 K t qu đi n di s n ph m v i c p m i LR0R/LR5 tách chi t theo ph ng pháp phenol:chloroform b sung -mercaptoethanol

K t qu đi n di cho th y l ng DNA đ c khu ch đ i nhi u h n M u 75 cho v ch sáng vƠ rõ h n NgoƠi ra, k t qu còn có thêm v ch s n ph m m u DL0038B

Trong quy trình bổ sung -mercaptoethanol, mẫu DL0067 vẫn chưa khuếch đại thành công trong phản ứng PCR Vì vậy, chúng tôi tiếp tục thực hiện quy trình PCR để khuếch đại vùng gen nrLSU của các mẫu này.

Trong quá trình tối ưu hóa chu trình PCR, chúng tôi đã thực hiện thí nghiệm trên 7 mẫu DL006, DL0015, DL0075, DL0038B, DL0067, DL0069, và DL0077 Kết quả kiểm tra DNA được thực hiện bằng phương pháp quang phổ với điều kiện nhiệt độ tối ưu cho PCR là 55 độ C.

B ng 3.4 K t qu ki m tra DNA b ng m t đ quang ph k các m u n m tách chi t có b sung -mercaptoethanol.

Hình 3.7 K t qu đi n di 7 m u v i c p m i LR0R/LR5 trong quy trình b sung

Quá trình tách chiết DNA được cải tiến bằng cách bổ sung -mercaptoethanol, giúp thu được DNA có độ tinh khiết cao hơn Nhiệt độ tối ưu cho phản ứng PCR sử dụng mồi LR0R/LR5 là 55°C, cho phép tạo ra sản phẩm đúng kích thước nrLSU khoảng 950 bp, theo nghiên cứu của Sung et al (2007) Chúng tôi đã điều chỉnh quy trình thí nghiệm để tối ưu hóa việc khuếch đại DNA cho mẫu nấm ký sinh côn trùng, sử dụng phương pháp phenol: chloroform kết hợp với -mercaptoethanol và tối ưu hóa nhiệt độ PCR.

B ng 3.5 ng h p thi t l p chu k nhi t PCR khu ch đ i các vùng gen nrLSU c a các m u n m ký sinh côn trùng

Giai đo n Bi n tính Bi n tính M i b t c p Kéo dài Kéo dài cu i cùng

Th i gian 5 phút 30 giây 30 giây 2 phút 5 phút

Sau khi tối ưu hóa quy trình tách chiết DNA và quy trình PCR, chúng tôi tiến hành thực nghiệm khuếch đại vùng gen mục tiêu nrLSU từ 6 mẫu nấm ký sinh côn trùng DL006, DL0015, DL0038B, DL0069, DL0075, và DL0077 Sau đó, chúng tôi gửi giải trình các mẫu nấm này tới công ty Nam Khoa.

K T QU HI U CH NH TRỊNH T

Mặc dù những cải tiến về mặt kỹ thuật và thuật toán nhằm cải thiện độ chính xác trong việc xử lý các cơ sở dữ liệu đang được nghiên cứu tích cực, nhưng tỷ lệ sai sót vẫn có thể xảy ra và khó có thể đạt được độ chính xác tuyệt đối bằng phương pháp tự động Khi một cơ sở dữ liệu bị sai, nó có thể dẫn đến nhiều sai lầm nghiêm trọng trong việc phân tích sau này Do vậy, những biện pháp hiệu chỉnh là cần thiết để đảm bảo độ chính xác cho dữ liệu.

SVTH: Nguy n Th H i Ng c 34 tr c ti p th c hi n nh m kh c ph c t i đa vi c xác đ nrLSU nrLSU

Hình 3.8 Hi u ch nh tín hi u nhi u đ u m ch xuôi c a nrLSU m u DL0015

Tại vị trí số 1, mạch xuôi là ch T và mạch ngược là ch A Khi quan sát trình tự trên mạch xuôi, tín hiệu peak nucleotide ch A nổi bật, trong khi ch T có mức độ thấp hơn ở vùng đầu 5‟ Tại vị trí này, mạch xuôi ch T được hiểu chính xác bằng chữ a, cho thấy sự chính xác của nucleotide được viết bằng chữ cái thường.

Tín hiệu vùng này có xu hướng phát triển các định hướng huỳnh quang không rõ ràng do rối loạn đầu 5', gây khó khăn trong việc xác định Tuy nhiên, máy đã có giải pháp mới giúp tín hiệu trở nên rõ ràng hơn, cho phép thu được trình tự chính xác và cải thiện khả năng hiểu chính xác trên máy này.

Hình 3.9 V trí sai l ch c a hai k t qu gi i trình t đ u m ch xuôi c a LSU

Tại các vị trí (i) đến (vi) không có sự tương đồng giữa hai mạch, ví dụ tại vị trí (i): mạch xuôi là C, mạch ngược là G Những tín hiệu mạch xuôi rõ ràng nên phải hiểu rằng mạch ngược C sẽ chuyển thành G.

B ng 3.6 B ng hi u ch nh các nucleotide t i các v trí (i) đ n (vi)

V trí (m ch F) Nu g c Nu hi u ch nh

G A i v i các trình t nu gi a, t t c các peak đ u rõ ràng, và có s trùng kh p trên c hai k t qu đ c b ng m i xuôi và m i ng c K t qu hi u ch nh v n đ c gi nguyên nh c, hình d i minh h a m t ph n khúc gi a.

Hình 3.10 Hi u ch nh vùng gi a trên 2 m ch nrLSU

Hiệu chỉnh vùng 3: Có sự khác biệt tại vị trí nút 863 và 864 mà chúng ta cần chú ý Tại đây, các nút T và A thể hiện rõ ràng, trong khi các nút G tại vị trí 1091 và 1092 cần được điều chỉnh Nhìn chung, ở vùng 3, các tín hiệu từ nút T và A rõ ràng hơn, trong khi tín hiệu từ các nút G lại không ổn định, do đó cần thực hiện hiệu chỉnh cho hai nút T và A.

T ng t vùng 4: các nu m ch xuôi t v trí 856 đ n 860 có peak rõ ràng, còn m ch ng c t ng ng v i nu 1084 đ n 1088 thì tín hi u b nhi u nên s gi nguyên các nu m ch xuôi

Hình 3.11 Hi u ch nh vùng 3, vùng 4 trên m ch xuôi c a gen nrLSU

T i vùng đ u 3‟ m ch xuôi t v trí nu 865 đ n 904 ta th y trên m ch ng c không có xu t hi n nu Tuy nhiên, d a trên hình ph , ta th y các nu t v trí 865 đ n

878 có peak rõ rƠng Do đó, ph n nu này gi l i, và b các nu t 879 đ n 904

Hình 3.12 Hi u ch nh vùng cu i m ch xuôi (5’-3’) c a gen LSU

Hình 3.13 Hi u ch nh vùng cu i trên m ch xuôi c a gen nrLSU

K T QU XÂY D NG CÂY PHÁT SINH LOÀI

V lý thuy t

Chúng tôi đã xây dựng cơ sở lý luận cho việc xác định các loài nấm ký sinh côn trùng thông qua các bước khô sát in silico để đánh giá các hệ thống phân loại, thu thập và xây dựng cơ sở dữ liệu cho vùng gen mục tiêu nrLSU Quy trình thực nghiệm đã được thiết lập nhằm thu thập vùng gen mục tiêu, giải trình tự và hiệu chỉnh trình tự để đưa ra các trình tự chính xác nhất Thành công trong việc xây dựng cây phân loại dựa trên 155 trình tự tham khảo từ Sung và cộng sự Các cây phân loại đã được xây dựng để xác định các mẫu nấm ký sinh côn trùng bằng 3 phương pháp: Neighbor Joining, Maximum Parsimony và Maximum Likelihood.

V th c nghi m

Xây d ng đ c ph ng pháp tách chi t và h tr đnh danh loài n m ký sinh côn trùng v i th t nh sau:

Chúng tôi đƣ xơy d ng thành công quy trình th c nghi m tách chi t DNA t h s i n m b ng ph ng pháp phenol-chloroform có b sung -mercaptoethanol

Xây d ng thƠnh công quy trình PCR đ khu ch đ i vùng gen m c tiêu nrLSU

Gi i trình t và hi u chnh đ c 6 trình t c a 6 m u n m ký sinh côn trùng DL006, DL0015, DL0038B, DL0069, DL0075, DL0077 v i c p m i khu ch đ i nrLSU và xu t ra đ c nh ng trình t chính xác

Xây dựng thành công các cây phả hệ phân tán mạch danh 6 mẫu nấm DL006, DL0015, DL0038B, DL0069, DL0075, DL0077, trong đó mẫu DL006 là loài rất gần với Cordyceps cf takaomontana, mẫu DL0015 là loài rất gần với Cordyceps pruinosa, mẫu DL0038B là loài rất gần với Isaria tenuipes, mẫu DL0075 là loài rất gần với Cordyceps staphylinidicola, và mẫu DL0069, DL0077 là loài rất gần với Simplicillium sp.

Chúng tôi đang tiến hành tách chiết, khu cách ly và xây dựng cây phả hệ để phân tích thêm 4 mẫu ký sinh trùng còn lại trong bộ sưu tập mẫu tại phòng thí nghiệm.

Kết quả nghiên cứu cho thấy việc xây dựng cây phân loại dựa vào các vùng gen nrLSU đã giúp định danh hình thái của một số loài nấm ký sinh côn trùng trong thực nghiệm.

Ông Trùng H Th o D c là một loại đông trùng h th o quý hiếm, có khả năng hỗ trợ điều trị các bệnh do virus, ung thư, HIV/AIDS, đái tháo đường và suy giảm tình dục Nghiên cứu của L u Tham M u (2009) đã chỉ ra tiềm năng của loài đông trùng h th o này trong lĩnh vực y học, đặc biệt là trong việc phát hiện và ứng dụng tại Việt Nam.

[2] Lê T n H ng, Võ Th H nh, Lê Th Bích Ph ng, Tr n Th nh Phong,

Trần Ngọc Hùng Vương và Somsak Sivichai (2010) đã nghiên cứu về ẩm thực từ côn trùng tại Vườn quốc gia Cát Tiên, chỉ ra rằng đây là nguồn tài nguyên quý giá cho các nghiên cứu sinh học Hội nghị Khoa học kỷ niệm 35 năm Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam-Hà Nội đã nhấn mạnh tầm quan trọng của việc bảo tồn và phát triển nguồn tài nguyên này.

[3] Nguy n D ng Khuê (2005), ắS d ng n m Metarhizium anisopliae Sorok

Phòng tr m i nhƠ (Coptotetrmes formosanus Shiraki) theo ph ng pháp lơy nhi mẰ, H i ngh côn trùng h c toƠn qu c l n th 5, HƠ N i, tr 409-414

[4] Nguy n Th L c, Võ Th Bích Chi, Nguy n Th NhƠn, Ph m Quang H ng,

Hu nh V n Nghi p, V Ti n Khang vƠ Nguy n c ThƠnh (2002), ắNghiên c u, s n xu t vƠ ng d ng hai ch ph m sinh h c đ qu n lý các loƠi sơu h i lúaẰ, Vi n lúa BSCL, tr 274-295

[5] Ph m Quang Thu (2009), ắ i u tra phát hi n n m Nh ng trùng h th o

Cordyceps nutans pat phơn b khu b o t n thiên nhiên Tơy Yên T - S n ng - B c GiangẰ, T p trí nông nghi p và phát tri n nông thôn, s 4 - tháng 4/2009

[6] Ph m Quang Thu (2009), ắPhát hi n n m đông trùng h th o Cordyceps gunnii (Berk.) t i v n qu c gia Tam o, t nh V nh PhúcẰ, T p chí Nông nghi p và Phát tri n Nông thôn, 135, tr 96-99

Phạm Quang Thụ (2013) đã nghiên cứu về ứng dụng công nghệ cao trong sản xuất nông nghiệp tại Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, nhằm nâng cao hiệu quả và chất lượng trong lĩnh vực này.

[8] Ph m Th Thùy (2010), ắNghiên c u phát tri n các ngu n n m Beauveria vƠ

Metarhizum đ ng d ng phòng tr sơu h i cơy tr ng, cơy r ng vƠ phát tri n n m Cordyceps lƠm th c ph m ch c n ng cho ng iẰ, Báo cáo t i H i th o

Qu c gia b nh h i th c v t Vi t Nam, NhƠ xu t b n Nông nghi p, 224 -231

Trần Văn Hai, Trịnh Thị Xuân, và Phạm Kim Sơn (2006) đã thực hiện nghiên cứu về sự sinh khối và thí nghiệm hiệu lực của một số loại nấm ký sinh trên sầu riêng tại thành phố Cần Thơ Nghiên cứu này được đăng tải trong Tạp chí Nghiên cứu Khoa học, trường HCT.

[10] Tr nh Tam Ki t (2001), ắDanh l c các loƠi th c v t Vi t Nam (ph n N m)Ằ,

NhƠ xu t b n Nông nghi p, HƠ N i.

[11] Võ Th Thu Oanh, Lê ình ôn, Bùi Cách Tuy n (2007), ắ c đi m sinh h c vƠ kh n ng gơy b nh c a n m Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin đ i v i sơu khoang (Spodoptera litura F.) h i rau c i xanh (Brassica juncea L.)Ằ,

T p chí KHKT Nông Lâm nghi p, s 1&2, i h c Nông Lơm Tp HCM, 58-63

[12] Bok J W., Lermer L., Chilton J., Klingeman H.G., Tower G.H N (1999), ắAntitumor sterols from the mycelia of Cordyceps sinensisẰ Phytochemistry, 51(7), pp 891-898

Clavariaceae using nuclear large subunit rDNA sequences and a new genus segregated from ClavariaẰ, Mycologia, 98(5):746ậ762

[14] Dowell K (2008), ắMolecular phylogenetics: an introduction to computation methods and tools for analyzing evolutionary relationshipẰ, Math 500, 1-16

[15] Fell J W., Boekhout T., Fonseca A., Scorzetti G., Statzell-Tallman A (2000), ắBiodiversity and systematics of Basidiomycetous yeasts as determined by large-subunit rDNA D1/D2 domain sequence analysisẰ, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 50, 1351-1371

[16] Felsenstein J (1985), ắConfidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrapẰ, Evolution, 39(4), 783-791

[17] Gue-ho E., Improvisi L., Christen R., Hoog G S (1993), ắPhylogenetic relationships of Cryptococcus neoformans and some related Basidiomycetous yeasts determined from partial large subunit rRNA sequencesẰ, Antonie van Leeuwenhoek, 63, 175-189

[18] Hall B.G (2001), ắPhylogenetic trees made easy: A how-to manual for molecular biologistsẰ, Sinauer Association Inc 179 tr

[19] Hodge K T., Krasnoff S B., Humber R A (1996), ắToiypocladium injatum is the anamorph of Cordyceps subsessilisẰ, Mycologia, 88(5), 715-719

[20] Holliday J C., Cleaver P., Loomis-Powers M., Patel D., (2004), ắAnalysis of quality and techniques for hybridization of medicinal fungus Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc (Ascomycetes)Ằ, International Journal of Medicinal Mushrooms, 6, 151-164

[21] Holliday J., Cleaver M (2008), ắMedicinal value of the Caterpillar fungi species of the genus Cordyceps (Fr.) Link (Ascomycetes) A Review”,

International Journal of Medicinal Mushrooms, 10 (3), 219-234

[22] Jeewon R., Liew E.C.Y., Hyde K.D., (2003), ắMolecular systematics of the

Amphisphaeriaceae based on cladistics analyses of partial LSU rDNA gene sequencesẰ, Mycol Res, 107 (12), 1392-1402

[23] Josep Guarro, Josepa Gené, and Alberto M Stchigel (1999), ắDevelopments in fungal taxonomyẰ, Clinical Microbiology Reviews, 454-500

[24] Kiho T., Kobayashi T., Morimoto H (2000), ắStructural features of an anti- diabetic polysaccharide (TAP) from Tremella aurantiaẰ, Chem Pharm Bull (Tokyo), 48, 1793-1795

[25] Kobayasi Y (1982), ắKeys to the taxa of the genera Cordyceps and

TorrubiellaẰ, Transactions of the Mycological Society of Japan, 23, 329-364

[26] Kurtzman C.P., Robnett C J (1998), ắIdentification and phylogeny of ascomycetous yests from analysis of nuclear large subunit (26S) ribosomal DNA partial sequencesẰ, Antonie Van Keeuwenhoek, 73, 331-371

[27] Lee J S., Lim M O., (2006), ắIdentification of medicinal mushroom species based on nuclear large subunit rDNA sequencesẰ, The Journal of Microbiology, 44(1), 29-34

[28] Lemey P., Salemi M., Vandamme A M (2009), ắThe phylogenetic handbook:

A practical approach to phylogenetic analysis and hypothesis testing, Cambridge University Press, 709 tr

[29] Lo Hui-Chen., Hsieh C., (2013), ắA systematic review of the mysterious

Caterpillar fungus Ophiocordyceps sinensis in Dong-Chong XiaCao and related bioactive ingredientsẰ, J Tradit Complement Med, 3 (1): 16-32

[30] Liu Y J., Whelen S., Hall B D (1999), ắPhylogenetic Relationships Among

Ascomycetes: Evidence from an RNA Polymerse II SubunitẰ, Molecular Biology and Evolution, 16 (2), 1799-1808

[31] McCoy C W (1990), ắEntomogenous fungi as microbial pesticidesẰ, tr 139-

[32] Pagel M., (1999), ắInferring the historical patterns of biological evolutionẰ

[33] Rehner S.A., Samuels G.J., (1995), ắMolecular systematics of the

Hypocreales: a teleomorph gene phylogeny and the status of their anamorphsẰ Can J Bot, 73: 816-823

[34] Sonnenberg R., Nolte A.W., Tautz D (2007), ắAn evaluation of LSU rDNA

D1-D2 sequences for their use in species identificationẰ, Frontiers in Zoology, tr 4-6

[35] Spatafora J W., Sung G H., Sung J M., Hywel-Jones N L., White J F Jr

(2007), ắPhylogenetic evidence for an animal pathogen origin for ergot and the grass endophytesẰ, Molecular Ecology 16: 1701-1711

[36] Siev M., Weinberg R., Penman S., (1969), ắThe selective interruption of nucleolar rna synthesis in HELA cells by cordycepinẰ The Journal of Cell Biology, 41 (2), 510- 526

[37] Sun Y J., Lü P., Ling J.Y., Zhang H X., Chen C., Zhang C.K (2003), ắNucleosid from Cordyceps kyushuensis and the distribution of two active components in its different partsẰ, Yao Xue Xue Bao, 38(9), 690-694

[38] Sung G H., Hywel-Jones N L., Sung J M., Luangsa-ard J J., Shrestha B.,

Spatafora J W (2007), ắPhylogenetic classification of Cordyceps and the clavicipitaceous fungiẰ, Studies in Mycology, 57(1), 5-59

[39] Sung G H., Sung J M., Hywel-Jones N L., Spatafora J W (2007), ắA multi- gene phylogeny of Clavicipitaceae (Ascomycota, Fungi): Identification of localized incongruence using a combinational bootstrap approachẰ, Molecular Phylogenetics and Evolution

[40] Taborsky V (1992), ắSmall-scale processing of microbial pestcidesẰ FAO

[41] Vilgalys R., Hester M (1990), ắRapid genetic identification and mapping of enzymatically amplified ribosomal DNA from several Cryptococcus speciesẰ, Journal of Bacteriology, 172, 4239-4246

[42] Wang S Y., Shiao M S (2000), ắPharmacological Functions of Chinese

Medicinal fungus Cordyceps sinensis and related speciesẰ, Journal of Food and Drug Analysis, 8(4), 248-257

[43] Wasser S P (2002), ắMedicinal mushrooms as a source of anti-tumor and immunomodulating polysaccharidesẰ, Appl Microbiol Biotechnol, 60, 258-

[44] Wenger R M (1984), ắSynthesis of cyclosporine Total syntheses of ằcyclosporin A‟ and ằcyclosporin H‟, two fungal metabolites isolated from the species Tolypocladium inflatum GAMSẰ, HCA, 67, 502-525

[45] Wong Y Y., Moon A., (2010), ắCordycepin inhibits protein synthesis and cell adhesion through effects on signal transductionẰ, Journal of Biological Chemistry, 285, 2610-2621

[46] Zhou J., Tang K (2009), ắCordyceps fungi: natural products, pharmacological