Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học hai loài Stephania Lour. ở Việt Nam.Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học hai loài Stephania Lour. ở Việt Nam.Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học hai loài Stephania Lour. ở Việt Nam.Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học hai loài Stephania Lour. ở Việt Nam.Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học hai loài Stephania Lour. ở Việt Nam.
TỔNG QUAN
VỊ TRÍ PHÂN LOẠI VÀ PHÂN BỐ CHI STEPHANIA LOUR
Chi Stephania Lour được João de Loureiro đặt tên lần đầu tiên vào năm 1790 và đã được nhiều nhà phân loại thực vật nghiên cứu, hoàn thiện qua các thời kỳ, như Hook & Thoms (1855), Benth & Hook (1862), và Miers (1866) Hiện nay, hầu hết các hệ thống phân loại đều xếp chi này vào họ Tiết dê (Menispermaceae) thuộc bộ Hoàng liên (Ranunculales), tuy nhiên, Thorn lại phân loại chi Stephania Lour vào họ Tiết dê nhưng thuộc bộ Hoàng liên gai (Berberidales).
Các nhà khoa học Việt Nam như Nguyễn Tiến Bân [3], [4], Lê Khả Kế [25],
Võ Văn Chi, Dương Đức Tiến, Lê Đình Bích và Trần Văn Ơn đều đồng thuận với hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan (được chỉnh sửa năm 1996), trong đó loại bỏ bậc phân loại phân bộ Menispermineae, và xác định rằng chi Stephania Lour có vị trí cụ thể trong hệ thống này.
Phân lớp Hoàng liên (Ranunculidae)
Chi Stephania Lour có quan hệ họ hàng gần gũi với 2 chi khác là Cissampelos
L và Cyclea Arn Ex Wight do cùng là dây leo, có cuống đính vào phiến lá, bộ nhị có các nhị liền nhau thành một trụ, bao phấn hàn liền thành 1 bệ ngang; khác nhau ở chỗ cụm hoa của chi Stephania Lour là xim tán kép, còn của 2 chi Cissampelos L. và Cyclea Arn Ex Wight là xim tán đơn (hay ngù) [4], [129], [170], [208].
1.1.2 Phân bố của chi Stephania Lour.
1.1.2.1 Phân bố của chi Stephania Lour trên thế giới
Chi Stephania Lour phân bố khắp thế giới trong đó tập trung nhiều ở các nước vùng nhiệt đới, á nhiệt đới như: Trung Quốc (43 loài), Thái Lan (18 loài), Indonesia
Việt Nam có 22 loài, trong khi các nước châu Phi ghi nhận 12 loài Malaysia và Ấn Độ đều có 11 loài, còn Philippin và Papua New Guinea mỗi nước có 8 loài Australia có 7 loài, Myanma và Đài Loan mỗi nước có 5 loài, khu vực Hymalaya có 3 loài, và Campuchia cũng có 3 loài.
Nhật Bản (2 loài), Sri Lanka (2 loài), Lào (2 loài), Đông Timor (1 loài), Quần đảo Solomon (1 loài), Banglades (1 loài), Nepal (1 loài)…
1.1.2.2 Phân bố của chi Stephania Lour tại Việt Nam
Việt Nam có 22 loài Bình vôi, phân bố rộng rãi từ vùng núi cao đến đồng bằng và ven biển Một số loài thậm chí mọc trên bãi cát hoặc gò hoang ven biển, như S pierei Diels Các loài này hiện diện ở cả ba miền, bao gồm miền Bắc với các tỉnh như Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hải Phòng, Hà Nội, Hà Tây, Hòa Bình, Yên Bái, Lào Cai, Thái Nguyên, Tuyên Quang, Phú Thọ, và Hà Giang.
Phân bố của một số loài thuộc chi Stephania Lour tại Việt Nam trải dài từ miền Bắc (Nam Định, Ninh Bình) đến miền Trung (Thanh Hóa, Nghệ An, Lâm Đồng, Đắc Lắc, Ninh Thuận, Quảng Nam, Đà Nẵng, Thừa Thiên Huế, Bình Định, Phú Yên) và miền Nam (An Giang, Đồng Nai, Sông Bé, Bà Rịa-Vũng Tàu) Thông tin chi tiết được trình bày trong Bảng 1.1.
Bảng 1.1 Phân bố một số loài thuộc chi Stephania Lour tại Việt Nam
Stt Tên loài Tên Việt Nam Phân bố TLTK
Bình vôi núi Bình vôi ngắn cao, nhị
Bình Campuchia vôi Đắc Lắc, Lâm Đồng [11],
Hán phòng kỷ, Bình vôi hoa đầu
Quảng Ninh (Cẩm Phả, Hòn Gai), Hòa Bình (Kỳ Sơn)
Củ dòm, củ gà ấp, bình vôi nhựa tím, cà tòm (Tày, Tuyên Quang)
Lào Cai, Yên Bái, Bắc cạn, Thái Nguyên, Sơn La, Hòa Bình, Phú Thọ,
Hà Tây, Bắc Giang, Bắc Ninh, Quảng Ninh
Ngải tượng, củ một, củ thiên đầu thống, củ nghếch, củ mối tròn
Hà Giang, Tuyên Quang, Nam Định,
Hà Nam, Ninh Bình, Cao Bằng, Lạng Sơn,
Stt Tên loài Tên Việt Nam Phân bố TLTK
Dây mối, xạ chen Lào Cai, Hà Tây,
Ninh Bình, Đà Nẵng, Quảng Nam, Ninh Thuận, Lâm Đồng, Đồng Nai
Thiên kim đằng, dây lõi tiền
Hà Nội, Nam Định, Nghệ An, Đồng Nai
Dây mối, Lõi tiền Vùng đồng bằng và núi thấp
11 S kerrii Craib Bình vôi Việt Nam [204]
Bình vôi Quảng Tây, bình vôi
Quảng Ninh, Hà Nam, Ninh Bình, Hà Tây, Lạng Sơn
S longa Lour Lõi tiền, dây lõi tiền rễ dài
Vùng đất thấp từ Cao Bằng, Lạng Sơn tới Thừa Thiên Huế
15 S oblata Craib Bình vôi Việt Nam [204]
16 S pierrei Diels Bình vôi, dây đồng tiền
Bình vôi Lâm Đồng, Thừa
18 S rotunda Lour Bình vôi Tây Nguyên, Bình
S sinica Diels Bình vôi, bình vôi Trung Quốc, củ một Trung quốc, dây lõi tiền bắc
Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hà Tây, Hòa Bình, Hà Nam, Ninh Bình tới Bà Rịa- Vũng Tàu
Phấn phòng kỷ Lào Cai, Yên Bái, Hà
Bắc, Hà Giang, Hà Tây, Quảng Ninh.
Stt Tên loài Tên Việt Nam Phân bố TLTK
Bình vôi đỏ, lõi tiền đỏ
ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CHI STEPHANIA LOUR VÀ HAI LOÀI NGHIÊN CỨU
1.2.1 Đặc điểm thực vật chi Stephania Lour.
Theo các tài liệu, chi Stephania Lour có các đặc điểm chung sau:
Dây leo có thể sống lâu năm hoặc hàng năm, thường có thân mảnh mai với màu sắc đa dạng từ xanh nhạt đến xanh thẫm Thân non thường nhẵn, trong khi thân già có rãnh dọc và mụn cóc sần sùi màu nâu xám hoặc nâu đen Gốc thân phình thành củ với nhiều hình dạng và kích thước khác nhau, từ hình cầu, hình trứng đến hình trụ, có khối lượng từ 0,5-2 kg, nhưng một số loài có thể nặng tới 70 kg hoặc hơn Màu sắc vỏ củ thay đổi tùy thuộc vào loài và điều kiện môi trường, có thể là nhẵn hoặc xù xì với các màu như nâu sáng, xám tro hay đen Thịt củ có thể nạc hoặc lẫn vằn xơ, với màu sắc từ trắng ngà, vàng tươi đến đỏ tươi, tùy theo từng loài.
Lá mọc cách Cuống lá thường mảnh, dài 2(-5)-15(-20) cm, hai đầu phình lên
Cuống lá thường gắn vào phiến lá ở vị trí cách xa mép dưới của gốc lá, với khoảng cách từ 1/15 đến 1/3 chiều dài phiến lá, tùy thuộc vào từng loài Phiến lá có thể mỏng hoặc dày, nhẵn bóng hoặc có lông, với các hình dạng như hình khiên, hình lọng, hình tam giác rộng, hình trứng - tam giác, và mép lá có thể nguyên hoặc chia thùy Gân lá dạng chân vịt gồm 8 đến 12 gân xuất phát từ đỉnh cuống lá Chóp lá có thể nhọn, thuôn nhọn, tù hoặc gần tròn, trong khi gốc lá thường gần tròn, phẳng hoặc hình tim Màu sắc của phiến lá đa dạng, bao gồm xanh nhạt, xanh vàng nhạt, xanh đậm, xanh nâu nhạt, hoặc có đốm tía như ở loài S dielsiana.
Hoa của cây có tính đơn tính khác gốc, với cụm hoa đực và cái thường mọc từ kẽ lá hoặc trên thân cây già không lá (S viridiflavens) Các cụm hoa này có thể có dạng tán đơn, tán kép, xim tán kép, hoặc hình đầu đến tán ngù, thường có cuống và xếp theo kiểu chùm Hoa đực có cấu trúc đối xứng tỏa tròn, với đài 6-8, rời và xếp thành 2 vòng, cánh hoa thường 3 hoặc 4, hình trứng ngược, màu vàng hoặc trắng xanh Nhị thường có 4, tạo thành ống hình trụ, bao phấn dính nhau thành hình đĩa Hoa cái có thể đối xứng hoặc bất đối xứng, thường có đài 1 và cánh hoa 2, bầu hình trứng với 2 lá noãn nhưng chỉ 1 phát triển thành hạt Vòi rất ngắn hoặc không có, núm nhụy từ 4-6 chia thùy ngắn hoặc rách, tạo hình dáng giống như dùi.
Quả hạch có hình gần tròn, hình trứng, hoặc trứng bầu với hai bên dẹt, cuống quả lệch về một phía gần dấu vết nhụy Khi chín, quả có màu vàng đậm hoặc đỏ tươi, bề mặt nhẵn bóng Hạt bên trong quả có hình móng ngựa, trứng dẹt hoặc hơi tròn, với một dải hình móng ngựa gồm 2 hoặc 4 dãy bướu hoặc gờ ngang Đặc điểm hình thái của hạt là dấu hiệu quan trọng để xác định tên loài Cây mầm có lá mầm tương đương với rễ mầm, được bao quanh bởi nội nhũ.
1.2.2 Đặc điểm thực vật của loài Stephania venosa (Bl.) Spreng
Tên đồng nghĩa: Clypea venosa Bl [21], [38], [170]
Tên thường dùng: Bình vôi đỏ [38]
Tên khác: Lõi tiền đỏ [38]
Dây leo có củ với mủ đỏ, củ lớn nổi lên trên mặt đất có đường kính lên tới 40 cm Thân cây màu rơm đỏ, nhẵn và không lông, khi khô chuyển sang màu lục Lá mọc cách, phiến lá hình trứng rộng tam giác, kích thước từ 6-11(-19) x 12(-20) cm, gốc lá hình tim và ngọn lá nhọn hoặc tù, mép lá nguyên hoặc hơi chia thùy Gân lá có màu đỏ, cuống dài từ 6-8 cm Phát hoa xuất hiện ở nách lá với vài tán dày; hoa đực có 6 đài và 3 cánh hoa, trong khi hoa cái có cuống, đài 1 màu cam và 2 cánh hoa Quả hạch hình gần trứng, dẹp nhỏ, hạt hình trứng bầu, dẹt, với 4 hàng gai dọc chiều lưng bụng, mỗi hàng có từ 12-20 gai nhỏ.
1.2.3 Đặc điểm thực vật của loài Stephania viridiflavens H S Lo et M Yang
Tên thường dùng: Bình vôi
Thân cây leo có đặc điểm hơi hóa gỗ, với phiến lá hình tam giác, dài từ 8-15 cm, đôi khi đạt đến 20 cm Chóp lá nhọn hoặc hơi tù, gốc lá gần bằng, có hình tròn hoặc hơi lõm Mép lá có thể nguyên hoặc gợn sóng, và cả hai mặt lá đều không có lông Cuống lá dài hơn hoặc gần bằng phiến lá, khi khô có màu vàng Cụm hoa đực thường mọc sớm ở thân già không có lá, với cuống cụm hoa dài từ 2,5-5 cm, mang 6-8 xim tán tạo thành tán kép Hoa đực nhỏ, có cuống dài khoảng 2 mm, và đài hoa có 6 lá, màu lục nhạt, xếp thành 2 vòng.
THÀNH PHẦN HÓA HỌC CHI STEPHANIA LOUR
Các alcaloid đã phân lập từ các loài trong chi Stephania Lour có thể xếp vào 9 nhóm: benzylisoquinolin, bisbenzylisoquinolin, aporphin, proaporphin, protoberberin, morphinan, hasubanan, stephaoxocan và eribidin.
Các alcaloid thuộc nhóm này có khung chung là benzylisoquinolin, có 13 chất được phân lập từ 7 loài khác nhau
Bảng 1.2 Danh mục các chất thuộc nhóm benzylisoquinolin
Stt Tên chất Loài TLTK
Nhóm bisbenzylisoquinolin bao gồm 47 alcaloid được phân lập từ 14 loài thực vật, trong đó S tetrandra và S erecta mỗi loài chứa 14 chất, còn S cepharantha có 9 chất Một số alcaloid trong nhóm này có giá trị dược lý cao như cepharanthin, tetrandrin và cycleanin.
Bảng 1.3 Danh mục các chất thuộc nhóm bisbenzylisoquinolin
Stt Tên chất Loài TLTK
S brachyandra, S epigaea, S. japonica, S erecta, S pierrei
Nhóm aporphin bao gồm 77 hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc từ 33 loài khác nhau Đặc biệt, một số loài như S venosa có số lượng alcaloid được phân lập đáng kể.
(20 chất), S cepharantha (15 chất), S sasakii (13 chất), S abyssinica (9 chất).
Bảng 1.4 Danh mục các chất thuộc nhóm aporphin
Stt Tên chất Loài TLTK
11 Corydin (C20H23NO4) S lincagensis, S macrantha, S. zippenlianna, S abyssinica, S. dinklagei, S venosa, S. viridiflavens
14 Crebanin (C20H21NO4) S abyssinica, S capitata, S. cepharantha, S dielsiana, S. aculeata, S bancroftii, S. deltifolia, S hainanensis, S. officinarum, S sasakii, S. succifera, S venosa, S. yunnanensis, S zippeliana, S. brachyandra
21 Dicentrin (C20H21NO4) S dinklagei, S cepharantha, S. brachyandra, S dentifolia, S. dicentrinifera, S epigaea, S. mashanica, S pierrei, S. zippeliana, S abyssinica, S. venosa
22 Dicentrinon (C19H13NO5) S abyssinica, S zippeliana, S. dinklagei
32 Isocorydin (C20H23NO4) S cepharantha, S disciflora, S. dolichopoda, S lincagensis, S. macrantha, S officinarum, S. pierrei, S yunnanensis, S. dinklagei, S viridiflavens
36 Liriodenin (C17H19NO3) S sutchuenensis, S sasakii, S dinklagei S venosa
42 Nor-Nuciferin (C18H19NO2) S cepharantha, S sasakii [48]
56 Oxocrebanin (C19H13NO5) S hainanensis, S succifera, S. venosa
59 Oxostephanin (C18H11NO4) S zippeliana, S japonica, S. dielsiana, S venosa
62 Roemerin (C18H17NO2) S lincagensis, S yunnanensis, S. disciflora, S excentrica, s abyssinica, S venosa
67 Stephanin (C19H19NO3) S abyssinica, S aculeata, S. brachyandra, S capitata, S. cepharantha, S bancroftii, S. dielsiana, S epigaea, S. japonica, S kwangsiensis, S. micrantha, S yunnanensis, S. herbacea, S venosa
Nhóm proaporphin có 8 alcaloid đã được phân lập từ 9 loài, trong đó loài S venosa là loài chiết được nhiều alcaloid thuộc nhóm này (5 alcaloid).
Bảng 1.5 Danh mục các chất thuộc nhóm proaporphin
Stt Tên chất Loài TLTK
6 Pronuciferin (C19H21NO3) S cepharantha, S.glabra, S. sasakii, S sutchuenensis
7 Stepharin (C18H19NO3) S aculeata, S glabra, S. bancroftii, S intermedia, S. yunnanensi, S venosa, S. viridiflavens
The protoberberine group comprises 27 alkaloids isolated from 22 species, with notable examples including S glabra (13 alkaloids), S venosa (7 alkaloids), and S intermedia (6 alkaloids) Other species such as S cepharantha, S macrantha, and S succifera also contribute to this group Some of these alkaloids, such as L-tetrahydropalmatin, palmatin, and stepholidin, have been utilized in medicinal applications.
Bảng 1.6 Danh mục các chất thuộc nhóm protoberberin
Stt Tên chất Loài TLTK
2 Corydalmin (C20H23NO4) S glabra, S succifera, yuunanensis, S intermedia, macrantha, S bancroftii, aculeata, S brachyandra, venosa
4 Cyclanolin (C20H24O4N+) S dielsiana, S japonica, tetrandra, S herbacea, cephrantha, S venosa
Stt Tên chất Loài TLTK
14 Palmatin (C20H25N+O4) S glabra, S officinarum, S. succifera, S yunnanensis, S. kwangsiensis, S macrantha, S. cepharantha, S intermedia, S. venosa, S viridiflavens
Stt Tên chất Loài TLTK yunnanensis, S intermedia, S. dielsiana, S brachyandra, S. epigaea, S micrantha, S. viridiflavens, S kwangsiensis, S. bancroftii, S disciflora, S venosa
Nhóm morphinan có 21 alcaloid được phân lập từ 17 loài thuộc chi
Stephania Lour., trong đó loài S cepharantha có nhiều alcaloid (12 alcaloid) được phân lập nhất thuộc nhóm này.
Bảng 1.7 Danh mục các chất thuộc nhóm morphinan
Stt Tên chất Loài TLTK
17 Salutaridin (C19H21NO4) S yunnannensis, S pierrei, S. cepharantha
S cepharantha, S. dielsiana, S dicentrinifera, S. elegans, S epigaea, S glabra,
Nhóm hasubanan có 49 alcaloid, được phân lập từ 11 loài thuộc chi
Stephania Lour., trong đó một số loài có số lượng alcaloid thuộc nhóm này nhiều như: S longa (21 alcaloid), S japonica (13 alcaloid), S abyssinica (10 alcaloid),
Bảng 1.8 Danh mục các chất thuộc nhóm hasubanan
Stt Tên chất Loài TLTK
Các alcaloid nhóm eribidin (dibenzazonin)
Protostephanin (C20H27NO4) phân lập từ loài Stephania japonica [48], [57].
Bảng 1.9 Danh mục ba chất thuộc nhóm stephaoxocan
Stt Tên chất Loài TLTK
Duanyun Si và cộng sự, năm 2001 [164] đã chiết được 2 biflavonoid là stephaflavon A và stephaflavon B từ loài S tetrandra.
Pal Mahesh và cộng sự, 1996 [144] đã chiết được một chất là: 7,4’
Dihydroxyisoflavon-8-C-β-glucopyranosid từ củ loài S glabra.
Hai isoflavonoid là genistein, genistin được tìm thấy trong dịch chiết ethanol từ củ 6 tuổi của Stephania venosa (Bl.) Spreng [84].
Một số chất khác đã được phân lập từ củ của các loài thuộc chi Stephania
Lour Bao gồm: P-hydroxyphenylethylp-coumarat, cinamic acid, β-sitosterol-D- glucose, P- hydroxyphenylethyl ferulat, β-sitosterol (từ S longa [71]), và aloe- emodin (từ S dinklagei [70]).
THÀNH PHẦN HÓA HỌC HAI LOÀI STEPHANIA VENOSA VÀ
1.4.1 Thành phần hóa học loài Stephania venosa (Bl.) Spreng.
Hoạt chất chính trong loài Stephania venosa (Bl.) Spreng là các alcaloid Nghiên cứu toàn cầu đã chỉ ra rằng, từ loài này đã phân lập và xác định được 34 alcaloid, thuộc 3 nhóm khác nhau.
- Nhóm Aporphin (21 chất): Ayuthianin [88], (-)-O-acetyl sukho diamin [148], d-corydin [172], crebanin [67], [114], dehydrocrebanin [67], dicentrin [87], [114],
[111], [160], 4-α-hydroxyushinsunin [61], kamalin [54], [67], liriodenin [68], nantenin [61], O-methylbulbocapnin [139], [191], [193], oxocrebanin [87], oxostephanin [87], oxostephanosin [67], [148], roemerin [61], stephanin [115], [121], sukhodiamin-β-N-oxid [61], sukhodiamin [88], thailandin [64], [67], ushinsunin-β- N-oxid [61], uthongin [87].
- Nhóm Proaporphin (6 chất): (±) N carboxamido stephanin [61], 11,12- dihydrostepharin [61], [67], glaziovin [67], N-methyltetrahydropalmatin [139], O- methylstepharinosin [61], stepharin [61].
- Nhóm Protoberberin (7 chất): Corydalmin, cyclanolin [96], N- methyltetrahydropalmatin [139], L- tetrahydropalmatin [48], [141], [135], palmatin
Nghiên cứu đã phát hiện ra dấu vết của các isoflavonoid genistein và genistin trong dịch chiết từ củ 6 tuổi của cây Stephania venosa (Bl.) Spreng, với nồng độ lần lượt là 8,03 mg và 51,73 mg trên 100 g củ.
Chưa có nghiên cứu nào về phân lập các chất của loài S venosa thu hái tại Bà Rịa – Vũng Tàu (Việt Nam).
1.4.2 Thành phần hóa học loài Stephania viridiflavens H.S Lo & M Yang
Hoạt chất được quan tâm trong loài Stephania viridiflavens H.S Lo & M. Yang là các alcaloid Các nghiên cứu trên thế giới chỉ ra rằng, từ loài Stephania viridiflavens
H.S Lo & M Yang đã phân lập và xác định được 17 alcaloid, thuộc 4 nhóm:
- Nhóm aporphin (6 chất): (+)-6R, 6aS-isocorydin Nβ –oxid, (+)-6R, 6aS- corydin Nβ –oxid, (+)-N-methyl-laurotetanin [200], corydin, isocorydin, xylopinin [199].
- Nhóm benzylisoquinolin (7 chất): orientalin [199] (+)-1S, 2R-laudanidin-Nβ- oxid; (+)-1S, 2S-laudanidin-Nα-oxid; (+)-laudanidin; (+)-reticulin; (+)-1S, 2R- reticulin-Nβ-oxid; (+)-1S, 2S-reticulin-Nα-oxid [199], [201].
- Nhóm Protoberberin (3 chất): jatrorrhizin [67], [77], palmatin, L- tetrahydropalmatin [20], [199].
Tại Việt Nam, nghiên cứu của Vũ Xuân Giang (2003) đã phân lập hai alcaloid từ loài S viridiflavens thu hái tại Sơn La, bao gồm L-tetrahydropalmatin và palmatin Định lượng alcaloid toàn phần trong dược liệu khô đạt 2,92%, trong đó hàm lượng L-tetrahydropalmatin có trong củ là 0,63%.
Củ loài bình vôi, bao gồm S venosa và S viridiflavens, không chỉ chứa alcaloid là thành phần hóa học chính mà còn có tinh bột, đường khử, flavonoid và một số acid hữu cơ.
TÁC DỤNG SINH HỌC VÀ CÔNG DỤNG LOÀI STEPHANIA VENOSA VÀ
1.5.1 Tác dụng sinh học và công dụng loài Stephania venosa (Bl.) Spreng
1.5.1.1 Tác dụng sinh học từ dịch chiết tổng và các phân đoạn tinh chế từ loài Stephania venosa
Loài Stephania venosa (Bl.) Spreng đã được nghiên cứu và cho thấy nhiều tác dụng quan trọng như giảm lo âu, gây độc tế bào, ức chế kết tập tiểu cầu, kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa, kháng viêm, và ảnh hưởng đến cơ quan sinh sản.
Tác dụng giảm lo âu
Nghiên cứu sử dụng dịch chiết ethanol thô từ S venosa trên chuột với liều lượng 5, 10 và 20 mg/kg cân nặng mỗi ngày trong 2 tuần Tác dụng giải lo âu và chống trầm cảm được đánh giá ngay sau khi uống liều đầu tiên, cùng với các thời điểm 1 và 2 tuần sau đó, thông qua các thử nghiệm mê lộ chữ thập nâng cao và thử nghiệm bơi cưỡng bức Kết quả cho thấy chỉ có liều 20 mg/kg cân nặng mang lại tác dụng giải lo âu đáng kể ở tất cả các thời điểm điều trị, trong khi không có tác dụng chống trầm cảm được ghi nhận.
Tác dụng gây độc tế bào
Dịch chiết nước từ Stephania venosa (Bl.) Spreng có khả năng gây độc tế bào, kích thích quá trình apoptosis, đồng thời ngăn chặn sự tăng sinh, xâm lấn và di căn của tế bào.
Dịch chiết nước từ củ S venosa cho thấy hoạt tính gây độc tế bào và kích thích chu trình chết ở cả tế bào lympho bình thường và tế bào lympho từ bệnh nhân ung thư cổ tử cung Sự kết hợp với liều chiếu 0,5 Gy mang lại hiệu quả tối ưu trong việc tăng cường tác động này.
( 60 Co) tia gamma với 300 àg/ml S venosa [111], [151].
Dịch chiết nước cho thấy hoạt tính gây độc tế bào trên các tế bào bạch cầu đơn nhõn trong máu ngoại vi của người (PBMCs), với giá trị IC 50 đạt 300 µg/ml.
Nghiên cứu về dịch chiết nước từ S venosa cho thấy hoạt tính cảm ứng chu trình chết của tế bào PMBCs ở nồng độ 300 àg/ml tương tự như bức xạ 0,5 Gɤ (60 Co) khi so sánh với các tế bào không được điều trị Ngoài ra, dịch chiết này cũng thể hiện hoạt tính chống tăng sinh tế bào với IC50 là 40 àg/ml trong mô hình khảo nghiệm bằng 3 H-thymidine.
Từ dịch chiết nước, ba chất tinh khiết đã được phân lập, bao gồm palmatin, tetrahydropalmatin, và crebanin Palmatin và crebanin thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh mẽ trên dòng tế bào MCF7 với giá trị IC50 khoảng 5-6 µg/ml, trong khi tetrahydropalmatin có hoạt tính yếu hơn Đối với loài tụm biển, palmatin và crebanin cũng cho thấy tác dụng gây độc tế bào rõ rệt với LC50 lần lượt là 74,4 và 29,6 µg/ml Ngoài ra, dịch chiết ethanol từ củ S venosa và một alcaloid aporphin đã được đánh giá cho thấy hoạt tính gây độc tế bào đáng kể trên tế bào ung thư buồng trứng SKOV3, với giá trị ED50 là 31 µg/ml, cho thấy hiệu quả phụ thuộc vào liều lượng.
ED50 đối với tế bào ung thư SKOV3 là 6 àg/ml, cho thấy ảnh hưởng độc tế bào chỉ xảy ra với tế bào ung thư, không ảnh hưởng đến tế bào lành Dịch chiết ethanol cho hoạt tính gây độc tế bào với LC50 là 90,8 àg/ml, trong khi dịch chiết nước có giá trị cao hơn là 184,9 àg/ml, cho thấy hoạt tính giảm 2 lần Ngoài ra, dịch chiết ethanol cũng được thử nghiệm trên dòng tế bào ung thư MCF7 với hoạt tính gây độc tế bào, cho giá trị IC50 là 11,6 àg/ml.
Hoạt tính ức chế kết tập tiểu cầu
Dịch chiết methanol từ củ Stephania venosa (Blume) Spreng cho thấy khả năng chống kết tập tiểu cầu với giá trị IC 50 là 55,9 µg/ml, được xác định qua thử nghiệm ức chế kết tập tiểu cầu do adenosin diphosphat (ADP) trên huyết tương người giàu tiểu cầu (PRP).
Dịch chiết phân đoạn ethanol của củ Stephania venosa (Blume) Spreng cho hoạt tính kháng khuẩn in vitro đối với vi khuẩn Bacillus cereus, Escherichia coli và
Staphylococcus aureus được kiểm tra bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa cho thấy giá trị MIC lần lượt là 0,078; 0,625 và 0,078 mg/ml Trong khi đó, phân đoạn n-hexan thể hiện tác dụng ức chế yếu hơn đối với cả ba chủng vi khuẩn, đặc biệt là với E coli, với giá trị MIC lần lượt là 2,5; > 5,0 và 2,5 mg/ml.
Dịch chiết ethanol từ củ của S venosa cho hoạt động ức chế rõ rệt trên
Artemia sp với LC50 là 260,26 àg/ml Liều gõy độc/liều gõy chết đối với vi khuẩn của dịch chiết là 750 mg/kg [127].
Dịch chiết ethanol từ củ Stephania venosa có tác dụng ức chế nấm Tyrosinase với IC50 1,74 mg/ml trong thử nghiệm với phương pháp Dopachrome [127].
Tác dụng chống oxy hóa
Dịch chiết ethanol từ củ Stephania venosa (Blume) Spreng cho thấy hiệu quả chống oxy hóa với giá trị EC50 là 4,98 mg/ml trong thử nghiệm dọn gốc tự do DPPH Bên cạnh đó, dịch chiết methanol cũng thể hiện khả năng chống oxy hóa tương tự như dịch chiết ethanol, được xác nhận qua các thử nghiệm DPPH và FRAP, đánh giá khả năng giảm hoạt tính chống oxy hóa của sắt.
Khi sử dụng đường uống với liều 250 mg/kg trên chuột, tác dụng kháng viêm được ghi nhận trên mô hình gây phù nề chân chuột bằng carrageenin chỉ sau 1 giờ, đạt hiệu quả 74,3%.
Tác dụng trên cơ quan sinh sản
Nghiên cứu của Theo Gomuttapong và cộng sự cho thấy dịch chiết ethanol 95% từ củ 6 tuổi của loài S venosa (Bl.) Streng không có hoạt tính estrogen trên chuột thử nghiệm qua đường uống, tuy nhiên lại xuất hiện dấu hiệu gây độc, đặc biệt là trên chuột đã cắt buồng trứng với sự gia tăng các chỉ số bạch cầu.
Nghiên cứu cho thấy dịch chiết nước của Stephania venosa có khả năng ức chế rõ rệt thụ thể 5-HT trên noãn bào Xenopus, với giá trị IC 50 lần lượt là 3 và 60 àg/ml khi tế bào trứng được tiêm 5-HT và không tiêm Dịch chiết ở nồng độ 1 àg/ml gây ra sự thay đổi trong đường cong nồng độ phản ứng của 5-HT, trong khi giá trị ED 50 của 5-HT là 0,1 và 1 mM trong mẫu không có và có dịch chiết Hơn nữa, tác dụng ức chế của dịch chiết (0,1 - 1,0 mg/ml) đối với các thụ thể NMDA và glycin thấp hơn so với tác dụng trên thụ thể 5-HT.
1.5.1.2 Tác dụng sinh học của các alcaloid có trong loài Stephania venosa
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng loài Stephania venosa có nhiều tác dụng sinh học đa dạng, bao gồm an thần, gây ngủ, độc tế bào ung thư, tác động tích cực lên hệ tuần hoàn và hô hấp, cũng như khả năng chống viêm, giảm đau, và kháng khuẩn, kháng nấm.
Bảng 1.10 Tác dụng sinh học của một số alcaloid có trong loài S venosa
Stt Chất Tác dụng TLTK
1 Crebanin Tăng cường trí nhớ trong thử nghiệm, ức chế
NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu nghiên cứu là củ, thân, lá, hoa, quả, hạt các cây Bình vôi thu hái tại các địa điểm:
Mẫu M1 được thu hái tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu, với các tiêu bản mẫu cây được lưu giữ tại Phòng tiêu bản của Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội, mang mã số “HNIP/18073/14” Ngoài ra, các mẫu này cũng được bảo quản tại phòng tiêu bản của Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật - Viện khoa học và Công nghệ Việt Nam, với mã số “HV – Thủy 1”.
Mẫu M2 được thu hái tại Văn Chấn - Yên Bái, với các tiêu bản lưu giữ tại Phòng tiêu bản, Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội mang mã số “HNIP/18594/20” và “HNIP/18595/20”, cũng như tại Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật với mã số “HV – Thủy 2” Tại Vườn thực vật Trường ĐH Dược Hà Nội và vườn nghiên cứu Ba Trại - Ba Vì, có 12 cá thể Bình Vôi Bà Rịa – Vũng Tàu và 37 cá thể Bình Vôi Yên Bái được trồng để theo dõi sự phát triển và thu hoạch hoa, quả, hạt từ năm 2014 đến 2019 Các mẫu khác được sử dụng để nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học, với yêu cầu chọn củ có khối lượng nhất định.
2 đến 3 kg, trong thời điểm cây không ra hoa, cân và xác định khối lượng củ trước khi nghiên cứu.
2.1.2 Động vật và các dòng tế bào ung thư thí nghiệm
Chuột nhắt trắng chủng Swiss albino, cả hai giống, trọng lượng 20 ± 2g, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp.
Chuột cống trắng Wistar, giống đực, khỏe mạnh, nặng 120 ± 20g và từ 8-10 tuần tuổi, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, được cung cấp bởi Học Viện Quân Y Những động vật thí nghiệm này được nuôi dưỡng trong điều kiện phòng thí nghiệm ổn định, sử dụng thức ăn tiêu chuẩn từ Viện Vệ sinh Dịch tễ và có nước uống tự do.
5 ngày trước thực nghiệm tại phòng nuôi động vật thí nghiệm của Bộ môn Dược lực, trường Đại học Dược Hà Nội.
AGS cells are human gastric adenocarcinoma cells, while HeLa cells are derived from human cervical cancer HepG2 cells represent human hepatocellular carcinoma, and MCF7 cells are associated with human breast cancer These cancer cell lines are crucial for research in understanding cancer biology and developing targeted therapies.
(human breast carcinoma - ung thư vú ở người) do GS TS J M Pezzuto, Trường Đại học Hawaii và GS Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp.
Các hóa chất, dung môi và thuốc thử đạt tiêu chuẩn phân tích theo Dược điển Việt Nam IV bao gồm n-butanol, cloroform, ethanol, ethylacetat, n-hexan, methanol, kali dihydrophosphat và triethylamin Ngoài ra, oxostephanin được phân lập từ nghiên cứu của Nguyễn Vũ Minh, và L-tetrahydropalmatin là chất chuẩn do Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương cung cấp với mã số WS 0316141.01, có độ tinh khiết 96,16% và công thức hóa học C21H25NO4.
Các chất sử dụng trong nghiên cứu tác dụng sinh học:
The study utilized various reagents and compounds, including Trolox and Ellipticine from Sigma Aldrich, ascorbic acid from Fisher, and trypsin Additionally, it incorporated thiobarbituric acid (TBA), FeSO4, and hydrogen peroxide (H2O2) for experimental purposes Fetal bovine serum (FBS) was sourced from GIBCO and Invitrogen, while Sulforhodamin B (SRB) and trichloroacetic acid (TCA) were obtained from Sigma and Fisher Acetic acid was sourced from Merck, and DPPH was also acquired from Sigma Aldrich, ensuring a comprehensive set of materials for the research.
-Quercetin chất chuẩn, độ tinh khiết 94,37%, mã QT104 111016, do Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp.
- Indomethacin chất chuẩn, đạt tiêu chuẩn phân tích do Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung Ương cung cấp.
-Prednisolon dạng viên nén 5mg sản xuất bởi công ty cổ phần NAHAPHARM Số đăng kí VD-16472-12, hạn sử dụng 04/05/2022.
- Dung môi pha mẫu cao toàn phần dược liệu: Dimethyl sulfoxid do công ty Kanto Chemical Nhật Bản sản xuất, Cat.no 10378 – 01, Lot No 701B1131.
- Viên bông khối lượng 20±2 mg đã tiệt trùng.
- Đệm phosphat hoặc đệm KCl.
-Carrageenin (Carragenan sodium salt, a naturally occurring polysaccharid) của hãng Sigma Aldrich, lọ 250 gam.
2.1.4 Máy móc, thiết bị và dụng cụ nghiên cứu
Bộ dụng cụ nghiên cứu thực vật bao gồm các thiết bị phân tích hoa, kính lúp, bộ dụng cụ cắt và tẩy nhuộm tiêu bản, cùng với kính hiển vi điện tử Kruss từ Đức và kính hiển vi soi nổi Leica EZ4 từ Mỹ Ngoài ra, tủ sấy cũng là một phần quan trọng trong quá trình nghiên cứu.
- Nghiên cứu hóa học: Bộ chiết Soxhlet 250ml; Buret; Các dụng cụ thủy tinh
Trong lĩnh vực nghiên cứu và phân tích, các thiết bị như cốc có mỏ và bình định mức đóng vai trò quan trọng Máy lắc siêu âm Ultrasonic LC 60H và máy nghiền dược liệu DF-4 là những công cụ không thể thiếu Bộ sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao Camag, bao gồm máy phun mẫu bán tự động Camag Linomat 5 và máy triển khai sắc ký Camag ADC 2, giúp tối ưu hóa quy trình phân tích Đặc biệt, máy chụp ảnh bản mỏng và phần mềm phân tích Camag TLC Visualizer, cùng với hai phần mềm winCATS và VideoScan, hỗ trợ trong việc đánh giá dữ liệu hiệu quả Bản mỏng silicagel 60 F254 từ Merck, máy cất quay và máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu (VKNTTW, HHC) là những thiết bị bổ sung quan trọng cho quá trình nghiên cứu và phát triển.
Vào tháng 1 năm 2020, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã sử dụng một loạt thiết bị hiện đại cho nghiên cứu Cột Phenomenex Germini C18 (250 x 4,6 mm; 5µm) được áp dụng để phân tích mẫu Mỏy đo điểm chảy Kofler micro-hotstage hỗ trợ xác định tính chất vật lý của hợp chất Đặc biệt, máy ghi phổ khối lượng AGILENT 1100 LC – MSD Trap với công nghệ phun mù điện tử Electron Spray Ionization Mass Spectrometry (ESI-MS) đã được sử dụng để phân tích thành phần hóa học Cuối cùng, máy ghi phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance AM500 FT-NMR, với chất chuẩn nội là tetramethyl silan, đã giúp xác định cấu trúc phân tử của các hợp chất nghiên cứu.
Máy xét nghiệm sinh hóa Screen – Master của hãng Hospitex Diagnostic (Italy) được sử dụng để nghiên cứu tác dụng sinh học, cùng với các thiết bị như pipette Eppendorf, cân phân tích, và máy đọc ELISA 96 giếng của Bio-Rad Ngoài ra, kính hiển vi điện tử giúp quan sát vi thể thận, trong khi máy Plethysmometer No 7250 của Ugo-Basile (Italy) được sử dụng để đo độ phù chân chuột.
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Nghiên cứu về thực vật
2.2.1.1 Mô tả đặc điểm hình thái 2 loài nghiên cứu
Tiến hành quan sát và mô tả đặc điểm hình thái của thực vật, cũng như điều kiện sinh trưởng và phát triển của cây tại thực địa Thu hái và làm tiêu bản mẫu cây, đồng thời chụp ảnh và lưu giữ tiêu bản để nghiên cứu Sử dụng kính hiển vi soi nổi EZ4 để phân tích, chụp ảnh và mô tả các đặc điểm của các bộ phận sinh sản như hoa, quả và hạt.
2.2.1.2 Giám định tên khoa học các mẫu nghiên cứu
Giám định tên khoa học của cây được thực hiện thông qua việc phân tích đặc điểm hình thái và bộ phận sinh sản, sử dụng kính hiển vi soi nổi Leica EZ4 tại Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội Các bước chính trong quá trình giám định bao gồm việc thu thập mẫu, quan sát hình thái, và phân tích cấu trúc sinh sản để xác định tên khoa học chính xác.
- Dựa trên khóa phân loại chi Stephania Lour của Thực vật chí Trung Quốc
[129], Nguyễn Chiều (Việt Nam) [14] và thực vật chí Thái Lan [170], so sánh với các đặc điểm thực vật đã mô tả để sơ bộ xác định loài.
- So sánh với tiêu bản lưu trữ và các tài liệu phân loại thực vật [12], [14], [78],
[129], [170], [176], [207], [208] cùng với sự giúp đỡ của các chuyên gia phân loại thực vật để kết luận tên khoa học của loài.
2.2.1.3 Xác định đặc điểm vi học 2 loài nghiên cứu
Nghiên cứu vi phẫu của thân, cuống lá và lá của hai loài thực vật đã được thực hiện bằng phương pháp cắt tẩy nhuộm kép và tạo tiêu bản qua phương pháp giọt ép, từ đó thu được các tiêu bản vi phẫu dược liệu Vị trí cắt vi phẫu được lựa chọn kỹ lưỡng để đảm bảo độ chính xác và tính đại diện của mẫu nghiên cứu.
- Thân: Chọn đoạn thân bánh tẻ, khoảng lóng thứ 4 tính từ ngọn lá, vị trí cắt không được sát mấu.
- Cuống lá: Chọn cuống lá của lá bánh tẻ, vị trí cắt ở khoảng giữa của cuống lá.
- Lá: Chọn lá bánh tẻ, kích thước trung bình, vị trí cắt ở khoảng 1/3 (về phía cuống lá) giữa vị trí cuống lá gắn vào phiến lá và mép lá.
Dược liệu được sấy khô và nghiền mịn từ củ và lá của hai loài nghiên cứu, sau đó được rây qua sàng 355 Tiếp theo, tiêu bản được tạo ra bằng phương pháp giọt ép, cho ra các tiêu bản bột dược liệu chất lượng.
Quan sát các đặc điểm, mô tả và chụp ảnh các tiêu bản dưới kính hiển vi Kruss tại Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội [26], [39], [42].
2.2.2 Nghiên cứu về thành phần hoá học
2.2.2.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học Định tính các nhóm chất hữu cơ trong dược liệu bằng các phản ứng hóa học theo tài liệu [19] và [28]. Định tính bằng sắc ký lớp mỏng
Tiến hành định tính bằng sắc ký lớp mỏng bột củ hai loài nghiên cứu theo quy trình sau đây:
Để chiết xuất, cân chính xác 2,0 g bột dược liệu và ngâm trong dung môi MeOH Sau 24 giờ, chuyển toàn bộ hỗn hợp vào bình chiết ngấm kiệt, liên tục bổ sung dung môi và rút dịch chiết với tốc độ 20 giọt/phút Kiểm tra chiết kiệt alcaloid theo phụ lục 12.3 - Dược điển Việt Nam IV Dịch chiết thu được sẽ được cô đặc đến cắn và hòa tan trong 100 ml MeOH để tạo thành dung dịch chấm mẫu.
- Chuẩn bị mẫu chuẩn: Pha các dung dịch chuẩn L-tetrahydropalmatin và oxostephanin có nồng độ 0,03 mg/ml (đối chứng).
- Khảo sát điều kiện sắc ký lớp mỏng:
+ Pha tĩnh: Sử dụng bản mỏng silicagel 60 F254 của hãng Merck Trước khi chấm, bản mỏng được hoạt hóa ở 110 o C trong 1 giờ.
+ Pha động: Khảo sát một số hệ dung môi khai triển Lựa chọn hệ dung môi thích hợp cho hiệu năng tách tốt nhất.
+ Chấm sắc ký: Chấm sắc ký bằng máy Linomat 5 Khảo sát thể tích tiêm mẫu và chiều dài băng chấm mẫu phù hợp.
Để triển khai sắc ký, đặt bản mỏng vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi và đậy kín Sau đó, để yên và quan sát quá trình tách cho đến khi vết dung môi cách mép trên khoảng 2 cm, rồi lấy ra và đánh dấu đường dung môi Cuối cùng, để bản mỏng khô tự nhiên trong tủ hốt Đừng quên quan sát và chụp ảnh bản mỏng sắc ký dưới ánh sáng trắng cũng như ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm.
Dựa vào khả năng phân tách của hệ pha động và kích thước Rf của các vết, chúng ta có thể đưa ra kết luận sơ bộ về các vết trong dịch chiết cũng như so sánh với vết chuẩn đối chứng.
2.2.2.2 Chiết xuất và phân lập các hợp chất trong dược liệu
Chiết xuất các hợp chất từ dược liệu được thực hiện bằng phương pháp ngâm chiết với hỗn hợp MeOH : H2O theo tỷ lệ 85 : 15 ở nhiệt độ phòng trong 3 lần, mỗi lần 24 giờ Sau đó, các hợp chất được chiết phân bố bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần Việc phân lập các chất trong từng phân đoạn được thực hiện thông qua cột sắc ký silicagel pha thường, pha đảo và sephadex LH 20 Độ sạch của các hợp chất được kiểm tra sơ bộ bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng, quan sát dưới ánh sáng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm, và sử dụng thuốc thử Dragendorff để hiện màu sắc ký lớp mỏng.
2.2.2.3 Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập
Để xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập, cần dựa vào các chỉ số như điểm chảy, [αD], và các phương pháp phân tích hiện đại như phổ khối (MS), GC-MS, phổ khối phân giải cao (HR-MS), cùng với cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều Việc đối chiếu với các tài liệu đã công bố cũng là một yếu tố quan trọng trong quá trình này.
2.2.2.4 Định lượng alcaloid toàn phần và L-tetrahydropalmatin trong 2 mẫu nghiên cứu Định lượng alcaloid toàn phần bằng phương pháp acid – base Định lượng alcaloid toàn phần trong củ của hai loài nghiên cứu theo Dược điển Việt Nam III [8] Định lượng 5 lần, lấy kết quả trung bình. Định lượng L-tetrahydropalmatin Định lượng L-tetrahydropalmatin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), dựa theo phương pháp trong chuyên luận Bình vôi - DĐVN V [22].
2.2.3 Thử độc tính cấp và đánh giá tác dụng sinh học
Trong nghiên cứu độc tính và tác dụng sinh học, mẫu cao thử được chuẩn bị bằng cách cắt nhỏ củ hai mẫu nghiên cứu, sấy khô ở 55 o C đến hàm ẩm dưới 10%, sau đó xay thành bột thô và xác định hàm ẩm Tiến hành chiết xuất bằng phương pháp chiết ngấm kiệt với dung môi ethanol 70%, ngâm trong 24 giờ, với tốc độ chảy 1ml/phút và tỷ lệ dược liệu 20:1 Dịch chiết ethanol được gộp lại, sau đó cô thu hồi dung môi bằng dụng cụ cất quay đến cao 1:1, tiếp theo cô trên nồi cách thủy với công suất 800W cho đến khi đạt thể chất cao đặc và xác định khối lượng cao thu được Thông tin chi tiết về mẫu cao được trình bày trong Bảng 2.1.
Bảng 2.1 Thông tin mẫu cao chuẩn bị để thử độc tính và đánh giá tác dụng
Mẫu thử Mã cao Loài
Liều dùng quy đổi theo cao
Liều cao dùng quy đổi Chuột nhắt Chuột cống
Bình vôi thu hái tại
4,5548 g dược liệu khô tuyệt đối
Bình vôi thu hái tại Văn Chấn – Yên Bái
5,5520 g dược liệu khô tuyệt đối
Các mẫu cao thử được hòa tan trong DMSO với tỷ lệ 1g cao/1,5 ml DMSO và siêu âm ở 30°C trong 20 phút để đảm bảo tan hoàn toàn Sau đó, hỗn dịch được phân tán trong NaCMC 0,8% với các nồng độ phù hợp Động vật được cho uống hỗn dịch chế phẩm thử qua kim đầu tù theo các liều thử nghiệm đã thiết kế Chế phẩm thử sau khi pha chế được bảo quản ở tủ lạnh ở nhiệt độ 8°C.
Nghiên cứu về độc tính cấp và xác định LD50 trên chuột nhắt trắng được thực hiện bằng phương pháp Litchfield – Wilcoxon, theo hướng dẫn của WHO và tài liệu của Đỗ Trung Đàm, Đoàn Thị Nhu Nghiên cứu này được tiến hành tại Bộ môn Dược lực, Trường Đại học Dược Hà Nội.
Trước khi tiến hành thí nghiệm, chuột được nhịn ăn qua đêm và chia thành các lô 10 con Các mẫu thử được cho chuột uống với liều tăng dần để xác định liều thấp nhất gây chết 100% chuột và liều cao nhất không gây chết chuột Theo dõi tình trạng chung của chuột và các dấu hiệu nhiễm độc như nôn, co giật, kích động, cùng số lượng chuột chết trong vòng 72 giờ sau khi uống thuốc Tất cả chuột chết được mổ để đánh giá tổn thương đại thể, từ đó xây dựng đồ thị tuyến tính xác định LD50 Tiếp tục theo dõi tình trạng chuột đến hết ngày thứ 7 sau khi uống thuốc.