(LUẬN án TIẾN sĩ) nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của ba loài thuộc chi gynostemma blume ở việt nam

TỔNG QUAN

Vị trí phân loại, phân bố và đặc điểm thực vật của chi Gynostemma Blume 3 1 Vị trí phân loại của chi Gynostemma Blume

1.1.1 V ị trí phân lo ạ i c ủ a chi Gynostemma Blume

Gynostemma Blume là một chi dây leo nhiều năm thuộc họ Bí Cucurbitaceae, phân bố từ dải nhiệt đới châu Á đến đông Á, bao gồm các khu vực từ Himalaya đến Nhật Bản, Malaysia và New Guinea Chi này được Carl Ludwig Blume đặt tên vào năm 1825, khi ông công bố hai loài Gynostemma pedata (sau đổi tên thành G pedatum) và Gynostemma simplicifolia (sau này đổi tên thành G simplicifolium) Đến nay, các nhà phân loại thực vật đã phát hiện và bổ sung thêm, nâng tổng số loài trong chi Gynostemma lên khoảng 19.

Theo hệ thống phân loại thực vật của A Takhtajan năm 2009, chi Gynostemma Blume thuộc tông Zanonieae, phân họ Nhandiroboideae, họ Bí (Cucurbitaceae), bộ Bí (Cucurbitales), liên bộ Hoa tím (Violanae), phân lớp Sổ (Dilleniidae), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), và ngành Ngọc lan (Magnoliophyta).

Chi Gynostemma Blume được phân chia thành hai phân chi dựa trên đặc điểm của quả: (i) Subgenus Trirostellum với quả nang tự mở bằng 3 van, và (ii) Subgenus Gynostemma có quả mọng không tự mở Phân chi Trirostellum tiếp tục được chia thành hai loạt.

Section Pentagyne và Section Trirostellae Các nhà thực vật Việt Nam như

Phạm Hoàng Hộ và Võ Văn Chi đã đồng thuận về hệ thống phân loại chi Gynostemma Blume Các loài trong chi này có đặc điểm chung là có tua cuốn thường phân nhánh và chủ yếu là đơn tính khác gốc Lá của chúng thường là dạng kép chân chim với từ 3-9 lá chét, hình trứng hoặc răng cưa, mọc so le, trong khi hoa mọc thành chùm hoặc chùy, và quả có dạng nang hoặc quả mọng chứa 2-3 hạt.

Theo các công bố mới nhất tham khảo trên trang web www.theplanist.org

[145], chi Gynostemma Blume hiện có 19 loài chính thức (bảng 1.1) Các loài

Gynostemma phân bố chủ yếu ở từ dải nhiệt đới châu Á đến Đông Á, từ dải Hymalaya (kéo dài từ Pakistan qua bắc Ấn độ, Bhutan, Nepal và nam Trung

Trung Quốc là quốc gia sở hữu nhiều loài thuộc chi Gynostemma nhất, với 14 trên tổng số 19 loài, trong đó có 9 loài đặc hữu Các loài này chủ yếu phân bố ở phía tây nam Trung Quốc, đặc biệt là phía nam tỉnh Thiểm Tây và lưu vực sông Trường Giang Một trong những loài nổi bật là Gynostemma pentaphyllum.

(Thunb.) Makino phổ biến nhất và xuất hiện cả ở Trung Quốc, BanG laxumdesh, Bhutan, Ấn Độ, Indonesia, phía nam Nhật Bản, phía nam Hàn

Quốc, Lào, Malaysia, Myanmar, Nepal, New Guinea, Sri Lanka, Thailand và Việt Nam [124]

Bảng 1.1 Danh sách các loài thuộc chi Gynostemma Blume [145]

TT Tên loài Tài liệu công bố

1 Gynostemma aggregatum C Y Wu & S K Chen Acta Phytotax Sin

2 Gynostemma burmanicum King ex Chakrav Indian J Agric Sci

3 Gynostemma cardiospermum Cogn ex Oliv Hooker's Icon Pl

23(1), pl 2225, 1892 Trirostellum cardiospermum (Cogn ex Oliv.) Z P

4 Gynostemma caulopterum S Z He Acta Phytotax Sin

5 Gynostemma compressum X X Chen & D R Liang Guihaia 11(1): 13–14, f s n., 1991

6 Gynostemma guangxiense X X Chen & D H Qin Acta Bot Yunnan

7 Gynostemma intermedium W J de Wilde & Duyfjes Blumea 52: 265, 2007

8 Gynostemma laxiflorum C Y Wu & S K Chen Acta Phytotax Sin

9 Gynostemma laxum (Wall.) Cogn Monogr Phan 3:

914, 1981 Gynostemma crenulata Ridl J Fed Malay States

Mus 10: 93 93, 1920 Gynostemma wightianum (Arn.) Benth & Hook f Gen Pl 1: 839, 1867

Pestalozzia laxa (Wall.) Thwaites Enum Pl Zeyl 124

Zanonia laxa Wall Pl Asiat Rar 2: 29

29, 1831 Zanonia wightiana Arn Pugillus Pl Ind Or

10 Gynostemma longipes C Y Wu Acta Phytotax Sin

11 Gynostemma microspermum C Y Wu & S K Chen Acta Phytotax Sin

12 Gynostemma pallidinerve Z Zhang Acta Phytotax Sin

13 Gynostemma papuanum W J de Wilde & Duyfjes Blumea 52: 267, 2007

14 Gynostemma pentagynum Z P Wang Acta Bot Yunnan

15 Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino Bot Mag (Tokyo) 16:

16 Gynostemma pubescens (Gagnep.) C Y Wu Acta Phytotax Sin

Gynostemma pedatum var pubescens Gagnep Fl Indo-Chine 2:

1990 Trirostellum yixingense C.P Wang & Q.Z Xie Acta Phytotax Sin

19 Gynostemma zhejiangense X J Xue Bull Bot Res.,

Tại Việt Nam, theo các tác giả Võ Văn Chi [5] và Phạm Hoàng Hộ [13], chi Gynostemma Blume chỉ có 3 loài tại Việt Nam:

- Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino (cổ yếm, thư tràng năm lá) phân bố nhiều ở các vùng rừng núi, lùm bụi có độ cao 1-2000m tại nhiều tỉnh Bắc, Trung, Nam [6], [13]

- Gynostemma laxum (Wall.) Cogn (thư tràng thưa, Cổ yếm lá bóng) thường xuất hiện ở các rừng thưa tại Lào Cai, Hòa Bình, Ninh Bình, Quảng Trị [6], [5], [13]

- Gynostemma pedatum Blume (phân bố ở Ba vì, Lạng Sơn, Sapa, Ninh

1.1.3 Đặ c đ i ể m th ự c v ậ t chi Gynostemma Blume 1.1.3.1 Đặc điểm chung

Chi Gynostemma Blume bao gồm các loài cây thảo nhiều năm, thường có dạng dây leo nhẵn hoặc có lông Các loài này thường phát triển dưới tán cây, với rễ có thể có củ hoặc không Cành của chúng mảnh và có lông thưa hoặc lông mịn.

Lá mọc so le, thường có hình dạng kép chân vịt với 3-9 lá chét, hiếm khi xuất hiện lá đơn Phiến lá chét có hình trứng hoặc mác và thường có màu xanh khi khô Tua cuốn thường chẻ đôi, nhưng cũng có trường hợp hiếm gặp là đơn.

Cây đơn tính khác gốc, hiếm khi đơn tính cùng gốc [124], [154]

Hoa của cây có đặc điểm là hoa đơn tính, thường mọc thành cụm hoặc chùy tại nách lá hoặc đầu cành Cuống hoa có khớp và lá bắc con ở gốc Hoa đực có ống đài ngắn với 5 thùy, các mảnh hình mác hẹp và tràng màu xanh hoặc trắng, hình bánh xe với 5 thùy xẻ sâu Nhị hoa đực có 5 chỉ ngắn, hàn liền, bao phấn hình trứng, nứt dọc và hạt phấn hình cầu hoặc elip Hoa cái có đài và tràng tương tự hoa đực, nhưng có dấu vết nhị lép Bầu hoa cái hình cầu với 2-5 ô, vòi nhụy thường có 3, đôi khi 2, 4 hoặc 5, và núm nhụy có hình lưỡi liềm hoặc xẻ răng cưa không đều, với noãn 2 treo trong mỗi ô.

Quả mọng có hình cầu hoặc giống hạt đậu, kích thước tương tự như quả nang, thường có 3 thùy từ đỉnh Đỉnh quả có thể có u hoặc dấu vết của 3 vòi nhụy dài Bên trong quả, có từ 2 đến 3 hạt hình trứng, rộng và dẹp, có thể có nhú hoặc gai nhú.

Nghiên cứu về nhiễm sắc thể trong chi Gynostemma Blume cho thấy số nhiễm sắc cơ bản là 2n = 22, với khả năng xuất hiện đa bội, thường gặp là 2n = 22, 44, 66 hoặc 88 Hiện tượng đa bội nhiễm sắc thể thường xuyên xảy ra ở một số loài như G cardiospermum (2n = 22, 66), G longipes (2n = 22, 44), G yixingerse (2n = 22, 88) và G pentaphyllum (2n = 22, 44, 66).

1.1.3.2 Một số khóa phân loại của chi Gynostemma Blume

Theo thực vật chí Trung Quốc, 14 loài thực vật đã được phân loại tại Trung Quốc, trong đó có 9 loài đặc hữu Việc phân loại dựa trên các đặc điểm ưu tiên như loại quả, bao gồm quả nang và quả mọng Đối với quả nang, các đặc điểm ưu tiên là hoa cái, núm nhụy, vòi nhụy và đường kính, tập trung vào cơ quan sinh sản Trong khi đó, đối với quả mọng, các đặc điểm ưu tiên là dạng lá đơn hay kép, số lá chét, và tính chất của lá (lông hay nhẵn), trước khi xem xét đến đặc điểm về quả và hạt, nhấn mạnh vào cơ quan dinh dưỡng.

Khung 1 Khóa phân loại chi Gynostemma Blume ở Trung Quốc [124]

1a Quả nang hình chuông, tự mở ở mặt bụng khi trưởng thành, 3 thùy; vết vòi nhụy 3(-5), dạng mỏ dài

Hoa cái có thể xuất hiện đơn độc hoặc theo từng cặp, thường nằm ở nách lá với cuống hoa dài từ 3 đến 4 cm; bầu hoa có 5 ô và vòi nhụy có 5 Trong khi đó, hoa cái cũng có thể xuất hiện nhiều, tập trung trong chùm hoặc chùy, mọc ở nách lá hoặc đầu cành, với cuống hoa ngắn hơn 5 mm; bầu hoa có 3 ô và vòi nhụy có 3.

3a Hoa cái trong chùy hoa thưa; cuống quả 8 – 10 mm

6 Gynostemma laxiflorum 3b Hoa cái trong chùm dạng bông; cuống quả ngắn hơn 5 mm

4a Núm nhụy hình lưỡi liềm và khía răng không đều, vòi nhụy 2.5 – 3 mm, hoặc dày và ngắn, khoảng 0.5 mm

5a Vòi nhụy mỏng và dài, 2.5 – 3 mm; vòi nhụy tồn tại dài tới 5 mm; bề mặt hạt không có cánh và không có rãnh

2 Gynostemma yixingense 5b Vòi nhụy ngắn và dày; dấu vết vòi nhụy dạng mỏ ngắn; hạt hình tim rộng, mép có khía hoặc có cánh hẹp

3 Gynostemma cardiospermum 4b Núm nhụy 2 thùy, chia đôi (chạc), không bao giờ hình lưỡi liềm, vòi nhụy ngắn hơn 0.5 mm

6a Quả có đường kính khoảng 3 mm, nhẵn, có chấm/đốm tối/sậm màu; lá có năm lá chét hình elip

4 Gynostemma microspermum 6b Quả có đường kính 5 – 6 mm, có lông tơ trắng, không có điểm đốm đen/sậm màu; lá có 5-7 lá chét hình trứng ngược – elip 5 Gynostemma aggregatum 1b Quả mọng hình cầu hoặc hình cầu – dẹt, không tự mở; vết vòi nhụy ngắn, có một u/bướu – núm, không bao giờ dạng mỏ

7a Lá đơn 7 Gynostemma simplicifolium 7b Lá kép, chân vịt

8a Thân 3 góc, có cánh hẹp 14 Gynostemma caulopterum 8b Thân hình trụ, có khía theo chiều dọc, không có cánh

Lá cây có tuổi thọ 3 năm, với bề mặt trơn nhẵn và không có lông ở cả hai mặt, hoặc có lông dọc theo gân chính Thân cây có lông thưa thớt tại các nốt và đốt Các mảnh tràng hoa có hình dáng mác hẹp, kích thước từ 2 đến 3 mm.

8 Gynostemma laxum 10b Phiến lá và thân dày đặc lông tơ; các mảnh tràng hình thuôn/chữ nhật – elip; khoảng 2 mm

9b Lá có (3-) 5 – 7(-9) lá chét 11a Quả có lông rậm /lông tơ nhiều; thân mập

10 Gynostemma pentaphyllum 11b Quả nhẵn, thân mảnh

12a Cuống quả ngắn hơn 5 mm; lá có lông tơ dày hoặc thưa 10 Gynostemma pentaphyllum 12b Cuống quả 7 – 25 mm

13a Cây đơn tính cùng gốc; quả 3 cạnh hình trứng ngược hoặc 3 cạnh hình cầu

11 Gynostemma guangxiense 13b Cây đơn tính khác gốc; quả hình cầu hoặc tam giác ngược

14a Quả hình tam giác ngược, dẹt; lá chét

5 – 7, hình elip hoặc elip-trứng

12 Gynostemma compressum 14b Quả hình cầu; lá chét 7 – 9, hình thoi- elip hoặc trứng ngược – mác

13 Gynostemma longipes Theo Flora of Thailand, khóa phân loại các loài trong chi Gynostemma

Blume tại khu vực sinh học Thái Lan và Malesia có sự tương đồng với hệ thực vật của Trung Quốc Tuy nhiên, do đặc thù sinh thái, khu vực Malesia còn bổ sung thêm hai loài đặc hữu là G intermedium và G papuanum, chỉ xuất hiện tại đây.

Tuy nhiên do quan điểm phân loại, W.J.J.O De Wilde đã gộp một số loài vào thành dạng (forma) của G pentaphyllum (có 7 dạng khác nhau) (khung 2)

Khung 2 Khóa phân loại chi Gynostemma Blume tại vùng Thailand và Malesia [154]

1a Quả nang, đường kính 3-4 mm, mở ở đỉnh bằng 3 rãnh Hạt có đường kính 2 mm Cụm hoa ngắn, rủ xuống (phân chi Trirostellum), xuất hiện ở phía bắc

Thành phần hóa học của chi Gynostemma Blume

Nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Gynostemma Blume trên thế giới chủ yếu tập trung vào loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino Các thành phần chính bao gồm saponin, flavonoid, polysaccharid, chlorophyll và sterol Tài liệu thu thập được cho thấy thành phần hóa học của chi Gynostemma Blume được phân loại theo các nhóm chất khác nhau.

1.2.1 Nhóm saponin trong chi Gynostemma Blume

Các nghiên cứu đầu tiên đã phát hiện saponin trong G pentaphyllum

Thunb.) Makino sở hữu cấu trúc dammaran, trong đó đã phát hiện và công bố hơn 200 saponin, cụ thể là các gypenosid Tất cả các hợp chất này đều thuộc dạng khung dammaran hoặc các biến thể của nó.

Hình 1.4 Khung cấu trúc dammaran

Cấu trúc gypenosid rất đa dạng, với R1 và R5 thường gắn với các mạch đường, trong khi R2 và R6 có thể chứa nhóm OH R3 và R4 có thể là dạng keto hoặc cũng có thể chứa nhóm OH Phân loại các gypenosid trong chi Gynostemma Blume dựa trên chuỗi carbon tại vị trí C17.

- Nhóm 1 Cấu trúc dammar-24-en và các dẫn chất, chiếm đa số (142 gypenosid): nhóm thế R7(a); R7(b)

- Nhóm 2 Cấu trúc thay đổi liên kết đôi trên mạch carbon C17 (46 gypenosid): nhóm thế R7(c-i)

- Nhóm 3 Cấu trúc vòng tại mạch carbon C17 (38 gypenosid)

Cấu trúc gypenosid Nhóm thế R 7

Hình 1.5 Cấu trúc chung của các gypenosid

1.2.1.1 Cấu trúc dammar-24-en và các dẫn chất a Khung 3β,20β-dihydroxydammar-24-en

Hình 1.6 Khung cấu trúc 3β,20β-dihydroxydammar-24-en

Phần genin của gypenosid trong nhóm này bắt nguồn từ khung dammarenediol-II, với hai nhóm hydroxyl ở vị trí beta tại C3 và C20 Nhóm CH3 ở vị trí 19 có khả năng bị oxy hóa thành nhóm CH2OH hoặc CHO Một số gypenosid còn có nhóm hydroxyl ở vị trí C2 theo hướng α.

- Dẫn chất 3β,19,20β-trihydroxydammar-24-en (bảng 1.2)

Các saponin thuộc nhóm này có khối lượng và kích thước phân tử tương đương với các protopanaxadiol (chuyển nhóm OH từ vị trí 12β sang 19) (hình 1.6 và bảng 1.2)

Bảng 1.2 Các gypenosid 3β,19,20β-trihydroxydammar-24-en

STT Hợp chất CTPT R 1 R 2 R 3 R 4 Loài

1 XXVII-Em C 36 H 62 O 8 glc H CH 2 OH H G pent [106]

2 LXXIX C 42 H 72 O 13 glc H CH 2 OH glc G pent [173]

5 LV C 47 H 80 O 17 glc H CH 2 OH glc(6-1)xyl G pent [131]

1)glc H CH 2 OH glc G pent [59]

H CH 2 OH glc(6-1)xyl G pent [174]

H CH 2 OH glc(6-1)rha G pent [60]

- Dẫn chất 3β,20β-dihydroxydammar-24-en-19-al (hình 1.6 và bảng 1.3)

Bảng 1.3 Các dẫn chất 3β,20β-dihydroxydammar-24-en-19-al

STT Hợp chất CTPT R 1 R 2 R 3 R 4 Loài

9 XXVIII-Em C 35 H 58 O 7 ara H CHO H G pent [106]

10 XXIX C 41 H 68 O 12 ara(2-1)glc H CHO H G pent [131]

11 XXVIII C 42 H 70 O 13 glc(2-1)glc H CHO H G pent [131]

12 3 C 47 H 78 O 17 ara(2-1)rha H CHO glc G pent [60]

II C 48 H 80 O 18 glc(2-1)glc H CHO glc G pent [171]

14 XXXVII C 52 H 86 O 21 ara(2-1)glc H CHO glc(6-1)xyl G pent [132]

15 XXXVI C 53 H 88 O 21 ara(2-1)glc H CHO glc(6-1)rha G pent [132]

16 2 C 54 H 90 O 22 glc(2-1)glc H CHO glc(6-1)rha G pent [60]

- Dẫn chất 2α,3β,20β-trihydroxydammar-24-en (hình 1.6 và bảng 1.4)

Bảng 1.4 Các dẫn chất 2α,3β,20β-trihydroxydammar-24-en

STT Hợp chất CTPT R 1 R 2 R 3 R 4 Loài

17 LXXVIII C 41 H 70 O 12 H OH CH 3 glc(6-1)xyl G pent [172]

18 1 C 47 H 80 O 17 glc OH CH 3 glc(6-1)xyl G pent [94]

19 LXXIII C 48 H 82 O 17 glc OH CH 3 glc(6-1)rha G pent [173]

20 1 C 53 H 90 O 22 glc(2-1)glc OH CH 3 glc(6-1)xyl G yixi [158] b Khung 3β,12β,20β-trihydroxydammar-24-en

Các saponin nhóm này có thêm nhóm hydroxyl C12 trên khung cấu trúc dammarenediol-II và thường thấy xuất hiện ở các saponin phân lập từ chi Panax

L (gọi là protopanaxadiol) Một số saponin thuộc nhóm này cũng có các nhóm thế ở vị trí C2α và C19 (hình 1.7)

Các saponin có cấu trúc protopanaxadiol là đặc trưng của chi Panax L., thường thấy ở các loài như sâm Triều Tiên (P ginseng C A Mey.), sâm Mỹ (P quinquefolius L.), sâm Nhật Bản (P japonicas (T Nees) C A Mey.) và sâm Việt Nam (P vietnamensis Ha).

Grushv.) Có nhiều saponin cấu trúc protopanaxadiol được phát hiện từ loài

Gynostemma pentaphyllum; trong đó có 6 saponin cũng có mặt trong thành phần hóa học của P ginseng là Rb1, Rb1-6’’-malonyl, Rb3, Rd, Rd-6’’-malonyl,

Bảng 1.5 Các dẫn chất protopanaxadiol

STT Hợp chất CTPT R 1 R 2 R 3 R 4 Loài

21 XIII (Gynos M) C 41 H 70 O 12 H H CH 3 glc(6-1)xyl G pent

23 LXXV C 42 H 72 O 13 H H CH 3 glc(6-1)glc G pent

C 47 H 80 O 17 glc H CH 3 glc(6-1)xyl G pent

26 X (Gynos J) C 48 H 82 O 17 glc H CH 3 glc(6-1)rha G pent

27 XI (Gynos K) C 48 H 82 O 17 glc(6-1)rha H CH 3 glc G pent

30 XVII (Gynos S) C 48 H 82 O 18 glc H CH 3 glc(6-1)glc G pent

31 VIII (Rd) C 48 H 82 O 18 glc(2-1)glc H CH 3 glc G pent

33 LVIII C 52 H 88 O 21 ara(2-1)glc H CH 3 glc(6-1)xyl G pent

34 XV C 52 H 88 O 21 xyl(2-1)glc H CH 3 glc(6-1)xyl G pent

35 Gynos Q C 52 H 88 O 21 glc(2-1)xyl H CH 3 glc(6-1)xyl G pent

36 XVI C 53 H 90 O 21 xyl(2-1)glc H CH 3 glc(6-1)rha G pent

37 Gynos R C 53 H 90 O 21 glc(2-1)xyl H CH 3 glc(6-1)rha G pent

38 IV (Rb3) C 53 H 90 O 22 glc(2-1)glc H CH 3 glc(6-1)xyl G pent

39 VII (Gynos G) C 54 H 92 O 21 glc(6-1)rha H CH 3 glc(6-1)rha G pent

41 I-EH (ProgynosA2) C 54 H 92 O 22 glc(6-1)rha H CH 3 glc(6-1)glc G pent

42 V (Gynos E) C 54 H 92 O 22 glc(2-1)glc H CH 3 glc(6-1)rha G pent [81],

44 III (Rb1) C 54 H 92 O 23 glc(2-1)glc H CH 3 glc(6-1)glc G pent

Phần genin của nhóm này được xem là dẫn chất của protopanaxadiol, với sự bổ sung của một nhóm hydroxyl tại vị trí C19 Đồng thời, tại vị trí C20, có khả năng xuất hiện đồng phân 20R.

Bảng 1.6 Các dẫn chất 3β,12β,19,20β-tetrahydroxydammar-24-en

STT Hợp chất CTPT R 1 R 2 R 3 R 4 Loài

51 LXXVI C 36 H 62 O 9 H H CH 2 OH glc G pent [172]

52 LXV C 41 H 70 O 13 H H CH 2 OH glc(6-1)xyl G pent [173]

53 LIV C 41 H 70 O 13 ara(2-1)glc H CH 2 OH H G pent [132]

54 LXVI C 42 H 72 O 13 H H CH 2 OH glc(6-1)rha G pent [173]

55 XXXVIII C 42 H 72 O 14 glc(2-1)glc H CH 2 OH H G pent [131]

56 LXIV C 47 H 80 O 18 glc H CH 2 OH glc(6-1)xyl G pent [174]

57 LXXII C 48 H 82 O 18 glc(6-1)rha H CH 2 OH glc G pent [173]

58 LXII C 53 H 90 O 23 glc(2-1)glc H CH 2 OH glc(6-1)xyl G pent [174]

Hình 1.8 Đồng phân 20R của dẫn chất 3β,12β,19,20β-tetrahydroxydammar-24-en

Bảng 1.7 Các dẫn chất 20R của 3β,12β,19,20β-tetrahydroxydammar-24-en

STT Hợp chất CTPT R 1 R 2 R 3 R 4 Loài

59 LIII (20R) C 41 H 68 O 13 ara(2- 1)glc H CHO H G pent [132]

60 XL (20R) C 42 H 70 O 14 glc(2-1)glc H CHO H G pent [131]

C 42 H 72 O 14 glc(2-1)glc H CH 2 OH H G pent [131]

Một số dẫn chất protopanaxadiol có nhóm hydroxyl tự do tại vị trí C2 hướng α (hình 1.8, bảng 1.8)

Bảng 1.8 Các hợp chất có cấu trúc 2α,3β,12β,20β-tetrahydroxydammar-24-en

STT Hợp chất CTPT R 1 R 2 R 3 R 4 Loài

Jh1 C 36 H 61 O 9 glc OH CH 3 H G pent [160]

64 LXXVII C 41 H 70 O 13 H OH CH 3 glc(6-1)xyl G pent [172]

65 LXXIV C 42 H 72 O 14 H OH CH 3 glc(6-1)glc G pent [172]

C 42 H 72 O 13 H OH CH 3 glc(6-1)rha G pent [81],

67 1 C 42 H 72 O 14 glc OH CH 3 glc G pent [93]

68 L C 42 H 72 O 14 glc(2-1)glc OH CH 3 H G pent [134],

69 LI (20R) C 42 H 72 O 14 glc(2-1)glc OH CH 3 H G pent [134],

70 LVII C 47 H 80 O 18 glc OH CH 3 glc(6-1)xyl G pent [133]

71 XLV C 48 H 82 O 18 glc OH CH 3 glc(6-1)rha G pent [81],

72 XLIV C 48 H 82 O 19 glc OH CH 3 glc(6-1)glc G pent [135]

73 XLVI C 48 H 82 O 19 glc(2-1)glc OH CH 3 glc G pent [135],

74 2 C 50 H 84 O 20 glc OH CH 3 glc(2-1)glc-

75 LVI C 53 H 90 O 23 glc(2-1)glc OH CH 3 glc(6-1)xyl G pent [133],

76 1 C 53 H 90 O 23 glc(4-1)glc OH CH 3 glc(6-1)xyl G pent [67]

77 XLIII C 54 H 92 O 23 glc(2-1)glc OH CH 3 glc(6-1)rha G pent [81],

78 XLII C 54 H 92 O 24 glc(2-1)glc OH CH 3 glc(6-1)glc G pent [135]

Nhóm hydroxyl C12 có thể bị oxy hóa chuyển thành nhóm keton (hình 1.9, bảng 1.9)

Hình 1.9 Khung cấu trúc 3β,20β-dihydroxydammar-24-en-12-on Bảng 1.9 Các dẫn chất có cấu trúc 3β,20β-dihydroxydammar-24-en-12-on

STT Hợp chất CTPT R 1 R 2 R 3 R 4 Loài

80 2 C 53 H 88 O 23 glc(2-1)glc OH CH 3 glc(6-1)xyl G pent [59]

81 1 C 54 H 90 O 23 glc(2-1)glc OH CH 3 glc(6-1)rha G pent [59] c Các nhóm thế khác

Các gypenosid thuộc nhóm này có đặc điểm các vị trí có thể bị thế hydroxyl, carbonyl, carboxyl tại các vị trí 21, 23, 26

- Thế hydroxyl tại vị trí C21 (hình 1.10, bảng 1.10)

Hình 1.10 Cấu trúc 3β,20β,21-trihydroxydammar-24-en Bảng 1.10 Các hợp chất 3β,20β,21-trihydroxydammar-24-en

STT Hợp chất Công thức R 1 R 2 R 3 R 4 Loài

88 XXXII C 42 H 72 O 14 glc CH 2 OH H glc G pent [136]

89 XXX C 42 H 72 O 14 glc CH 2 OH glc H G pent [136]

90 XXXI C 42 H 72 O 14 glc(2-1)glc CH 2 OH H H G pent [136]

91 XXIII C 48 H 82 O 19 glc(2-1)glc CH 2 OH H glc G pent [136]

92 XXIII-Eg (20R) C 48 H 82 O 19 glc(2-1)glc CH 2 OH H glc G pent [106]

93 XXII C 53 H 90 O 23 glc(2-1)glc CH 2 OH glc(6-

94 XXXIV C 54 H 92 O 24 glc(2-1)glc CH 2 OH H glc(6-

98 XXXIII C 42 H 70 O 14 glc(2-1)glc CHO H H G pent [136]

100 LII C 47 H 78 O 18 ara(2-1)rha CHO H glc G pent [182]

101 XXVI C 47 H 78 O 18 ara(2-1)glc CHO glc H G pent [131]

102 XXV C 47 H 78 O 18 ara(2-1)glc CHO H glc G pent [131]

103 XXV-Em (20R) C 47 H 78 O 18 ara(2-1)glc CHO H glc G pent [106]

104 XXXV C 53 H 88 O 23 glc(2-1)glc CHO glc(6-

- Thế carboxyl tại C21 tạo thành các saponin acid (hình 1.11, bảng 1.11)

Hình 1.11 Cấu trúc 3,20-dihydroxydammar-24-en-21-oic Bảng 1.11 Các hợp chất có cấu trúc 3,20-dihydroxydammar-24-en-21-oic STT Hợp chất Công thức R 1 R 2 R 3 Loài

109 1 C 47 H 76 O 20 glc ara(3-1)glc COOH G card [168]

112 2 C 47 H 76 O 20 ara(3-1)glc glc COOH G pub [165]

(3-1)rha glc(2-1)glc CH 2 OH G pent [61]

(3-1)glc glc(2-1)glc CH 3 G pent [61]

(3-1)glc(6-1)rha glc CH 2 OH G pub [165]

(3-1)glc(6-1)rha (2-1)glc glc CHO G pub [165]

(3-1)glc(6-1)rha (2-1)glc glc CH 2 OH G pub [165]

- Thế hydroxyl tại C26 (hình 1.12, bảng 1.12)

Hình 1.12 Cấu trúc 3β,12β,20β,26-tetrahydroxydammar-24-en Bảng 1.12 Các gypenosid khung 3β,12β,20β,26-tetrahydroxydammar-24-en

STT Hợp chất CTPT R 1 R 2 R 3 Loài

126 LIX C 41 H 70 O 14 H OH glc(6-1)xyl G pent [133]

128 LXX C 53 H 90 O 23 glc(2-1)glc H glc(6-1)xyl G pent [175]

129 LXI C 53 H 90 O 24 glc(2-1)glc OH glc(6-1)xyl G pent [174]

C 54 H 92 O 23 glc(2-1)glc H glc(6-1)rha G pent [130]

131 XLVII C 54 H 92 O 24 glc(2-1)glc OH glc(6-1)rha G pent [134]

- Thế keton tại C23 (hình 1.13, bảng 1.13)

Hình 1.13 Cấu trúc 20β-hydroxydammar-24-en 12,23-dion Bảng 1.13 Hợp chất có cấu trúc 20β-hydroxydammar-24-en 12,23-dion

STT Hợp chất CTPT R 1 R 2 Loài

1.2.1.2 Thay đổi liên kết đôi trên nhóm thế C17

- Nhóm dammar-23-en Đa số các saponin thuộc nhóm này có nhóm hydroxyl hướng β tại C12 (hình 1.14, bảng 1.14)

Hình 1.14 Cấu trúc 3β,12β,20β-trihydroxydammar-23-en

Bảng 1.14 Các hợp chất 3β,12β,20β-trihydroxydammar-23-en

STT Hợp chất CTPT R 1 R 2 R 3 R 4 R 5 Loài

143 LX C 41 H 70 O 14 H OH CH 3 glc(6-1)xyl OH G pent

144 GD3 C 42 H 72 O 16 H OH CH 3 glc(6-1)glc OOH G pent

145 GypGC4 C 42 H 72 O 15 H OH CH 3 glc(6-1)rha OOH G pent

146 GypGC7 C 48 H 82 O 19 glc OH CH 3 glc(6-1)rha OH G pent

147 GD5 C 48 H 82 O 21 glc(2-1)glc OH CH 3 glc OOH G pent

148 LXIX C 53 H 90 O 23 glc(2-1)glc H CH 3 glc(6-1)xyl OH G pent

149 LXVIII C 53 H 90 O 24 glc(2-1)glc OH CH 3 glc(6-1)xyl OH G pent

150 3 C 53 H 90 O 24 glc(2-1)glc H CH 3 glc(6-1)xyl OOH G pent

151 7 C 53 H 88 O 25 glc(2-1)glc H CHO glc(6-1)xyl OOH G pent

152 GD4 C 54 H 92 O 25 glc(2-1)glc OH CH 3 glc(6-1)rha OOH G pent

Nhóm hydroxyl C12 có thể bị oxy hóa chuyển thành nhóm keton (hình 1.15 và bảng 1.15)

Hình 1.15 Khung cấu trúc 3β,20β-dihydroxydammar-23-en-12-on Bảng 1.15 Các dẫn chất có cấu trúc 3β,20β-dihydroxydammar-23-en-12-on

STT Hợp chất CTPT R 1 R 2 R 3 R 4 R 5 Loài

Một số hợp chất dammar-23-en có nhóm thế hydroxyl tại C26 (hình 1.16, bảng 1.16)

Hình 1.16 Cấu trúc 3β,20β,26-trihydroxydammar-23-en Bảng 1.16 Hợp chất có cấu trúc 3β,21,26-trihydroxydammar-23-en

STT Hợp chất Công thức R 1 R 2 R 3 R 4 Loài

155 3 C 53 H 90 O 22 ara(2-1)glc rha OH O-glc G pent [109]

Một số dammar-23-en có nhóm thế hydroxyl tại C21 (hình 1.17, bảng 1.17)

Hình 1.17 Cấu trúc 3β,12β,20β,21-tetrahydroxydammar-23-en Bảng 1.17 Các gypenosid 3β,12β,20β,21-tetrahydroxydammar-23-en

STT Hợp chất CTPT R 1 R 2 R 3 R 4 R 5 Loài

Một số dammar-23-en có nhóm thế carboxyl tại C21 và C29 (hình 1.18, bảng 1.18)

Hình 1.18 Cấu trúc 3β,20β-dihydroxydammar-23-en-21,29-dioic Bảng 1.18 Các hợp chất 3β,20β-dihydroxydammar-23-en-21,29-dioic

STT Hợp chất Công thức R 1 R 2 R 3 Loài

(3-1)glc(6-1)rha glc OH G card [168]

Nhiều saponin thuộc nhóm này có nhóm hydroxyl hướng β tại C12 (hình 1.19, bảng 1.19)

Hình 1.19 Cấu trúc 3β,12β,20β-trihydroxydammar-25-en Bảng 1.19 Các hợp chất 3β,12β,20β-trihydroxydammar-25-en

STT Hợp chất CTPT R 1 R 2 R 3 R 4 Loài

161 TR1 C 36 H 62 O 10 H OH glc OH G pent [65]

162 Gynos TR-1 C 36 H 62 O 11 OH OH glc OH G pent [65]

163 GypGC1 C 42 H 70 O 14 H OH glc(6-1)rha =O G pent [75],

164 GypGC2 C 42 H 72 O 14 H OH glc(6-1)rha OH G pent [75]

165 GypGC3 C 42 H 72 O 15 H OH glc(6-1)rha OOH G pent [75]

166 GypGC5 C 42 H 72 O 15 H OH glc(6-1)glc OH G pent [75]

167 GD1 C 47 H 72 O 15 H OH glc(6-1)glc =O G pent [81]

168 GypGC6 C 48 H 82 O 19 glc OH glc(6-1)rha OH G pent [75]

1)glc OH glc(6-1)rha =O G pent [81]

Một số saponin dammar-25-en có nhóm thế hydroxyl tại C21 (hình 1.20, bảng 1.20)

Hình 1.20 Cấu trúc 3β,20β,21-trihydroxydammar-25-en Bảng 1.20 Hợp chất có cấu trúc 3β,20β,21-trihydroxydammar-25-en

STT Hợp chất CTPT R 1 R 2 R 3 R 4 R 5 Loài

172 4 (20R) C 52 H 85 O 21 ara(2-1)glc H CH 3 glc O-rha G pent [109]

Một số dammar-25-en có nhóm thế di-carboxyl tại C21, 29 (hình 1.21, bảng 1.21)

Hình 1.21 Cấu trúc 3β,20β-dihydroxydammar-25-en-21,29-dioic

Bảng 1.21 Hợp chất 3β,20β-dihydroxydammar-25-en-21,29-dioic

STT Hợp chất Công thức R 1 R 2 R 3 Loài

(3-1)glc(6-1)rha glc OH G card [168]

- Các hợp chất dammar-23,25-dien (hình 1.22 và bảng 1.22)

Hình 1.22 Cấu trúc 3β,20β,21-trihydroxydammar-23,25-dien Bảng 1.22 Các hợp chất 3β,20β,21-trihydroxydammar-23,25-dien

STT Hợp chất CTPT R 1 R 2 R 3 Loài

177 Gypensapog enin W C 37 H 60 O 9 glc CH 3 COOCH 3 G pent [180]

- Các hợp chất dammar-20(21),24-dien và dammar-20(22),24-dien (hình 1.23, bảng 1.23)

Hình 1.23 Cấu trúc 3β,12β-dihydroxydammar-20,24-dien Bảng 1.23 Các hợp chất 3β,12β-dihydroxydammar-20,24-dien

STT Hợp chất CTPT R 1 R 2 R 3 R 4 Loài

178 Damulin A C 42 H 70 O 13 glc(2-1)glc OH OH

179 Damulin B C 42 H 70 O 13 glc(2-1)glc OH OH 20 24 G pent

183 Longipenos- id GL2 C 54 H 86 O 20 (6-1)rha glc(2-1)rha (3-1)rha

- Bão hòa liên kết đôi (hình 1.24 và bảng 1.24)

Hình 1.24 Cấu trúc 3β,20β,21-trihydroxydammaran Bảng 1.24 Các hợp chất 3β,20β,21-trihydroxydammaran STT Hợp chất CTPT R 1 R 2 R 3 R 4 R 5 R 6 Loài

1.2.1.3 Đóng vòng trên nhóm thế tại C17

Nhóm các gypenosid vòng epoxy-dammaran tại vị trí C17 (nhóm ocotillon) hoặc có thể tạo thành vòng carbon 5 cạnh

Hình 1.25 Cấu trúc 3β-hydroxy-21,23-epoxydammar-24-en Bảng 1.25 Các gypenosid 21-23 epoxydammaran

STT Hợp chất CTPT R 1 R 2 R 3 R 4 R 5 Loài

* Hợp chất 199 là (21R,23R)-3b,20ξ,21,26-tetrahydroxy-19-oxo-21,23-epoxydammar-24-en

Hình 1.26 Cấu trúc 3β-hydroxydammar-24-en-21,23-lacton Bảng 1.26 Các hợp chất 3β-hydroxydammar-24-en-21,23-lacton

STT Hợp chất CTPT R 1 R 2 R 3 Loài

Hình 1.27 Cấu trúc 3β-hydroxy-20,25-epoxydammaran Bảng 1.27 Các hợp chất 3β-hydroxy-20,25-epoxydammaran

STT Hợp chất CTPT R 1 R 2 R 3 Loài

206 13 C 42 H 70 O 14 xyl(2-1)xyl OH OAc G pent [166]

207 11 C 41 H 70 O 14 xyl(2-1)glc OH OH G pent [166]

208 12 C 41 H 70 O 14 glc(2-1)xyl OH OH G pent [166]

209 14 C 43 H 72 O 15 glc(2-1)xyl OH OAc G pent [166]

Hình 1.28 Cấu trúc 3β,25-dihydroxy-20,24-epoxydammaran

Bảng 1.28 Các hợp chất 3β,25-dihydroxy-20,24-epoxydammaran

STT Hợp chất CTPT R 1 R 2 R 3 Loài

213 Gynosid A C 41 H 70 O 13 xyl(2-1)glc OH H (24S) G pent [95]

214 Gynosid C C 41 H 70 O 13 xyl(2-1)glc OH H (24R) G pent [95]

215 Gynosid D C 41 H 70 O 14 xyl(2-1)glc OH OH (24S) G pent [95]

216 2 C 41 H 70 O 14 glc(2-1)xyl OH OH G pent [167]

217 Gynosid B C 42 H 72 O 14 glc(2-1)glc OH H (24S) G pent [95]

Bảng 1.29 Các hợp chất 3β-hydroxy-21,24-cyclodammaran

STT Hợp chất CTPT R 1 R 2 R 3 Loài

Hình 1.29 Khung cấu trúc chung của các 3β-hydroxy-21,24-cyclodammaran

- Vòng kép epoxydammaran (hình 1.30, bảng 1.30)

Hình 1.30 Cấu trúc 3β-hydroxy-20,24;20,12-diepoxydammaran Bảng 1.30 Hợp chất 3β-hydroxy-20,24;20,12-diepoxydammaran

STT Hợp chất CTPT R 1 R 2 Loài

226 Gynosid E C 41 H 70 O 13 xyl(2-1)glc OH G pent [95]

Gần đây, các gypenosid có cấu trúc dammaran đã được phân lập từ mẫu GCL cuống quả dài thu hái tại Mèo Vạc, Hà Giang, trong đó một số gypenosid bị cắt mất chuỗi 6 carbon Nghiên cứu này do Phạm thực hiện.

Hà Thanh Tùng [108] (hình 1.31, bảng 1.31) – là cấu trúc dammaran mới

Hình 1.31 Cấu trúc 3β-hydroxy-hexanordammaran-20-on Bảng 1.31 Hợp chất có cấu trúc 3β-hydroxy-hexanordammaran-20-on

STT Hợp chất CTPT R 1 R 2 Loài

228 Longipenosid ND2 C 48 H 78 O 20 (6-1)rha glc(2-1)rha (3-1)rha

Phần đường của saponin: các saponin trong G pentaphyllum (Thunb.)

Makino thường chứa một hoặc hai mạch đường, với ba mạch đường rất hiếm gặp Mỗi mạch đường có thể bao gồm 1, 2 hoặc 3 đường đơn, gắn tại các vị trí C3(β), C12(β), C20(β) và C21 của genin Trong các saponin của GCL, có bốn loại đường chính thuộc dạng pyranose: β-D-glucopyranose, β-D-xylopyranose, α-L-rhamnopyranose và α-L-arabinopyranose.

1.2.2 Các flavonoid phân l ậ p t ừ chi Gynostemma Blume

Flavonoid cũng là một trong những nhóm chất chính trong các loài thuộc chi Gynostemma Blume nhưng ít được báo cáo hơn (bảng 1.33)

Bảng 1.32 Các flavonoid phân lập được từ chi Gynostemma

- Nghiên cứu định lượng flavonoid trong 6 loài của chi Gynostemma

Blume thu hái tại Quảng Tây bằng phương pháp đo quang phổ tại bước sóng

510 nm, so sánh với chuẩn nội rutin cho kết quả hàm lượng flavonoid toàn phần trong loài Gynostemma guangxiense X X Chen & D H Qin là cao nhất [73]

- Sterol: có 18 hợp chất sterol được phân lập từ loài G pentaphyllum, gồm các khung như ergostanol [27], [26], [29], β-sitosterol [98], cholestan [28] và stigmastan

Nghiên cứu về G pentaphyllum (Thunb.) Makino cho thấy sự hiện diện của 15 loại chlorophyll và dẫn chất được xác định bằng phương pháp HPLC-MS, bao gồm pheophytin a, pheophytin a’, chlorophyll a, chlorophyll a’, hydroxypheophytin a, hydroxypheophytin a’, pheophytin b, pheophytin b’, chlorophyll b, chlorophyll b’, hydroxychlorophyll b, hydroxypheophytin b và hydroxypheophytin b’.

- Nhóm polysaccharid cũng được quan tâm bởi liên quan đến tác dụng điều hòa miễn dịch Các hợp chất polysaccharid trong loài G pentaphyllum

Polysaccharid trong GCL liên kết với protein, có khối lượng phân tử từ 9000 đến 33.000 Da Tỷ lệ mol của các monosaccharid trong polysaccharid này rất khác nhau Cụ thể, polysaccharid trung tính CGPP chủ yếu bao gồm mannose, glucose, arabinose, rhamnose, galactose và acid glucuronic với tỷ lệ mol 2,0:2,2:1,3:2,2:1,2:2,5 Ngược lại, polysaccharid khác từ phân đoạn rửa giải bằng NaCl chứa glucose, galactose, mannose và fructose với tỷ lệ mol 1:2,17:1,25:1,02 Ngoài ra, polysaccharid GP-I tan trong nước có thành phần gồm glucose, galactose, mannose, rhamnose và arabinose với tỷ lệ mol 5,3:4,2:3,0:0,7:0,8.

- Các acid hữu cơ gồm có acid benzoic, acid 3,4-dihydroxybenzoic, acid 3-ethoxy-4-hydroxybenzoic từ G laxum (Wall.) Cogn [118]

- Chưa thấy báo cáo nào công bố alcaloid xuất hiện ở các loài trong chi

Gynostemma Blume Riêng với loài G pentaphyllum (Thunb.) Makino, Arbain khẳng định không có alcaloid [31]

Như vậy qua tham khảo các tài liệu đã thu thập có thể tóm tắt như sau:

- Đa số các công bố nghiên cứu thành phần hóa học của chi Gynostemma Blume là từ loài G pentaphyllum (Thunb.) Makino gồm có 195 saponin và 8 flavonoid

- Loài Gynostemma longipes C Y Wu có 17 saponin, không có flavonoid

- Loài Gynostemma laxum (Wall.) Cogn có 8 flavonoid, chưa thấy có báo cáo về thành phần saponin

- Loài Gynostemma cardiospermum Cogn ex Oliv có 6 saponin và 3 flavonoid

- Loài Gynostemma pubescens (Gagnep.) C Y Wu có 8 saponin

- Loài Gynostemma yixingense C Y Wu & S K Chen có 1 saponin.

Tác dụng sinh học và độc tính của chi Gynostemma Blume

Dược liệu GCL, được sử dụng lâu đời theo kinh nghiệm dân gian tại tỉnh Quý Châu, Trung Quốc, nổi bật với việc người dân nơi đây có tuổi thọ cao và tỉ lệ mắc ung thư thấp nhờ vào việc thường xuyên uống trà GCL Theo Y học cổ truyền Trung Quốc, GCL có vị hơi đắng, tính bình-ấm, có tác dụng bổ âm và trợ dương, thường được chỉ định cho các trường hợp tăng lipid, hồi hộp, tức ngực, cùng với các triệu chứng như tê bì tay chân, chóng mặt, nhức đầu, hay quên, ù tai, tự hãn và thể trạng yếu Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra tác dụng dược lý của GCL, đặc biệt là loài G pentaphyllum (Thunb.) Makino, với các hoạt chất gypenosid tương tự như thành phần trong nhân sâm.

1.3.1 Tác d ụ ng ch ố ng ung th ư

Các nghiên cứu về GCL đã chỉ ra tác dụng gây độc tế bào và chống ung thư, với hơn 100 báo cáo khác nhau Những nghiên cứu này tập trung vào các thành phần như saponin tinh khiết, flavonoid, carotenoid, chlorophyll, gypenosid toàn phần, polysaccharid và dịch chiết ethanol GCL cho thấy khả năng ức chế khởi phát và tiến triển ung thư thông qua ba cơ chế chính: tác dụng gây độc và kìm hãm tế bào ung thư, tác dụng ức chế khối u trên động vật thí nghiệm, và khả năng ngăn ngừa đột biến gen.

Thử nghiệm in vitro đã đánh giá tác dụng gây độc tế bào của các chất tinh khiết như saponin, carotenoid, polysaccharid, flavonoid, chlorophyll và dịch chiết ethanol từ G pentaphyllum Các nghiên cứu cho thấy giá trị IC50 của các chất này nằm trong khoảng 0,05 đến 74,3 µg/ml, cho thấy sự gây độc tế bào ung thư đáng kể Đặc biệt, độc tính tế bào của các phân đoạn và chất phân lập từ G pentaphyllum được kiểm tra trên 30 dòng tế bào khác nhau, thể hiện hoạt tính chống ung thư in vitro rộng rãi của loại cây này.

Có 28 saponin phân lập từ loài G pentaphyllum có tác dụng gây độc tế bào, trong đó có 9 hợp chất là sản phẩm thủy phân loại bỏ phần đường Đáng chú ý nhất là hợp chất 3β-hydroxy-21,24-cyclodammar-20(22),24-dien-21-on

Hợp chất (23S)-3β-hydroxydammar-20,24-dien-21-oic acid 21,23-lactone cho thấy hoạt tính chống ung thư mạnh mẽ với giá trị IC50 đạt 0,11 àM trên tế bào ung thư phổi A549 và 0,58 àM trên tế bào u nguyên bào thần kinh đệm U87, vượt trội hơn nhiều so với epotosid (23,8 và 12,4 àM) Ngoài ra, hợp chất này cũng có tác dụng mạnh với IC50 đạt 3,90 àg/ml đối với các tế bào ung thư vú ở người MDA-MB.

Các nghiên cứu chỉ ra rằng khả năng gây độc tế bào có liên quan đến các aglycon có nhóm thế vòng 5 cạnh tại vị trí C-17, bao gồm 21,23-lacton, 21,23-epoxy hoặc 21,24-cyclodammar Hiệu ứng này đặc biệt mạnh mẽ khi có sự hiện diện của liên kết đôi tại vị trí C20-22.

Nếu aglycon có nhóm thế mạch thẳng tại C-17, thì thường sẽ có hai nhóm hydroxyl tại vị trí 20β và 21 Ngược lại, một số chất chỉ có một nhóm hydroxyl tại vị trí 2α Phần đường cũng có khả năng gây độc tế bào, đặc biệt là các chất có chuỗi đường ara(2-1)rha tại vị trí 3β.

Một số dẫn chất và sản phẩm thủy phân từ dịch chiết G pentaphyllum cho thấy khả năng gây độc tế bào ung thư Nghiên cứu của Chen và cộng sự đã chỉ ra rằng bốn dẫn chất sulphat của polysaccharid GPP2, được chiết xuất từ G pentaphyllum, trong đó GPP2-s4 có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư gan ở người lên tới 46,4% tại nồng độ 2000 µg/ml.

Dẫn chất acid của polysaccharid chiết xuất từ G pentaphyllum, GP-B1, có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư hắc tố B16 với giá trị IC50 đạt 65,4 µg/ml mà không gây độc cho tế bào thường Hợp chất này không chỉ ức chế các dòng tế bào ung thư mà còn kích thích đáp ứng miễn dịch tế bào, làm tăng nồng độ các cytokine TNF-α, IFN-ɣ, IL-10, IL-12 trong huyết thanh chuột ung thư sắc tố B16 Bên cạnh đó, phân đoạn carotenoid cho thấy hiệu quả mạnh nhất đối với tế bào ung thư gan người Hep3B với giá trị IC50 đạt 1,6 µg/ml.

G pentaphyllum có tác dụng ức chế tế bào ung thư thông qua nhiều cơ chế khác nhau, bao gồm: làm ngừng chu kỳ tế bào, tăng cường cảm ứng gây chết tế bào, ức chế quá trình xâm lấn và di căn, ngăn chặn quá trình đường phân của tế bào ung thư, và điều hòa hệ miễn dịch.

GCL có tác dụng chống ung thư thực nghiệm chủ yếu nhờ vào gypenosid, một hỗn hợp saponin từ G pentaphyllum Các gypenosid này đã cho thấy khả năng giảm kích thước khối u rắn rõ rệt (34,24%) sau 28 ngày thử nghiệm trên chuột NUDE cấy tế bào ung thư miệng người Hơn nữa, chúng còn làm tăng tỉ lệ sống sót của chuột thí nghiệm cấy tế bào ung thư bạch cầu WEHI-3, đồng thời kích thích sự gia tăng các tế bào đa bội khổng lồ trong tủy xương và giảm khối lượng lách, cho thấy khả năng nâng cao đáp ứng miễn dịch của mẫu thử gypenosid.

Trong nghiên cứu về tác dụng của gypenosid từ G pentaphyllum, kết quả cho thấy hợp chất này có khả năng gây độc tế bào đối với các dòng tế bào ung thư đại trực tràng như SW-480, SW-620 và Caco2 Đặc biệt, khi kết hợp gypenosid với thuốc chống ung thư 5-Fluorouracil (5-Fu), hiệu quả điều trị được nâng cao rõ rệt, với sự ức chế kích thước và khối lượng khối u lên đến 74,43% so với 29,97% khi sử dụng 5-Fu đơn độc Nghiên cứu trên mô hình chuột bị ung thư đại trực tràng Apc(Min) cũng cho thấy sự giảm đáng kể về kích thước và số lượng polyp khi kết hợp gypenosid với 5-Fu, mở ra triển vọng mới cho phương pháp điều trị ung thư đại trực tràng.

Các polysaccharid trong G pentaphyllum có khả năng chống khối u trong các thí nghiệm Chúng ức chế sự phát triển của khối u trong mô hình chuột gây ung thư bằng dòng tế bào sarcoma S180 Tác dụng này phụ thuộc vào liều lượng và có thể kích hoạt hệ miễn dịch, làm tăng số lượng đại thực bào cùng với các sản phẩm miễn dịch như NO, IL-1β và TNF-α.

Bảng 1.33 Tác dụng chống ung thư thực nghiệm của G pentaphyllum Thành phần Mô hình Tác dụng (tỉ lệ % so với chứng) TLTK

Gypenosid Chuột nude được cấy tế bào ung thư miệng SAS của người

(liều 20 mg/kg trong 28 ngày)

Gypenosid Chuột BALB/c được tiêm tế bào ung thư bạch cầu WEHI-3 của người

Tỉ lệ sống 150% (liều 2 mg/kg trong

Tỉ lệ sống 175% (liều 4 mg/kg trong

Gypenosid Chuột nude được cấy tế bào ung thư bạch cầu HL-60 của người

Giảm kích thước khối u: 44% (liều

Gypenosid Chuột BALB/c được cấy tế bào ung thư trực tràng CT-26 chuột

Giảm kích thước khối u: 75%, liều

Giảm kích thước khối u: 55%, liều

Giảm kích thước khối u: 26%, liều

50 + 5 mg/kg 5-Fu trong 19 ngày

Gypenosid Chuột Apc Min/+ : mô hình u tuyến ruột

Giảm số polyp: 66,06%, liều 500 mg/kg trong 4 tuần

Giảm số polyp: 59,92%, liều 750 mg/kg trong 4 tuần

Gypenosid Chuột Apc Min/+ : mô hình u tuyến ruột

Giảm số polyp: 59,32%, liều 750 mg/kg trong 8 tuần

Polysaccharid Chuột BALB/c được cấy tế bào ung thư S180 sarcoma chuột

(liều 100 mg/kg trong 14 ngày)

(liều 200 mg/kg trong 14 ngày)

Polysaccharid Chuột ICR được cấy tế bào ung thư gan H22 chuột

(liều 50 mg/kg trong 10 ngày)

(liều 200 mg/kg trong 10 ngày)

G pentaphyllum – CGPP ức chế sự phát triển khối u trên mô hình chuột ICR được cấy tế bào gây ung thư gan H22 Được điều trị bằng CGPP, chuột tăng khối lượng cơ thể, tăng chỉ số lách/ tuyến ức, tăng tế bào đơn nhân lách ở chuột mang khối u Các cytokine cũng tăng đáng kể như IL-2, TNF-α, IFN-γ cũng như làm tăng hoạt động của các tế bào diệt tự nhiên và các tế bào gây độc lympho T Tác dụng ức chế khối u và điều hòa miễn dịch cũng làm tăng đáng kể tuổi thọ của chuột thí nghiệm [92]

1.3.1.3 Tác dụng chống đột biến gen

Gypenosid có khả năng ngăn chặn tác nhân gây đột biến cyclophosphamid ở chuột nhắt và thúc đẩy quá trình phục hồi ADN Ở liều 0,33 mg/ml, gypenosid ức chế 70% hoạt tính của men ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) trong protein siêu vi cytocrom P448 in vitro Ngoài ra, gypenosid còn phá hủy ADN và hỗ trợ sửa chữa ADN của gen biểu hiện trên tế bào ung thư miệng SAS, điều này giải thích lý do gypenosid gây độc tế bào ung thư miệng SAS.

1.3.2 Tác d ụ ng đ i ề u hòa mi ễ n d ị ch

Tác dụng điều hòa miễn dịch của các saponin trong Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino đã được chú ý từ lâu Báo cáo đầu tiên vào năm

Một số nghiên cứu về chi Gynostemma Blume ở Việt Nam

- Hoàng Văn Lâm và cs đã nghiên cứu tính đa dạng sinh học của chi

Gynostemma Blume tại miền Bắc Việt Nam, phát hiện có 3 loài tại Việt Nam là Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino, Gynostemma laxum (Wall.)

Cogn và Gynostemma longipes C.Y Wu [79]

Nghiên cứu đã chỉ ra các đặc điểm vi phẫu của thân, lá, cuống lá và đặc điểm bột của các mẫu cây, từ đó góp phần phân biệt và tiêu chuẩn hóa loài G pentaphyllum (Thunb.) Makino.

- Bằng phương pháp đo phổ phát xạ tia X đã xác định trong loài G pentaphyllum (Thunb.) Makino có 15 nguyên tố vô cơ: Al, Si, Mg, Ca, P, K,

Mn, Na, Fe, Ba, Ti, Cu, Cr, Pb, Ag Trong đó, nguyên tố có hàm lượng cao nhất là Si (10%) và thấp nhất là Ag (0,0001%) [8]

- Bằng phản ứng hoá học đã xác định trong G pentaphyllum (Thunb.)

Makino có chứa saponin, flavonoid, acid amin, acid hữu cơ, sterol, đường khử và polysaccharid [1][15]

Hình 1.32 Vinagynostesid A phân lập từ Gynostemma longipes C Y Wu

- Đã phân lập được một số flavonoid từ G pentaphyllum (Thunb.) Makino: ombuin, quercetin [17]; ombuosid, rutin [21]

Từ loài GCL thu hái tại Hòa Bình Gynostemma sp., các tác giả đã phân lập và xác định một saponin dammaran mới mang tên vinagynostesid A Genin của saponin này có khung ocotillon đặc trưng với cấu trúc 20, 24 epoxy gắn liền với vòng D.

- Phát hiện trong G pentaphyllum (Thunb.) Makino có 2 acid hữu cơ là acid benzoic và acid vanillic [1]

1.4.3 Nghiên c ứ u v ề độ c tính và tác d ụ ng sinh h ọ c

- Không phát hiện thấy có độc tính cấp ở G pentaphyllum (Thunb.)

Makino tới mức liều 50 g/kg thể trọng Ở mức liều 3 g/kg thỏ/ngày liên tục trong 30 ngày không thấy biểu hiện độc tính bán trường diễn [8]

Gypenosid đã được chứng minh có tác dụng bảo vệ gan và chống oxy hóa hiệu quả ở liều 200 mg và 600 mg/kg ttc, thông qua việc giảm trọng lượng gan và hoạt độ AST, ALT trong mô hình gây độc tế bào gan bằng paracetamol Ngoài ra, gypenosid còn làm giảm nồng độ MDA trong dịch đồng thể gan và hạn chế tổn thương vi mô gan Đặc biệt, liều 200 mg/kg ttc của saponin toàn phần cho tác dụng tương đương với sylimarin 70 mg/kg ttc, trong khi liều cao hơn cho hiệu quả mạnh mẽ hơn.

Dịch chiết 1:1 từ G pentaphyllum (Thunb.) Makino có khả năng hạ cholesterol máu, hiệu quả theo cả hai phương pháp: tăng cholesterol nội sinh bằng tween80 và tăng cholesterol ngoại sinh khi chuột được cho ăn cholesterol.

GCL năm lá (G pentaphyllum) đã được nghiên cứu tại Việt Nam với tác dụng hạ đường huyết đáng chú ý Nghiên cứu in vivo trên chuột cho thấy, ở liều 5 g/kg, cao toàn phần chiết xuất từ G pentaphyllum có khả năng bảo vệ tế bào bêta khỏi sự phá hủy do tiêm STZ (p < 0,001 so với nhóm chứng) Thêm vào đó, các nghiên cứu cũng đã chỉ ra tác dụng và cơ chế của phanosid, một saponin có khả năng hạ đường huyết hiệu quả.

Nghiên cứu lâm sàng ngẫu nhiên, mù đôi và đối chứng giả dược trên 25 bệnh nhân đái tháo đường type 2 đã chứng minh hiệu quả của chế phẩm kết hợp sulfonylureas – cao toàn phần GCL với kết quả có ý nghĩa thống kê (p < 0,001 so với nhóm chứng).

Cao lỏng G pentaphyllum (Thunb.) Makino đã được đánh giá với nhiều tác dụng khác nhau, trong đó có khả năng tăng cường sức lực qua nghiệm pháp chuột bơi Ngoài ra, sản phẩm này cũng cho thấy hiệu quả trong việc nâng cao đáp ứng miễn dịch, cả trong các mô hình suy giảm miễn dịch do cyclophosphamid và tia xạ.

Tại Việt Nam, loài GCL năm lá (G pentaphyllum (Thunb.) Makino) đã được nghiên cứu di thực và trồng thành công tại Đức Trọng, Lâm Đồng [22]

Hàm lượng saponin toàn phần trong cây Giảo cổ lam được xác định đạt 4,12%, tương đương với các cây trồng ở vùng núi phía Bắc Đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu trồng và chế biến cây Giảo cổ lam tại tỉnh Bắc Kạn” do Viện Kinh tế Y tế và các vấn đề xã hội thực hiện, đã khảo sát ba loài thuộc chi Gynostemma Blume và lựa chọn G longipes (GCL bảy lá) cho nghiên cứu tiếp theo Các điều kiện sinh trưởng tối ưu được xác định là trồng bò lan trong 90 ngày với mật độ 20 x 20 cm tại các huyện Ba Bể, Pác Nặm và Chợ Đồn để đạt sản lượng tốt nhất Dự án “Bảo tồn, phát triển, sản xuất cây dược liệu Giảo cổ lam tại huyện Bá Thước, tỉnh Thanh Hóa” đã thiết lập vườn ươm hơn 1.000 m², cung cấp 10.000 hom giống và trồng trên diện tích 1,5 ha.

Nghiên cứu trồng Giảo cổ lam tại Trung Quốc đã tạo ra vùng nguyên liệu lớn cho sản xuất công nghiệp, đặc biệt với loài GCL năm lá (G pentaphyllum) Các điều kiện tối ưu cho loài này bao gồm pH đất từ 6,5 đến 7, nhiệt độ từ 15 đến 30 độ C, và độ sáng tối ưu từ 65 đến 75%, cho phép đạt sản lượng 4 – 5 tấn/ha/năm khi được chăm sóc dinh dưỡng hợp lý Thí nghiệm di thực và trồng GCL năm lá tại Sydney, Australia cho thấy năng suất tương đương với Trung Quốc (5 tấn/ha/năm), nhưng lượng chất chiết xuất cao hơn nhiều, đạt 28,5% so với 10,3 – 18,1%, chứng tỏ Australia là vùng trồng hứa hẹn cho dược liệu này.

Công dụng và sử dụng của các loài trong chi Gynostemma Blume

G pentaphyllum, hay còn gọi là "jow-goo-lan", là một loại cây leo mọc lan giống như nho, được mô tả lần đầu trong tài liệu Materia Medica for Famine vào năm 1406 bởi Zhu Xiao như một loại rau cứu đói Lý Thời Trân đã ghi chép về công dụng của GCL trong việc chữa trị nhiều bệnh liên quan đến tiêu huyết, phù cổ họng, khối u và chấn thương trong tác phẩm “Compendium of Meteria Medica” xuất bản năm 1958 Loài cây này chủ yếu mọc ở các khu vực miền núi phía nam Trung Quốc, do đó ít được đề cập trong các tài liệu tiêu chuẩn của hệ thống y học.

Y học cổ truyền Trung Quốc coi GCL (Giảo cổ lam) là một loại thảo dược quý, có vị ngọt, hơi đắng và tính ấm, với tác dụng bổ âm, trợ dương, chống viêm và tăng cường miễn dịch Hiện nay, GCL thường được sử dụng dưới dạng trà để tăng lực, cải thiện sức bền và giảm mệt mỏi Tại Việt Nam, một số chế phẩm từ GCL đã được đưa vào thị trường, bao gồm trà Giảo cổ lam, viên Giảo cổ lam, viên Curpenin kết hợp GCL với curcumin từ Nghệ vàng, và viên Gylopsin kết hợp GCL với polyphenol từ Chè dây.

NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu, trang thiết bị nghiên cứu

2.1.1 M ẫ u nghiên c ứ u Đối tượng nghiên cứu là phần trên mặt đất của ba loài thuộc chi

- GCL năm lá (Giảo cổ lam, cổ yếm, thư tràng năm lá - Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino) gồm:

+ Mẫu DK-01, DK-02 thu hái tại tỉnh Cao Bằng vào tháng 9 năm 2005 được định danh bởi GS Vũ Văn Chuyên – Trường đại học Dược Hà Nội

+ Mẫu GCL năm lá thu hái tại Sapa, tỉnh Lào Cai vào tháng 3, 4 và tháng

7, 8 năm 2010 Mã số tiêu bản HNIP/1854218 lưu tại phòng tiêu bản của Bộ môn Thực vật, Trường đại học Dược Hà Nội

GCL cuống quả dài (Gynostemma longipes C Y Wu) được thu hái tại Sapa, tỉnh Lào Cai vào các tháng 3, 4 và tháng 7, 8 năm 2010 Mẫu vật mang mã số HNIP/1854318 hiện đang được lưu trữ tại phòng tiêu bản của Bộ môn Thực vật, Trường đại học Dược Hà Nội.

Cổ yếm lá bóng (Gynostemma laxum) được thu hái tại huyện Đà Bắc, tỉnh Hòa Bình vào tháng 7 và 8 năm 2010 Mẫu tiêu bản mang mã số HNIP/1854418 hiện đang được lưu giữ tại phòng tiêu bản của Bộ môn Thực vật, Trường đại học Dược Hà Nội.

Nguyên liệu sau khi thu hái được cắt thành đoạn ngắn, phơi và sấy ở 50 o C tới khô, bảo quản trong túi PE và bao bì kín

Nguyên liệu dùng để chiết xuất được tán thành bột thô

Mẫu đánh giá độc tính cấp được chiết xuất bằng nước theo sơ đồ hình 2.1 Trong quá trình sử dụng, mẫu có thể được cô đặc hoặc pha loãng với nước cất tùy thuộc vào yêu cầu của thí nghiệm, và liều lượng được tính dựa trên số gam dược liệu.

Các mẫu sàng lọc độc tính tế bào là phân đoạn chứa chủ yếu các saponin

SP (sơ đồ hình 2.1 – chiết xuất từ loài G pentaphyllum) và GL3, GL3A, GL3B, GL3C (sơ đồ hình 2.2 – chiết xuất từ loài G longipes)

Hình 2.1 Sơ đồ chiết xuất cao đặc dược liệu 5:1

+ Các hóa chất và thuốc thử dùng trong định tính hóa học đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định của Dược điển Việt Nam

Silica gel is essential in chromatography, with various types available for different applications Notable options include Kieselgel 60, 70-230, and 230-400 mesh from Merck, Germany, and YMC RP-18 30-50 from Fujisilisa Chemical Ltd., Japan Additionally, Sephadex LH-20 25-100 from Supelco and Diaion HP-20 250-850 from Sigma are also widely used in the field.

+ Bản mỏng sắc ký DC Alufolien 60 silica gel F254 (Merck 1.05554.0001) hoặc DC Platen RP18 F254s (Merck 1.15685.0001)

Dung môi như n-hexan, cloroform (CHCl3), methylen clorid (CH2Cl2), ethylacetat (EtOAc), aceton, n-butanol (BuOH), methanol (MeOH) và dimethylsulfoxid (DMSO) đều đạt tiêu chuẩn phân tích theo Dược điển Việt Nam Ngoài ra, cloroform (CDCl3), aceton ((CD3)2CO) và methanol (CD3OD) cũng đạt tiêu chuẩn tinh khiết cho phân tích NMR từ các nhà cung cấp uy tín như Sigma và Merck.

- Thuốc đối chiếu: doxorubicin 98,0 % (HPLC) - Sigma Aldrich (D1515); mitoxantron 97,0 % (HPLC) - Sigma Aldrich (M6545); sulfasalazin 98,0% - Supelco (S0883)

- Động vật thí nghiệm: chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả hai giống khỏe mạnh, trọng lượng 20 g cung cấp bởi Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương

Các dòng tế bào ung thư bao gồm MCF-7 (tế bào ung thư vú), OVCAR-8 và SK-OV-3 (tế bào ung thư buồng trứng), Lu và A549 (tế bào ung thư phổi), HL-60 (tế bào bạch cầu cấp), HT-29 (tế bào ung thư đại tràng) và HepG2 (tế bào ung thư gan) Tất cả các dòng tế bào này được lưu giữ tại ngân hàng dòng tế bào Hàn Quốc tại Seoul.

Lipofectamine LTX from Invitrogen (USA) was utilized along with NF-κB-Luc and PPRE-Luc plasmids provided by ChungNam National University (South Korea) Additionally, TNF-α was sourced from ATgen (Seoul, South Korea), while oligo-dT primers were obtained from Promega The taq polymerase pre-mixture was supplied by TaKaRa (Japan).

TRI Reagent (Sigma Aldrich); β-actin (Thermo Fisher Sciencific, Mỹ); ethidium bromid 95% (Sigma Aldrich)

- Máy ảnh canon D90, kính lúp soi nổi Leica EZ4

- Đèn soi tử ngoại Vilber Lourmat CN6, máy ly tâm Centrifuge Harmonic Series, máy cất chân không Butchi Rotavapor R200, máy hút và nén chân không GAST

Phân tích phổ hồng ngoại được thực hiện dưới dạng viên nén KBr trên máy GX – Perkin Elmer (USA), trong khi phổ tử ngoại được đo bằng máy UV/VIS spectrophotometer Cary IE – Varian (Australia) Đối với phổ khối lượng, máy Agilent 1100 LC – MSD Trap được sử dụng, và phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS được đo trên máy FT-ICR-Mass spectrophotometer Cuối cùng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân được thực hiện trên máy Bruker Advance AM500 FT-NMR tại phòng cấu trúc của Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

- Máy ELISA Thermo Fisher của hãng Thermo Labsystems (Phần Lan), máy đo sáng LB 953 Autolumat (EG&G Berthold, Mỹ)

- Dụng cụ thủy tinh: các loại cột dùng cho sắc ký cột mở đường kính 1cm;

2,2cm; 3cm; 10cm và 15 cm; bình cầu dung tích 25 ml, 50 ml, 250 ml, 500 ml,

1000 ml và 2000 ml; các loại pipet và ống nghiệm thủy tinh sử dụng tại Bộ môn Dược liệu, trường Đại học Dược Hà Nội.

Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Giám đị nh tên khoa h ọ c c ủ a m ẫ u nghiên c ứ u

- Thu mẫu có hoa, quả làm tiêu bản và lưu mẫu tại phòng tiêu bản trường Đại học Dược Hà Nội

- Mô tả bằng phương pháp mô tả phân tích [4]

The study involves the scientific identification of specimens through morphological comparison, utilizing online herbarium samples from various prestigious institutions, including the Herbarium of National Taiwan University (TAI), Muséum National d’Histoire Naturelle (P), Royal Botanic Gardens, Kew (K), New York Botanical Gardens (NY), Botanischer Garten und Botanisches Museum Berlin-Dahlem (B), and the Royal Botanic Garden Edinburgh Herbarium (RBGE), alongside several specialized monographs.

2.2.2 Nghiên c ứ u thành ph ầ n hóa h ọ c 2.2.2.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ Định tính các nhóm chất hữu cơ chính trong các mẫu nghiên cứu bằng phản ứng hóa học theo phương pháp ghi trong tài liệu Dược liệu học tập 1, 2; phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc [12], [16], [24]

2.2.2.2 Chiết xuất và phân lập các hợp chất trong dược liệu

Chiết xuất bằng phương pháp chiết hồi lưu, dùng các dung môi phân cực như methanol, ethanol 70% để thu được tối đa các nhóm chất, tham khảo theo

“Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc” [12]

Phân lập hợp chất từ ba loài GCL được thực hiện bằng phương pháp sắc ký cột mở, sử dụng silica gel pha thuận, pha đảo và sephadex LH20 làm chất hấp phụ Quá trình phân lập được theo dõi thông qua sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao Những phương pháp sắc ký này có những đặc điểm chính đáng chú ý trong nghiên cứu.

+ Cột thủy tinh: đường kính thay đổi (1; 1,5; 2,5 và 15 cm) với chiều dài từ 30 – 100 cm

+ Pha tĩnh: chất hấp phụ được ngâm cho trương nở 2 - 4 giờ (riêng sephadex ngâm 12 – 24 giờ) trong MeOH

Nhồi cột và đưa mẫu lên cột là quá trình quan trọng trong phương pháp nạp cột ướt, trong đó chất hấp phụ được nhồi cột và sử dụng hỗn hợp dung môi làm pha động để rửa giải Mẫu phân lập được đưa lên cột dưới dạng dịch đặc bằng pipet, hoặc đối với silica gel pha thuận, mẫu được phân tán trong silica gel, sau đó làm khô, nghiền mịn và đưa hỗn hợp lên cột.

Quá trình hứng và gom dịch rửa giải diễn ra khi dịch rửa được thu thập bằng ống nghiệm thủy tinh thông qua thiết bị hứng tự động Dịch rửa giải trong các ống được gom lại dựa trên kết quả phân tích từ sắc ký lớp mỏng.

+ Hoạt hóa bản mỏng ở 105 o C trong 60 phút

+ Dùng mao quản đưa dịch chiết các phân đoạn lên bản mỏng, sấy nhẹ

Sau khi thực hiện sắc ký, cần sấy nhẹ hoặc để khô tự nhiên bản mỏng Tiến hành quan sát sắc ký đồ ở hai bước sóng 254 và 366 nm, hoặc phun dung dịch acid sulfuric 10%/EtOH Cuối cùng, sấy nóng bản mỏng ở 105 o C trong 5-10 phút để hoàn thiện quá trình.

* Chiết xuất và phân lập các chất từ G pentaphyllum (Thunb.) Makino

Bột thô GCL năm lá (Gynostemma pentaphyllum) được xử lý bằng cách chia thành nhiều mẻ, chiết tạp chất bằng ether dầu hỏa và sau đó sấy khô để loại bỏ dung môi Tiếp theo, chiết hồi lưu bằng methanol 3 lần Cuối cùng, dịch chiết được dồn lại và bốc hơi ở áp suất giảm, thu được 500 g cao chiết MeOH.

Sử dụng 5 lít EtOH tuyệt đối để lọc bỏ tủa, sau đó cô đặc dịch lọc và rót vào 2 lít aceton để thu được 200 g saponin thô Hòa tan 50 g saponin thô trong butanol tối thiểu, thêm silica gel và trộn đều Loại dung môi bằng máy cất quay cho đến khi đạt dạng bột khô, trơn chảy Phân đoạn bằng cột silica gel theo phương pháp nhồi cột ướt, ổn định cột bằng dung môi rửa giải Đưa bột saponin-silica gel lên cột và rửa giải bằng hệ dung môi CHCl3-MeOH-H2O với tỷ lệ thay đổi theo gradient từ (4:1:0,1 đến 2:1:0,1), thu được sáu phân đoạn từ SP1 đến SP6.

Phân đoạn SP3 (7,5g) được phân lập bằng sắc ký pha đảo với silica gel YMC RP-18, sử dụng dung môi aceton-H2O (1:1,5) Sau đó, cột sắc ký silica gel pha thường với dung môi CHCl3-MeOH-H2O (3:1:0,2) đã thu được các hợp chất SAP5 (21 mg), SAP3 (15 mg) và SAP6 (17 mg), tất cả đều ở dạng bột màu trắng.

Phân đoạn SP4 (6,7 g) tiếp tục phân lập bằng sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi CHCl3-MeOH-H2O (2,5:1:0,25) thu được 3 phân đoạn

Sau khi thực hiện kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, các phân đoạn đã được tách tiếp trên cột YCM RP-18 sử dụng hệ dung môi MeOH-H2O với tỷ lệ 1:1, từ đó thu được ba hợp chất.

SAP4 (25 mg), SAP7 (15 mg) và SAP1 (30 mg)

Hình 2.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ G pentaphyllum

Hợp chất SAP8 (19 mg) và SAP2 (25 mg) đã được phân lập từ phân đoạn SP5 (5,5 g) thông qua phương pháp sắc ký cột pha thường, sử dụng hệ dung môi CHCl3-MeOH-H2O với tỷ lệ 1,5:1:0,3.

* Chiết xuất và phân lập các chất từ G longipes C Y Wu

Hình 2.3 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ G longipes

Bột thô GCL cuống quả dài (Gynostemma longipes C Y Wu) có trọng lượng 0,8 kg và độ ẩm 11,0% được chiết hồi lưu cách thủy bằng methanol nóng ba lần Sau khi dồn dịch chiết và bốc hơi dung môi ở áp suất giảm, thu được 60,0 g cao chiết methanol màu nâu Cao chiết này được phân tán đều trong nước nóng và lần lượt chiết bằng các dung môi CHCl3 và EtOAc, sau đó bốc hơi dung môi để thu được ba phân đoạn GL1 (13g), GL2 (8g) và GL3 (38g).

Phân đoạn GL3 được hấp phụ hoàn toàn trên cột sắc ký diaion HP-20 và được rửa giải bằng các dung môi chứa MeOH với tỷ lệ 0%, 30% và 100%, tạo ra ba phân đoạn GL3A (10,0g), GL3B (12,5g) và GL3C (15,5g).

Cắn GL3C được phân lập qua sắc ký cột silica gel, sử dụng dung môi thay đổi từ CH2Cl2:MeOH (20:1 đến 2,5:1) và kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, cho ra các phân đoạn GL3C1 đến GL3C4 Phân đoạn GL3C3 (3,4g) tiếp tục được tách bằng sắc ký pha đảo silica gel RP18 với dung môi aceton-MeOH-H2O (1:1:1), tạo ra ba phân đoạn GL3C3A, GL3C3B và GL3C3C Phân đoạn GL3C3A được tinh chế bằng sephadex LH-20 với dung môi MeOH-H2O (2:1), thu được hợp chất CGP1 (10,0 mg) Trong khi đó, phân đoạn GL3C3C được phân lập bằng silica gel pha thường với hệ CH2Cl2-MeOH-H2O (6:1:0,1), cho ra hợp chất CGP5.

(14,0 mg) và CGP7 (8,0 mg) (hình 2.3)

* Chiết xuất và phân lập các chất từ G laxum (Wall.) Cogn

Bột thô Cổ yếm lá bóng (Gynostemma laxum) với khối lượng 1,0 kg và độ ẩm 10,2% được ngâm chiết bằng MeOH ở nhiệt độ phòng qua 3 lần Sau khi gộp dịch chiết, dung môi được thu hồi dưới áp suất giảm, tạo ra dịch đậm đặc Tiếp theo, nước cất được thêm vào và lắc đều, sau đó chiết lần lượt với các dung môi n-hexan và EtOAc Kết quả thu được các phân đoạn chiết: n-hexan (GL1 = 20 g), EtOAc (GL2 = 18 g) và nước (GL3 = 50 g).

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Kết quả thẩm định tên khoa học của mẫu nghiên cứu

3.1.1 Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino – GCL n ă m lá

Thu hái mẫu tại vùng rừng thưa, độ cao 800 - 1600 m Quan sát thực địa và phân tích hình thái, mẫu nghiên cứu có đặc điểm sau:

Thân cây mảnh, có góc-rãnh và nhẵn hoặc có lông tơ rải rác Lá kép chân vịt có từ 3 đến 7 lá chét, thường là 5 đến 7 lá chét, với bề mặt có lông tơ hoặc nhẵn Lá chét hình trứng – thuôn hoặc mác, lá chét giữa kích thước 3 – 12 x 1,5 – 4 cm, trong khi lá chét bên nhỏ hơn Cả hai mặt lá chét đôi khi có lông cứng, với 6 – 8 đôi gân bên, gốc lá hẹp dần vào cuống, mép lá khía tai bèo, và đỉnh nhọn hoặc có mũi nhọn ngắn Cuống lá chét dài từ 1 đến 5 mm, trong khi tua cuốn dạng chỉ có 2 nhánh.

Hình 3.1 Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino - GCL năm lá

1- nơi sống; 2- mặt cắt thân; 3- mặt trên lá; 4- mặt dưới lá; 5- hoa cái; 6- hoa đực;

7- cột nhị; 8- cụm quả non; 9, 10- quả già và quả già cắt ngang; 11,12- hạt chín

Hoa đực có cụm hoa chùy với cuống hoa dạng chỉ dài từ 10 – 15 cm, có nhiều nhánh Cuống hoa nhỏ, chỉ từ 1 – 4 mm, và lá bắc hình giùi Ống đài rất ngắn, thùy đài hình tam giác khoảng 0.7 mm với đỉnh nhọn Tràng hoa có màu xanh lá cây nhạt hoặc trắng, thùy tràng hình trứng – mác, kích thước 2,5 – 3 x khoảng 1 mm, với 1 gân và đỉnh nhọn dài Hoa cái có cụm hoa chùy ngắn hơn hoa đực, với đài và tràng tương tự Bầu hoa hình cầu, có 2 hoặc 3 ô, vòi nhụy 3 và núm nhụy 2 thùy, cùng với 5 nhị lép ngắn.

Quả không tự mở, có màu đen khi trưởng thành, hình cầu với đường kính từ 5 đến 6 mm, không có lông và chứa 2 đến 3 hạt Hạt có màu nâu, hình trứng hoặc hình tim, đường kính khoảng 4 mm, dẹt, với hai mặt có nhú, gốc hình tim và đỉnh tù Thời gian ra hoa từ tháng 3 đến tháng 11, trong khi quả xuất hiện từ tháng 4 đến tháng 12.

Sau khi phân tích các đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu và đối chiếu với khóa phân loại của Trung Quốc, mẫu nghiên cứu đã được so sánh với các mẫu lưu tại nhiều phòng tiêu bản, bao gồm Đại học Quốc gia Đài Loan, Royal Botanic Gardens, Kew, New York Botanical Gardens, Herbier Muséum Paris, Royal Botanic Garden Edinburgh Herbarium và Chinese Virtual Herbarium Dựa trên các tài liệu chuyên khảo, mẫu nghiên cứu được xác định là Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino, hay còn gọi là GCL năm lá.

3.1.2 Gynostemma longipes C Y Wu – GCL cu ố ng qu ả dài

Quan sát thực địa và phân tích hình thái, mẫu nghiên cứu có đặc điểm sau:

Hình 3.2 Gynostemma longipes C Y Wu – GCL cuống quả dài

1- cành mang lá; 2- mặt trên lá; 3- mặt dưới lá; 4- cành mang tua cuốn; 5- cành mang cụm hoa cái; 6- cành mang cụm hoa đực; 7,8- hoa cái; 9-quả non; 10- cụm quả trưởng thành; 11- hạt; 12- hoa đực

Cây có thân lông tơ và lá mỏng, với lá kép chân vịt gồm 7 – 9 lá chét Cuống lá kép dài từ 4 – 8 cm, trong đó lá chét giữa có kích thước 5 – 12 x 2 – 4,5 cm, có hình thoi, elip hoặc trứng ngược – mác Gốc lá chét hẹp dần về cuống, mép lá khía tai bèo không đều và đỉnh lá có mũi nhọn ngắn Các lá chét bên nhỏ hơn lá chét giữa, với đỉnh tù, mặt dưới có lông rậm và lông tơ ở gân, trong khi mặt trên có lông tơ rải rác Cuống lá chét dài khoảng 1 cm và tua cuốn mảnh, chia thành 2 nhánh.

Hoa đực có cụm hoa chùy dài từ 10 đến 20 cm, với trục và nhánh có lông tơ Lá bắc hình tuyến dài khoảng 2 mm, cuống hoa dạng chỉ dài khoảng 4 mm Lá bắc con hình tuyến, kích thước khoảng 0.7 mm Thùy đài hình trứng, kích thước 1 x 0,5 mm, nhọn; tràng hoa màu trắng, thùy tràng hình trứng – mác hẹp, kích thước 2,5 x 1 mm, có lông và 1 gân, đỉnh có mũi nhọn dài Hoa cái có cấu trúc tương tự hoa đực, với đài và tràng giống nhau nhưng tràng hình tam giác rộng hơn, bầu hình cầu.

2 ô, mỗi ô chứa một noãn, bề mặt có lông; vòi nhụy 2; núm nhụy chia 3 - 4 thùy

Quả có màu vàng và xanh lục, hình cầu với đường kính từ 6 đến 7 mm, bề mặt nhẵn Cuống quả dạng chỉ, dài từ 15 đến 20 mm Hạt có màu xám nhạt hoặc nâu, hình tim dẹt, kích thước khoảng 3 x 3 mm và dày khoảng 1 mm.

Sau khi phân tích các đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu và đối chiếu với khóa phân loại Trung Quốc, mẫu được so sánh với các tiêu bản tại Royal Botanic Garden Edinburgh Herbarium và Chinese Virtual Herbarium Dựa trên các tài liệu chuyên khảo, mẫu đã được định danh là Gynostemma longipes.

C Y Wu – GCL cuống quả dài; GCL bảy lá

3.1.3 Gynostemma laxum (Wall.) Cogn – th ư tràng th ư a, C ổ y ế m lá bóng

Quan sát thực địa và phân tích hình thái, mẫu nghiên cứu có đặc điểm sau:

Thân cây mảnh, nhiều nhánh, có bề mặt nhẵn hoặc được phủ lông măng rải rác Lá cây có hình dạng chân vịt với 3 lá chét; cuống lá dài từ 1.5 đến 4 cm và nhẵn Lá chét giữa có hình thuôn hoặc hình mác, kích thước 5-10 x 2-3 cm, với gốc hình nêm rộng và đỉnh nhọn hoặc có mũi nhọn ngắn Lá chét bên có hình trứng, kích thước 4-7 x 2-3.5 cm, nhẵn và mép lượn sóng với khía tai bèo; cuống lá chét dài từ 2 đến 7 mm.

Hoa đực: cụm hoa hình chùy, mọc ở đầu cành hoặc nách lá, (5-) 10 – 30 cm, có lông tơ; lá bắc hình giùi – mác, khoảng 1 mm; cuống của hoa hình chỉ,

Cây có lá bắc con hình giùi, nhỏ, và thùy đài hình tam giác – trứng hẹp với kích thước khoảng 0,5 mm Tràng hoa có màu vàng – xanh lá cây, với thùy tràng hình trứng – mác hẹp, kích thước 1,5 x 0,5 mm, bề mặt nhẵn, có 1 gân, nguyên vẹn và đỉnh có mũi nhọn Cụm hoa cái tương tự như cụm hoa đực, với thùy tràng hình tam giác hẹp và bầu hình cầu có đường kính khoảng 1 mm Vòi nhụy có 3 phần, rời nhau và đỉnh chẻ thành 2.

Quả màu vàng – xanh lá cây, hình cầu, 8 – 10 mm, nhẵn, không tự mở

Hạt màu xám nhạt, hình trứng rộng, đường kính khoảng 4 mm, dẹt, cả hai mặt có nhú, gốc tròn, đỉnh nhọn Hoa tháng 7 - 8, quả tháng 8 – tháng 9 (hình 3.3)

Hình 3.3 Gynostemma laxum (Wall.) Cogn – Cổ yếm lá bóng

1,2 - cành mang lá, tua cuốn; 3- cành mang quả; 4- chùm quả; 5- chùm hoa cái; 6- hoa cái; 7- cụm quả non; 8- quả già; 9,10- hoa đực; 11- cột nhị; 12- hạt

Bài viết phân tích các đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu và đối chiếu với khóa phân loại của Trung Quốc, đồng thời so sánh với 15 mẫu lưu tại phòng tiêu bản Chinese Virtual Herbarium Ngoài ra, nghiên cứu còn tham khảo một số tài liệu chuyên khảo để xác định mẫu, kết luận rằng mẫu được định tên là Gynostemma laxum.

(Wall.) Cogn.– thư tràng thưa, Cổ yếm lá bóng, GCL ba lá nhẵn

3.2 Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học của ba loài GCL

3.2.1 Đị nh tính các nhóm ch ấ t h ữ u c ơ b ằ ng ph ả n ứ ng hóa h ọ c

Kết quả định tính các nhóm chất chính trong hai loài Gynostemma longipes và Gynostemma laxum được tổng hợp lại ở bảng 3.1 và bảng 3.2.

Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất chính trong Gynostemma longipes

TT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Kết luận

1 Alcaloid Phản ứng với TT Mayer - Không

Phản ứng với TT Dragendorff - Phản ứng với TT Bouchardat -

2 Flavonoid Phản ứng Cyanidin + Có

Phản ứng với TT diazo +

3 Saponin Hiện tượng tạo bọt +++ Có

Phân biệt hai loại saponin Saponin triterpenoid

4 Anthranoid Phản ứng Borntraeger - Không

5 Glycosid tim Phản ứng Liebermann-Burchard # - Không

6 Coumarin Phản ứng mở đóng vòng lacton - Không

Phản ứng với TT diazo +

7 Tanin Phản ứng với FeCl3 5% + Không

Phản ứng với chì acetat +

Phản ứng với dd gelatin 1% -

8 Chất béo Vết mờ trên giấy lọc - Không

9 Steroid Phản ứng Liebermann-Burchard # + Có

10 Carotenoid Phản ứng với H2SO4 đặc - Không

11 Acid hữu cơ Phản ứng với bột Na2CO3 + Có

12 Acid amin Phản ứng với TT ninhydrin 3% + Có

13 Đường khử Phản ứng với TT Fehling ++ Có

14 Polysaccharid Phản ứng với TT Lugol ++ Có

Ghi chú: (-): âm tính; (+): dương tính; (++): dương tính rõ; (+++): dương tính rất rõ

Bảng 3.2 Kết quả định tính các nhóm chất chính trong Gynostemma laxum

TT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Kết luận

1 Alcaloid Phản ứng với TT Mayer - Không

Phản ứng vơi TT Dragendorff - Phản ứng với TT Bouchardat -

2 Flavonoid Phản ứng Cyanidin +++ Có

Phản ứng với TT diazo ++

3 Saponin Hiện tượng tạo bọt + Có

Phân biệt hai loại saponin Saponin triterpenoid

4 Anthranoid Phản ứng Borntraeger - Không

5 Glycosid tim Phản ứng Liebermann-Burchard # - Không

6 Coumarin Phản ứng mở đóng vòng lacton - Không

Phản ứng với TT diazo ++

7 Tanin Phản ứng với FeCl3 5% ++ Không

Phản ứng với chì acetat +

Phản ứng với dd gelatin 1% -

8 Chất béo Vết mờ trên giấy lọc - Không

9 Steroid Phản ứng Liebermann-Burchard # + Có

10 Carotenoid Phản ứng với H2SO4 đặc - Không

11 Acid hữu cơ Phản ứng với bột Na2CO3 + Có

12 Acid amin Phản ứng với TT ninhydrin 3% + Có

13 Đường khử Phản ứng với TT Fehling ++ Có

14 Polysaccharid Phản ứng với TT Lugol ++ Có

Ghi chú: (-): âm tính; (+): dương tính; (++): dương tính rõ; (+++): dương tính rất rõ

# kết quả định tính bằng phản ứng Liebermann-Burchard khác nhau do chiết xuất bằng các dung môi khác nhau

Kết quả định tính từ bảng 3.2 và bảng 3.3 cho thấy G longipes và G laxum có thành phần hóa học tương đồng, bao gồm flavonoid, saponin, đường khử, acid hữu cơ, acid amin, sterol và polysaccharid Tuy nhiên, G laxum chủ yếu chứa flavonoid với độ dương tính rất cao (+++), trong khi saponin chỉ có độ dương tính thấp (+) Ngược lại, G longipes lại có ít flavonoid (dương tính (+)) nhưng lại chứa nhiều saponin với độ dương tính rất rõ (+++).

3.2.2 Nh ậ n d ạ ng các h ợ p ch ấ t h ữ u c ơ đ ã phân l ậ p đượ c

Từ loài G pentaphyllum (Thunb.) Makino (GCL năm lá) đã phân lập được 8 chất, ký hiệu là SAP1 – SAP8

Từ loài G longipes C Y Wu (GCL cuống quả dài) đã phân lập được 3 chất, ký hiệu là CGP1, CGP5, CGP7

Từ loài G laxum (Wall.) Cogn (Cổ yếm lá bóng) đã phân lập được 9 chất, ký hiệu là E1, E5, GL1, GL2, GL6, GL7B, GL8, GL9, GL10

3.2.2.1 Xác định cấu trúc hóa học các chất phân lập từ G pentaphyllum

H ợ p ch ấ t SAP2 (3β,20S,21-trihydroxydammar-24-en-3-O-α-L-rhamnopyra nosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-α-L-arabinopyranosyl-21-O-β-D- glucopyranosid)

Hợp chất SAP2 thu được dưới dạng bột màu trắng

Phổ ESI-MS cho m/z ở 1061,4 [M-H] - , suy ra M62 tương ứng với công thức phân tử C53H90O21

Phổ 13 C-NMR của SAP2 xuất hiện chủ yếu các tín hiệu thuộc 2 vùng, vùng trường cao là các tín hiệu của phần aglycon và vùng trường trung bình với các tín hiệu có độ dịch chuyển hóa học của C từ 60-107 ppm của các gốc đường

Xem xét các tín hiệu của khung aglycon thấy xuất hiện 7 nhóm methyl dưới dạng singlet tại δH 1,02 (3H, H-18); 0,91 (3H, H-19); 1,69 (3H, H-26);

1,64 (3H, H-27); 1,03 (3H, H-28); 0,87 (3H, H-29); 0,92 (3H, H-30) Đây là điểm đặc trưng của khung chính dammar-24-en trong cấu trúc saponin của loài

Gynostemma pentaphyllum nói riêng và chi Gynostemma Blume nói chung

Sau khi phân tích tín hiệu của phần đường, chất SAP2 có 4 gốc đường với 4 tín hiệu carbon anomer tại δC 104,26 (C-1’), 101,94 (C-1’’), 104,99 (C-1’’’), và 105,09 (C-1’’’’) Các tín hiệu carbon này tương tác với các proton tương ứng tại δH 4,52 (1H, d, J=5,5 H-1’), 5,23 (1H, brs – H-1’’), 4,51 (1H, d, J=7,5 – H-1’’’), và 4,30 (1H, d, J=7,5 – H-1’’’’) trên phổ HSQC Sự hiện diện của gốc đường α-rhamnose được nhận biết qua tín hiệu tại δH 5,23 và tín hiệu doublet của nhóm methyl tại δH 1,24 (3H, d, J=6,5, H-6’’) Giá trị J nhỏ cho thấy cặp proton H-1’’/H-2’’ chiếm vị trí axial, tạo thành liên kết α-glycosid giữa hai gốc đường này Trên phổ HMBC, proton H-1’ (δH).

Kết quả nghiên cứu độc tính cấp

3.3.1 Đ ánh giá độ c tính c ấ p c ủ a G longipes (GCL cu ố ng qu ả dài)

Bảng 3.23 Kết quả đánh giá độc tính cấp của cao đặc G longipes

Số lượng động vật chết (sau 1 tuần)

Số lượng động vật sống (sau 1 tuần)

Thí nghiệm được tiến hành bằng cách cho từng lô chuột nhắt uống cao đặc GCL cuống quả dài với liều lượng tăng dần từ 70 g đến 200 g Sau một tuần, tình trạng của chuột được theo dõi và số lượng chuột nhắt trắng chết trong từng nhóm được ghi nhận.

Nghiên cứu cho thấy, khi sử dụng liều 70 g dược liệu/kg ttc, chuột bắt đầu có biểu hiện giảm vận động và đi ngoài phân lỏng, nhưng không có trường hợp nào tử vong Tuy nhiên, từ liều 80 g/kg ttc trở đi, số lượng chuột chết bắt đầu xuất hiện và tăng dần theo liều lượng, đến liều 200 g/kg ttc thì toàn bộ chuột trong lô 14 đều chết (bảng 3.23) Dựa trên dữ liệu trong bảng, giá trị LD50 được tính toán theo phương pháp Litchfield - Wilcoxon là 119,49 g dược liệu/kg ttc khi sử dụng đường uống.

3.3.2 Đ ánh giá độ c tính c ấ p c ủ a G laxum (C ổ y ế m lá bóng)

Bảng 3.24 Kết quả đánh giá độc tính cấp của cao đặc G laxum

Số lượng động vật chết (sau 1 tuần)

Số lượng động vật sống (sau 1 tuần)

Trong nghiên cứu, chuột được cho uống cao đặc Cổ yếm lá bóng với liều lượng tăng dần từ 20 - 150 g dược liệu/kg thể trọng Kết quả cho thấy không có chuột nào chết và không có biểu hiện ngộ độc ở các lô ban đầu, chuột vẫn sinh hoạt bình thường Tuy nhiên, từ lô 9 trở đi (liều 100 g dược liệu/kg), chuột xuất hiện triệu chứng tiêu chảy, nhưng triệu chứng này biến mất sau 72 giờ ngừng thuốc, và chuột trở lại ăn uống và sinh hoạt bình thường.

Nh ậ n xét: Do không có cá thể chuột nào chết nên không tính được liều

LD50; có thể kết luận dược liệu G laxum (Cổ yếm lá bóng) không thể hiện độc tính cấp đến mức liều 150 g dược liệu/ kg ttc bằng đường uống.

Kết quả nghiên cứu độc tính tế bào trên một số dòng tế bào ung thư

3.4.1 Kh ả o sát độ c tính t ế bào c ủ a các phân đ o ạ n

Các mẫu thử được nghiên cứu bao gồm: (1) phân đoạn SP chứa hỗn hợp saponin thô chiết xuất từ GCL năm lá (G pentaphyllum) theo sơ đồ hình 2.1; (2) phân đoạn GL3 và các phân đoạn con sau khi phân tách qua cột diaion HP-20; (3) GL-3A; (4) GL-3C; (5) GL-3C chiết xuất từ GCL cuống quả dài (G longipes) theo sơ đồ hình 2.2 Kết quả chi tiết được trình bày trong bảng 3.25.

Bảng 3.25 Tỉ lệ % ức chế các dòng tế bào ung thư của các mẫu thử

Các mẫu có khả năng ức chế hơn 50% sự phát triển của tế bào sẽ được tiến hành thí nghiệm tiếp theo để xác định giá trị IC50 Việc xác định IC50 sẽ được thực hiện cho các mẫu GL3C và các mẫu khác.

SP trên cả ba dòng tế bào OVCAR-8, Lu và MCF-7; xác định IC50 mẫu GL3 trên tế bào dòng MCF-7 Kết quả được trình bày ở bảng 3.26.

Mẫu thử GL3C và SP thể hiện độc tính trên cả 3 dòng tế bào nghiên cứu

Mẫu GL3C chiết xuất từ G longipes có giá trị IC50 là 72,65 µg/ml trên dòng tế bào MCF-7, trong khi mẫu saponin toàn phần (SP) chiết xuất từ G pentaphyllum đạt IC50 50,88 µg/ml trên cùng dòng tế bào này.

Bảng 3.26 IC 50 của các mẫu nghiên cứu trên ba dòng tế bào ung thư

Hợp chất IC 50 (àg/ml)

3.4.2 Đ ánh giá độ c tính t ế bào c ủ a các ch ấ t phân l ậ p đượ c

Bảy hợp chất mới từ loài G pentaphyllum (gypVN 1-7) và ba hợp chất từ G longipes (CGP1, CGP5, CGP7) đã được nghiên cứu về tác dụng gây độc trên các dòng tế bào ung thư như HL-60 (ung thư bạch cầu cấp), MCF-7 (ung thư vú), HT-29 (ung thư đại tràng), SK-OV-3 (ung thư buồng trứng) và A549 (ung thư phổi) Kết quả chi tiết được trình bày trong bảng 3.27 và 3.28.

Bảng 3.27 IC 50 của các hợp chất gypenosid VN1-7 trên một số dòng tế bào ung thư

HL-60 A549 HT-29 SK-OV-3 MCF-7

Kết quả ở bảng 3.27 cho thấy chứng dương mitoxantron có tác dụng mạnh trờn tất cả cỏc dũng tế bào thớ nghiệm, IC50 từ 8-12 àM Cỏc hợp chất gypenosid

VN 1-7 thể hiện tỏc dụng (IC50 < 50 àM) trờn hầu hết cỏc dũng tế bào MCF-7, HT-29, A549, SK-OV-3 Đối với dòng tế bào ung thư bạch cầu cấp (HL-60), các hợp chất chỉ có tác dụng yếu

Bảng 3.28 IC 50 của gylongiposid II, III và CGP7 trên một số dòng tế bào ung thư

Theo bảng 3.28, ba hợp chất phân lập từ phân đoạn GL3C là gylongiposid II, gylongiposid III và CGP7 đều cho thấy hiệu quả tích cực đối với các dòng tế bào ung thư thử nghiệm, với tất cả các hợp chất có IC50 < 50 µM Đặc biệt, hợp chất CGP7 thể hiện tác dụng mạnh mẽ nhất đối với dòng tế bào ung thư buồng trứng OVCAR-8, với IC50 đạt 9,8 µM.

Kết quả nghiên cứu tác dụng ức chế NF-κB và chống viêm

Bảy hợp chất phân lập từ G laxum, bao gồm GL-1, GL-2, GL-8, đã được nghiên cứu về tác dụng ức chế NF-κB trong tế bào HepG2 Kết quả cho thấy GL-1, GL-2 và GL-8 có khả năng ức chế đáng kể NF-κB, với mức độ ức chế phụ thuộc vào liều lượng TNF-α Giá trị IC50 của GL-2 là 7,6 ± 0,4 àM, GL-8 là 9,2 ± 0,3 àM và GL-1 là 9,3 ± 0,3 àM Các hợp chất còn lại không có tác dụng hoặc chỉ có tác dụng không đáng kể.

Hình 3.37 Hoạt tính luciferase của các chất phân lập từ G laxum

3.5.2 Tác d ụ ng ch ố ng viêm

Sự kích hoạt NF-κB và cảm ứng phiên mã các chất trung gian gây viêm như iNOS và COX-2 đóng vai trò quan trọng trong quá trình viêm Các hợp chất GL-1, GL-2 và GL-8 đã cho thấy khả năng chống viêm bằng cách ức chế biểu hiện gen iNOS và COX-2 Đặc biệt, GL-2 có tác dụng ức chế đáng kể, trong khi GL-1 và GL-8 chỉ ức chế yếu đối với gen này khi bị kích hoạt bởi TNF-α, và hiệu quả này phụ thuộc vào liều lượng của chất thử.

Hình 3.38 Tác dụng ức chế gen biểu hiện iNOS và COX-2

BÀN LUẬN

Về phân loại các loài trong chi Gynostemma Blume

Dựa trên hệ thống các nghiên cứu về các loài thuộc chi Gynostemma

Blume đã phân loại 17 taxon thuộc 14 loài thực vật xuất hiện tại Trung Quốc, trong đó có 9 loài đặc hữu Tương tự, W.J.J.O De Wilde và cộng sự đã phân loại các taxon ở vùng địa lý sinh học Thái Lan và Malesia, trong đó 7 taxon (bao gồm 3 taxon chỉ có ở khu vực này) được ghép thành các dạng của loài G pentaphyllum Bảng 4.1 cung cấp sự so sánh giữa các quan điểm phân loại khác nhau.

Bảng 4.1 Bảng so sánh hệ thống phân loại chi Gynostemma Blume STT theplantlist.org (WCSP) Flora of China [124] Flora of Thailand [155]

9 G laxum (Wall.) Cogn G laxum (Wall.) Cogn -

G pentaphyllum forma pentaphyllum forma dasycarpum

Ba mẫu nghiên cứu gồm GCL năm lá, GCL cuống quả dài và Cổ yếm lá bóng đã được chụp ảnh và phân tích đặc điểm hình thái Các mẫu này được đối chiếu với khóa phân loại của Trung Quốc và tài liệu chuyên khảo, cũng như so sánh với các mẫu lưu tại các phòng tiêu bản nổi tiếng như Đại học Quốc gia Đài Loan, Royal Botanic Gardens - Kew, New York Botanical Gardens, và Muséum National d’Histoire Naturelle Nhờ sự hỗ trợ chuyên môn của PGS TS Trần Văn Ơn cùng cán bộ phòng tiêu bản Trường đại học Dược Hà Nội, các mẫu đã được giám định đến loài, từ đó cung cấp cơ sở vững chắc cho các công bố về thành phần hóa học, độc tính và tác dụng sinh học Kết quả phân tích hình thái, cùng với ảnh chụp và mô tả chi tiết các đặc điểm hình thái của cơ quan sinh sản và sinh dưỡng, đã góp phần xây dựng dữ liệu cho phân loại thực vật chi Gynostemma Blume tại Việt Nam.

Về thành phần hóa học

4.2.1 V ề k ế t qu ả đị nh tính các nhóm ch ấ t h ữ u c ơ

Nghiên cứu sử dụng các phép thử định tính trên 14 nhóm chất chính cho thấy cả hai loài G longipes và G laxum đều chứa 7 nhóm chất gồm flavonoid, saponin, steroid, acid hữu cơ, acid amin, đường khử và polysaccharid So với loài G pentaphyllum, các thành phần nhóm chất chính trong chi Gynostemma Blume tại Việt Nam có sự tương đồng Tuy nhiên, mức độ phản ứng dương tính với saponin và flavonoid lại khác nhau: G pentaphyllum dương tính rất rõ với cả hai nhóm, trong khi G longipes chỉ dương tính rõ với saponin, và G laxum chỉ dương tính rõ với flavonoid Kết quả này phù hợp với các báo cáo trước đó và nhấn mạnh tầm quan trọng của việc phân biệt các loài Gynostemma khi thu hái và sử dụng.

Bảng 4.2 So sánh nhóm saponin, flavonoid trong ba loài nghiên cứu

Nhóm chất/ aaa aThí nghiệm G pentaphyllum

Kết luận D ươ ng tính rõ saponin và flavonoid

D ươ ng tính rõ saponin

D ươ ng tính rõ flavonoid

4.2.2 V ề k ế t qu ả phân l ậ p các h ợ p ch ấ t Các hợp chất SAP1-8 phân lập từ G pentaphyllum

Từ mẫu G pentaphyllum năm lá, các nhà nghiên cứu đã phân lập được 8 saponin thuộc khung dammaran (SAP1-8), trong đó có 7 hợp chất mới được đặt tên là gypenosid VN1-7 Đặc biệt, một hợp chất 3β,20S,21-trihydroxydammar-24-en 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-α-L-arabinopyranosyl-21-O-β-D-glucopyranosid cũng đã được phân lập lần đầu tiên từ G cardiospemum.

Gypenosid VN1 sở hữu khung aglycon 3β,20β,21-trihydroxydammar-24-en tương đồng với các hợp chất 82-87 Những hợp chất này có cấu trúc tương tự, với sự khác biệt ở phần gốc đường gắn tại vị trí C3 và C21 Đặc biệt, gypenosid VN1 có số lượng gốc đường nhiều nhất trong số đó.

Bảng 4.3 Các hợp chất có cấu trúc 3β,20β,21-trihydroxydammar-24-en 3β,20β,21-trihydroxydammar-24-en STT Tên chất R 1 R 2

87 1 [166] 6-O-acetyl glc(2-1)rha (3-1)xyl glc

Gypenosid VN1 ara(2-1)rha (3-1)glc glc(6-1)glc

Gypenosid VN2 và VN3 được đặc trưng bởi sự hiện diện của nhóm keton C12, với VN3 có cấu trúc đường phức tạp tại vị trí C3, bao gồm 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-β-D-xylopyranosid, điều này chưa từng thấy ở các loài GCL khác Trong khi đó, gypenosid VN4 cũng có nhóm keton C12 nhưng khác biệt với một nhóm OH tại vị trí C25 và sự chuyển dịch liên kết đôi từ C23-24, tạo thành cấu trúc 3β,20β,21,25-tetrahydroxydammar-23-en-12-on.

Cả hai khung aglycon này chưa thấy báo cáo xuất hiện trong các loài thuộc chi

(aglycon của gypenosid VN2, VN3)

Hình 4.1 Aglycon mới của hợp chất gypenosid VN2, VN3 và VN4

Gypenosid VN5 và VN6 là các saponin với cấu trúc vòng 5 cạnh thuộc loại C21-24 So với các hợp chất đã được công bố trong các nghiên cứu trước (214-219), các hợp chất được phân lập trong nghiên cứu này có thêm các nhóm thế tại vị trí C12 và C25.

3β,12β,20S,21β,25-pentahydroxy-21,24R-cyclodammaran (gypenosid VN5) và 3β,20S,21β,25-tetrahydroxy-21,24R-cyclodammaran-12-on (gypenosid VN6) Như vậy đây cũng là hai khung aglycon mới phát hiện trong các loài thuộc chi Gynostemma Blume

Hình 4.2 Aglycon mới của các chất gypenosid VN5, VN6

Gypenosid VN7 là saponin thuộc nhóm 21,23-epoxydammaran, có phần aglycon là (23S)-3β,20β,21β,26-tetrahydroxy-21,23-epoxydammar-24-en (hình 4.3) rất gần với aglycon của các hợp chất 189, 190 và 191 (bảng 1.25)

Hợp chất 190 - phanosid, một loại saponin được chiết xuất từ cây GCL năm lá (G pentaphyllum (Thunb.) Makino) thu hái tại Việt Nam, có khả năng kích thích tiết insulin cả trong môi trường in vitro và in vivo.

Các gypenosid VN1-4 có nhóm thế mạch thẳng tại C17 và được phân loại là bidesmosid, với chuỗi đường gắn tại vị trí C3 và C21 Trong khi đó, gypenosid VN5-7 có nhóm thế đóng vòng tại C17, thuộc loại monodesmosid, chỉ có chuỗi đường ở vị trí C3 Đặc biệt, đa số chuỗi đường gắn tại C3 là α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-α-L-arabinopyranosyl, ngoại trừ gypenosid VN3, trong đó gốc đường α-L-arabinopyranosyl được thay thế bằng β-D-xylopyranosyl.

Như vậy 8 chất phân lập được từ mẫu GCL năm lá thu hái ở Việt Nam là SAP 1-8 đều lần đầu tiên được phát hiện ở loài Gynostemma pentaphyllum

(Thunb.) Makino Trong 8 chất này có 7 chất mới đặt tên là gypenosid VN1-7

Qua tra cứu các tài liệu cho thấy phần aglycon của 6 hợp chất gypenosid VN2-

7 có 5 cấu trúc mới chưa được công bố trong tự nhiên

Các hợp chất CGP1, CGP5, CGP7 phân lập từ GCL cuống quả dài

Từ loài GCL cuống quả dài - Gynostemma longipes C Y Wu, các nhà nghiên cứu đã phân lập được ba saponin, bao gồm hai hợp chất mới mang tên gylongiposid II và gylongiposid III Ngoài ra, một hợp chất đã được công bố trước đó từ loài G pentaphyllum, có tên là (23S)-3β,20ξ,21ξ-trihydroxy-19-oxo-21,23-epoxy dammar-24-en 3-O-[α-L-rhamnopyranosyl(1→2)][β-D-xylopyranosyl(1→3)]-α-L-arabinopyranosid cũng được xác định.

Gylongiposid II là saponin có phần aglycon là 3β,20β,21β-trihydroxy- 21,23α-epoxydammar-24-en tương tự như các hợp chất 189, 190 và 191 (bảng 1.25), chỉ khác nhau ở phần đường tại vị trí C3 Gylongiposid III là saponin có vòng epoxy kép, có khung aglycon mới là 3β,25-dihydroxy-20,24;21,24- diepoxydammar (hình 4.4) Đặc điểm cấu trúc aglycon của gylongiposid III rất gần với aglycon của hợp chất (222) – tên là gynosid E (3β,25-dihydroxy- 20,24;20,12-diepoxydammar) phân lập từ loài G pentaphyllum [95]

Như vậy trong 3 chất phân lập được từ mẫu GCL cuống quả dài là CGP1;

CGP5; CGP7 đều lần đầu tiên được phát hiện ở loài Gynostemma longipes C

Y Wu Hai hợp chất GCP1 (gylongiposid II), CGP5 (gylongiposid III) là chất mới Riêng hợp chất gylongiposid III có phần aglycon mới, đóng vòng kép diepoxy dammaran ít gặp trong tự nhiên

Các hợp chất phân lập từ Cổ yếm lá bóng

From the plant Gynostemma laxum (Wall.) Cogn., nine compounds have been isolated, including three flavonoids: quercetin, ombuin, and rhamnetin-3-O-rutinosid Additionally, four glycosides were identified: 2,4-dihydroxybenzyl-O-α-L-rhamnopyranosid, benzyl-O-β-D-glucopyranosid, benzyl-β-D-xylopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosid, and ethyl-β-rutinosid The analysis also revealed one organic acid, vanillic acid, and one ester, ethyl 3,4-dihydroxybenzoate.

Trong 9 hợp chất phân lập được có 1 hợp chất mới là 2,4- dihydroxybenzyl-O-α-L-rhamnopyranosid và một số hợp chất cũng xuất hiện ở các loài trong chi Gynostemma Blume: hợp chất quercetin từ loài G pentaphyllum [17], [50]; G laxum [118]; G cardiospermum [168]; hợp chất ombuin từ loài G pentaphyllum [17], [50] và acid vanillic từ loài G pentaphyllum [1]

Các kết quả phân lập và nhận dạng cho thấy GCL cuống quả dài (G longipes) chỉ có các saponin, không phân lập được flavonoid; ngược lại mẫu

Cổ yếm lá bóng (G laxum) chỉ chứa flavonoid, glycosid và acid hữu cơ, mà chưa phát hiện saponin Kết quả này phù hợp với các phân tích định tính trước đó, cho thấy rằng thành phần hoạt chất của các loài trong chi Gynostemma Blume là khác nhau Do đó, việc sử dụng thay thế hoặc thu hái nhầm lẫn các loài GCL là không nên.

Nghiên cứu về thành phần hóa học của Gynostemma Blume đã làm phong phú kiến thức về hóa học các hợp chất thiên nhiên, đặc biệt là các loài trong chi này.

Về độc tính cấp và tác dụng sinh học

4.3.1 V ề độ c tính c ấ p Đánh giá độc tính cấp là thông tin đầu tiên thể hiện tính an toàn của dược liệu Qua kinh nghiệm dân gian đã sử dụng làm trà uống hàng ngày [37] và một số nghiên cứu đánh giá độc tính cấp, độc tính bán trường diễn và độc tính trường diễn [34] của dược liệu GCL năm lá (G pentaphyllum (Thunb.) Blume) cho thấy không có độc tính Hai loài GCL cuống quả dài (G longipes C Y Wu) và

Cổ yếm lá bóng (G laxum (Wall.) Cogn.) hiện chưa có thông tin về tính an toàn, do đó việc đánh giá độc tính cấp của hai loài này là rất cần thiết Đây là công bố đầu tiên về độc tính cấp của loài G laxum và G longipes.

Kết quả thí nghiệm đánh giá độc tính cấp của mẫu G laxum (Cổ yếm lá bóng) cho thấy không có tác dụng độc hại nào ảnh hưởng đến hành vi hoạt động tự nhiên, hô hấp và tiêu hóa của chuột Tất cả 14 lô thử nghiệm với liều lượng từ 20 đến 150 g dược liệu/kg ttc đều không ghi nhận trường hợp chuột nào chết, chứng tỏ dược liệu này an toàn cho sức khỏe.

Cổ yếm lá bóng được coi là an toàn khi sử dụng qua đường uống, điều này phù hợp với nghiên cứu về thành phần hóa học của loài G laxum, trong đó flavonoid là thành phần chính thay vì saponin.

Trong thí nghiệm đánh giá độc tính cấp của G longipes (GCL cuống quả dài), chuột thí nghiệm đã cho thấy các triệu chứng như biếng ăn và đi ngoài phân lỏng sau khi uống 70 g dược liệu/kg thể trọng cơ thể Liều thấp nhất gây tử vong cho động vật thí nghiệm là 80 g dược liệu/kg, trong khi liều gây tử vong 100% số chuột là

Dược liệu GCL cuống quả dài có giá trị LD50 là 119,49 g, cho thấy đây là một loại dược liệu ít độc Tuy nhiên, khi thử nghiệm ở liều 70 g dược liệu/kg ttc (tương đương khoảng 6 g/kg thể trọng ở người), hầu hết các cá thể chuột đều gặp tình trạng tiêu chảy Do đó, cần tiến hành các nghiên cứu tiếp theo về độc tính bán trường diễn của loài này Đây là báo cáo đầu tiên ghi nhận độc tính đường uống của một loài trong chi Gynostemma Blume trên chuột.

4.3.2 V ề tác d ụ ng gây độ c t ế bào c ủ a phân đ o ạ n chi ế t và các saponin tinh khi ế t

Nghiên cứu này sử dụng phương pháp MTT để đánh giá độc tính tế bào của các saponin phân lập từ G pentaphyllum và G longipes Phương pháp MTT, được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (NCI) công nhận, là tiêu chuẩn để sàng lọc các chất có khả năng ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt tế bào ung thư trong điều kiện in vitro Các dòng tế bào được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm các dòng tế bào ung thư ở người như HL-60 (ung thư bạch cầu cấp), MCF-7 (ung thư vú), HT-29 (ung thư đại tràng) và SK-OV (ung thư buồng trứng).

Nghiên cứu sử dụng ba dòng tế bào OVCAR-8, A549 và Lu để sàng lọc tác dụng của các phân đoạn, trong đó doxorubicin (50 µg/ml) được dùng làm thuốc đối chứng Doxorubicin, thuộc nhóm anthracyclin, là một thuốc hóa trị liệu hiệu quả trong điều trị nhiều loại ung thư như bạch cầu cấp, carcinoma vú, và ung thư bàng quang Kết quả cho thấy doxorubicin có tỉ lệ ức chế cao (>70%) và IC50 thấp trên các dòng tế bào OVCAR-8, Lu, MCF-7 Hai phân đoạn SP và GL-3C đã được chọn để tiếp tục phân lập; phân đoạn SP chứa saponin phân cực tốt, trong khi GL-3C từ G longipes có độ phân cực kém hơn Để đánh giá độc tính tế bào, nghiên cứu sử dụng mitoxantron, một dẫn chất anthracendion, cho thấy có hiệu quả chống lại nhiều dòng tế bào ung thư như HL-60, MCF-7, HT-29, SK-OV-3, A549, với IC50 ≤ 10 µM.

Các saponin phân lập từ G pentaphyllum (7 chất mới) và G longipes (3 chất) đều thuộc nhóm dammaran và đã được thử nghiệm độc tính tế bào Các hợp chất gypenosid VN1-7 từ G pentaphyllum cho thấy tác dụng gây độc yếu trên dòng tế bào ung thư bạch cầu cấp HL-60 (IC50 > 50 àM), phù hợp với các báo cáo trước đó về độc tính tế bào không ấn tượng của G pentaphyllum Các gypenosid còn lại có tác dụng trung bình trên các dòng tế bào A549, HT-29, MCF-7, SK-OV-3 Đặc biệt, hợp chất CGP7 từ G longipes cho thấy tác dụng gây độc mạnh với tế bào OVCAR-8, gần bằng chứng dương mitoxantron (9,8 àM so với 8,2 àM) Kết quả này cho thấy các gypenosid có khả năng gây độc tế bào trên nhiều dòng tế bào ung thư, như đã được một số báo cáo khác công bố.

Trong 10 gypenosid thử độc tính tế bào được chia thành hai nhóm cấu trúc chính: nhóm có thế mạch thẳng tại C-17 và nhóm có thế đóng vòng tại C-17

Cấu trúc saponin dammaran tại C-17, bao gồm gypenosid VN1, VN2, VN3 và VN4, có hai nhóm OH ở vị trí 20β và 21, trong khi cấu trúc vòng tại C-17 gồm 21,24R-cyclodammaran (gypenosid VN5, VN6) và 21,23-epoxydammar-24-en (gypenosid VN7, gylongiposid II và CGP7) cùng với 20,24;21,24-diepoxydammaran (gylongiposid III) Nghiên cứu cho thấy rằng cấu trúc vòng, đặc biệt là 21,24R-cyclodammaran và 21,23-epoxydammar-24-en, có vai trò quan trọng trong việc gây độc tế bào ung thư Bên cạnh đó, các saponin có cấu trúc mạch thẳng tại C-17 cũng thể hiện tác dụng gây độc đối với tế bào ung thư.

Các gốc đường gắn tại C3 trong phân tử saponin khung triterpenoid đóng vai trò quan trọng trong tác dụng gây độc tế bào ung thư, đặc biệt là gốc đường α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosyl Nghiên cứu cho thấy trong 19 hợp chất glycosid có độc tính tế bào từ G pentaphyllum, có 11 chất mang chuỗi đường này gắn trực tiếp vào C3 Hơn nữa, trong số các saponin có độc tính tế bào, 7/10 chất chứa chuỗi đường 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-α-L-arabinopyranosyl Điều này khẳng định vai trò của nhóm đường α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosyl gắn vào C3 trong việc gây độc tế bào ung thư.

Những phát hiện này là lần đầu tiên công bố tác dụng ức chế tế bào ung thư của saponin chiết xuất từ G pentaphyllum và G longipes được thu hái tại Việt Nam, đóng góp vào việc mở rộng dữ liệu về hiệu quả chống ung thư của các loài trong chi này.

4.3.3 V ề tác d ụ ng ứ c ch ế NF- κ B và ch ố ng viêm

Một số loài thuộc chi Gynostemma Blume đã được sử dụng trong y học cổ truyền Trung Quốc nhờ vào tác dụng long đờm, giảm ho và điều trị viêm phế quản mạn tính Chúng cũng có tác dụng lợi tiểu, hạ sốt và chống viêm Nghiên cứu in vitro và in vivo cho thấy các saponin và hợp chất gypenosid XLIX từ G pentaphyllum có khả năng ức chế NF-κB tại đại thực bào, từ đó cắt đứt con đường gây viêm Ngoài ra, cổ yếm lá bóng (G laxum) cũng được dùng trong dân gian để chữa viêm khí quản, viêm gan và viêm thận Khác với một số loài khác, G laxum không chứa saponin mà chủ yếu có các flavonoid, acid hữu cơ và glycosid.

Các tác dụng sinh học của G laxum và tìm hiểu cơ chế chưa được nghiên cứu

NF-κB là yếu tố phiên mã quan trọng liên quan đến viêm và rối loạn dị ứng, với nhiều gen gây viêm biểu hiện quá mức trong tình trạng viêm Các gen này bao gồm những gen mã hóa cytokine tiền viêm, chemokin, phân tử bám dính và enzym gây viêm như iNOS và COX-2.

Nghiên cứu này tập trung vào vai trò của yếu tố hoại tử khối u alpha (TNF-α) trong việc phosphoryl hóa và phá vỡ proteasom của các protein ức chế I-κB, dẫn đến sự giải phóng NF-κB Các NF-κB tự do sau đó gắn kết với vị trí κB trên ADN, khởi động quá trình phiên mã.

1,0 và 10,0 àM) và chứng dương sulfasalazin 100 nM sẽ thể hiện tỏc dụng ức chế thông qua hoạt độ luciferase