Cordyceps là nhóm nấm ký sinh trên côn trùng (Kobayashi, 1982; Spatafora Blackwell, 1993) thuộc họ Clavicipitaceae, bộ Hypocreales, lớp Pyrenomycetes thuộc ngành nấm túi (Ascomycota). Chi Cordyceps nổi tiếng trong y học cổ truyền Trung Quốc và có nhiều tác dụng đối với sức khỏe lâm sàng bao gồm các hoạt động điều hòa miễn dịch, chống ung thư, chống oxy hóa, chống viêm và chống vi khuẩn (Tuli et al., 2014, Yue et al., 2013). Nổi bật nhất trong số này là các loài Ophiocordyceps sinensis (Đông Trùng Hạ Thảo), Cordyceps militaris (Nhộng Trùng Thảo), Cordyceps subsessilus, Cordyceps takaomontana nhờ vào khả năng tạo ra các hoạt chất sinh học quý sử dụng khá rộng rãi trong y dược. Nhóm nấm này mang nhiều đặc tính sinh học đáng chú ý nhờ khả năng ký sinh gây bệnh cho côn trùng và hình thành nên các dạng quả thể độc đáo. Ophiocordyceps sinensis (Đông trùng hạ thảo), là loài nấm có chứa nhiều hoạt chất quan trọng được dùng nhiều nhất trong y dược nhất. Các nghiên cứu cho thấy sinh khối của loài nấm này có đến hơn 20 tác dụng chữa bệnh khác nhau đối với con người: (1) điều chỉnh đáp ứng miễn dịch (Kuo et al., 1996), (2) ức chế sự phát triển của tế bào khối u (Bok et al., 1999), (3) gia tăng chức năng gan (Manabe et al., 1996), (4) thúc đẩy việc tiết ra các hormone tuyến thượng thận (Wang et al., 1998), (5) giảm huyết áp và sự căng cơ (Chiou et al., 2000), (6) điều hòa đường máu (Guo Zhang 1995), v.v... Các nghiên cứu về nhóm nấm Cordyceps cho thấy có nhiều loài Cordyceps sp. được phát hiện cũng có khả năng ứng dụng trong y dược. Tiêu biểu như Cordycepin có trong Cordyceps militaris có khả năng ức chế quá trình tổng hợp RNA, DNA và ngăn chặn sự tái bản của virus (Kuo et al., 1994). Hợp chất Galactomannan được tách chiết từ Cordyceps cicadae cho thấy chất này có khả năng chống lại sự phát triển của dòng tế bào ung thư xương ở chuột (Ukai et al., 1983). Một số polysaccharides tinh chế từ Cordyceps ophioglossoides đã được chứng minh là tác nhân chống khối u (Yanada et al., 1984; Ohmiru et al., 1986). Khả năng chống ung thư của Paecilomyces tenuipes đối với cơ thể sống đã được Ban et al., phát hiện năm 1998. Cũng ở loài nấm này, tác giả Shim et al., (2001) đã tìm thấy khả năng gây độc tế bào chống lại các dòng tế bào ung thư. Dẫn xuất nucleoside N6(2hydroxyethyl) adenosine (HEA) tách chiết từ Cordyceps pruinosa cho thấy tác dụng kháng Ca2+ và chống co thắt cơ tim (Furuya et al., 1983). Cordyceps pruinosa có khả năng kháng viêm thông qua việc ức chế sự biểu hiện của gene phụ thuộc NFkappaB (Kim et al., 2003). Cyclosporin chiết ra từ Tolypocladium inflatum (thể hữu tính là Cordyceps subsessilus) là chất duy nhất làm cho sự cấy ghép các cơ quan trong cơ thể người có thể thực hiện được.Nucleosides là một trong những thành phần chính của Cordyceps. Vào năm 1964, 3’deoxyadenosine hay cordycepin được phân lập từ Cordyceps militaris. Kể từ đó, nucleosides trong Cordyceps đã trở thành tiêu điểm vì cordycepin (3’deoxyadenosine) đã cho thấy hoạt tính chống khối u. Hay N6(2hydroxylethyl)adenosine đóng vai trò như là đối vận Ca2+ và thành phần ion được phân tích từ nấm nuôi cấy Cordyceps. Các nucleoside ở Cordyceps cũng đã được chứng minh cho thấy chúng có liên quan đến việc điều hoà và điều chỉnh các tiến trình sinh lý khác nhau trong hệ thần kinh trung ương. Adenosine được biết đến là nhằm làm suy giảm tính kích thích của các neuron hệ thần kinh trung ương và ức chế phóng thích các chất dẫn truyền thần kinh tiền synap. Ngoài ra, inosine, chất chuyển hoá sinh hoá chính của adenosine từ phản ứng oxi hoá khử amin, có thể kích thích sự phát triển sợi trục trong ống nghiệm và trong hệ thống thần kinh người trưởng thành. Từ các tóm lược như trên, có thể thấy rằng giá trị của nấm ký sinh côn trùng chi Cordyceps đã được khẳng định không chỉ dựa trên kinh nghiệm dân gian mà rất nhiều bằng chứng khoa học. Bên cạnh đó đối mặt với tình hình dịch bệnh của covid19 cơ quan quản lý dược phẩm và thực phẩm Hoa Kì (FDA) đã cho phép dùng cordycepin trong Nhộng trùng thảo nuôi cấy để chữa Sars – Cov 2 vì cordycepin có thể ức chế quá trình tổng hợp RNA, DNA và ngăn chặn quá trình tái bản của virus. Trong nhiều giá trị của chúng trong y dược, chúng tôi đặc biệt chú trọng đến khả năng sinh tổng hợp nucleoside (Cordycepin) của các chủng nấm – như một chỉ dấu sinh học quan trọng nhằm chọn lọc được chủng giống tốt. Việc phân tích mối tương quan của các gene liên quan đến quá trình sinh tổng hợp cordycepin, adenosine chính là cơ sở khoa học quan trọng để hiểu được sự chuyển hóa tạo adenosine và cordycepin và là một dữ liệu thú vị để sàng lọc chọn lựa các chủng giống tiềm năng có thể tạo nên adenosine và cordycepin.Cho đến nay, số lượng công trình nghiên cứu một số gene liên quan đến con đường sinh tổng hợp adenosine và cordycepin trên các mẫu nấm ký sinh côn trùng nói chung và loài Metacordyceps taii là không nhiều. Vì vậy em quyết định thực hiện khóa luận tốt nghiệp với chuyên đề “HỖ TRỢ ĐỊNH DANH PHÂN TỬ VÀ PHÂN TÍCH SỰ BIỂU HIỆN CỦA MỘT SỐ GENE LIÊN QUAN ĐẾN CON ĐƯỜNG CHUYỂN HÓA ADENOSINE VÀ CORDYCEPIN TRÊN LOÀI METACORDYCEPS TAII” với mục tiêu là khảo sát sự hiện diện, biểu hiện một số gene liên quan đến con đường sinh tổng hợp cordycepin và adenosine trên loài Metacordyceps taii từ đó giúp xác định các phân tử các gene có thể ảnh hưởng đến hàm lượng adenosine và cordycepin trên loài Metacordyceps taii, từ đó làm cơ sở dữ liệu hỗ trợ cho sàng lọc chọn lọc các loài chủng giống nấm ký sinh côn trùng có tiềm năng cao trong sản xuất adenosine và cordycepin phục vụ cho y học Việt Nam.
TỔNG QUAN VỀ CHI NẤM CORDYCEPS
Đặc điểm chung và lịch sử nghiên cứu của chi nấm Cordyceps
1.1.1 Đặc điểm chung của chi nấm Cordycecps
Cordyceps là một chi nấm lớn và đa dạng, thuộc họ Clavicipitaceae trong bộ Hypocreales, với hơn 750 loài đã được xác định Các loài nấm này chủ yếu ký sinh trên côn trùng và ấu trùng, tập trung chủ yếu tại Trung Quốc và các quốc gia Đông Nam Á.
Cordyceps thể hiện sự ký sinh chặt chẽ với vật chủ, với mức độ ký sinh khác nhau giữa các loài Một số loài chỉ ký sinh trên một vật chủ cụ thể, như Cordyceps sobolifera ký sinh trên nymph của Platypleura kaempferi ở Nhật Bản, trong khi những loài khác như Cordyceps militaris có thể ký sinh trên nhiều vật chủ khác nhau trong cùng một nhóm Khoảng 20 loài Cordyceps ký sinh trên các loài thuộc chi Elaphomyces, trong khi phần lớn các loài còn lại ký sinh trên côn trùng thuộc các bộ khác nhau như Homoptera, Lepidoptera, Coleoptera, Hymenoptera và Diptera Cordyceps phát triển các cơ chế phức tạp để né tránh hệ thống miễn dịch của vật chủ và đồng bộ vòng đời của chúng với vòng đời của vật chủ để tồn tại và sinh sản Những cơ chế này dẫn đến việc sản sinh ra các chất chuyển hóa thứ cấp độc đáo, có tiềm năng cho việc khám phá thuốc mới Cordyceps, được biết đến như “Đông trùng hạ thảo” trong y học cổ truyền Trung Quốc, là một trong những loại nấm có giá trị nhất và thường được tìm thấy trên Cao nguyên Tây Tạng ở độ cao lớn.
3500 đến 5500m Các nghiên cứu trước đây đã tiết lộ rằng Cordyceps có nhiều hợp chất sinh học quý chẳng hạn như cordycepin, axit cordycepic, ergosterol,
Polysaccharides có tác dụng dược lý đa dạng, bao gồm điều hòa miễn dịch, chống ung thư, chống oxy hóa, chống viêm và kháng khuẩn, đồng thời hỗ trợ sửa chữa tổn thương gan (Tuli et al., 2014; Yue et al., 2013) Quá trình ký sinh của Cordyceps trên côn trùng diễn ra qua ba giai đoạn: (1) Ký sinh trên côn trùng; (2) Cuối mùa thu, chất trên da sâu bướm tương tác với bào tử nấm, giải phóng bào tử và xâm nhiễm vào sâu bướm; (3) Đến mùa hè năm sau, nấm ký sinh hoàn toàn, giết chết sâu bướm và hình thành quả thể, tiếp tục phát triển.
Hình 1.1: Cordyceps confragosa ngoài tự nhiên (Kepler et al., 2017)
1.1.2 Lịch sử nghiên cứu chi Cordyceps
Cordyceps có lịch sử lâu đời như một loại thần dược quý hiếm có tác dụng điều trị nhiều loài bệnh của Trung Quốc Năm 1964, Cordyceps sinensis chính thức
Đông trùng hạ thảo, được ghi nhận là một loại thuốc thảo dược trong dược điển Trung Quốc, đã được tác giả Wang Ang mô tả trong tác phẩm “Trích yếu về y dược” Năm 1843, Miles Joseph Berkeley phát hiện ra loài nấm có "rễ" mọc trên sâu và đã phân loại, đặt tên cho nó là Sphaeria sinensis.
1878, Saccardo nhà phân loại học người Ý đã đặt tên chính thức cho Đông trùng hạ thảo được phát hiện ở Trung Quốc là Cordyceps sinensis.
Thành phần loài và phân loại khoa học chi Cordyceps
Hiện nay, hơn 400 loài nấm Cordyceps đã được nghiên cứu và xác định, trong đó khoảng 120 loài được tìm thấy ở Trung Quốc Các loài này chủ yếu được phân loại dựa trên phương pháp phân tích giải phẫu hình thái theo nghiên cứu của Kobayashi (1982) và Main (1958), và chúng thuộc họ Clavicipitaceae.
Hệ thống phân loại khoa học của chi nấm Cordyceps: (Kepler et al., 2017) Giới (Regnum): Fungi
Thành phần dinh dưỡng của Cordyceps
1.3.1 Thành phần dinh dưỡng chung của Cordyceps
Hiện nay, các nghiên cứu phân tích thành phần hóa học từ chiết xuất của
Cordyceps sinenis cho thấy có nhiều thành phần dinh dưỡng bao gồm: Axit amin,
Vitamin E, K và các vitamin tan trong nước như B1, B2, B12 Ngoài ra, chúng còn chứa nhiều các phức hợp polysaccharides, proteins, sterols, nucleosides, các nguyên
8 tố vi lượng và đa lượng (K, Na, Ca, Mg, Fe, Cu, Mn, Zn, Pi, Se, Al, Si, Ni, Sr, Ti, Cr,
Ga, V, và Zr) và các dẫn xuất đường như mono, di, oligosaccharides
1.3.2 Thành phần hóa học chính của Cordyceps
Nucleosides là một trong 2 nhóm hợp chất chính xuất hiện trong chi
Cordyceps militaris đã được nghiên cứu từ năm 1964 khi 3’-deoxyadenosine hay cordycepin được phân lập, cho thấy hoạt tính chống khối u Các nucleosides trong Cordyceps, bao gồm N6-(2-hydroxylethyl)-adenosine, đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh các quá trình sinh lý trong hệ thần kinh trung ương Adenosine giúp giảm tính kích thích của các neuron và ức chế phóng thích chất dẫn truyền thần kinh tiền synap Thêm vào đó, inosine, một sản phẩm chuyển hóa của adenosine, có khả năng kích thích sự phát triển sợi trục trong ống nghiệm và hệ thống thần kinh người trưởng thành.
Hình 1.2: cấu trúc hóa học của cordycepin
Adenosine là một nucleoside nội sinh có mặt trong tất cả các tế bào của cơ thể, với cấu trúc hóa học 6-amino-9-beta-D-ribofuranosyl-9-H-purine Nó không chỉ tham gia vào việc cấu thành DNA và ATP - nguồn năng lượng chính cho tế bào, mà còn tạo ra các hoạt chất quý giá như Cordycepin và D-manitol trong y học Nghiên cứu cho thấy Adenosine có tác dụng tích cực đối với hệ tim mạch, đồng thời đóng vai trò quan trọng trong quá trình dẫn truyền thần kinh, trao đổi chất và cung cấp năng lượng hàng ngày.
Hình 1.3: Cấu trúc hóa học của adenosine
Cordyceps chứa polysaccharid với hàm lượng từ 3% đến 8% tổng khối lượng khô, đây là hợp chất chính trong loại nấm này Các dẫn xuất đường như axit cordycepic (d-mannitol) cũng đã được nghiên cứu và cho thấy có hoạt tính chống oxi hóa, tiềm năng tăng cường miễn dịch, chống khối u, cũng như khả năng giảm và điều hòa lượng đường trong máu (Li et al., 2001; Li et al., 2002).
Các loài thuộc chi Cordyceps chiếm một lượng lớn các hợp chất từ sterols
Hầu hết các sterol từ loài Cordyceps đều cho thấy khả năng kháng khối u mạnh mẽ Ergosterol và ergosterol peroxide là hai sterol chính được tìm thấy trong các loài này Ngoài ra, còn có một số sterol khác như 3-sitosterol, campeasterol, daucosterol và 5α, 8α-epidioxy-24 (R).
Methyl-cholesta-6,22-dien-3β-D-glucopyranoside đã được phân lập từ các loài trong chi Cordyceps, cho thấy nhiều đặc tính dược lý quan trọng Những sterol này có khả năng gây độc tế bào, kháng vi-rút, chống loạn nhịp tim, ức chế trung bì người được kích hoạt tế bào và giảm immunoglobulin A trong bệnh thận.
1.3.2.5 Protein, axit amin và các hợp chất khác
Cordyceps contains a protein content ranging from 29.1% to 33%, comprising 18 amino acids including aspartic acid, threonine, serine, glutamate, proline, glycine, valine, methionine, isoleucine, leucine, tyrosine, phenylalanine, lysine, histidine, cystine, cysteine, and tryptophan The amino acids with the highest concentrations are glutamate, arginine, and aspartic acid, while arginine, glutamate, tryptophan, and tyrosine are noted for their significant medicinal properties.
Cordyceps militaris has been studied (Zheng et al., 2011) and found to contain 61 protease gene families, predominantly serine proteases and metallopeptidases, along with 12 genes encoding trypsin, 167 genes for protein kinases, and 105 genes for glycoside hydrolases Furthermore, Cordyceps militaris possesses most of the essential genes for adenine and adenosine metabolism, although it lacks ribonucleotide triphosphate reductase and deoxyadenosine kinase Additionally, Cordyceps contains various polar compounds, including hydrocarbons, alcohols, and aldehydes, as well as proteins, peptides, polyamines, amino acids, and some cyclic dipeptides.
Cordyceps cũng có hoạt tính chống ung thư và hỗ trợ miễn dịch Nấm Hypcrealean
AP và một số loài trong chi Cordyceps có khả năng sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp với hoạt tính sinh học, tạo ra nguồn tiềm năng cho việc phát triển dược phẩm và thuốc điều trị.
Tiềm năng ứng dụng của Cordyceps
1.4.1 Ứng dụng kiểm soát sâu bệnh
Nhiều loài nấm ký sinh côn trùng như Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae và Normurea rileyi đã được ứng dụng rộng rãi trong kiểm soát dịch hại thông qua đối kháng sinh học Đặc biệt, Metarhizium anisopliae là loài nấm đầu tiên được áp dụng trong lĩnh vực này.
Từ năm 1992, nhiều nghiên cứu tại Việt Nam đã thành công trong việc ứng dụng nấm ký sinh côn trùng để phòng trừ sâu hại cây trồng, với các loại nấm như Metarhizium anisopliae và Beauveria bassiana được sử dụng để kiểm soát mối nhà, sâu khoang hại cải xanh, sâu hại đậu tương, đậu xanh, rầy mềm và các loại sâu hại lúa Nghiên cứu của nhóm tác giả Sung et al (2007) đã phân loại nấm có khả năng tác động đến hành vi côn trùng vào chi nấm Cordyceps, trong đó Cordyceps unilateralis có khả năng tác động đến hệ thần kinh của kiến, khiến chúng leo lên cây và bám chặt trước khi chết, từ đó giúp bào tử nấm phát triển và phân tán rộng rãi.
1.4.2 Ứng dụng trong lĩnh vực y dược
Nhiều loài nấm trong chi Cordyceps có khả năng kiềm chế sự phát triển của khối u, tăng cường miễn dịch và nâng cao thể lực, hỗ trợ hiệu quả cho bệnh nhân ung thư Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng Cordyceps có thể ức chế sự phát triển của tế bào khối u (Bok et.al., 1999; Nakamura, 1999) và khả năng kháng ung thư của polysaccharide hòa tan trong kiềm thu được từ Cordyceps ophioglossoides (Yanada).
1984), khả năng gây độc tế bào để chống tế bào ung thư của Paecilomyces tenuipes (Shim et.al., 2001)
Hợp chất trong chi nấm Cordyceps có khả năng điều hòa miễn dịch, giúp ngăn ngừa bệnh tật Cordyceps có hai chức năng chính là điều chỉnh tăng hoặc giảm miễn dịch Nấm này có thể ức chế miễn dịch bằng cách kiểm soát các rối loạn tự miễn dịch và viêm do tổn thương mô, đồng thời ngăn chặn quá trình thải ghép sau khi cấy ghép nội tạng (Taylor et al., 2005) Ngoài ra, Cordyceps còn điều khiển miễn dịch bẩm sinh và đáp ứng miễn dịch (Li & Tsim, 2004; Ng.T.B & Wang, 2005).
NGHIÊN CỨU ĐỊNH DANH VÀ PHÁT SINH LOÀI
Phương pháp định danh hình thái
Phương pháp định danh hình thái là tiêu chuẩn vàng trong việc xác định các loài nấm, đặc biệt là chi Cordyceps, thông qua phân tích giải phẫu hình thái Hình thái khuẩn lạc nấm dạng sợi, với cấu trúc hình trụ và đường kính 2–10 μm, có thể quan sát bằng mắt thường và là yếu tố quan trọng trong việc định danh nấm (Lima & Borba, 2001) Quan sát dưới kính hiển vi cho phép kiểm tra hình dạng và sự sắp xếp của các bào tử (Gaddeyya et al., 2012) Năm 1982, Kobayashi đã phát triển khóa phân loại cho các loài Cordyceps và Torrubiella dựa trên 282 loài Cordyceps, 59 loài Torrubiella và 75 loài khác, hiện vẫn được sử dụng để hỗ trợ định danh Tuy nhiên, phương pháp truyền thống còn nhiều hạn chế như tác động môi trường, thời gian yêu cầu lớn và kỹ năng cao, dẫn đến sự biến đổi trong hình thái và đặc điểm của một loài Định danh phân tử mang lại tốc độ nhanh và độ đặc hiệu cao trong phân biệt các loài nấm, vượt trội hơn so với các xét nghiệm hình thái và sinh hóa truyền thống (Liu et al., 2000; Sugita & Nishikawa, 2003).
In 2007, Sung et al reorganized the classification of the Cordyceps fungi and the Clavicipitaceae family Their findings revealed that the Clavicipitaceae family includes sexual forms from the genera Metacordyceps, Hypocrella, Regiocrella, and Torrubiella, while the asexual forms are represented by the genera Aschersonia, Metarhizium, Nomuraea, Paecilomyces, Pochonia, Rotiferophthora, and Verticillium Additionally, within the Cordycipitaceae family, the sexual forms of the genus Cordyceps correspond to the asexual forms of Beauveria.
Engyodontium, Isaria, Lecanicillium, Mariannaeae, Microhilum, Simplicillium Ophiocordyceps, Elaphocordyceps là các thể hữu tính trong họ Ophiocordycipitaceae và các thể vô tính bao gồm: Hirsutella, Haptocillium, Harposporium, Hymenostilbe,
Paecilomyces, Paraisaria, Sorosporella, Syngliocladium, Tolypocladium và Verticillium.
Phương pháp định danh phân tử
Việc xác định các loài nấm gặp khó khăn do thiếu đặc điểm và cấu trúc riêng biệt Các chu kỳ sống phức tạp, như quá trình chuyển đổi giữa nấm men và sợi nấm, cùng với khả năng tồn tại của một số loài với các đặc điểm giải phẫu và sinh hóa khác nhau, đã ảnh hưởng đến quá trình định danh hình thái, dẫn đến kết quả không chính xác.
Các phương pháp nhận dạng nấm cổ điển, như nuôi cấy và phân tích bằng kính hiển vi, thường không chính xác và chậm, mất từ 7 đến 14 ngày, đồng thời phụ thuộc vào chuyên môn của người thực hiện Các đặc điểm hình thái, hóa học và sinh học thường mang tính chủ quan, dễ dẫn đến sai sót trong việc định danh loài Nhiều loài nấm không thể phát triển trong điều kiện phòng thí nghiệm cũng không được tiếp tục định danh Các tính trạng kiểu hình không phản ánh đúng mức độ phân loài giữa các loài, trong khi các đặc điểm di truyền có thể phân biệt rõ ràng, đặc biệt là trong các chi có hình thái tương tự.
Fusarium, Aspergillus, và Scedosporium (Balajee et al., 2005; Gilgado et al., 2005;
Trong vòng 20-30 năm qua, phương pháp định danh phân tử đã được áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu sự phát sinh loài (Hillis, 1987; Patterson, 1987; Doolittle, 1990; Hillis và Moritz, 1990) Hiện nay, bên cạnh các kỹ thuật định danh truyền thống, đa số các nghiên cứu đều sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử, góp phần tích cực vào công tác định danh loài.
Giải quyết hiệu quả những vấn đề tồn tại trong mối quan hệ giữa thể vô tính và hữu tính của các loài nấm là rất quan trọng Việc xác định chính xác loài và hệ thống phân loại của các chi nấm sẽ giúp nâng cao hiểu biết về đa dạng sinh học và ứng dụng trong các lĩnh vực như nông nghiệp và y học.
Khái niệm mã vạch DNA lần đầu tiên được đề xuất bởi Hebert và cộng sự năm
Mã vạch DNA là các chuỗi DNA ngắn, dễ dàng khuếch đại, có độ dài từ 500–800 bp, cho phép xác định nhanh chóng loài bằng cách so sánh với tập hợp trình tự tham chiếu Đặc điểm của mã vạch DNA rất quan trọng vì nó có thể thu nhận từ bất kỳ mẫu vật nào, không phụ thuộc vào hình thái hay giai đoạn vòng đời của nấm Để đảm bảo tính nhất quán trong nhận dạng, mã vạch DNA cần phải là duy nhất cho mỗi loài và không thay đổi Sự biến đổi giữa các loài cần vượt quá biến đổi trong loài, tạo ra khoảng cách mã vạch, thường được đánh giá bằng Mô hình khoảng cách 2 tham số Kimura Nhiều locus di truyền đã được nghiên cứu như mã vạch cho nấm, với gene RPB1 cho thấy khả năng phân loại cao và thành công trong việc nhận dạng ở Ascomycota.
2009; O’Donnell et al., 2013; Tanabe et al., 2005), gene Tubulin (Frisvad & Samson,
Vùng D1/D2 của tiểu đơn vị lớn (LSU) trong cụm gene rDNA đã được áp dụng hiệu quả để xác định loài và nhận dạng chủng nấm men, như đã được chứng minh trong các nghiên cứu của Fell et al (2000) và Kurtzman Gene Tef1 cũng đã được sử dụng trong việc nhận diện loài nấm, theo các tác giả James et al (2006), O’Donnell et al (2010), và Schoch et al (2009).
Khả năng ứng dụng của các locus di truyền như mã vạch tiềm năng bị hạn chế bởi sự thiếu tiêu chuẩn hóa trong quá trình khuếch đại, sự khác biệt trong việc lựa chọn mồi, khả năng phân giải phụ thuộc vào loài chi, và sự thiếu hụt cơ sở dữ liệu tham chiếu được kiểm soát chất lượng.
Ribosome là bào quan quan trọng có mặt trong mọi tế bào của vi sinh vật nhân sơ và nhân chuẩn, thực hiện chức năng sinh tổng hợp protein Cấu trúc ribosome bao gồm rRNA và protein ribosome, với hai tiểu phần: tiểu phần nhỏ (40S) chứa 18S RNA và tiểu phần lớn (60S) chứa 28S, 5,8S và 5S RNA Ribosome được hình thành từ DNA ribosome, bao gồm nhiều đơn vị lặp lại với các vùng như nrLSU (ribosomal large subunit-25-28S), 18S, ITS (internal transcribed spacer), 5.8S, 5S RNA và vùng IGS (intergenic spacer), trong đó vùng IGS bao gồm ETS (external transcribed spacer) và NTS (non-transcribed spacer).
Vùng ITS là locus phổ biến nhất trong nghiên cứu phân giới loài (Horton et al., 2001; Bridge et al., 2005) Ribosomal DNA (rDNA) của sinh vật nhân chuẩn được cấu trúc thành hai bộ đơn vị lặp lại, bao gồm các vùng đệm mã hóa 18S, 5.8S và 28S ribosomal RNA Sự biến đổi trong các vùng đệm của vùng ITS đã chứng minh khả năng phân biệt đa dạng của các taxa khó xác định Vùng ITS hiện nay là vùng được giải trình tự DNA phổ biến nhất trong giới Nấm và là vùng đặc trưng thuận lợi cho hệ thống phân loại ở cấp độ loài và các loài.
Hình 1.4: Hình biểu diễn cấu trúc vùng gene ITS
2.2.3 Gene MT-Atp6 (Mitochondrially encoded ATP synthase 6)
Gene Atp6 là gene mã hóa cho enzyme ATPase của ty thể tiểu phần số 6
ATPase là enzyme thiết yếu trong ty thể, giúp chuyển đổi ADP thành ATP thông qua kênh gradient proton, được tạo ra bởi chuỗi hô hấp, cung cấp năng lượng cho tế bào (Sun et al., 2003) Tiểu đơn vị Atp6 của phức hợp F1-F0 ATPase chủ yếu xuất hiện ở sinh vật nhân chuẩn, với F1 chứa các lõi xúc tác trên màng và F0 nằm trong màng ty thể, có các kênh proton kết nối với nhau qua một thân cây trung ương và cuống ngoại vi (Huang et al., 2009) Tiểu đơn vị này không chỉ là phần quan trọng của các kênh proton mà còn đóng vai trò then chốt trong việc di chuyển proton qua màng Do gene Atp6 có chức năng quan trọng và kích thước nhỏ trong DNA, nó được xem là một gene tiềm năng cho nghiên cứu phân loại loài.
2.2.4 Gene Tef1 (translation elongation factor 1α)
Gene Tef1 (translation elongation factor 1) mã hóa cho protein EF-1, đóng vai trò quan trọng trong việc gắn nhóm aminoacyl tRNAs vào ribosome tiểu phần 40S, cần GTP để thực hiện phản ứng này EF-1 là một chuỗi polypeptide thiết yếu trong quá trình kéo dài chuỗi polypeptide ở sinh vật nhân thật và có chức năng điều khiển sinh tổng hợp protein Gene Tef1 có các vùng intron bảo tồn cao và chỉ có một bản sao duy nhất trong hệ gene, phù hợp để nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài Năm 2011, gene Tef1 được sử dụng để định danh hai loài mới trong chi Cantharellus, cho thấy tính bảo tồn và biến động cao giữa các loài Do đó, gene Tef1 là công cụ hữu ích để xác định mối quan hệ các loài nấm, và đã được giải trình tự ở nhiều loài như nấm men và nấm Mucor racemosus.
Hình 1.5: Hình biểu diễn cấu trúc vùng gene Tef1
Cặp mồi 983F/2218R được sử dụng để khuếch đại vùng gene Tef1 với sản phẩm PCR có chiều dài từ 900 đến 1200 bp (Rehner et al., 2005) Với tính phổ quát, cặp mồi này có khả năng khuếch đại cho nhiều loài nấm, do đó đã được áp dụng trong nhiều nghiên cứu phát sinh của các loài nấm và các chi liên quan (Matheny et al., 2007).
2.2.5.1 Phả hệ phân tử trong nghiên cứu phát sinh loài
Xây dựng cây phát sinh loài là một quá trình nghiên cứu về tiến hóa và mối quan hệ giữa các loài, nhằm đưa ra những dự đoán về các mối quan hệ này Cây phát sinh loài được hình thành dựa trên các mối quan hệ tương tác giữa các loài (Potter, 2008; Rizzo & Rouchka, 2007).
Cây phát sinh loài biểu diễn mối quan hệ di truyền giữa các loài và hiện được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu tiến hóa nhờ vào công cụ tin sinh học (Zhou et al., 2004) Mối quan hệ giữa hai loài được phân loại là sự phát sinh loài, và những tiến bộ trong nghiên cứu gene, DNA, và protein đã mở rộng các phương pháp tính toán hỗ trợ xây dựng cây phát sinh loài (Potter, 2008) Một trong những phương pháp là so sánh trình tự gene của các loài khác nhau; tuy nhiên, việc liên kết nhiều chuỗi trình tự có hạn chế, dẫn đến cây phát sinh loài không chính xác khi trình tự có mức độ tương đồng thấp (Potter, 2008) ClustalW là thuật toán được sử dụng để sắp xếp trình tự, giúp xây dựng cây phát sinh loài một cách chính xác hơn.
Cây phát sinh loài được xây dựng dựa trên thuật toán bao gồm hai phần chính Đầu tiên, các trình tự có độ tương đồng cao được xác định thông qua phân tích năng lượng liên kết của các trình tự bổ sung, như năng lượng chuyển đổi giữa các nucleotide Tiếp theo, thứ tự liên kết của các chuỗi trong bộ dữ liệu được xác định để thiết lập mối quan hệ giữa các trình tự cơ bản Cây phát sinh loài, được mô tả theo hệ nhị phân, có hai loại chính: cây có gốc và cây không gốc Các cây này được biểu diễn dưới dạng nút (clade) hoặc lá (leaf), với mối quan hệ giữa các loài được gọi là cạnh hoặc chi nhánh, trong đó chiều dài của các chi nhánh thể hiện thời gian tiến hóa.
2.2.5.2 Những bước cơ bản trong nghiên cứu phát sinh chủng loài
Một phân tích phát sinh loài đơn giản bao gồm bốn bước sau:
Bước 1: Sắp gióng cột (xây dựng bộ dữ liệu cục bộ và xử lý bộ dữ liệu của phả hệ phân tử)
Bước 2: Lựa chọn mô hình tiến hóa tối thích
Bước 3: Xây dựng phát sinh loài
Bước 4: Đánh giá của cây phát sinh loài
Các phương pháp, kỹ thuật sinh học phân tử
Tách chiết DNA là một kỹ thuật thiết yếu trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử, bao gồm ba bước chính: phá vỡ màng tế bào, biến tính protein và tủa cũng như thu nhận DNA.
Cấu trúc thành tế bào nấm phức tạp hơn so với màng tế bào của động vật có vú và vi khuẩn Màng tế bào động vật có vú chỉ bao gồm một lớp lipid kép và protein xuyên màng, khiến chúng dễ bị phân hủy bởi enzyme proteinase K và các chất phá màng khác Trong khi đó, thành tế bào nấm được cấu tạo từ kitin, β-(1-3) glucan, β-(1-6) glucan, lipid và peptit, tạo ra những đặc tính vật lý đặc biệt ảnh hưởng đến quá trình tách chiết và thu nhận DNA từ các loài nấm.
Nhóm tác giả Kuo et al đã nghiên cứu và bổ sung các chất hỗ trợ cho quá trình tách chiết, trong đó β-mecaptoethanol có khả năng loại bỏ protein bằng cách cắt đứt liên kết disulfide, giúp phá vỡ cấu trúc bậc 3 và bậc 4 của protein, từ đó làm cho quá trình tủa protein trở nên dễ dàng hơn Bên cạnh đó, CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide) cũng được sử dụng để thu nhận DNA với độ tinh sạch cao, nâng cao hiệu quả tách chiết (Kuo et al., 2007; Anderson et al., 2003).
2.3.2 Kỹ thuật PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)
Vào năm 1983, Kary Mullis đã phát minh ra kỹ thuật PCR, một phương pháp sử dụng các thành phần cơ bản của hệ thống sao chép tự nhiên để nhân bản một đoạn ngắn DNA trong ống nghiệm Quá trình này bao gồm nhiều bước quan trọng để đảm bảo sự sao chép chính xác của DNA.
24 phần: DNA khuôn, dNTP, mồi, enzyme polymerase, MgCl2 và dung dịch đệm Phản ứng này được thực hiện trong máy luân nhiệt
Một phản ứng PCR bao gồm nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ trải qua ba bước chính: biến tính, bắt cặp mồi và kéo dài Trong bước biến tính, DNA được làm nóng ở nhiệt độ 94-95°C, tách thành hai mạch đơn Tiếp theo, trong bước bắt cặp mồi, nhiệt độ được điều chỉnh đến Ta, với Ta thấp hơn Tm khoảng 5°C, nơi Tm là nhiệt độ nóng chảy của mồi và phụ thuộc vào trình tự mồi Cuối cùng, ở bước kéo dài, nhiệt độ được tăng lên 72°C để enzyme polymerase hoạt động, nối dài mạch DNA mới Sau n chu kỳ, số lượng DNA mới tạo ra là 2n từ một phân tử DNA gốc ban đầu.
2.3.3 Phương pháp giải trình tự
Phương pháp giải trình tự DNA là kỹ thuật quan trọng để xác định các nucleotide cấu thành phân tử DNA Maxam và Gilbert, cùng với Sanger và cộng sự, là những người đầu tiên công bố phương pháp này vào năm 1997.
Phương pháp giải trình tự DNA dựa vào biến đổi hóa học được Maxam và Gilbert mô tả vào năm 1997 Phương pháp này sử dụng sự thủy giải đặc trưng của phân tử DNA để xác định trình tự thông qua các phản ứng hóa học Nguyên tắc chính của phương pháp này là
(1): Đánh dấu một đầu của phân tử DNA cần giải trình tự bằng một gốc phospho đồng vị phóng xạ (32P)
(2): Xử lý đoạn DNA đã đánh dấu với chất hóa học có thể làm biến đổi đặc hiệu một hoặc hai loại base của nuleotide trên DNA
(3): Nạp DNA đã xử lý vào 4 giếng trên gel polyacrylamide biến tính và tiến hành điện di
Trên phim X-quang, các vị trí dừng lại của DNA trên gel điện di tạo thành các vạch nhờ đánh dấu phóng xạ 32P, cho phép xác định trình tự nucleotide của đoạn DNA.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
Các phần mềm và trang web được sử dụng
The NCBI (National Center for Biotechnology Information) is a vital resource for collecting and searching biological data Its PubMed service provides access to a comprehensive database of published scientific research in the fields of medicine and life sciences, sourced from MEDLINE Additionally, the GenBank service allows users to find information related to nucleotide and protein sequences, taxonomy, genome mapping, protein structures, domain information, and related publications available on PubMed.
Phần mềm BLAST trực tuyến trên trang web NCBI cho phép người dùng so sánh các đoạn mồi với hàng triệu trình tự gen được lưu trữ trong cơ sở dữ liệu Genbank Công cụ này giúp xác định sự tương đồng và phân tích gen hiệu quả, hỗ trợ nghiên cứu sinh học phân tử và di truyền.
IDT analyzer (https://sg.idtdna.com/calc/analyzer) là công cụ hữu ích để xác định các thông số quan trọng của mồi, bao gồm chiều dài mồi, tỷ lệ %GC, nhiệt độ nóng chảy, và khả năng hình thành cấu trúc thứ cấp như Hairpin-dimer, Self-dimer và Hetero-dimer.
Phần mềm Annhyb phiên bản 4.946 là công cụ mạnh mẽ giúp chỉnh sửa và xử lý trình tự nucleotide Phần mềm cung cấp nhiều tính năng hữu ích, bao gồm đọc và cung cấp thông tin về trình tự, tìm kiếm và sắp xếp trình tự, cũng như kiểm tra độ đặc hiệu của mồi.
Phần mềm Chromas Lite 2.1.1 là một công cụ miễn phí hỗ trợ người dùng trong việc đọc kết quả giải trình tự DNA, bằng cách hiển thị các đường peak và thể hiện sự bắt màu của các nucleotide trong trình tự.
Phần mềm Bioedit: là phần mềm dùng để thao tác sắp xếp trình tự, so sánh và sắp giống cột đa trình tự
Phần mềm Mega X: là phần mềm dùng để tiến hàng xây dựng cây phát sinh loài theo các phương pháp Maximum Parsimony, Maximum Likelihood, Neighbor-Joining
Bộ mẫu nấm ký sinh côn trùng
Mẫu nấm ký sinh côn trùng Metacordyceps taii, được thu thập từ vườn quốc gia Bidoup – núi Bà, tỉnh Lâm Đồng, đã được TS Trương Bình Nguyên cung cấp và định danh hình thái Sau đó, mẫu nấm này được sử dụng để xây dựng cây phát sinh loài nhằm bổ sung cơ sở dữ liệu cho nghiên cứu.
Dụng cụ và thiết bị hóa chất
Trong nghiên cứu sinh học phân tử, các dụng cụ quen thuộc như kẹp lấy mẫu, đèn cồn, eppendorf, micro pipette, đầu tip, ống đong, erlen và becher đóng vai trò quan trọng Những dụng cụ này hỗ trợ hiệu quả trong quá trình thực hiện thí nghiệm và phân tích mẫu.
The Vortex ZX3 and Velp Ý are essential vortex mixers, while the Hettich Universal 320R cold centrifuge from Germany ensures efficient sample separation Key laboratory equipment includes electrophoresis units, freezers, and thermostatic baths, alongside precision balances from Satorious, also based in Germany Additionally, the Ascent Max fume hood provides a safe workspace, and the Scanning UV/VIS spectrophotometer from Smart Spec and BioRad facilitates accurate optical measurements for various applications.
1.3.3 Hóa chất cần thiết cho quá trình tách DNA
Tris-HCl pH 8 1M, EDTA 0.5M 2%, SDS 10%, NaCl 2.5M (Đã hấp), β- mercaptoethanol 99.9%, 1% CTAB, dd H2O (đã hấp), proteinase K 1mg/ml, PCI: Phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1 v/v/v), Phenol, Chloroform, TE 1X, Isoamylalcohol, Ethanol 70%, Isopropanol
1.3.4 Hóa chất cần thiết để thực hiện quá trình PCR và điện di bao gồm:
Master Mix (2X) (bio-line), Primer forward 10 μM, Primer reverse 10 μM, dd H2O (đã hấp), Agarose, TBE 1X, Gel red 6X, Thang phân tử 100bp
Quy trình nghiên cứu
Hình 2.1: Tóm tắt quy trình nghiên cứu
Xây dựng cây phả hệ phân tử đa gene
Xây dựng bộ dữ liệu phân tử hỗ trợ định danh loài
Khuếch đại các vùng gene mục tiêu bằng phương pháp Real Time
Giải trình tự và hiệu chỉnh trình tự
Khuếch đại các vùng gene
Tách chiết RNA và chuyển đổi cDNA
Phân tích hàm lượng adenosine và cordycepin trên các mẫu nấm thu nhận
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Phương pháp khai thác dữ liệu
Tiến hành tìm kiếm và thu thập dữ liệu trình tự gene từ các mẫu nấm ký sinh côn trùng trên các cơ sở dữ liệu uy tín như NCBI, PUBMED, Web of Science và Embase Những thông tin này hỗ trợ trong việc định danh phân tử một cách chính xác.
2.2 Phương pháp đánh giá mồi
2.2.1 Đánh giá các thông số vật lý của mồi
Sau khi thu thập thông tin và trình tự của cặp mồi, việc kiểm tra và đánh giá các thông số bằng phần mềm IDT Analyzer (www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer) là cần thiết để xác định các thông số quan trọng Các thông số mồi cần đạt tiêu chí như: chiều dài từ 17-28 bp, %GC trong khoảng 40-60%, không có sự lặp lại của các base G hoặc C liên tiếp dài hơn 3 base tại đầu 3’ của mồi, và Tm nằm trong khoảng 50-60 độ C.
65 o C, ∆G (kcal/mole) của hệ mồi đều lớn hơn hoặc bằng -9 kcal/mole
2.2.2 Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi
Sau khi đánh giá các thông số vật lý của mồi đạt tiêu chuẩn, quá trình tiếp theo là kiểm tra độ đặc hiệu của mồi bằng phần mềm BLAST trên NCBI và phần mềm annhyb Việc này giúp xác định khả năng bắt cặp của mồi và đánh giá kích thước sản phẩm của nó.
2.3.1 Tách chiết DNA theo phương pháp Phenol/Chloroform bổ sung β- mercaptoethanol và CTAB:
Bước 1: Ly giải tế bào với lysis buffer có sử dụng β-mercaptoethanol và CTAB
Dùng que cấy vòng (vô trùng) tiến hành lấy một phần hệ sợi nấm (khoảng 1.5 g) hũa tan trong ống eppendorf chứa sẵn 700 àl dung dịch lysis buffer (70 àl Tris-
HCl pH 1M, 392 àl NaCl 2,5 M, 140 àl CTAB 10%, 14 àl β- mercaptoethanol 99.9%,
14 àl dd H2O, 70 àl Proteinase K 1 mg/ml), đảo ống đều. Ủ qua đêm ở nhiệt độ 65 o C.
Bước 2: Loại bỏ Protein và các thành phần phụ khác
Tiến hành ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ cặn và thu dịch nổi Sau đó, bổ sung 700 µl dung dịch PCI (phenol/chloroform/isoamyl alcohol với tỷ lệ 25:24:1), lắc đều ống và tiếp tục ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 10 phút.
Thu dịch nổi, bổ sung 1V chloroform, lắc đều Ly tâm 13000 vòng/ phút trong
Thu dịch nổi, tiến hành bổ sung 1/10V dung dịch NaOAC 3 M, lắc đều Bổ sung 1V isopropanol, lắc đều và ủ ở nhiệt độ 4 o C trong vòng 2 giờ
Ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút Loại bỏ dịch nổi, thu tủa
Bổ sung 1ml ethanol 70 độ, ly tâm 13000 vòng/ phút trong 10 phút ở 4 o C, loại dịch nổi
Loại bỏ ethanol và làm khô cặn tại 50 o C
Bảo quản mẫu ở nhiệt độ -20 o C
2.3.2 Kiểm tra độ tinh sạch của sản phẩm DNA đã tách chiết
Hàm lượng DNA có thể xác định thông qua sự hấp thụ ánh sáng mạnh ở bước sóng 260 nm, với giá trị mật độ quang OD260 cho phép xác định nồng độ DNA trong dung dịch (A260 = 1 tương ứng với 50 µg/ml DNA sợi đơn) Đồng thời, protein hấp thụ ánh sáng mạnh ở bước sóng 280 nm, do đó cần đo OD ở cả hai bước sóng 260 và 280 nm để xác định độ tinh khiết, nồng độ và các thông số liên quan Tỷ số A260/A280 được sử dụng để đánh giá độ tinh khiết của DNA, với tỷ số trong khoảng 1,8 đến 2,0 cho thấy DNA đạt tiêu chuẩn tinh khiết Nếu tỷ số nhỏ hơn 1,8, DNA có thể bị nhiễm protein, trong khi tỷ số lớn hơn 2,0 cho thấy sự nhiễm RNA Chỉ số A230 cũng được đo cùng với chỉ số A260.
34 và A280 Chỉ số A230 cho thấy khả năng nhiễm tạp chất của mẫu DNA (bị nhiễm carbonhydrate hoặc phenol)
Quy trình thực hiện tách chiết DNA bao gồm việc pha loãng DNA với tỷ lệ 50 lần bằng dung dịch TE 1X Sau đó, toàn bộ dung dịch được chuyển vào cuvette để đo nồng độ DNA ở các bước sóng 260 nm, 280 nm và 230 nm Độ tinh sạch của DNA được xác định thông qua tỷ số giữa các giá trị đo được.
2.3.3 Trình tự mồi sử dụng khuếch đại phản ứng PCR
Sử dụng các cặp mồi phổ quát như nrSSU, nrLSU, ITS, Tub, tef và Atp6 để khuếch đại gene mục tiêu từ các mẫu nấm ký sinh côn trùng Danh sách đầy đủ các mồi được sử dụng trong thực nghiệm sẽ được trình bày dưới đây.
Bảng 2.1 Bảng các mồi sử dụng trong thực nghiệm
Gene Mồi Ký hiệu Trình tự (5’ – 3’) L %G
Thành phần cho một phản ứng PCR :
Hình 2.2: Chu trình nhiệt độ chung PCR Chu kì PCR (35X):
Điện di là quá trình được thực hiện trên gel Agarose 1.5% với dung dịch đệm TBE, sử dụng điện thế 100V trong 30 phút Kết quả sẽ được quan sát bằng máy chụp ảnh gel của BioRad Lưu ý rằng X là nhiệt độ bắt cặp tối ưu của mồi.
Sau khi có kết quả giải trình tự, tiến hành hiệu chỉnh bằng phần mềm Chromas lite 2.1.1 Kiểm tra các peak ở hai đầu của trình tự mồi xuôi và mồi ngược; nếu peak không rõ ràng, cần thực hiện hiệu chỉnh Đối với mạch F, xuất file fasta bình thường, trong khi mạch R cần thực hiện reverse & complement trước khi xuất file fasta Cuối cùng, sử dụng phần mềm Sea View phiên bản 4.2.12 để sắp gióng cột và kiểm tra độ tương đồng, hiệu chỉnh trình tự.
Nếu phát hiện lỗi (mismatch) hoặc khoảng trống (gap) trong trình tự DNA, hãy sử dụng phần mềm Chromas Lite 2.1.1 để mở lại và kiểm tra lại trình tự Việc so sánh và phân tích kỹ lưỡng sẽ giúp rút ra kết luận cuối cùng với độ chính xác cao nhất, từ đó xuất ra trình tự DNA chính xác nhất.
2.3.5 So sánh với cơ sở dữ liệu Genbank
Sau khi hiệu chỉnh và xuất ra trình tự chính xác nhất của đoạn DNA, bước tiếp theo là sử dụng chương trình BLAST để đánh giá Nếu kết quả tìm kiếm cho thấy có những trình tự tương đồng phù hợp, điều này có nghĩa là có thể xác định được một số trình tự hoàn chỉnh liên quan.
Khi trình tự nghiên cứu có chiều dài tương đồng và không có sự sai khác giữa các nucleotide, trình tự đó sẽ được chấp nhận là đã hiệu chỉnh xong Nếu có sự khác biệt so với các trình tự trên Genbank của NCBI, cần xem xét lại các nucleotide khác nhau này Sử dụng peak trên Chromas lite 2.1.1 để xác định liệu có thể có lỗi kỹ thuật trong quá trình hiệu chỉnh Nếu peak không rõ ràng, cần thu thập các trình tự có độ tương đồng trên 50% từ NCBI, sắp xếp chúng và kiểm tra tần số xuất hiện của các nucleotide để xác định nucleotide cần thay thế Qua quá trình này, sẽ thu được trình tự chính xác nhất với độ tin cậy cao nhất.
2.3.6 Xây dựng bộ cơ sở dữ liệu DNA
Ngoài việc thu nhận trực tiếp trình tự của các mẫu nấm, các loài nấm thuộc chi Cordyceps chủ yếu được tham khảo từ nghiên cứu của Sung và các cộng sự vào năm [năm].
Vào năm 2007, bộ dữ liệu đã được đưa vào Genbank và sau đó được sử dụng trong phân tích phát sinh loài Chương trình MEGA 6.0 đã được áp dụng để xây dựng cây phát sinh loài cho các chi nấm Cordyceps.
2.3.7 Đồng bộ hóa bộ dữ liệu
Sau khi tổng hợp, bộ dữ liệu sẽ được đồng bộ hóa sau khi xây dựng cây cục bộ (cây phát sinh loài thô) Quá trình này bao gồm việc sắp xếp cột, loại bỏ các trình tự khác biệt với gene có độ tương đồng cao, nhằm tạo sự đồng nhất về chiều dài của các trình tự Điều này không chỉ tăng cường mức độ tin cậy mà còn nâng cao giá trị bootstrap cho cây phát sinh loài.
2.3.8 Dò tìm mô hình tiến hóa
Xác định mô hình tiến hóa phù hợp nhất để dựng cây Maximum likelihood bằng chức năng Find Best DNA/Protein Models (ML) trong JmodelTest ver 2.1.10
Mô hình có điểm số AIC score thấp nhất là mô hình tốt nhất để dựng cây ML Các
37 cây NeighbourJoining và cây Maximum Parsimony sử dụng mô hình tiến hóa theo mặc định của chương trình MEGA 6.0
2.3.9 Xây dựng cây phát sinh loài
KẾT QUẢ KHẢO SÁT INSILICO
1.1 Kết quả khảo sát insilico các gene định danh phân tử
Bảng 3.1: Bảng thông số vật lí của các cặp mồi định danh phân tử
Gene Mồi Ký hiệu Trình tự (5’ – 3’) L %GC
Chú thích: Hairpin dimer là cấu trúc kẹp tóc, Self dimer tự bắt cặp của mồi, Hetero dimer là mồi xuôi và mồi ngược bắt cặp với nhau.
Dựa trên phân tích IDT, các thông số quan trọng của cặp mồi tham khảo bao gồm chiều dài mồi, %GC, nhiệt độ nóng chảy, khả năng hình thành cấu trúc kẹp tóc, và primer dimer Chiều dài mồi thường dao động từ 17-28 bp, trong khi thành phần %GC nên nằm trong khoảng 40-60% Các vùng có %GC cao hơn có thể gặp khó khăn trong quá trình biến tính trong PCR, dẫn đến hiệu quả phản ứng không cao.
Khi thiết kế mồi cho PCR, cần tránh lặp lại các base G hay C liên tiếp dài hơn 3 base Ở đầu 3’ của mồi, nên có base G hay C để tăng độ đặc hiệu cho bắt cặp Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi là thông số quan trọng để xác định nhiệt độ bắt cặp trong chu trình PCR, và nhiệt độ chênh lệch giữa mồi xuôi và mồi ngược không nên vượt quá 5 oC (lý tưởng là 2-3 oC) Giữ Tm trong khoảng 55 – 80 oC, với mồi có nhiệt độ bắt cặp từ 55 - 60 oC để tránh sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu Cấu trúc thứ cấp như kẹp tóc, homo dimer và hetero dimer cần được kiểm soát, vì cấu trúc bền vững sẽ làm giảm hiệu quả của phản ứng PCR Sử dụng năng lượng tự do (ΔG) để đánh giá độ bền vững của các liên kết, với trị tuyệt đối của ΔG nhỏ hơn 9 kcal/mole cho thấy liên kết kém bền vững Do đó, cần điều chỉnh vị trí mồi để tránh cấu trúc thứ cấp, đặc biệt tại đầu 3’ Mồi nên có các đặc tính như tránh cấu trúc thứ cấp, không có lặp lại hơn 4 base liên tiếp và có hàm lượng GC khoảng 50-60%.
1.1.1 Kết quả kiểm tra mồi bằng BLAST và Annhyb của các cặp mồi
1.1.1.1 Kết quả kiểm tra cặp mồi ITS1/ITS4
Hình 3.1: Kết quả Annhyb cặp mồi ITS1/ITS4 trên trình tự gene ITS
Kết quả từ Annhyb cho thấy kích thước và vị trí bắt cặp của cặp mồi ITS1/ITS4 trên trình tự loài đại diện Metacordyceps taii, với mã số truy cập là [điền mã số truy cập tại đây].
Mồi xuôi ITS1 có điểm số bắt cặp là 80, trong khi mồi ngược ITS4 đạt điểm số 100 Cụ thể, mồi xuôi ITS1 bổ sung tại vị trí 2532-2550, còn mồi ngược ITS4 tại vị trí 3069.
3088, sản phẩm khuếch đại 557 bp
Sau đó, cặp mồi ITS1/ITS4 được kiểm tra độ đặc hiệu thông qua các công cụ như BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) trên NCBI
Hình 3.2: Kết quả BLAST cặp mồi ITS1/ITS4 khuếch đại gene ITS
Kết quả phân tích BLAST cho thấy cặp mồi PCR ITS1/ITS4 có khả năng bám trên cùng một trình tự trong CSDL GenBank, với mồi xuôi và mồi ngược được kết nối bởi một đường kẻ màu đen Qua khảo sát, cặp mồi này đã khuếch đại gene ITS của loài Metacordyceps taii (mã số KC244316.1) với độ tương đồng tuyệt đối 100% và giá trị mong đợi (E value) thấp, chứng tỏ cặp mồi ITS1/ITS4 có độ tương đồng cao với loài này.
1.1.1.2 Kết quả kiểm tra cặp mồi 982F/2218R
Hình 3.3: Kết quả Annhyb cặp mồi 982F/2218R trên trình tự gene Tef
Kết quả Annhyb cho thấy cặp mồi 982F/2218R đã bắt cặp với trình tự của loài Cordyceps militaris (mã số XM_006665968) Cụ thể, mồi xuôi 982F có điểm số bắt cặp là 50, trong khi mồi ngược 2218R đạt 58 Ngoài ra, mồi xuôi 928F cũng đã bắt cặp bổ sung tại vị trí 283-305, và mồi ngược 2218R tại vị trí 1300.
1322, sản phẩm khuếch đại 1040 bp
Hình 3.4: Kết quả BLAST cặp mồi 982F/2218R khuếch đại gene tef
Kết quả phân tích BLAST cho thấy cặp mồi PCR 982F/2218R có khả năng khuếch đại gene Tef của loài Metacordyceps taii với mã số truy cập KC244318.1, đạt độ tương đồng tuyệt đối 89,96% và giá trị E value là 0,014, cho thấy sự tương đồng cao và có ý nghĩa giữa cặp mồi và loài này Mồi xuôi và mồi ngược được xác định trên cùng một trình tự trong CSDL GenBank, cho phép chúng bám vào hai mạch khác nhau để tạo ra sản phẩm PCR.
1.1.1.3 Kết quả kiểm tra cặp mồi Atp6-C1A/Atp6-C2A
Kết quả Annhyb của cặp mồi Atp6-C1A/Atp6-C2A trên trình tự gene Atp6 cho thấy kích thước và vị trí bắt cặp của chúng với loài đại diện Cordyceps militaris (mã số truy cập KP722502) Mồi xuôi Atp6-C1A đạt điểm số bắt cặp 62, trong khi mồi ngược Atp6-C2A có điểm số 63 Cụ thể, mồi xuôi Atp6-C1A bắt cặp tại vị trí 24255-24274, còn mồi ngược Atp6-C2A tại vị trí 24922-24947, tạo ra sản phẩm khuếch đại có kích thước 693 bp.
Hình 3.6: Kết quả BLAST cặp mồi Atp6-C1A/Atp6-C2A khuếch đại gene Atp6
Kết quả Blast cặp mồi Atp6-C1A/Atp6-C2A khảo sát cho thấy khuếch đại được vùng gene Atp6 của các loài Metacordyceps với với mã số truy cập là
Cặp mồi Atp6-C1A/Atp6-C2A cho thấy độ tương đồng tuyệt đối (Max ident) đạt 84,62% và giá trị mong đợi (E value) thấp, điều này chứng tỏ mối liên hệ chặt chẽ với các loài Metacordyceps.
1.2 Kết quả khảo sát các gene liên quan đến con đường chuyển hóa adenosine và cordycepin trên loài
Bảng 3.2: Bảng thông số vật lý của các cặp mồi được sử dụng để khuếch đại các gene chuyển hóa trên loài Metacorydyceps tai
Gene Ký hiệu Trình tự mồi 5’ – 3’
Dựa vào phân tích IDT, các thông số quan trọng của cặp mồi tham khảo được đánh giá bao gồm chiều dài mồi, %GC, nhiệt độ nóng chảy, khả năng hình thành cấu trúc kẹp tóc và primer dimer Chiều dài mồi thường dao động từ 17-28 bp, trong khi thành phần %GC nên ở mức khoảng 40-60% Những vùng có %GC cao hơn có thể không biến tính tốt trong quá trình PCR, dẫn đến hiệu quả phản ứng kém.
Để thiết kế mồi PCR hiệu quả, cần tránh lặp lại các base G hay C liên tiếp dài hơn 3 base và đảm bảo có ít nhất một base G hoặc C ở đầu 3’ của mồi để tăng độ đặc hiệu Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi là thông số quan trọng, với nhiệt độ bắt cặp lý tưởng trong khoảng 55 - 60 o C để tránh sản phẩm không đặc hiệu Nhiệt độ chênh lệch giữa mồi xuôi và mồi ngược không nên vượt quá 5 o C, tốt nhất là 2-3 o C Cấu trúc thứ cấp như hairpin loop, homo dimer và hetero dimer cần được kiểm soát, vì cấu trúc bền vững sẽ làm giảm hiệu quả của phản ứng PCR Sử dụng năng lượng tự do (ΔG) để đánh giá độ bền vững của các liên kết; theo IDT, ΔG nhỏ hơn 9 kcal/mole cho thấy liên kết kém bền Cuối cùng, mồi nên tránh cấu trúc thứ cấp, có độ dài không lặp lại quá 4 base liên tiếp và hàm lượng GC khoảng 50-60%.
1.2.1 Kết quả kiểm tra cặp mồi SS-F-R trên Annhyb và BLAST
Thu nhận trình tự adenylosuccinate synthetase từ NCBI với mã số Accession number: AZNH01000010.1 Tiến hành kiểm tra độ đặc hiệu mồi bằng Annhyb
Hình 3.7: Kết quả Annhyb của cặp mồi SS-F-R
Chú thích: Màu đỏ là vị trí bắt cặp của mồi SS - F, Màu xanh là vị trí bắt cặp của mồi SS - R
Kết quả sắp xếp trình tự mồi và trình tự tham chiếu adenylosuccinate synthetase trên NCBI (số truy cập: AZNH01000010.1) cho thấy mồi SS-F bắt cặp 100% với trình tự từ 383 bp đến 402 bp, trong khi mồi SS-R bắt cặp 100% với trình tự từ 463 bp đến 482 bp Sản phẩm khuếch đại thu được có chiều dài 100 bp.
Hình 3.8: Kết quả BLAST trình tự cặp mồi SS-F-R
According to BLAST results, the primer pair SS-F-R successfully amplified the adenylosuccinate synthetase sequence in Metacordyceps (Metarhizium) species This indicates that the SS-F-R primer pair is specific for amplifying the adenylosuccinate synthetase gene region in Metacordyceps, with notable scores: E value of 53, Score of 37.4, Query cover of 34%, and a Max identity of 100%.
1.2.2 Kết quả kiểm tra cặp mồi 5’-F-R trên Annhyb và BLAST
Thu nhận trình tự 5’-Nucleotidase từ NCBI với mã số Accession number:
AZNH01000017.1 Tiến hành kiểm tra độ đặc hiệu mồi Annhyb
Hình 3.9: Kết quả Annhyb của cặp mồi 5’-F-R
Chú thích: Màu đỏ là vị trí bắt cặp của mồi 5’-F, màu xanh là vị trí bắt cặp của mồi
Kết quả sắp xếp trình tự mồi 5’-F-R và trình tự tham chiếu 5’-nucleotidase trên NCBI (accession number: AZNH01000017.1) cho thấy mồi 5’-F bắt cặp 100% với trình tự từ 805 bp đến 824 bp, trong khi mồi 5’-R bắt cặp 100% với trình tự từ 942 bp đến 961 bp Sản phẩm khuếch đại thu được có chiều dài 157 bp.
Hình 3.10: Kết quả BLAST trình tự cặp mồi 5’-F-R
According to BLAST results, the primer pair 5’-F-R successfully amplifies the 5' nucleotidase sequence of Metacordyceps species This indicates that the 5’-F-R primer pair is specific for amplifying the 5’-nucleotidase region in Metacordyceps, with the following scores: E value = 55, Score = 37.4, Query cover = 33%, and Max ident = 100%.
1.2.3 Kết quả kiểm tra cặp mồi SA-F-R trên annhyb và blast
Hình: 3.11: Kết quả annhyb của cặp mồi SA-F-R
KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM
2.1 Kết quả bổ sung dữ liệu phân tử về gene ITS, Tef, Atp6 của
2.1.1 Kết quả tách chiết DNA
Mẫu nấm Metacordyceps taii được thu nhận từ vườn quốc gia Bidoup nhờ sự cung cấp của TS Trương Bình Nguyên Phân tích định danh hình thái được thực hiện thông qua việc tách chiết DNA bằng phương pháp Phenol/Chloroform, kết hợp với β-mercaptoethanol và CTAB Mức độ tinh sạch của DNA sau khi tách chiết được kiểm tra bằng phương pháp hấp phụ quang phổ ở các bước sóng 260 và 280 nm.
Kết quả đo OD cho thấy tỉ số A260/A280 nằm trong khoảng 1,8 – 2, xác nhận DNA đã được tinh sạch Nồng độ DNA đạt yêu cầu, đủ điều kiện để thực hiện phản ứng PCR khuếch đại các vùng gene mong muốn.
DNA sau khi tách chiết được sử dụng để thực hiện phản ứng PCR với các cặp mồi nhằm khuếch đại các vùng gene ITS, Tef, Atp6 Mục tiêu là thu nhận trình tự các vùng gene này để hỗ trợ định danh phân tử cho mẫu nấm Metacordyceps taii từ vườn quốc gia Bidoup, qua đó bổ sung bộ cơ sở dữ liệu phân tử cho loài nấm này Sản phẩm PCR được định tính bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1,5% Kết quả được minh họa bằng hình dưới đây.
Hình 3.13: Kết quả điện di sản phẩm PCR gene ITS, Tef, Atp6
Kết quả điện di ba mẫu cho thấy phương pháp tách chiết bằng phenol/chloroform kết hợp với β-mercaptoethanol mang lại hiệu quả cao Các băng xuất hiện đúng kích thước mong đợi, không có băng chứng âm, xác nhận sản phẩm PCR không bị tạp nhiễm Thang và băng khá thẳng cho thấy điện trường ổn định Dựa trên kết quả này, các mẫu đã được PCR và gửi đi giải trình tự tại công ty Nam Khoa để xây dựng cây phát sinh loài, hỗ trợ cho việc định danh phân tử.
2.1.2 Kết quả giải trình tự
Sản phẩm PCR, sau khi được khuếch đại và kiểm tra bằng phương pháp điện di, sẽ được gửi đi để giải trình tự tại công ty Nam Khoa Kết quả giải trình tự được thể hiện rõ trong hình 3.14.
Kết quả giải trình tự vùng gene ITS cho thấy sự xuất hiện rõ nét của các sóng đơn, đại diện cho từng nucleotidase Tiếp theo, công cụ BLAST được sử dụng để thực hiện kiểm tra sơ bộ các trình tự đã thu nhận.
Hình 3.15: Kết quả BLAST vùng trình tự gene ITS
Hình 3.16: Kết quả BLAST vùng trình tự gene Tef
Kết quả BLAST cho các trình tự gene Atp6 cho thấy điểm số tương đồng rất cao với loài Metacordyceps taii, đạt trên 90% với E-value = 0,0 Điều này chứng minh rằng các trình tự thu được từ sản phẩm PCR là trình tự gene ITS và Tef.
Atp6 trên loài Metacordyceps taii
2.1.3 Xây dựng bộ cơ sở dữ liệu phân tử
Bộ cơ sở dữ liệu được phát triển dựa trên nghiên cứu của nhóm tác giả Sung và cộng sự năm 2007, cùng với các trình tự gen của các loài nấm ký sinh côn trùng từ ngân hàng gene Điều này tạo ra một nền tảng tham chiếu hữu ích để hỗ trợ việc định danh các mẫu.
58 nấm thực nghiệm Metacordyceps taii Bộ cơ sở dữ liệu bao gồm 65 trình tự gene ITS,
Bài viết trình bày 83 trình tự gene Tef và 59 trình tự gene Atp6, tạo thành bộ cơ sở dữ liệu phân tử đa gene với 33 trình tự thông qua việc kết hợp các trình tự của 3 gene ITS, Tef và Atp6 Các trình tự thu thập được để xây dựng bộ cơ sở dữ liệu được trình bày trong bảng 3.3.
Bảng 3.3: Thông tin các trình tự được thu nhận để xây dựng bộ cơ sở dữ liệu
Name Strain ITS Tef Atp6
1 Aphysiotroma stercorarium ATCC 62321 - AF543782 AY489566
2 Aschersonia badia BCC 8105 - DQ522317 DQ522317
3 Aschersonia placenta BCC 7869 JN049842 EF469056 EF468998
5 Balansia henningsiana GAM 16112 JN049815 AY489610 AY489576
6 Balansia pilulaeformis A.E.G 94-2 JN049816 DQ522319 EF468999
7 Beauveria caledonica ARSEF 2567 HQ880817 AF339520 EF469000
11 Claviceps paspali ATCC 13892 JN049818 DQ522321 -
12 Claviceps purpurea GAM 12885 KJ529004 AF543778 -
13 Claviceps purpurea S.A cp11 KX977396 EF469058 -
16 Cordyceps bifusispora EFCC 5690 AY245627 EF468746 -
19 Cordyceps cardinalis OSC 93610 JN049843 EF469059 EF469007
20 Cordyceps cardinalis OSC 93609 KF937320 DQ522325 EF469006
24 Cordyceps militaris OSC 93623 JN049825 DQ522332 EF469012
25 Cordyceps nigrella EFCC 9247 JN049853 EF468758 -
26 Cordyceps ninchukispora BCC1422 FJ765278 FJ765262 -
29 Cordyceps pruinosa ARSEF 5413 JN049826 DQ522351 EF469033
32 Cordyceps scarabaeicola ARSEF 5689 JN049827 DQ522335 DQ522496
36 Cordyceps tuberculata OSC 111002 JN049830 DQ522338 EF469017
39 Cosmospora coccinea CBS 114050 JN049831 AY489629 AY489596
41 Epichloở typhina ATCC 56429 JN049832 AF543777 AY489584
42 Glomerella cingulata CBS 114054 KF819613 AF543773 AY489590
43 Glomerella cingulata F.A.U 513 DQ286202 AF543772 EF469020
86 Haptocillium sinense CBS 567.95 AJ292417 DQ522343 EF469022
87 Haptocillium zeosporum CBS 335.80 AJ292419 EF469062 EF469023
44 Hypocrea lutea ATCC 208838 - AF543781 AY489592
45 Hypocrella schizostachyi BCC 14123 - AY986948 EF469025
46 Isaria farinosa OSC 111005 KM035983 DQ522348 EF469028
47 Isaria farinosa OSC 111006 JQ291610 EF469065 EF469027
48 Isaria tenuipes OSC 111007 - DQ522349 EF469029
49 Lecanicillium antillanum CBS 35085 MH861888 DQ522350 EF469030
50 Lecanicillium psalliotae CBS 532.81 JN049846 EF469067 EF469032
51 Lecanicillium tenuipes CBS 309.85 JN036556 DQ522341 EF469019
52 Metacordyceps chlamydosporia CBS 101244 JN049821 DQ522327 EF469008
22 Metacordyceps neogunnii OSC 76404 JN049822 AY489616 AY489582
53 Metacordyceps taii ARSEF 5714 JN049829 AF543775 EF469016
54 Metarhizium album ARSEF 2082 AY375446 DQ522352 EF469034
55 Metarhizium anisopliae ARSEF 3145 JN049834 AF543774 EF469035
56 Metarhizium flavoviride ARSEF 2037 AF138271 DQ522353 EF469036
57 Ophiocordyceps acicularis OSC 128580 JN049820 DQ522326 EF469003
14 Ophiocordyceps agriotidis ARSEF 5692 AY245626 DQ522322 EF469004
15 Ophiocordyceps aphodii ARSEF 5498 - DQ522323 EF469005
58 Ophiocordyceps brunneipunctata OSC 128576 GU723777 DQ522324 -
18 Ophiocordyceps capitata OSC 71233 EF530933 AY489615 AY489581
59 Ophiocordyceps coccidiicola NBRC 100682 AB968404 AB968583 AB031197
61 Ophiocordyceps entomorrhiza KEW 53484 JN049850 EF468749 -
21 Ophiocordyceps fracta OSC 110990 - DQ522328 EF469009
63 Ophiocordyceps gracilis EFCC 8572 JN049851 EF468751 -
64 Ophiocordyceps heteropoda EFCC 10125 JN049852 EF468752 -
65 Ophiocordyceps irangiensis OSC 128577 AY646400 DQ522329 -
66 Ophiocordyceps irangiensis OSC 128578 JN049833 DQ522345 -
23 Ophiocordyceps melolonthae OSC 110993 - DQ522331 EF469011
27 Ophiocordyceps nutans OSC 110994 AF224274 DQ522333 -
28 Ophiocordyceps ophioglossoides OSC 106405 AF208524 AY489618 AY489583
33 Ophiocordyceps sinensis EFCC 7287 JN049854 EF468767 -
34 Ophiocordyceps sphecocephala OSC 110998 AY491994 DQ522336 EF469014
67 Ophiocordyceps stylophora OSC 111000 JN049828 DQ522337 -
35 Ophiocordyceps subsessilis OSC 71235 JN049844 EF469061 EF469015
38 Ophiocordyceps variabilis ARSEF 5365 - DQ522340 EF469018
68 Ophionectria trichospora OSC109876 - AF543779 EF469039
69 Paecilomyces carneus CBS 399.59 EF411237 EF468788 -
70 Paecilomyces lilacinus CBS 28436 AY624189 EF468792 -
71 Pochonia gonioides CBS 891.72 MH860626 DQ522354 EF469041
72 Pseudonectria rousseliana CBS 114049 JF937565 AF543780 AY489598
73 Shimizuomyces paradoxus EFCC 6279 JN049847 EF469071 EF469046
74 Shimizuomyces paradoxus EFCC 6564 - EF469072 EF469045
75 Simplicillium lamellicola CBS 116.25 MH854806 DQ522356 EF469047
76 Simplicillium lanosoniveum CBS 101267 EF641862 DQ522357 EF469048
77 Simplicillium lanosoniveum CBS 704.86 AJ292396 DQ522358 EF469049
78 Tolypocladium parasiticum ARSEF 3436 FJ973068 EF468799 FJ973044
79 Torrubiella ratticaudata ARSEF 1915 JN049837 DQ522360 EF469052
80 Torrubiella wallacei CBS 101237 EF641891 EF469073 EF569587
81 Verticillium chlamydosporium CBS 504.66 AJ292398 EF469069 EF469040
82 Verticillium dahliae ATCC 16535 KT225533 AY489632 AY489600
83 Verticillium epiphytum CBS 384.81 MH861358 DQ522361 EF469053
84 Verticillium epiphytum CBS 154.61 MH858003 EF468802 -
85 Verticillium incurvum CBS 460.88 - DQ522362 EF469054
2.1.4 Xây dựng cây phả hệ phân tử
Cây phả hệ phân tử đa gene được xây dựng dựa trên gene ITS, Tef và Atp6 thông qua phần mềm Mega X, bằng cách sắp xếp các trinh tự của các loài nấm ký sinh côn trùng với bộ cơ sở dữ liệu Nghiên cứu này sử dụng ba phương pháp chính là Neighbor Joining (NJ), Maximum Parsimony (MP) và Maximum Likelihood (ML) để xây dựng cây phả hệ Kết quả được đánh giá dựa trên các chỉ số bootstrap của ba cây NJ, MP và ML, với giá trị bootstrap được lặp lại 1000 lần.
Sau khi đồng bộ cơ sở dữ liệu, quá trình tìm kiếm mô hình tiến hóa tối ưu cho cây Maximum Likelihood (ML) được thực hiện nhằm tạo ra cây phả hệ phân tử ML chất lượng cao nhất.
Cây phả hệ phân tử Maximum Likelihood đa gene ITS-Tef-Atp6 cho thấy sự phân nhóm rõ ràng giữa ba nhóm Clavicipitaceae A, B và C, với các giá trị Bootstrap từ 1000 lần lặp lại tương ứng với các cây NJ/MP/ML.
Clavicipitaceae nhóm A: bao gồm các loài Metacordyceps taii, Shimizuomyces paradoxus, Verticillium epiphytum thuộc các chi Metacordyceps, Hypocrella phù hợp với nghiên cứu của Sung và cộng sự (2007)
Clavicipitaceae nhóm B: bao gồm các loài Ophiocordyceps coccidiicola, Ophiocordyceps agriota thuộc chi Ophiocordyceps phù hợp với nghiên cứu của Sung và cộng sự (2007)
Nhóm Clavicipitaceae C bao gồm các loài Cordyceps militaris và Cordyceps pruinosa thuộc chi Cordyceps, phù hợp với nghiên cứu của Sung và cộng sự (2007) Phân tích trên ba phương pháp NJ/MP/ML cho thấy sự tương đồng về phân chi và phân Clade, mang lại kết quả đáng tin cậy Giá trị bootstrap cho nhóm ngoại phân đạt 100 trên cả ba cây NJ/ML/MP, chứng tỏ độ tin cậy cao của cây phân loại này.
Kết quả phân tích địa hình học của cây phả hệ phân tử cho thấy mẫu thực nghiệm trong nghiên cứu có mối quan hệ gần gũi với Metacordyceps taii và Metarhizium anisopliae, với giá trị bootstrap trên ba cây NJ/ML/MP lần lượt là.
100/100/100 chứng tỏ có độ tin cậy cao
2.2 Kết quả nghiên cứu một số gene liên quan đến con đường chuyển hóa adenosine và cordycepin
2.2.1 Kết quả phân tích hàm lượng adenosine và cordycepin
Hàm lượng adenosine và cordycepin trong mẫu nấm được định lượng thông qua việc gửi mẫu đến Viện Y Tế Công Cộng Thành Phố Hồ Chí Minh Phân tích được thực hiện dựa trên phương pháp LC-MS/MS, cho kết quả chính xác về hàm lượng adenosine và cordycepin có trong mẫu nấm thực nghiệm.
Metacordyceps taii có hàm lượng adenosine và cordycepin trong mẫu thực nghiệm với hàm lượng adenosine là 755 mg/kg và cordycepin là 53,1 mg/kg
2.2.2 Kết quả khuếch đại các gene bằng phương pháp Real Time PCR
