TỔNG QUAN
VỊ TRÍ PHÂN LOẠI, ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ PHÂN BỐ CỦA CHI
Sự phân nhóm của họ Lycopodiaceae và chi Huperzia Bernh vẫn chưa đạt được sự thống nhất Trước đây, tất cả các loài đều được xếp vào chi Lycopodium L ngoại trừ loài Phylloglossum drummondii Kunze Gần đây, các nghiên cứu về phát sinh loài, đặc điểm hình thái và phân tử đã chỉ ra rằng chi Lycopodium L cần được thu hẹp và phân chia thành nhiều chi nhỏ với những quan điểm khác nhau.
Theo hệ thống phân loại thực vật của Illgaard (1987), được công nhận rộng rãi trên toàn cầu, chi Huperzia Bernh có vị trí phân loại cụ thể trong hệ thống này.
Chi Huperzia Bernh Ở Việt Nam, theo tác giả Phạm Hoàng Hộ (1999) [10], họ Thông đất phân bố ở Việt Nam có 3 chi gồm: Lycopodiella Holub., Lycopodium L và Huperzia Bernh
1.1.2.1 Đặc điểm chung của chi Huperzia Bernh
Cây thảo thường phát triển trên mặt đất, đá, hoặc sống ký sinh trên cây gỗ lớn trong rừng rậm Rễ cây có khả năng xuyên qua lớp vỏ thân cây, lớp mùn đất, và đá, tạo thành các chùm rễ chia nhánh đều hoặc không đều, mọc thẳng đứng hoặc buông thõng Điểm giao giữa thân và cành thường xuất hiện các hành con sinh dưỡng, một đặc điểm đặc trưng của một số loài trong chi này.
Lá đơn phân và lưỡng phân có thể xếp chồng lên nhau hoặc không, và đôi khi chứa bào tử, hoặc tất cả các lá có thể chụm lại thành hình hoa thị như ở Huperzia drummondii.
Lá bào tử có hình dáng tương tự như lá dinh dưỡng, nhưng thường nhỏ hơn và mang màu sắc đặc trưng, không có chùy rõ ràng Chúng có hình thẳng hoặc hình mác, mỏng, có thể nguyên vẹn hoặc có răng ở mép Túi bào tử có hình dạng thận hoặc tròn, mọc đơn lẻ tại nách lá bào tử và khi vỡ sẽ chia thành hai mảnh Bào tử có rãnh nhỏ lõm về phía trung tâm.
1.1.2.2 Đặc điểm của các loài thuộc chi Huperzia Bernh ở Việt Nam
Theo Phạm Hoàng Hộ (1999) [10] và Võ Văn Chi (2012) [5], chi Huperzia
Bernh ở nước ta có 11 loài a) Huperzia cancellata (Spring) Trevis (Tên đồng nghĩa: Phlegmariurus cancellatus (Spring) Ching, Phlegmariurus cancellatus var minor Ching, Urostachys cancellatus (Spring) Herter ex Nessel)
Cây thảo phụ sinh có thân thõng, dài tối đa 40 cm, với cấu trúc lưỡng phân 2-4 lần Thân cây có đường kính khoảng 2 mm và được bao phủ bởi lá Lá cây có hình dáng mập, nhọn, dài từ 3-4 mm và rộng 0,75 mm Chùy xuất hiện ở chốt nhánh, hẹp hơn phần không thụ, với lá bào tử dài khoảng 1,5 mm Bào tử nang có hình tròn và nở thành hai mảnh bằng nhau Cây còn được biết đến với tên khoa học Huperzia carinata (Poir.) Trevis, đồng nghĩa với Lycopodium carinatum.
(Desv ex Poir.) Trevis., Phlegmariurus carinatus (Desv ex Poir.) Ching, Urostachys carinatus (Desv ex Poir.) Herter ex Nessel)
Cây thảo phụ sinh có thân rãnh, treo thõng, dài từ 35-50 cm và phân nhánh từ 1-4 lần Lá của cây xếp xoắn ốc, không có cuống, có hình dáng dùi nhọn, dài và hướng lên trên Hoa nằm ở ngọn cành, không phân nhánh, với các lá bào tử tương tự như lá thường nhưng ngắn và rộng hơn Túi bào tử có hình thận, nở thành hai mảnh bằng nhau Cây còn được biết đến với tên khoa học Huperzia chinense (Christ.) Ching, có tên đồng nghĩa là Lycopodium chinense.
Cây thảo mọc thành bụi nhỏ, cao từ 10-15 cm, với thân hình trụ có đường kính 1-1,5 mm và 1-2 lần lưỡng phân Lá cây hẹp, mọc vòng, dài 4-7 mm, rộng 1 mm, nhọn và có mép uốn xuống, gắn đứng vào thân Túi bào tử nằm ở nách lá gần ngọn, có hình thận và nở thành hai mảnh bằng nhau.
5 d) Huperzia fordii (Baker) R.D Dixit (Huperzia fordii (Baker) Holub)
Cây thảo phụ sinh có chiều cao từ 30-40 cm, với thân lưỡng phân rộng 2-3 mm Lá của cây dài từ 7-10 mm và rộng đến 4 mm, có mép uốn xuống mà không có răng, gắn thẳng vào thân Bông lá bào tử xuất hiện ở đầu nhánh, có hình dáng hẹp và dài, với kích thước túi bào tử là 1,7 mm chiều rộng và 1,2 mm chiều cao Loài cây này rất giống với một số loài khác trong cùng họ.
Huperzia serrata về dạng cây, kích thước và sinh thái, chỉ khác ở mép lá không có răng
[5], [17] e) Huperzia hamiltonii (Spring) Trevis (Tên đồng nghĩa: Lycopodium hamiltonii (Spring) Trevis., Phlegmariurus hamiltonii var petiolatus (C.B Clarke) Ching)
Cây thảo phụ sinh có thân đứng hoặc thõng, dài tới 50 cm, chia nhánh lưỡng phân với đường kính khoảng 1,5 mm Lá của cây trải ra, có chiều dài từ 6-15 mm và rộng 3-5 mm, bề mặt bóng Phần sinh sản nằm ở nửa trên của thân, với lá bào tử tương tự như lá thường nhưng kích thước nhỏ hơn, túi bào tử có hình thận và nở thành hai mảnh bằng nhau Cây còn được biết đến với tên đồng nghĩa là Huperzia obovalifolia (Bon.) hay Lycopodium obovalifolium.
Cây thảo phụ sinh có thân dài từ 20-30 cm, với 2-3 lần lưỡng phân Lá cây xoắn ốc, hình xoan dài khoảng 1 cm, thường nằm sát vào thân, với gân giữa rõ ràng Chùy của cây dài 15 cm và có 1-2 lần lưỡng phân Bào tử diệp nhỏ, hình tròn, nở thành hai mảnh bằng nhau Cây còn được biết đến với tên khoa học Huperzia phlegmaria (L.) Rothm., và có các tên đồng nghĩa như Lycopodium phlegmaria (L.) Rothm., Phlegmariurus phlegmaria (L.) Holub, và Phlegmariurus phlegmaria (L.) U Sen & T Sen.
Cây thảo phụ sinh có thân thõng, dài từ 30-100 cm, 1-4 lần lưỡng phân, to 3 mm
Lá xoan tam giác có kích thước rộng nhất ở gốc, dài từ 6-13 mm và gắn thẳng vào thân Chùy ở ngọn nhánh có thể dài đến 16 cm, trong khi lá bào tử nhỏ dài khoảng 1 mm, tương đương với kích thước của túi bào tử Túi bào tử nở thành hai mảnh bằng nhau Huperzia salvinoides (Herter.) Alston là một trong những loài tiêu biểu.
Cây thảo phụ sinh có thân lưỡng phân đều với đường kính khoảng 1 mm Lá cây nhỏ, sắp xếp theo 4 hàng, có hình xoan dài 1 mm, dày và cứng, gần như không có cuống Lá chia đôi ở ngọn nhánh, hẹp và đi kèm với lá bào tử nhỏ Nang bào tử có hình tròn, tự mở thành hai mảnh bằng nhau.
6 i) Huperzia serrata (Thunb.) Trevis (Lycopodium serratum (Thunb.) Trevis.,
Huperzia serrata f intermedia (Nakai) Ching, Huperzia serrata f longipetiolata
Cây Huperzia squarrosa (Forst.) Trevis, còn được biết đến với các tên đồng nghĩa như Lycopodium squarrosum và Phlegmariurus squarrosus, là loại thảo mọc cao từ 15-40 cm, với thân hình trụ, đường kính khoảng 2 mm, có thể đơn hoặc lưỡng phân 1-2 lần Lá cây có hình bầu dục, mũi mác, dài 15 mm, rộng 3 mm, tương đối mỏng với gân giữa rõ ràng và mép có răng Túi bào tử nằm ở nách lá, giống như lá thường, có hình thận và màu vàng tươi.
Cây thảo phụ sinh có thân dài từ 30-70 cm, với 1-2 lần lưỡng phân và đường kính khoảng 4-5 mm Lá của cây hẹp, nhọn và thường đứng, có bìa nguyên Chùy dài xuất hiện ở chốt nhánh, trong khi lá bào tử không khác biệt nhiều so với lá thường, chỉ nhỏ hơn một chút Bào tử nang có hình thận và nở thành hai mảnh không bằng nhau.
THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CHI HUPERZIA BERNH
Chi Huperzia Bernh là chi lớn nhất trong họ Lycopodiaceae, dẫn đến nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của nó Các hợp chất được phân lập có cấu trúc đa dạng, bao gồm các nhóm chính như alcaloid, triterpenoid, flavonoid, glycosid và tanin Trong số đó, alcaloid và triterpenoid với cấu trúc serratan là những thành phần hóa học chiếm ưu thế trong các loài thuộc chi này.
Alcaloid được phân lập từ chi Huperzia Bernh thường có cấu trúc khung gồm 16 carbon, nhưng cũng có thể lên đến 32 carbon do dimer hóa hoặc ít hơn 16 carbon do phân tách liên kết Chúng thuộc về các khung quinolizin, pyridin hoặc α-pyridon với hệ thống vòng đặc biệt, thường có công thức phân tử C16N hoặc C16N2 với 3 hoặc 4 vòng Ayer W.A (1994) đã phân loại các alcaloid lycopodium thành bốn lớp cấu trúc: lớp lycopodin, lớp lycodin, lớp fawcettimin và các lớp khác.
Hệ thống đánh số carbon cho các alcaloid dựa trên giả thuyết di truyền học của Conroy năm 1960, cho rằng các alcaloid hình thành từ hai đơn vị 2-propylpiperidin Cầu nối giữa C-4 và C-13 tạo thành bộ khung lycodan, trong khi vòng A thường bị oxy hóa thành vòng pyridin hoặc pyridon Sự chuyển dịch C-1 từ Nα sang Nβ dẫn đến khung lycopodin, và sự chuyển dịch liên kết giữa C-4 với C-13 sang C-4 với C-12 tạo thành bộ khung fawcettimin Gần đây, một số alcaloid với bộ khung mới đã được phân lập từ các loài thuộc chi Huperzia Bernh.
1.2.1.1 Lớp lycopodin Đây là lớp có số lượng lớn nhất và phân bố rộng rãi nhất trong số các lycopodium alcaloid đã biết Lycopodin alcaloid 1-55 (Bảng 1.2.) đã được phân lập từ các loài H serrata, H selago, H miyoshiana, H chinense, H saururus, H lucidulum, H phlegmaria, H sieboldii, H yunnanensis, H fargesii, H carinata, H squarrosa, H tetrasticha và H goebelii Lớp này được đặc trưng bởi bốn vòng sáu cạnh liên kết với nhau, vòng A và C tạo thành hệ thống vòng quinolizidin, liên kết C = C có thể tồn tại ở vị trí C-11 và C-8 Các vị trí C-5, C-6, C-8, C-10 và C-12 thường bị oxy hóa thành nhóm carbonyl và hydroxyl hoặc bị este hóa bởi acid acetic và acid dihydroferulic; nhóm carbonyl trong vòng B thường ở vị trí C-5, tuy nhiên nó có thể được tìm thấy tại C-6, chẳng hạn như trong huperzin E (14), F (15) và O (17) đã được phân lập từ H serrata
[113] Ngoài ra, nguyên tử nitơ có thể bị oxy hóa thành N-oxid, như trong lycopodin N- oxid và 15α-methyl lycopodin-5β, 6β-diol N-oxid [200]
Hình 1.1 Cấu trúc hóa học khung của alcaloid lớp lycopodin
Bảng 1.2 Các alcaloid lớp lycopodin phân lập từ chi Huperzia Bernh
STT Tên hợp chất Loài TLTK
Các hợp chất từ 56-81 (Bảng 1.3.) là lycodin alcaloid phân lập từ các loài H serrata, H selago, H saururus, H chinense, H phlegmaria, H lucidulum, H carinata,
H fordii, H squarrosa, H fargesii và H henryi Lớp này cũng có bốn vòng, trong đó vòng B, C, D tương tự như lycopodin alcaloid, riêng vòng A có biến đổi tạo thành vòng pyridin hoặc pyridon [113] Huperzin A (59), huperzinin (64) là những sản phẩm của việc tách liên kết N/C-9 và loại bỏ C-9, cho một khung C15N2 với ba vòng Carinatin A
(77) có cấu trúc đặc biệt, trong đó liên kết C-4 đã bị phá vỡ, C-4 liên kết với C-12 tạo thành một hệ thống vòng 5/6/6/6 mới [200]
Hình 1.2 Cấu trúc hóa học khung của alcaloid lớp lycodin
Bảng 1.3 Các alcaloid lớp lycodin phân lập từ chi Huperzia Bernh
Các alcaloid 82-147 (Bảng 1.4) thuộc về lớp fawcettimin, được coi là sản phẩm của sự di chuyển liên kết C-4/C-13 thành liên kết C-4/C-12 từ các tiền chất là lớp
STT Tên hợp chất Loài TLTK
72 8α-hydroxy-15,16-dehydro-des-N- methyl-α-obscurin H serrata [109]
15 lycopodin, C-13 thường bị oxy hóa để tạo nhóm hydroxyl hoặc tạo thành liên kết C = C với C-14 [113], [200]
Hình 1.3 Cấu trúc hóa học khung của alcaloid lớp fawcettimin
Bảng 1.4 Các alcaloid lớp fawcettimin phân lập từ chi Huperzia Bernh
STT Tên hợp chất Loài TLTK
1.2.1.4 Các alcaloid khác Đây là lớp gồm các alcaloid không thuộc 3 lớp trên, đại diện cho nhóm này là phlegmarin Trong cấu trúc của các alcaloid này, C-4 không liên kết với C-12, C-13 và thường chỉ có 3 vòng trừ huperzin V (154), lucidin A (156), oxolucidin A (161), lucidin
B (157), oxolucidin B (162) là có cấu trúc khung C27N3 với 6 vòng [113]
Hình 1.4 Cấu trúc hóa học khung các alcaloid khác Bảng 1.5 Các alcaloid khác phân lập từ chi Huperzia Bernh
STT Tên hợp chất Loài TLTK
Ngoài các alcaloid đã biết, một số alcaloid khung mới đã được phân lập từ chi Huperzia Bernh, bao gồm hupercumin A (C38N4) với cấu trúc gồm 2 vòng octahydroquinolin, 1 vòng decahydroquinolin và 1 vòng piperidin, và hupercumin B (C27N3) với cấu trúc tương tự nhưng thiếu 1 vòng decahydroquinolin Thêm vào đó, 4β-hydroxynankakurin B cũng được phân lập từ loài H phlegmaria.
Những nghiên cứu về các phân đoạn khác ngoài alcaloid (“non alkaloid”) cho thấy thành phần triterpenoid có cấu trúc serraten chiếm ưu thế trong các loài thuộc chi
Huperzia Bernh., ngoài ra cũng phân lập được một số diterpenoid [154], [176]
Serraten là nhóm hợp chất triterpenoid đặc trưng với cấu trúc 5 vòng và 7 nhóm methyl gắn với carbon bậc 3, nổi bật với vòng carbon 7 cạnh Chúng thường có liên kết đôi giữa C-14 và C-15, trong khi các vị trí C-3 và C-21 có thể bị oxy hóa thành nhóm hydroxyl hoặc ester hóa bởi acid acetic và cinnamic Ngoài ra, các vị trí C-24, C-29 và C-30 cũng có khả năng oxy hóa thành hydroxyl, với C-24 có thể tiếp tục oxy hóa để tạo acid cacboxylic Liên kết C=C tại C-14 có thể được hydrat hóa thành nhóm hydroxyl Nhóm hợp chất này lần đầu tiên được phát hiện ở các loài dương xỉ và cây lá kim thuộc họ thông.
Serratenediol là một triterpenoid đặc trưng với cấu trúc serraten, bao gồm vòng 7 carbon và 7 nhóm methyl, được phân lập lần đầu từ loài Thạch tùng răng cưa (H serrata) vào năm 1964 Nhiều nghiên cứu sau đó đã phát hiện ra sự hiện diện của nhiều triterpenoid khác trong các loài thuộc chi Huperzia Bernh., đặc biệt là từ loài H serrata.
Bảng 1.6 Các triterpenoid phân lập được từ chi Huperzia Bernh
STT Tên hợp chất Loài TLTK
178 21β-Hydroxy-serrat-14-en-3α-yl acetat H phlegmaria [194]
181 21α-Hydroxyserrat-14-en-3β-yl acetat H phlegmaria [154]
183 21α-Hydroxyserrat-14-en-3β-yl propanedioic acid monoester
208 21α-hydroxy-serrat-14-en-3β-yl dihydrocoumarat
209 21α-hydroxy-serrat-14-en-3β-yl p- dihydrocaffeat
210 21α -hydroxyserrat-14-en-3α-yl propanedioic acid monoester
211 3α,2lα-dihydroxy-serrat-14-en-24-oic acid
214 16-oxo-21β-hydroxyserrat-14-en-3α-yl acetat
216 16-oxo-3α-hydroxyserrat-14-en-21β-ol H serrata [36]
222 3α,2lβ-dihydroxy-serrat-14-en-24,29-diol H serrata [36]
223 3α,2lβ-dihydroxy-serrat-14-en-24-ol H serrata [36]
224 3β,2lα-Dihydroxy-serrat-14-en-24-ol H serrata [36]
225 3β,2lβ-Dihydroxy-serrat-14-en-24-ol H serrata [36]
227 3β,2lβ-Dihydroxy-serrat-14-en-29-ol H serrata [36]
228 3β-Hydroxy-serrat-14-en-21-on H serrata [36]
237 Serrat-14-en-3β,21α-diyl-acetat H miyoshiana [176]
Cho đến nay, một số diterpenoid được phân lập từ các loài thuộc chi Huperzia Bernh bao gồm: Margocilin (239) được phân lập từ loài H phlegmaria [200], (15R)-
12, 16-epoxy-11, 14-dihydroxy-8, 11, 13-abietatrien-7-on (240) và acid 3β- hydroxysandaracopimaric (241) được phân lập từ loài H serrata [201]
1.2.3 Các nhóm hợp chất khác
Ngoài các hợp chất alcaloid và terpenoid, các hợp chất tự nhiên khác như flavonoid, glycosid, đường khử và tanin cũng đã được xác định trong các loài thuộc chi Huperzia Bernh Nghiên cứu của Yang Y.B và cộng sự (2008) đã phát hiện flavon 5,5’-dihydroxy-20,40-dimethoxyflavon-7-O-β-D-(6’’-O-Z-p-coumaroyl)-glucopyranosid trong loài H serrata.
Cấu trúc hóa học của các hợp chất từ 1-242 phân lập từ chi Huperzia Bernh được trình bày ở Phụ lục 02.
TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CHI HUPERZIA BERNH
Nghiên cứu dược lý in vitro và in vivo đã chỉ ra rằng các alcaloid từ chi Huperzia Bernh có hiệu quả trong điều trị các bệnh liên quan đến hệ tim mạch, thần kinh-cơ, và hoạt tính enzym cholinesterase Những alcaloid này cũng có tác động tích cực đến khả năng học tập và trí nhớ Trong số đó, huperzin A nổi bật với tác dụng vượt trội.
Nghiên cứu đã chỉ ra rằng 22 loài thuộc chi này có chứa alcaloid và một số hợp chất terpenoid, được phân lập và chứng minh có khả năng gây độc tế bào.
1.3.1 Tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase
Trong các alcaloid được chiết xuất từ loài Huperzia Bernh., lớp lycodin thể hiện hoạt tính ức chế AChE vượt trội hơn so với các alcaloid khác Những hợp chất nổi bật có khả năng ức chế AChE bao gồm huperzin A, huperzin B, N-methylhuperzin B, sieboldine A và huperzinin, trong đó huperzin A là chất mạnh nhất và được nghiên cứu nhiều nhất Huperzin A được xem là một chất ức chế acetylcholinesterase mạnh, có tính chọn lọc và tác dụng ức chế butylcholinesterase yếu So với các thuốc tổng hợp như tacrin, donepezil, rivastigmin và galantamin, huperzin A và ZT-1 (chất bán tổng hợp của nó) cho thấy hiệu quả ức chế acetylcholinesterase tốt hơn, thời gian tác dụng dài hơn, sinh khả dụng đường uống cao hơn và ít độc hại hơn Thứ tự tác dụng ức chế acetylcholinesterase (IC50) của huperzin A so với các chất khác là donepezil> huperzin A> tacrin> physostigmin> galantamin> rivastigmin.
Nghiên cứu về tác dụng ức chế enzyme AChE không chỉ tập trung vào các chất tinh khiết mà còn mở rộng sang các cao chiết từ các loài thuộc chi Huperzia Những kết quả này cung cấp cái nhìn sâu sắc về khả năng ức chế AChE của các hợp chất tự nhiên, góp phần quan trọng trong việc phát triển các phương pháp điều trị liên quan đến bệnh Alzheimer và các rối loạn thần kinh khác.
Kết quả nghiên cứu của Bernh đã chỉ ra rằng nhiều loài thực vật có khả năng ức chế enzyme AChE hiệu quả, với giá trị IC50 được xác định và được trình bày trong Bảng 1.7.
Bảng 1.7 Tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase của cao chiết một số loài trong chi Huperzia Bernh
STT Tên loài Cao chiết Giá trị IC 50
STT Tên loài Cao chiết Giá trị IC 50
Nghiên cứu cho thấy cao chiết alcaloid toàn phần từ các loài thuộc chi này có tác dụng ức chế enzyme AChE mạnh hơn so với cao chiết methanol hoặc ethanol Cụ thể, nghiên cứu của Garcia và cộng sự (2017) chỉ ra rằng, mặc dù H cuernaquvacensis và H linifolia không chứa huperzin A, nhưng cao chiết alcaloid của chúng vẫn cho thấy hiệu quả ức chế AChE đáng kể, với các giá trị tương ứng là 0,74 ± 0,05 và 4,2 ± 1,24 àg/ml Điều này cho thấy rằng các hợp chất khác ngoài huperzin A cũng có thể là nguồn cung cấp chất ức chế AChE tiềm năng.
1.3.2 Tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh Đã có nhiều nghiên cứu về ảnh hưởng trên bộ nhớ và khả năng bảo vệ tế bào thần kinh của huperzin A Theo đó, huperzin A giúp cải thiện trí nhớ trên chuột thí nghiệm bị suy giảm nhận thức [110] Nó làm giảm sự chết các tế bào thần kinh gây ra bởi độc tính của glutamat [155], cải thiện trí nhớ, bảo vệ tế bào thần kinh vỏ não chống lại sự chết tế bào theo chương trình (apoptosis) gây ra bởi các mảng amyloid 25-53 và chống lại tác động gây độc tế bào bởi các gốc tự do [18], [143], làm yếu sự suy giảm nhận thức và chấn thương sau khi bị thiếu oxy, thiếu máu cục bộ trên não ở chuột [187] Tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh của huperzin A thông qua tác dụng hoạt hóa thụ thể nicotinic của hệ cholinergic Thông qua thụ thể này, huperzin A hoạt hóa yếu tố NF-κB, do đó làm giảm quá trình tổng hợp NO, enzym cyclooxygenase-2, thúc đẩy khả năng sống sót của dòng thế bào ung thư thần kinh đệm ở chuột Cũng trên cơ chế này, huperzin A làm
Liều 0,1 mg/kg có tác dụng giảm quá trình phá hủy mạch thần kinh do stress oxy hóa và rối loạn chức năng mạch máu não, từ đó cải thiện chức năng mạch não ở chuột.
Huperzin A có tác dụng đối kháng trên thụ thể N-methyl-D-aspartat và dòng kali, điều này có thể góp phần vào hiệu quả bảo vệ tế bào thần kinh Nghiên cứu đã chỉ ra rằng tác dụng này kéo dài trong 8 tuần liên tục.
Nghiên cứu của Odorcyk F.K và cộng sự (2017) đã chỉ ra rằng cao chiết alcaloid từ loài H quadrifariata có tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh Cụ thể, khi sử dụng liều 10 mg/kg trên chuột sơ sinh, cao chiết này có khả năng ngăn chặn suy giảm nhận thức do thiếu máu não cục bộ Phân tích mô học cho thấy cao chiết giúp giảm tổn thương mô ở hồi hải mã bằng cách giảm số lượng tế bào chết và số lượng tế bào T thâm nhập.
1.3.3 Tác dụng chống oxi hóa
Tổn thương oxy hóa do gốc tự do là một trong những nguyên nhân chính gây ra các bệnh thoái hóa thần kinh như Alzheimer và Parkinson Chất chống oxy hóa được coi là tác nhân quan trọng trong việc tiêu diệt gốc tự do, giúp bảo vệ não khỏi những tác hại này Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra mối liên hệ giữa nguy cơ thoái hóa thần kinh và tình trạng chống oxy hóa, nhấn mạnh vai trò thiết yếu của chất chống oxy hóa trong việc ngăn ngừa các bệnh lý liên quan.
Huperzin A đã được chứng minh có tác dụng chống oxy hóa bằng cách tăng cường hoạt động của các enzym như superoxid dismutase (SOD), catalase (CAT) và glutathion peroxidase (GSH-Px), đồng thời giảm nồng độ malondialdehyd (MDA), từ đó nâng cao khả năng sống sót của tế bào u ưa crôm ở chuột trước tác nhân oxy hóa hydrogen peroxid và các mảng peptid β-amyloid Nghiên cứu của Gao X và cộng sự (2009) cho thấy huperzin A không chỉ ức chế các mảng peptid β-amyloid mà còn ngăn ngừa phồng ti thể và gia tăng các phản ứng oxy hóa ở nồng độ thấp.
Nghiên cứu của Czapski G.A và cộng sự (2014) chỉ ra rằng một số phân đoạn alcaloid được chiết xuất từ loài Huperzia selago có hiệu quả trong việc bảo vệ sức khỏe.
Nghiên cứu cho thấy các đại phân tử có khả năng bảo vệ khỏi stress oxy hóa, với chỉ số bắt gốc tự do DPPH giảm tới 59% ở nồng độ 25 µg/ml Các phân đoạn alcaloid đã chứng minh hiệu quả chống oxy hóa lipid và protein trong mô não chuột đồng, giảm 20% và 76% tổn thương do sắt/ascorbat Phân tích bằng sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC-DAD) và phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS) cho thấy các alcaloid chứa lycodin, lycoposerramin G và 8β-hydroxylycoposerramin K có tác dụng chống oxy hóa, trong khi các phân đoạn khác không chứa các hợp chất này Huperzin A có tác dụng chống oxy hóa không phải do bắt gốc tự do trực tiếp Nghiên cứu của Bùi Thanh Tùng và cộng sự (2017) chỉ ra rằng phân đoạn ethylacetat từ H squarrosa có tác dụng chống oxy hóa mạnh nhất với IC50 là 9,35 ± 1,68 µg/ml, trong khi các phân đoạn ethanol, n-hexan và butanol có hiệu quả yếu hơn với các giá trị IC50 tương ứng là 26,91 ± 1,27 µg/ml, 83,70 ± 1,12 µg/ml và 16,21 ± 1,47 µg/ml Phân đoạn ethylacetat tiếp tục được nghiên cứu và cho thấy khả năng làm giảm nồng độ oxy hóa.
MDA, làm tăng hoạt độ của các enzym chống oxy hóa (SOD và GSH-Px) trong não chuột [179]
Stress oxy hóa là nguyên nhân chủ yếu gây ra viêm mạn tính, được gọi là “viêm lão hóa”, liên quan đến quá trình lão hóa và tuổi tác Các chất ức chế AChE đã được chứng minh là có khả năng tăng cường dẫn truyền cholinergic và đóng vai trò như tác nhân chống viêm trong các trường hợp này.
ĐỘC TÍNH CỦA CÁC LOÀI THUỘC CHI HUPERZIA BERNH
Nghiên cứu về độc tính của hợp chất huperzin A cho thấy nó gây ít tác dụng phụ hơn các chất ức chế AChE khác như physostigmin và tacrin, với liều LD50 trên chuột lần lượt là 4,6 mg (đường uống), 3 mg (tiêm dưới da), 1,8 mg (tiêm màng bụng) và 0,63 mg (tiêm tĩnh mạch) Nghiên cứu của Ma X.C và cộng sự (2003) chỉ ra rằng huperzin A làm tăng thể tích gan và enzym gan (AST và ALT) nhưng không thay đổi cấu trúc mô học của gan, điều này khác với tacrin Tương tự, nghiên cứu của Zangara và cộng sự (2003) không phát hiện sự thay đổi ở gan, thận, tim, phổi hay não của động vật sau khi sử dụng huperzin A trong 180 ngày Không có biến đổi gen hay quái thai được ghi nhận với liều 0,019 đến 0,38 mg/kg tiêm màng bụng ở chuột và 0,02 đến 0,2 mg/kg tiêm bắp ở thỏ Ngoài huperzin A, một số hợp chất khác từ chi Huperzia Bernh cũng được nghiên cứu, với liều LD50 của lycopodin, obscurin, annotinin lần lượt là 27,58 ± 1,16; 99,17 ± 11,29 và 114,6 ± 2,94 mg/kg khi tiêm tĩnh mạch trên chuột.
Nghiên cứu của Nguyễn Duy Tài và cộng sự (2013) đã xác định LD50 của cao chiết ethanol từ hai loài Thạch tùng răng cưa (H serrata) và Thạch tùng râu rồng (H squarrosa) khi uống trên chuột, với giá trị lần lượt là 5,33 g/kg và 1,71 g/kg.
CÔNG DỤNG TRONG Y HỌC CỔ TRUYỀN CỦA CÁC LOÀI THUỘC
Các loài trong chi Huperzia Bernh có mặt rộng rãi trên toàn cầu, đặc biệt là ở các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới, và chúng đã được công nhận với nhiều công dụng khác nhau.
Tại Trung Quốc, các loài thuộc chi Huperzia Bernh đã được sử dụng lâu dài trong y học dân gian để điều trị nhiều bệnh như nhiễm trùng, căng thẳng, sưng, tâm thần phân liệt, nhược cơ và ngộ độc phốt pho hữu cơ, với công dụng cụ thể được liệt kê trong Bảng 1.8.
Bảng 1.8 Công dụng trong y học cổ truyền Trung Quốc của các loài thuộc chi Huperzia Bernh
TT Tên loài Công dụng trong y học cổ truyền
(Spring) Ching Toàn cây dùng điều trị sốt thấp khớp [117]
Toàn cây được dùng để chữa sốt thấp khớp, điều trị đau khớp, thắt lưng, chân, tay, chấn thương, giải độc khi bị sưng
Ching Được dùng để trị đau khớp xương, phong thấp tê liệt, còn bào tử của nó thì được dùng chữa lở ngoài da
(Ching) Ching Toàn cây được sử dụng điều trị lao phổi [117]
Toàn cây được dùng làm thuốc giảm sưng đau do rắn cắn
(Herter) Ching Toàn cây dùng điều trị sốt thấp khớp [117]
R.D Dixit Được dùng toàn cây để trị phong thấp, viêm khớp xương, đòn ngã tổn thương và viêm cột sống phì đại, hạ sốt, giải độc
Toàn cây dùng điều trị sốt thấp khớp
(Spring.) Trevis Được dùng trị sốt cao, đau đầu, ho, ỉa chảy, thũng độc, đòn ngã tổn thương và rắn cắn
Toàn cây được dùng hạ sốt, giải độc, giảm đau tay chân, đau khớp, đau do ngã
Toàn cây được dùng làm thuốc giảm sưng đau do rắn cắn
TT Tên loài Công dụng trong y học cổ truyền
Toàn cây được sử dụng hạ sốt, giải độc, giảm đau tay chân, đau khớp, đau do ngã
Toàn cây được dùng làm thuốc điều trị nhiễm trùng, căng thẳng, sưng đau
(L.) Rothm Được dùng làm thuốc trị đau họng, thủy thũng, đòn ngã tổn thương
Toàn cây được dùng làm thuốc chữa đòn ngã tổn thương, chấn thương gân và chảy máu
Toàn cây được dùng làm thuốc chữa đòn ngã tổn thương, chấn thương gân và chảy máu
Thunb.) Trevis là một loại thảo dược được sử dụng phổ biến trong điều trị các bệnh liên quan đến tim mạch và hệ thần kinh cơ Nó có tác dụng hỗ trợ trong các tình trạng như sốt, bầm máu, căng thẳng, tiểu tiện ra máu và tâm thần phân liệt Ngoài ra, Thunb.) Trevis còn được biết đến như một chất chống viêm và có khả năng dự phòng giải độc trong trường hợp ngộ độc phospho hữu cơ.
Toàn cây dùng để trị bỏng, giải độc trong các trường hợp sưng, côn trùng cắn
Ching Toàn cây dùng điều trị sốt thấp khớp [117]
Toàn cây được sử dụng hạ sốt, giải độc, giảm đau tay chân, đau khớp, đau do ngã
Huperzia squarrosa (Forst.) Trevis được sử dụng tại Ấn Độ như một loại thuốc bổ cho phụ nữ trên 40 tuổi khi trộn với mật ong, hoặc kết hợp với tam thất để tăng cường sinh lý Bột cây phơi khô cũng được dùng làm thực phẩm bổ sung, giúp cải thiện trí nhớ và điều trị chứng mất ngủ Tại Nepal, loài này được dùng để giã đắp trị đau lưng Ở Argentina, Huperzia saururus (Lam.) Trevis được áp dụng trong y học cổ truyền nhằm tăng cường trí nhớ.
Tại một số nước Nam Mỹ, các loài Huperzia (spp.) được sử dụng trong y học dân gian, cả đơn lẻ và kết hợp với các dược liệu khác, để điều trị các bệnh liên quan đến gan, thận, sốt cao, viêm nhiễm và cảm lạnh.
Tại Việt Nam, một số loài thuộc chi Huperzia Bernh được sử dụng trong y học dân gian Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata) chữa các vết thương, thâm tím, và các triệu chứng như nôn ra máu, đái ra máu, và trĩ chảy máu Râu rồng (Huperzia squarrosa) được dùng để điều trị ngoại thương xuất huyết Bào tử Huperzia carinata giúp chữa hăm kẽ ở trẻ em và các bệnh ngoài da khác Hai loài này hiện nay đã được phát triển thành sản phẩm thực phẩm chức năng, bao gồm Hộ trí vương và Lohha trí não, với các thành phần chính là cao Thạch tùng và các thảo dược khác.
TỔNG QUAN CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CÂY THẠCH TÙNG ĐUÔI NGỰA (HUPERZIA PHLEGMARIA (L.) ROTHM.)
1.6.1 Các nghiên cứu về thành phần hóa học
Từ năm 1971 đến 2016, đã có 9 công trình nghiên cứu công bố về thành phần hóa học của loài Huperzia phlegmaria, trong đó đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 39 hợp chất, bao gồm 16 alcaloid và 23 hợp chất terpenoid Các nghiên cứu này chủ yếu được thực hiện bởi các nhà khoa học Nhật Bản và Trung Quốc.
Trong số 16 alcaloid phân lập được từ loài Huperzia phlegmaria có:
- Các alcaloid thuộc lớp lycopodin: Anhydrodihydrolycopodin, Gnidioidin
[157], Malycorin B và Malycorin C [200] Năm 2013 và 2014, Hirasawa và cộng sự phân lập được Huperminon A và Hupermin A thuộc lớp này [73], [74]
- Các alcaloid thuộc lớp lycodin: lycodin và huperzin A [114], [200];
Các alcaloid thuộc lớp fawcettimin đã được nghiên cứu và phân lập từ loài Huperzia phlegmaria ở Nhật Bản Năm 1982, nhóm nghiên cứu Nhật Bản đã chiết xuất thành công 4 hợp chất alcaloid, bao gồm lycoflexin, fawcettidin, lycophlegmarin và 8-deoxy-13-dehydro-serratinin Đến năm 2008, Hirasawa và cộng sự tiếp tục phát hiện thêm 3 alcaloid, trong đó có malycorin A thuộc lớp fawcettimin Năm 2015, Wang Z.F và cộng sự đã phân lập được lycoposerramin E, cũng là một alcaloid của lớp này.
- Năm 2015, Wang Z.F và cộng sự phân lập được 2 alcaloid mới với cấu trúc khung khác 3 lớp trên từ loài Huperzia phlegmaria là ∆ 13,N , N α -methylphlegmarin- Nβ- oxid và 4β-hydroxynankakurin B [190]
Ngoài các hợp chất alcaloid, nghiên cứu cho thấy triterpenoid có cấu trúc serraten là nhóm hợp chất chiếm ưu thế thứ hai được phân lập từ loài Huperzia phlegmaria.
Năm 1971, các nhà khoa học Nhật Bản đã thu hái loài Huperzia phlegmaria tại Ceyon (Sri Lanka) và phân lập được 11 triterpenoid thuộc nhóm serratenediol, bao gồm các hợp chất như Serratenediol, serratenediol 3-acetat, serratriol, hydroxyserratenon, tohogenol, và Phlegmanol A-E cùng với acid phlegmaric Trong số này, Serratenediol và các hợp chất liên quan đã được phân lập lần đầu từ loài Huperzia serrata, trong khi các hợp chất Phlegmanol A-E được phát hiện lần đầu từ loài Huperzia phlegmaria.
Shi và cộng sự (2005) phân lập và xác định cấu trúc của một triterpenoid mới là lycophlegmarin và 4 hợp chất triterpenoid khác bao gồm 21α-Hydroxyserrat-14-en-3β-
35 ol, 21α-Hydroxyserrat-14-en-3β-yl acetat, 21β-Hydroxyserrat-14-en-3α-ol và 21β- Hydroxyserrat-14-en-3β-ol từ phân đoạn ethylacetat của cao chiết phần trên mặt đất loài
Huperzia phlegmaria, một loài thực vật thu hái ở Trung Quốc, đã được nghiên cứu và vào năm 2012, nhóm khoa học Thái Lan đã phân lập được 9 triterpenoid từ phân đoạn diethyl ete của cao chiết Các hợp chất này bao gồm lycophlegmarin, 21α-Hydroxyserrat-14-en-3β-ol, 21α-Hydroxyserrat-14-en-3β-yl acetat, 21α-hydroxy-serrat-14-en-3β-yl dihydrocoumarat, 21α-hydroxy-serrat-14-en-3β-yl p-dihydrocaffeat, và Lycophlegmariol A-D.
Ngoài các triterpenoid kể trên, năm 2012, Wittayalai S và cộng sự đã phân lập được 1 abietan diterpenoid là margocilin Hợp chất này đã được phân lập từ loài
Azadirachta indica trước đó, tuy nhiên, đây là lần đầu tiên phân lập được từ loài Huperzia phlegmaria cũng như từ chi Huperzia Bernh [194]
Đến năm 2019, Đặng Kim Thu và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của hai alcaloid từ loài Thạch tùng đuôi ngựa tại Tam Đảo (Vĩnh Phúc), bao gồm 12-epilycodolin N-oxid và fawcettidin Hợp chất fawcettidin đã được công bố trong Tạp chí Dược liệu, Số 2, Tập 23 năm 2018.
1.6.2 Công dụng, độc tính và tác dụng sinh học
Loài Huperzia phlegmaria được ứng dụng trong y học cổ truyền ở nhiều quốc gia như Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam và các nước Đông Á Tại Trung Quốc, toàn cây được ngâm với rượu để chữa trị các bệnh như đau họng, thủy thũng, tổn thương do va chạm và sốt thấp khớp Ngoài ra, theo một số nghiên cứu, Huperzia phlegmaria còn được sử dụng trong dân gian để điều trị các bệnh viêm khớp dạng thấp, mề đay và mụn nhọt.
Thạch tùng đuôi ngựa (Herba Huperziae phlegmariae) là một loại thảo dược tại Việt Nam, được tác giả Võ Văn Chi (2012) mô tả là có vị nhạt, tính mát, và có tác dụng thanh nhiệt, chỉ thống, thông kinh, trừ thấp Tuy nhiên, hiện tại chưa có tài liệu nào ghi nhận việc sử dụng loài thảo dược này trong dân gian để chữa bệnh.
Cho đến nay, chưa tìm thấy công bố nào về độc tính và tác dụng sinh học của loài
Huperzia phlegmaria là một loài cây có nhiều nghiên cứu về độc tính và tác dụng sinh học của các hợp chất như huperzin A, huperminon A, hupermin A, lycophlegmariol B, lycophlegmariol D, 21β-Hydroxy-serrat-14-en-3α-yl acetat, lycophlegmarin và serratenediol, cả ở Việt Nam và trên thế giới Những nghiên cứu này được trình bày chi tiết trong phần tổng quan về chi Huperzia Bernh trong mục 1.3 và 1.4.
Hiện nay, nghiên cứu về thành phần hóa học của loài Huperzia phlegmaria còn hạn chế, đặc biệt tại Việt Nam, nơi chưa có công bố nào trước năm 2016 Đề tài "Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng theo hướng điều trị bệnh Alzheimer của loài Thạch tùng đuôi ngựa (Huperzia phlegmaria (L.) Rothm." là rất cần thiết Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp tư liệu quý giá về thành phần hóa học của chi Huperzia Bernh và loài Huperzia phlegmaria ở Việt Nam, đồng thời xác định độc tính cấp và tác dụng sinh học trong việc ức chế enzym acetylcholinesterase.
Huperzia phlegmaria thu hái ở Việt Nam.
NGUYÊN VẬT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu nghiên cứu là thân và lá của cây Thạch tùng đuôi ngựa thu hái tại xã
Hướng Sơn, huyện Hướng Hóa, tỉnh Quảng Trị (Tọa độ: 16 o 4737.0N 106 o 4344.0E) vào tháng 5 năm 2016 Tên khoa học được xác định bởi Tiến sĩ Nguyễn Thế Cường,
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã thực hiện giám định Huperzia phlegmaria (L.) Rothm vào ngày 04/08/2016.
Mẫu tiêu bản chứa đầy đủ các cơ quan sinh dưỡng như thân, lá, rễ và cơ quan sinh sản là bào tử, hiện đang được lưu trữ tại Khoa Dược, Trường Đại học Y Dược - Đại học Huế với số hiệu mẫu cụ thể.
HP01 và tại Phòng Tiêu bản của Khoa Tài nguyên Dược liệu - Viện Dược liệu với số hiệu là DL-020120
Cây Thạch tùng đuôi ngựa tươi được sử dụng đề nghiên cứu đặc điểm thực vật
(đặc điểm hình thái và vi học) Nguyên liệu được thu hái, rửa sạch, thái nhỏ, sấy khô ở
50-60 o C, xay thành bột thô và bảo quản ở nơi khô thoáng để tiến hành các nghiên cứu về thành phần hóa học, độc tính cấp và tác dụng sinh học
- Các hóa chất và thuốc thử đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định của Dược điển
Việt Nam V (methanol, ethanol, n-butanol, ethylacetat, cloroform, n-hexan, DMSO, acetylthiocholin iodid (ACTI), 5,5’-dithiobis-nitrobenzoic acid (DTNB), Hydrochloric acid (HCl), Kali dihydrophosphat (KH2PO4), Natri hydroxid (NaOH), Natri bicarbonat
(NaHCO3) ) Các dung môi đạt tiêu chuẩn sử dụng cho máy HPLC: Methanol, nước cất 2 lần, acetonitril được mua từ hãng Merck – Đức
- Enzym acetylcholinesterase (AChE): Được cung cấp bởi hãng Sigma-Adrich
(Mã sản phẩm: C3389-500UN, số lô: SLBV 7012; hoạt độ: 245 unit/mg)
- Các chất chuẩn được dùng trong các nghiên cứu tác dụng sinh học:
+ Galantamin, Donepezil, Vitamin E, Scopolamin chuẩn được cung cấp bởi hãng Sigma-Adrich (Mã sản phẩm lần lượt là: Y0001279; D6821; 58-95-7 và S1013)
+ D-galactose: được mua từ hãng Mym Biological Technology (Mã sản phẩm:
The enzyme quantification kit for anti-aging activity includes Malondialdehyde (MDA), Glutathione Peroxidase (GSH-Px), and Superoxide Dismutase (SOD), along with accompanying chemicals from Melsin Medical Co., Limited, based in China.
Chuột nhắt trắng Swiss albino trưởng thành, có trọng lượng từ 20-25g, được cung cấp bởi Học viện Quân y và sử dụng trong nghiên cứu này Những con chuột này được nuôi trong môi trường thoáng mát, với chế độ ánh sáng và tối là 12 giờ, đồng thời không bị hạn chế về thức ăn và nước uống.
- Mọi qui trình thí nghiệm tuân thủ chặt chẽ theo hướng dẫn chăm sóc và sử dụng động vật trong phòng thí nghiệm của Học viện Quân y
2.1.4 Trang thiết bị, dụng cụ
2.1.4.1 Trang thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu thực vật, hóa học
- Kính lúp soi nổi: Krussoptroni (Đức)
- Máy ảnh kỹ thuật số Canon (Nhật Bản)
- Dụng cụ cắt vi phẫu cầm tay
- Sắc ký bản mỏng (TLC) được thực hiện trên bản mỏng trắng sẵn DC-Alufolien
Sắc ký cột được thực hiện với chất hấp phụ là silica gel pha thường (60 N, hình cầu, kích thước 40-50 μm, Kanto Chemical Co., Inc., Tokyo, Nhật Bản), silica gel pha đảo RP-18 (Fuji Silysia Chemical Ltd, Kasugai, Aichi, Nhật Bản) và sắc ký lọc qua gel Sephadex LH-20 (Dowex® 50WX2-100, Sigma–Aldrich, Hoa Kỳ).
Sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chế (p-HPLC) được thực hiện trên hệ thống máy Agilent Technologies 1260 Infinity II, serial DEAEW01659, với cột Zorbax SB–C18 kích thước 5 μm và 9,4 × 250 mm, cùng đầu dò DAD tại Trường Đại học Y Dược, Đại học Huế.
Điểm nóng chảy được xác định bằng máy Buchi B-545, trong khi phổ hồng ngoại (IR) được phân tích trên máy FT-IR Prestige của Shimadzu, Nhật Bản Đối với phổ tử ngoại (UV), quá trình đo được thực hiện bằng máy UV-1800 spectrophotometer cũng của Shimadzu tại Khoa Hóa, Trường Đại học.
Góc quay cực ([α]D) được đo bằng máy JASCO DIP-1000 KUY polarimeter với kích thước cell 1dm, trong khi phổ nhị sắc tròn (CD) được xác định bằng máy Jasco J-805 spectropolarimeter tại Viện Hóa sinh biển, thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS) đã được thực hiện trên máy micrOTOF-Q 10187 (Bruker, Massachusetts, USA) tại Khoa Hóa, Đại học Khoa học Tự nhiên, thuộc Đại học Quốc gia và Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY) được thu thập trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer tại Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, cùng với máy Varian 400Hz wide-bore NMR Spectrometer tại Nhật Bản, sử dụng TMS làm chất chuẩn nội.
2.1.4.2 Trang thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu tác dụng sinh học
- Máy đo quang ELISA Micropate Reader EMR 500 (Hoa Kỳ)
- Bể siêu âm ELMASONIC S100H (Đức), đĩa 96 giếng (Đức)
- Cân phân tích HR – 250AZ (Hàn Quốc) độ chính xác 0,1 mg
- Micropipette (RAININ – Nhật) và Multi Channel Pipette (CAPP – Đức)
- Mê lộ nước Morris, mê lộ chữ Y, các đồ vật A1, A2, B
- Phần mềm phân tích kết quả ANY maze (Stoelting-USA), camera nối với máy tính
- Dụng cụ: cốc có mỏ, bình nón, ống nghiệm, bình định mức nhiều thể tích, đĩa
96 giếng, pipete, effendorf, giấy thấm,
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Phương pháp nghiên cứu thực vật
2.2.1.1 Phân tích, mô tả hình thái thực vật
Quan sát và mô tả đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu tại thực địa theo phương pháp ghi chép từ các tài liệu [3], [4] Tiến hành chụp ảnh, thu hái mẫu và thực hiện làm tiêu bản mẫu khô để phục vụ cho nghiên cứu.
- Phân tích bào tử trên kính lúp soi nổi và chụp ảnh bằng máy ảnh kĩ thuật số
2.2.1.2 Giám định tên khoa học
Giám định tên khoa học được thực hiện thông qua việc so sánh đặc điểm hình thái và bào tử, đối chiếu với các tài liệu và khóa phân loại thực vật Quá trình này cũng bao gồm việc so sánh với các tiêu bản lưu giữ tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, dưới sự hỗ trợ của các chuyên gia phân loại thực vật.
2.2.1.3 Nghiên cứu đặc điểm vi học
Làm vi phẫu lá và thân theo phương pháp cắt ngang, cắt dọc, nhuộm kép [2],
[13] Quan sát cấu tạo giải phẫu và đặc điểm bột dược liệu dưới kính hiển vi, mô tả và chụp ảnh bằng máy ảnh kỹ thuật số
2.2.2 Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học
2.2.2.1 Phương pháp định tính các nhóm hợp chất bằng phản ứng hóa học Định tính các nhóm chất hữu cơ chính trong dịch chiết methanol toàn phần theo các tài liệu [1], [14]
2.2.2.2 Phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế các hợp chất
Mẫu nghiên cứu tại huyện Hướng Hóa, tỉnh Quảng Trị được xử lý bằng cách rửa sạch, thái nhỏ, và sấy khô ở nhiệt độ 50-60°C, sau đó xay thành bột thô Các phương pháp chiết xuất khác nhau đã được áp dụng để thu được cao chiết toàn phần và cao chiết phân đoạn, nhằm đánh giá hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro Kết quả nghiên cứu này là cơ sở để tiến hành chiết xuất và phân lập các hợp chất, trong đó sử dụng phương pháp chiết acid để thu được cao chiết alcaloid toàn phần (HC) và phần cặn còn lại sau khi chiết alcaloid được chiết bằng etylacetat để thu được cao ethylacetat (HE).
Phân lập các hợp chất từ phân đoạn HC và HE được thực hiện thông qua sắc ký cột và hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Quá trình này được theo dõi bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng để đảm bảo tính chính xác và hiệu quả trong việc phân tách các hợp chất.
2.2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất
Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định thông qua các hằng số vật lý như điểm chảy và góc quay cực [α]D, cùng với các dữ liệu từ các phương pháp phổ như phổ hồng ngoại (IR), phổ tử ngoại (UV), phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS), và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) Ngoài ra, các kỹ thuật phổ hai chiều như HMBC, HSQC, COSY, NOESY và phổ nhị sắc tròn (CD) cũng được sử dụng để so sánh với các dữ liệu phổ đã được công bố trong tài liệu tham khảo.
2.2.3 Phương pháp nghiên cứu độc tính cấp và tác dụng sinh học
Kết quả sàng lọc cho thấy cao chiết toàn phần và cao chiết phân đoạn có khả năng ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro Trong số đó, cao chiết mạnh nhất sẽ được tiến hành nghiên cứu độc tính cấp trên động vật thực nghiệm nhằm xác định liều LD50, cũng như thực hiện các nghiên cứu tác dụng sinh học in vivo.
2.2.3.1 Chuẩn bị mẫu thử a) Mẫu thử để sàng lọc tác dụng ức chế enzym AChE in vitro:
- Chiết cao toàn phần: cho khoảng 50 g dược liệu đã xay thô vào bình nón, thêm
Để chiết xuất dược liệu, sử dụng 300 ml methanol tuyệt đối ngập hoàn toàn dược liệu, sau đó thực hiện siêu âm trong 3 giờ ở nhiệt độ phòng Tiến hành lọc để thu được dịch chiết, lặp lại quá trình chiết 2 lần, gộp các dịch chiết lại với nhau Cuối cùng, cô chân không để loại bỏ dung môi, thu được cao toàn phần với trọng lượng 3,0 g.
Cao toàn phần (3,0 g) được chiết tách thành các phân đoạn bằng cách sử dụng các dung môi có độ phân cực tăng dần, bao gồm n-hexan, chloroform và ethyl acetat Quá trình chiết diễn ra bằng cách phân tán cao vào 30 ml nước cất và thực hiện chiết lặp lại ba lần với mỗi dung môi, mỗi lần 30 ml Sau khi lắc, để yên cho phân lớp hoàn toàn, lớp dung môi được gạn riêng và cất thu hồi dưới áp suất giảm Kết quả thu được các cao tương ứng với từng phân đoạn: n-hexan (0,51 g), chloroform (0,72 g), ethyl acetat (0,90 g) và cao chiết nước còn lại (0,57 g).
Chiết cao alcaloid từ cao methanol toàn phần (3,0 g) được thực hiện bằng cách phân tán vào dung dịch acid tartaric 3%, siêu âm trong 10 phút và lọc để tách phần cặn Dịch lọc acid sau đó được điều chỉnh pH về 10 bằng dung dịch bão hòa Na2CO3, tiếp theo là lắc với dichloromethan (CH2Cl2).
Sau 42 lần gộp dịch chiết dichloromethan và loại bỏ hoàn toàn dung môi dưới áp suất giảm, thu được 0,36 g alcaloid toàn phần Mẫu thử đã được sử dụng để đánh giá độc tính cấp và nghiên cứu tác dụng sinh học in vivo.
Để chiết xuất alcaloid từ cây Thạch tùng đuôi ngựa, lấy 1,5 kg thân và lá khô (tương đương 6 kg dược liệu tươi) cho vào bình chiết, sau đó đổ 6 lít methanol ngập dược liệu và ngâm ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ Tiến hành rút dịch chiết 3 lần, gộp lại và cô quay dưới áp suất giảm để loại bỏ dung môi, thu được 75 g cao chiết methanol toàn phần Phân tán cao này trong dung dịch acid tartaric 3% (điều chỉnh pH 1-2) và gạn lấy dịch lọc Dịch lọc được lắc với ethylacetat để loại tạp, sau đó kiềm hóa bằng dung dịch Na2CO3 bão hòa (điều chỉnh pH 10) Cuối cùng, lắc dịch này với dichloromethan 3 lần, gộp dịch chiết và cô quay dưới áp suất giảm để thu được 8 g cao chiết alcaloid toàn phần Lặp lại quy trình chiết 3 lần để tăng hiệu suất.
24 g cao chiết alcaloid toàn phần (độ ẩm 8,2%)
2.2.3.2 Phương pháp nghiên cứu độc tính cấp
Nghiên cứu độc tính cấp và xác định liều LD50 trên chuột nhắt trắng bằng đường uống theo phương pháp Litchfied – Wilcoxon [105]
Phương pháp dò liều được thực hiện bằng cách cho hai chuột nhắt đầu tiên uống cao chiết với nồng độ 0,5 g/mL, liều lượng 0,2 ml cho mỗi 20 g trọng lượng chuột, một lần trong vòng 24 giờ Sau đó, theo dõi tình trạng của chuột trong 72 giờ Nếu cả hai chuột chết, tiến hành pha loãng dần và cho các cặp chuột khác uống cho đến khi xác định được liều lượng chỉ gây tử vong cho một trong hai chuột trong vòng 72 giờ.
Phương pháp đánh giá độc tính cấp được thực hiện bằng cách xác định liều cao chiết gây chết 1 trong 2 chuột, sau đó pha thành 5 liều khác nhau (2 liều cao hơn và 2 liều thấp hơn) với bước nhảy 30% nồng độ Chuột được chia thành 5 lô, mỗi lô 10 con, và theo dõi tình trạng chung cũng như số chuột chết trong 72 giờ Từ đó, lập bảng xác định tỷ lệ chuột chết để tính LD50 của cao chiết dược liệu theo phương pháp Litchfield – Wilcoxon Đánh giá thể trạng chuột cũng được thực hiện trong quá trình thử nghiệm tại Khoa Sinh lý học, Học viện Quân y.
2.2.3.3 Đánh giá hoạt tính ức chế AChE in vitro
Hoạt tính ức chế AChE in vitro được đánh giá theo phương pháp Ellman và cộng sự
Năm 1961, nghiên cứu dựa trên nguyên tắc rằng acetylthiocholin iodid (ATCI) bị thủy phân bởi AChE, tạo ra thiocholin và acid acetic Thiocholin sau đó phản ứng với thuốc thử Ellman (DTNB), dẫn đến hình thành hợp chất acid 5-thio-2-nitro benzoic có màu vàng Sự hình thành của hợp chất màu này tỷ lệ thuận với hoạt độ của AChE Để đánh giá hoạt tính của AChE, người ta xác định độ hấp thụ của mẫu thử ở bước sóng 405 nm.
PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH, XỬ LÝ SỐ LIỆU
Các số liệu thu thập được xử lí bằng phương pháp thống kê y sinh học, sử dụng phần mềm SPSS 22.0 và phần mềm Excel 2007
Trong nghiên cứu về hành vi chuột trong thử nghiệm mê lộ hình chữ Y, thời gian chuột bơi trong vùng bến đỗ vào ngày thứ 8 của thử nghiệm mê lộ nước Morris đã được ghi nhận Hoạt động của enzym AChE và nồng độ các enzym liên quan đến đánh giá hoạt động lão suy cũng được phân tích Phương pháp thống kê so sánh phương sai một nhân tố (One-way ANOVA) cùng với kiểm định Tukey đã được sử dụng để phân tích dữ liệu.
Trong nghiên cứu, số liệu về thời gian tiềm và quãng đường bơi đến bến đỗ trong thử nghiệm mê lộ nước Morris được phân tích bằng phương pháp so sánh phương sai hai nhân tố có lặp (Repeated Two-way ANOVA) Đồng thời, số liệu hành vi về thời gian khám phá trong pha luyện tập và pha kiểm tra trong thử nghiệm nhận thức đồ vật được phân tích bằng phương pháp so sánh cặp (paired-sample t-test) Phân tích sâu (Post-Hoc) được thực hiện để so sánh từng nhóm nghiên cứu.