(LUẬN án TIẾN sĩ) nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây thuốc thượng (phaeanthus vietnamensis ban; họ na annonaceace)

TỔNG QUAN

Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật và phân bố chi Phaeanthus Hook f &

1.1.1 V ị trí phân lo ạ i chi Phaeanthus Hook f & Thomson

Chi Phaeanthus, được Hook f & Thomson mô tả lần đầu vào năm 1855, có loài chuẩn là Phaeanthus nutans Chi này mang những đặc điểm đặc trưng của họ Na-Annonaceae, với lá nguyên, mọc cách và xếp thành.

2 dãy, bao hoa mẫu 3, nhị nhiều, hướng ngoài; lá noãn nhiều, rời; quả gồm nhiều phân quả trên đế quả lồi [43]

Họ Na-Annonaceae bao gồm khoảng 2.400 loài thuộc 107 chi, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới toàn cầu Với số lượng loài đa dạng, họ Na đã được phân loại theo nhiều hệ thống khác nhau, trong đó có các hệ thống của Bentham & Hooker (1872) và King (1892).

1893), Boerlage (1899), Engler & Diels (1900), Hutchinson (1923, 1964), Sinclair

(1955), Fries (1959), Walker (1971) Trừ hệ thống của Walker (1971) các tác giả trên đều xây dựng hệ thống của mình dựa trên đặc điểm của hoa và quả [1]

Hooker & Thomson (1855) đã phân loại chi Phaeanthus vào tông Guatterieae thuộc họ Annonaceae dựa trên những đặc điểm như quả chín rời nhau, cánh hoa xếp van, nhị dày đặc, và gốc cánh hoa không thót lại thành móng Chi Phaeanthus được phân biệt với các chi khác trong tông nhờ vào cánh hoa phẳng, mỏng hoặc có chất da, cùng với số lượng noãn xác định và cánh hoa ngoài nhỏ tương tự như lá đài.

Nhiều quan điểm khác nhau được đưa ra về mối quan hệ của chi trong họ Annonaceae Dựa trên các phân tích hoa và quả Van Zuilen (1996) đặt chi

Phaeanthus Hook.f & Thomson thuộc nhóm không chính thức cùng với các chi như Annickia, Enicosanthum, Ephedranthus, Malmea, Marsypopetalum, Neo-uvaria, Pseudephedranthus, Trivalvaria và Woodiellantha, trong đó một số chi đang được xem xét lại gần đây Nhiều tác giả đã ứng dụng phương pháp nghiên cứu phân tử để nghiên cứu phát sinh chủng loại cho các bậc phân loại dưới họ Annonaceae.

Các nghiên cứu về họ Annonaceae vẫn chưa đầy đủ, với nhiều hệ thống phân loại chưa được công nhận và thiếu sự ổn định khi bổ sung dữ liệu mới Chatrou và cộng sự (2012) đã phân tích 8 chỉ thị gen lục lạp từ 193 loài để đề xuất một phân chia mới cho họ Annonaceae, bao gồm 4 phân họ và 14 tông Tiếp theo, Xing và cộng sự (2017) đã thực hiện phân tích tương tự trên 705 loài, chiếm 29% tổng số loài của họ này, và đề xuất thay đổi vị trí của 5 chi cũng như giới thiệu một tông mới là Phoenicantheae, trong đó chi Phaeanthus thuộc tông Miliuseae, phân họ Malmeoideae.

Trong hệ thống phân loại thực vật, họ Annonaceae được một số tác giả tách riêng thành bộ Annonales, trong khi những người khác lại xếp vào bộ Magnoliales Hiện nay, hệ thống phân loại hiện đại APG, dựa trên phân tích trình tự ADN của các gen đặc trưng, đã được nhiều vườn thực vật và phòng tiêu bản toàn cầu, bao gồm cả Kew, chấp nhận.

Hệ thống phân loại APG IV (2016) cải thiện khả năng dự đoán các nhóm thực vật có hoa bằng cách phản ánh mối quan hệ tiến hóa, sử dụng thuật ngữ “Nhánh - Clade” thay cho các bậc phân loại truyền thống Trong hệ thống này, họ Annonaceae được xếp vào bộ Magnoliales, thuộc nhánh Magnoliids và nhánh Basal Angiosperms.

Vị trí phân loại của chi Phaeanthus Hook f & Thomson theo hệ thống phân loại của Xing (2017) và họ Annonaceae theo hệ thống phân loại APG IV

Nhánh (Clade): Basal Angiosperms Nhánh: Magnoliids-Ngọc lan

Bộ (Order): Magnoliales-Ngọc lan

Họ (Family): Annonaceae-Na Phân họ (Subfamily): Malmeoideae Tông (Tribes): Miliuseae Chi (Genus): Phaeanthus Hook f & Thomson

Nghiên cứu của Mols & Kessler (2000) về đặc điểm hình thái của chi Phaeanthus được coi là toàn diện nhất cho đến nay Dưới đây là khóa phân loại các loài thuộc chi này, trong đó lá có từ 13 đến 20 cặp gân bên.

Cuống hoa của P sumatrana có chiều dài từ 2,3 đến 5 cm, trong khi cánh hoa dài từ 1,3 đến 2,2 cm (có thể lên đến 3,3 cm) và có lông ngắn ở mặt trong Lá đài của loài này có lông mềm và thưa hoặc có thể nhẵn ở mặt trong Số lượng lá noãn dao động từ 25 đến 35, và phân quả có chiều dài từ 1,3 đến 1,8 cm.

2b Cuống hoa dài 6,5-7,7 cm; cánh hoa dài 2,5-3,7 cm, nhẵn ở mặt trong; lá đài nhẵn ở mặt trong; lá noãn 40-50; phân quả chưa quan sát được

8 P villosus 1b Lá có 9-15 cặp gân bên

3a Lá rất bóng (chủ yếu ở mặt trên) hoặc ánh bạc; phân quả dài 1,8-3 cm

4a Lá rất bóng ở mặt trên; cánh hoa dày như ; phân quả (2-)6-15, dài 1,9-3 cm, nhẵn; mào trung đới không trùm lên bao phấn

4 P splendens 4b Lá bóng màu xám bạc; phân quả 35-60, dài 1,8-2,2 cm, có lông

6 P tephrocarpus 3b Lá bóng; phân quả dài 0,8-1,8 cm

5a Lá đài dài 3-9 mm, có lông ở mặt trong; cánh hoa có 5-7 gân rõ; noãn đính bên 3 P nutans

5b Lá đài dài 1-4 mm long, nhẵn ở mặt trong; cánh hoa không có gân nổi rõ; noãn đính gần bên

6a Lá có chất da; mào trung đới không trùm lên bao phấn; noãn đính gần bên

2 P impressinervius 6b Lá có chất giấy; mào trung đới trùm lên bao phấn; noãn đính bên

7a Lá bắc dưới cùng dài 3-4 mm, lá bắc còn lại dài 1-2,5 mm; lá noãn 10-20

7 b Lá bắc dưới cùng giống các lá bắc khác dài 1-2,25mm; lá noãn 30-50

1.1.2 Phân bố và thành phần loài của chi Phaeanthus Hook f & Thomson

Cho tới nay công trình của Mols & Kessler (2000) về các loài thuộc chi

Phaeanthus vẫn được xem là đầy đủ nhất Phaeanthus là một chi nhỏ với khoảng

9 loài, phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á (từ Ấn Độ, Mianma, Thái Lan, Đông dương và các nước Đông Nam Á khác đến Niu Ghinê) [64]

Bảng 1.1 Phân bố các loài thuộc chi Phaeanthus

TT Tên loài Phân bố TLTK

Philippin, Sulawesi, Moluccas, Irian Jaya, Papua New Guinea, Brunei

4 P splendens Miq Sumatra, Bangka, Malaysia,

5 P sumatrana Miq Sumatra, Riau, Malaysia, Java [64]

Loài đặc hữu của Việt Nam: Thừa Thiên Huế (Phú Lộc: Rừng Nông;

Hương Phú: Sông Hai); Quảng Nam (Núi Thành; Duy Xuyên, Đại Lộc: Đại Lãnh; Quế Sơn: Quế Giằng: Hà Ra; Tiên Phước, Phước Sơn; Hiên)

Chi Phaeanthus lần đầu tiên được ghi nhận ở Việt Nam bởi Nguyễn Tiến Bân với loài thuốc Thượng-Phaeanthus vietnamensis Ban Đây là loài duy nhất thuộc chi Phaeanthus được phát hiện tại Việt Nam cho đến nay.

Loài thuốc Thượng là cây đặc hữu với phân bố hẹp tại vùng Trung bộ Việt Nam, được ghi nhận ở các tỉnh như Thừa Thiên Huế (Phú Lộc: Rừng Nông; Hương Phú: Sông Hai) và Quảng Nam (Núi Thành; Duy Xuyên; Đại Lộc: Đại Lãnh; Quế Sơn: Quế Giằng, Hà Ra; Tiên Phước, Phước Sơn; Hiên).

Loài đã được đưa vào Sách đỏ Việt Nam (2007) với cấp phân hạng VU B2b,e+3b (loài sắp nguy cấp) [3]

1.1.3 Đặc điểm thực vật của chi Phaeanthus Hook f & T homson

Cây bụi hoặc gỗ nhỏ, với một số loài có thể cao tới 25m, có cành màu nâu đến xám tro khi khô và vỏ có sọc hình thoi Cành non thường tròn hoặc hơi phẳng, có màu đen hoặc nâu hơi đỏ, với nhiều bì khổng và đôi khi có sẹo ngang Cuống lá màu đen, có rãnh dọc hoặc phẳng, trong khi lá hình trứng ngược đến hình elip, chất giấy hoặc da, thường bóng và chuyển màu đen khi khô Cụm hoa xuất hiện ở nách lá hoặc tận cùng, dạng xim với 1-4 hoa; hoa lưỡng tính, có lá bắc hình tam giác và cánh hoa ngoài nhỏ hơn cánh hoa trong Nhị từ 30-100, với bao phấn hướng ngoài, trong khi lá noãn có lông ráp màu rỉ sắt hoặc nâu vàng, núm lá noãn hình elip đến hình chùy Quả bao gồm các phân quả, với nhiều phân quả.

Hạt có hình elip, với cuống và vỏ mỏng, thường có màu đen khi chín Mỗi hạt có 1 hoặc 2 phần, áo hạt mỏng và nội nhũ nhăn, với rãnh nhăn hình phiến chia hạt thành 4 phần.

Thành phần hóa học

Các nghiên cứu cho thấy chi Phaeanthus chứa nhiều alcaloid, với 21 loại alcaloid đã được phân lập từ các loài trong chi này Cụ thể, có 7 bisbenzyl isoquinolin alcaloid, 3 benzyl isoquinolin alcaloid, 1 secobenzyl isoquinolin alcaloid, 1 protoalcaloid, 7 isoquinolin alcaloid và 2 phenanthren alcaloid (tham khảo các bảng 1.2-1.5).

Năm 1932, tác giả Santos đã phân lập được hợp chất phaeanthin từ vỏ cây

P ebracteolatus thu hái ở Philippin Năm 1951, Santos phân lập được một alcaloid bậc 4 mới từ rễ và định tên là phaeantharin Cấu trúc của phaeantharin đã được Van Beek và cộng sự xác định lại dựa trên dữ liệu phổ vào năm 1983 [89]

Năm 1968, nghiên cứu của Johns và cộng sự đã chỉ ra rằng loài P macropodus có hàm lượng alcaloid toàn phần trong lá là 1,13% và trong vỏ thân là 1,12% Hai alcaloid chính được phân lập từ loài này là phaeanthin và limacin, chiếm lần lượt 22,9% và 34,9% tổng hàm lượng alcaloid, với tỷ lệ giống nhau ở cả phần lá và vỏ thân.

Năm 1991, Fasihudin và cộng sự đã xác định được hai alcaloid chính trong

P crassipetalus là phaeanthin và limacin [37] Từ vỏ cây P crassipetalus, Awang và cộng sự công bố vào năm 2007 đã phân lập được 8 alcaloid: pecrassipine A và

B, doryphornin methyl ether, thalifolin, lanuginosin, (+)-vietnamin, (-)-O- methyldauricin và (+)-limacusin [20] Năm 2012, từ lá P crassipetalus, Zaima và cộng sự đã phân lập được 4 alcaloid gồm corydaldin, N-methylcorydaldin, backebergin và petalinemethin [101]

Bảng 1.2 Các alcaloid benzyl isoquinolin từ các loài thuộc chi Phaeanthus

TT Tên chất Bộ phận cây/loài TLTK

1 Phaeanthin Vỏ thân + lá P macropodus

Vỏ thân + lá P crassipetalus Becc

2 (-)-limacin Vỏ thân P crassipetalus Becc;

Vỏ thân + lá P macropodus (Miq.) Diels

3 (+)-limacusin Vỏ thân P crassipetalus Becc;

4 Phaeantharin Vỏ thân P ebracleolatus (C Presl)

Vỏ thân P opthalmicus (Roxb ex G Don) J Sinclair;

8 (+)-vietnamin Vỏ thân P crassipetalus Becc [20,101]

9 Pecrassipin A Vỏ thân P crassipetalus Becc [20,101]

10 Pecrassipin B Vỏ thân P crassipetalus Becc [20,101]

11 Petalinemethin Vỏ thân - lá P crassipetalus Becc;

Năm 2011, Atan và cộng sự đã phân lập được bốn alcaloid từ dịch chiết cồn vỏ cây P ophthalmicus gồm: O-methyl dauricin, limacin, corydaldin và oxostephanin [18]

Theo nghiên cứu của Võ Duy Lê Sơn, P vienamensis Ban chứa 3,925% alcaloid toàn phần Năm 2014, Lê Thị Ngọc Ngân đã xác định rằng P vietnamensis Ban có chứa alcaloid, tinh dầu, polyphenol, triterpenoid và acid hữu cơ Từ cao chiết ethylacetat của lá P vienamensis Ban, bà đã phân lập được 3 hợp chất: pinoresinol, lyoniresinol và syringaresinol Ngoài ra, Nguyễn Thị Nghĩa và cộng sự đã phân lập được 7 alcaloid, bao gồm petalinemethin, doryphornin methyl ether, N-methylcorydaldin, argentinin, atherosperminin, 1S,1'R-7,7'-O,O'-dimethylgrisabin và 1S,1'R-7-O-methylgrisabin Từ loài P saccopetaloides, Qian và cộng sự đã phân lập được 3 hợp chất là lirioresinol C, moupinamid và daucosterol.

Bảng 1.3 Các alcaloid isoquinolin từ các loài thuộc chi Phaeanthus

12 Doryphornin methyl ether (N-methyl-6,7- dimethoxy isoquinolon)

Vỏ thân P opthalmicus (Roxb ex G Don) J Sinclair

14 Thalifolin Vỏ thân P crassipetalus Becc [20]

18 Lanuginosin Vỏ thân P crassipetalus Becc [20]

Bảng 1.4 Các alcaloid khác từ các loài thuộc chi Phaeanthus

Bảng 1.5 Các hợp chất khác từ các loài thuộc chi Phaeanthus

Công dụng theo kinh nghiệm dân gian

Các loài thuộc chi Phaeanthus đã được sử dụng làm thuốc từ lâu đời ở nhiều quốc gia Tại Malaysia, P crassipetalus được dùng để điều trị vết thương và huyết áp cao, trong khi P ebracteolatus giúp giảm đau và P opthalmicus chữa trị vết thương và loét Vỏ thân hoặc lá của P ebracteolatus, P splendens và P vietnamensis Ban được áp dụng để điều trị đau mắt đỏ Ở Việt Nam, P vietnamensis Ban còn được sử dụng để trị mụn nhọt, đau bụng, tiêu chảy, kiết lỵ và cầm máu vết thương ngoài da.

Tác dụng sinh học

Viêm thần kinh là nguyên nhân chính gây tổn thương thần kinh trong các bệnh thoái hóa thần kinh Năm 2017, Zhou và cộng sự đã phát hiện syringaresinol, một chất có tác dụng chống viêm thần kinh mạnh mẽ với IC50 2,68 μM, cho thấy hiệu quả vượt trội hơn so với minocyclin (IC50 19,89 μM) Syringaresinol được xem là một chất tiềm năng hàng đầu trong điều trị các bệnh thoái hóa thần kinh.

Năm 2008, nghiên cứu của Manga đã chỉ ra rằng daucosterol có khả năng chống viêm mạnh hơn indomethacin trong mô hình phù tai chuột, khi sử dụng dầu Ba đậu với liều 90 μg/cm².

Năm 2013, Yang và cộng sự đã thực hiện thử nghiệm chống viêm trên tế bào RAW264.7 bằng cách kích thích LPS, và phát hiện rằng các hợp chất pinoresinol và syringaresinol có hiệu quả với giá trị IC50 trong khoảng từ 4,1 đến 413,8 μM.

Vào năm 2015, Ahmad đã tiến hành nghiên cứu hoạt tính của hai hợp chất pinoresinol và syringaresinol, cho thấy cả hai đều có tác dụng chống viêm hiệu quả Cụ thể, giá trị IC50 của pinoresinol là 17,2±0,07 μM và của syringaresinol là 7,9±0,04 μM, trong việc ức chế sự giải phóng Leukotrien C4 (LTC4).

1.4.2 Tác dụng giãn mạch máu

Năm 2002, Austin đã chứng minh rằng loài P splendens có khả năng hạ huyết áp, trong khi P ebracteolatus không chỉ hạ huyết áp mà còn giãn cơ trơn Tại Malaysia, P crassipetalus được người dân địa phương sử dụng để điều trị vết thương và huyết áp cao Năm 2007, Morita và cộng sự đã khảo sát hiệu quả giãn mạch của hai chất pecrassipin A và pecrassipin B trên động mạch chủ chuột cô lập, cho thấy cả hai chất này ở nồng độ 100μM đều có khả năng giãn mạch đáng kể, với đáp ứng tối đa lần lượt là 82% và 70% khi đối kháng với norepinephrin Pecrassipin A có hoạt tính giãn mạch vừa phải, không mạnh bằng curin từ Chondrodendron platyphyllum, trong khi pecrassipin B thể hiện hoạt tính giãn mạch chậm.

Đến năm 2011, Zaima và nhóm nghiên cứu đã tiếp tục điều tra khả năng gây giãn động mạch chủ ở chuột của các hợp chất chiết xuất từ loài P crassipetalus Kết quả nghiên cứu cho thấy những chất này có tác dụng đáng kể trong việc giãn nở động mạch chủ.

Tại động mạch chủ, phenylephrin (PE; 0,3 àM) được sử dụng để xử lý, sau đó các hợp chất limacin, pecrassipin A và backebergin cho thấy khả năng giãn mạch với nồng độ 30 àM Pecrassipin A và backebergin thể hiện tác dụng giãn mạch phụ thuộc vào thời gian Đặc biệt, tác dụng giãn mạch của limacin bị ức chế bởi NG-monomethyl L-arginin (L-NMMA), một chất ức chế tổng hợp nitric oxid (NO), trong khi pecrassipin A và backebergin không bị ảnh hưởng Điều này cho thấy cơ chế giãn mạch của limacin liên quan đến việc kích thích giải phóng NO.

A và backebergin là tham gia vào quá trình giải phóng NO bên cạnh khả năng chẹn kênh Ca 2+ và thụ thể của kênh này

Chất làm giãn mạch máu rất quan trọng trong điều trị co mạch và tăng huyết áp, cũng như cải thiện tuần hoàn ngoại vi Các chất giãn mạch phụ thuộc tế bào nội mô như bradykinin, acetylcholin và histamin hoạt động thông qua việc tăng nồng độ ion Ca2+ trong tế bào nội mô, kích hoạt giải phóng NO và dẫn đến giãn mạch Ngược lại, phản ứng co thắt cơ trơn xảy ra khi ion Ca2+ đi qua kênh điện thế phụ thuộc Ca2+ (VDC) và/hoặc thụ thể vận hành kênh Ca2+ (ROC) Các thuốc giãn mạch độc lập với tế bào nội mô như nicardipin, nifedipin, diltiazem và verapamil ức chế VDC, giảm nồng độ ion Ca2+ trong tế bào cơ trơn, từ đó gây giãn mạch Do đó, limacin, pecrassipin A và backebergin có khả năng gây giãn mạch và có thể ứng dụng trong các bệnh liên quan đến tim mạch.

Năm 1996, một nghiên cứu về tác dụng của một số alcaloid đã phát hiện ra hợp chất atherosperminin với nồng độ 100 àg/ml, cho thấy hoạt tính giãn mạch và khả năng ức chế mạnh kết tập tiểu cầu.

1.4.3 Tác dụng kháng khuẩn, kháng ký sinh trùng

Từ năm 1983, tác giả Van Beek và cộng sự đã xác định phaeantharin phân lập từ loài P ebracteolatus là một chất kháng khuẩn tiềm năng [89]

Nguyễn Thị Nghĩa và cộng sự đã phát hiện ra alcaloid toàn phần chiết xuất từ lá cây thuốc Thượng có hoạt tính kháng khuẩn Trong số các alcaloid phân lập, 1S, 1'R-7,7'-O,O'-dimethylgrisabin cho thấy khả năng kháng khuẩn mạnh mẽ, với nồng độ ức chế tối thiểu đối với Bacillus subtilis là 62,5 ppm.

Fashihuddin và cộng sự đã thành công trong việc phân lập hai alcaloid limacin và phaeanthin từ loài P crassipetalus, cho thấy hoạt tính kháng khuẩn trung bình đối với cả hai dòng vi khuẩn gram (-) và gram (+).

Trong tìm kiếm các chất từ thiên nhiên diệt động vật đơn bào-ký sinh trùng, phaeanthin thể hiện hiệu quả gấp 3 lần (IC50 2,41 àM) so với thuốc chuẩn

Pentostam được sử dụng trong việc tiêu diệt ký sinh trùng L donovani Limacin và pheanthin cho thấy hiệu quả tương đối trong việc tiêu diệt ký sinh trùng Trypanosoma cruzi trên chuột, có thể thông qua cơ chế chẹn kênh Ca2+ để kiểm soát sự xâm nhập của T cruzi vào tế bào chủ hoặc nhờ vào các đặc tính ức chế miễn dịch chọn lọc của chúng.

Nghiên cứu in vitro cho thấy dimethylgrisabin có khả năng kháng Plasmodium falciparum K1 (chủng kháng chloroquin) rất mạnh với IC50 là 0,031 àM, vượt trội hơn so với chloroquin (0,090) Bên cạnh đó, Phaeanthin cũng thể hiện khả năng kháng P falciparum K1 và P falciparum T9-96 (nhạy cảm với chloroquin) với IC50 lần lượt là 365,85±11,41 nM và 704,87±81,48 nM.

Hợp chất atherosperminin có tác dụng kháng P falciparum K1 với hoạt tính yếu, giá trị IC50 là 5,80 μM Trong khi đó, limacin thể hiện hoạt tính mạnh hơn với P falciparum T9-96 (IC50 0,24 μg/ml) so với P falciparum K1 (IC50 1,35 μg/ml) Điều này cho thấy limacin hoạt động tương tự như chloroquin, với IC50 lần lượt là 0,187 μg/ml và 0,01 μg/ml cho các chủng K1 và T9-96 Limacin cũng có thể bị ảnh hưởng bởi cơ chế kháng chloroquin ở chủng P falciparum K1.

Trong nghiên cứu in vitro, hợp chất oxostephanin thể hiện hoạt tính kháng

P falciparum K1 với giỏ trị IC50 là 2,96 àg/ml so với chứng dương dihydro artemisinin có IC50 là 1,19 ng/ml Oxostephanin thể hiện hoạt tính kháng virut (herpes simplex type 1) với giỏ trị IC50 là 12,6 àg/ml so với chứng dương acyclovir cú IC50 là 1,2 àg/ml [61]

Vài nét về cây thuốc Thượng ở Việt Nam

Cây thuốc Thượng là một loại thảo dược nổi tiếng tại vùng Quảng Nam-Đà Nẵng Theo thông tin từ DS Đống Việt Thắng, nguyên Trưởng Trạm Nghiên cứu Dược liệu tỉnh Quảng Nam-Đà Nẵng, cây thuốc này đã được ghi nhận lần đầu tiên vào năm

Năm 1979, trong khuôn khổ phong trào “Thuốc nam tự túc ở xã” tại huyện Duy Xuyên, tác giả Nguyễn Tiến Bân đã nghiên cứu và thu thập mẫu cây thuốc từ Quảng Nam-Đà Nẵng và tỉnh Bình Trị Thiên cũ Đến năm 1994, ông xác định được loài thuốc Thượng là một loài mới và đặt tên cho nó là Phaeanthus vietnamensis Ban Cây này còn được biết đến với các tên gọi khác như Thuốc mọi, thuốc dấu cà doong, và da xà lắc.

Cây thuốc Thượng, theo Nguyễn Tiến Bân, là loài đặc hữu của Việt Nam và đã được ghi vào sách đỏ Việt Nam năm 2007 Loài cây này thường mọc rải rác dưới tán rừng thưa và rừng thứ sinh ẩm, ở độ cao dưới 300 m Cây thuốc Thượng được ghi nhận tại các tỉnh như Thừa Thiên-Huế (Phú Lộc) và Quảng Nam-Đà Nẵng (Đại Lộc, Quế Sơn, Núi Thành, Duy Xuyên, Tiên Phước, Phước Sơn).

1.5.2 Công dụng theo dân gian

Theo kinh nghiệm của người dân xã Duy Tân, lá tươi của cây thuốc Thượng sau khi rửa sạch và hấp trong nồi cơm có thể được sử dụng để nhỏ mắt, chữa đau mắt đỏ rất hiệu quả Ngoài ra, trong các cuộc điều tra tại huyện Hòa Vang và Đại Lộc vào năm 1983 và 1984, các cán bộ nghiên cứu đã phát hiện thêm nhiều công dụng khác của cây thuốc này, bao gồm chữa vết thương phần mềm, ngộ độc thức ăn, rối loạn tiêu hóa, tiêu chảy, viêm ruột và dạ dày.

Cây thuốc Thượng sử dụng các bộ phận như lá, vỏ rễ và vỏ thân để chữa trị nhiều bệnh Theo tài liệu, cây có công dụng hiệu quả trong việc điều trị đau mắt đỏ, mụn nhọt sưng tấy, đau bụng, tiêu chảy, kiết lỵ và cầm máu cho các vết thương ngoài da.

Cao thuốc Thượng không chỉ hiệu quả trong việc pha loãng để trị đau mắt đỏ mà còn có thể uống để điều trị các chứng đau bụng, bao gồm đau dạ dày, bệnh đường ruột, và thống kinh Ngoài ra, ngậm và nuốt cao này còn giúp cắt cơn hen suyễn Người dân cũng sử dụng cao nấu từ lá cây thuốc Thượng và cây găng voi để chữa các triệu chứng sưng, nóng, đỏ, đau do bệnh khớp Nước sắc lá thuốc Thượng được chứng minh có hiệu quả trong điều trị viêm nhiễm phụ khoa và bệnh trĩ, cả theo đường uống lẫn sử dụng ngoài.

Cao nấu từ lá, cành non được dùng để giảm đau do khối u chèn ép, giảm đau thắt ruột sau cai nghiện cũng thể hiện tác dụng tốt

1.5.3 Những nghiên cứu về cây thuốc Thượng ở Việt Nam

Năm 1991, Nguyễn Thị Nghĩa và cộng sự đã phân lập 7 alcaloid từ cây thuốc Thượng, bao gồm petalinemethin, doryphornin methyl ether, N-methylcorydaldin, argentinin, atherosperminin, 1S,1'R-7,7'-O,O'-dimethylgrisabin và 1S,1'R-7-O-methylgrisabin Nhóm nghiên cứu phát hiện rằng alcaloid toàn phần chiết từ lá cây này có hoạt tính kháng khuẩn, đặc biệt 1S, 1'R-7,7'-O,O'-dimethylgrisabin cho thấy hoạt tính kháng khuẩn mạnh với nồng độ ức chế tối thiểu đối với Bacillus subtilis là 62,5 ppm.

Theo nghiên cứu của Võ Duy Lê Sơn, P vienamensis Ban chứa 3,925% alcaloid toàn phần Năm 2014, Lê Thị Ngọc Ngân đã xác định rằng P vietnamensis Ban có chứa alcaloid, tinh dầu, polyphenol, triterpenoid và acid hữu cơ Từ cao chiết ethylacetat của lá P vienamensis Ban, Lê Thị Ngọc Ngân đã phân lập được ba hợp chất: pinoresinol, lyoniresinol và syringaresinol.

Nghiên cứu về chi Phaeanthus và các hợp chất đã phân lập cho thấy cây thuốc Thượng có tiềm năng trong điều trị viêm và đau Việc tìm hiểu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học, đánh giá độc tính và tác dụng chống viêm, giảm đau của cây thuốc này là cần thiết và mang lại ý nghĩa thực tiễn.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Vật liệu nghiên cứu

Cây thuốc Thượng được thu thập đầy đủ các bộ phận như rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt tại xã Hòa Nhơn, huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng vào các ngày 12/4/2015 và 16/6/2015.

- Tiêu bản được lưu giữ tại Phòng tiêu bản, Viện Dược liệu - NIMM (số hiệu DL-

130415) và Phòng Thực vật Dân tộc học, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (số hiệu PV 152206)

✓ Nguyên liệu chiết xuất và thử tác dụng sinh học

Cây thuốc Thượng thu được thu hoạch vào tháng 6 năm 2015, sau đó lá và thân cành được tách riêng, rửa sạch và phơi âm can Chúng được sấy khô ở nhiệt độ 40 độ C và bảo quản trong túi PE cùng bao bì kín Trước khi tiến hành ngâm chiết bằng methanol, mẫu nghiên cứu được xay thành bột thô.

Dịch chiết được sử dụng trong nghiên cứu độc tính và tác dụng sinh học bằng cách sắc dược liệu với nước ba lần, sau đó cô đặc thành cao lỏng với tỷ lệ 1:1 (1 kg dược liệu khô tương ứng với 1 lít nước).

Khi sử dụng cô đặc hoặc pha loãng với nước cất, cần điều chỉnh theo yêu cầu thí nghiệm và tính toán liều lượng tương ứng với số gam dược liệu trên mỗi kg.

- Các hợp chất phân lập được từ thuốc Thượng dùng thử tác dụng gây độc tế bào ung thư và đánh giá hoạt tính kháng viêm

✓ Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

- Máy xét nghiệm sinh hoá tự động Chemix 180, hãng Sysmex (Nhật Bản)

- Máy xét nghiệm huyết học tự động XE 2100, hãng Sysmex (Nhật Bản)

- Máy đo thể tích bàn chân chuột Plethysmometer, Cat No 7140, hãng Ugo Basile (Ý)

- Máy đo giảm đau áp lực bàn chân chuột Paw Pressure Analgesy Meter, Cat No

- Cân phân tích CP224S, hãng Sartorius (Đức)

- Bộ dụng cụ mổ động vật cỡ nhỏ và các dụng cụ thí nghiệm khác

The Agilent 1200 HPLC system features a J’sphere H-80 column with dimensions of 20 × 250 mm, complemented by a pre-coated thin layer DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715) and RP18 F254S (Merck) It utilizes silica gel (Kieselgel 60, 70-230 mesh and 230-400 mesh, Merck) and employs a reverse phase with RP-18 particles sized at 30-50 µm from Fujisilysia Chemical Ltd., as well as Diaion HP-20 from Mitsubishi Chemical Industries Co., Ltd.

Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS được thực hiện trên máy Agilent 6550 iFunnel Q-TOF LC/MS, trong khi phổ NMR được ghi nhận trên máy Varian MR-400FT-NMR với chất chuẩn nội là TMS.

Phổ CD được ghi nhận bằng máy quang phổ Chirascan TM CD (Applied Photophysics Ltd., Surrey, Vương quốc Anh), trong khi độ quay cực được đo bằng máy JASCO P-2000 polarimeter tại Viện Hóa sinh biển thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

✓ Động vật, tế bào thí nghiệm

Chuột nhắt trắng trưởng thành thuộc chủng Swiss albino, không phân biệt giới tính, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm với trọng lượng trung bình mỗi con là 20,0 ± 2,0 g, được cung cấp bởi Ban chăn nuôi - Học viện Quân y.

- Chuột cống trắng trưởng thành chủng Wistar, không phân biệt giống, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, cân nặng trung bình mỗi con 200,0 ± 20,0 g, do Ban chăn nuôi

- Học viện Quân y cung cấp

- Các dòng tế bào: HepG2 (tế bào ung thư gan), MCF-7 (tế bào ung thư vú), LU-

1 (tế bào ung thư phổi), Jurkat (tế bào lympho), BV2 (tế bào tiểu thần kinh) do Trường Đại học Hawaii, US và Trường Đại học Milan, Italia cung cấp

✓ Thuốc thử và hóa chất

- Carrageenan, completed freund adjuvant (CFA), diclofenac của hãng Sigma (Hoa Kỳ)

- Dung dịch xét nghiệm máu ABX Minidil LMG của hãng ABX-Diagnostics (Thái lan)

- MTT: 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid, a tetrazol) của hãng Sigma (Hoa Kỳ)

- Môi trường nuôi cấy tế bào: Dulbecco's modified Eagle’s medium (DMEM), RPMI-

1640 medium, fetal bovine serum (FBS), trypsin của GIBCO-BRL (Hoa Kỳ)

- Các hóa chất dung môi khác đạt tiêu chuẩn dược dụng

Dung môi được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm CDCl3 và CD3OD, với việc lựa chọn dung môi phụ thuộc vào bản chất của từng mẫu Nguyên tắc quan trọng là dung môi phải hòa tan hoàn toàn mẫu thử để đảm bảo độ chính xác trong phân tích.

Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Th ẩ m đị nh tên khoa h ọc và xác định đặc điể m vi h ọ c

- Quan sát và mô tả đặc điểm hình thái thực vật, điều kiện sinh trưởng và phát triển của cây thuốc Thượng tại thực địa

- Thu hái, làm tiêu bản mẫu cây và lưu giữ tiêu bản

Giám định tên khoa học của cây thuộc họ Annonaceae được thực hiện thông qua việc phân tích các đặc điểm hình thái thực vật, so sánh các khóa phân loại và bản mô tả các chi trong họ này, dưới sự hướng dẫn của các chuyên gia phân loại thực vật.

- Nghiên cứu đặc điểm vi học: Cắt, làm tiêu bản vi phẫu và soi bột lá, thân, rễ

Quan sát và mô tả các đặc điểm của tiêu bản dưới kính hiển vi Leica Wetzlar GmbH và kính soi nổi Krussoptroni, cùng với việc chụp ảnh bằng máy ảnh kỹ thuật số Canon Tất cả các hoạt động này được thực hiện tại Khoa Tài nguyên Dược liệu thuộc Viện Dược liệu.

Nơi tiến hành nghiên cứu: Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2.2.1 Phương pháp phân lập các hợp chất

✓ Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60

F254 (Merck 1,05715) và RP18 F254S (Merck) được sử dụng để phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm Ngoài ra, có thể sử dụng dung dịch sulfuric acid 10% phun đều lên bản mỏng, sau đó sấy khô và hơ nóng từ từ cho đến khi xuất hiện màu sắc.

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel (Kieselgel 60, 70-

230 mesh và 230-400 mesh, Merck); pha đảo sử dụng loại RP-18 có cỡ hạt là 30-

50 m (Fujisilysia Chemical Ltd.); Diaion HP-20 (Misubishi Chemical Indutries Co., Ltd.)

✓ Tinh chế các hợp chất

Các hợp chất được tinh chế bằng thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Agilent 1200 với cột J’sphere kích thước 20 × 250 mm, H-80 Việc lựa chọn điều kiện dung môi phù hợp để phân tách các hợp chất phụ thuộc vào bản chất của chúng.

2.2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc

Cấu trúc hóa học của hợp chất hữu cơ thường được xác định thông qua việc ứng dụng các phương pháp phổ kết hợp Tùy thuộc vào độ phức tạp của cấu trúc hóa học, việc lựa chọn các phương pháp phổ phù hợp là rất quan trọng Đối với những hợp chất có cấu trúc phức tạp, yêu cầu phối hợp nhiều phương pháp phổ sẽ cao hơn Trong một số trường hợp, để xác định chính xác cấu trúc hóa học, cần kết hợp với các phương pháp khác như chuyển hóa hóa học và phương pháp sắc ký so sánh.

✓ Phổ khối lượng (Mass spectroscopy-MS)

Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS cho phép xác định khối lượng phân tử với độ chính xác cao

✓ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) là phương pháp hiện đại và hiệu quả nhất để xác định cấu trúc hợp chất Bằng cách kết hợp kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể phân tích cả cấu trúc lập thể của các phân tử.

Nguyên lý của các phương pháp phổ NMR, bao gồm phổ 1H-NMR và 13C-NMR, dựa trên sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân 1H và 13C dưới tác động của từ trường ngoài Sự cộng hưởng này được thể hiện qua độ dịch chuyển hóa học (chemical shift) Bên cạnh đó, đặc trưng của phân tử còn được xác định thông qua tương tác spin giữa các hạt nhân với nhau (spin coupling).

Trong phổ 1 H-NMR, độ dịch chuyển hóa học (δ) của các proton được xác định trong khoảng từ 0 đến 14 ppm Mức độ lai hóa của nguyên tử và đặc trưng của độ dịch chuyển hóa học cùng với tương tác spin giúp chúng ta xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất.

Phổ vạch carbon cung cấp tín hiệu đặc trưng cho từng nguyên tử carbon, với mỗi nguyên tử cộng hưởng trong một trường khác nhau, tạo ra các tín hiệu phổ khác nhau Thang đo phổ 13C-NMR được tính bằng ppm, với dải thang độ rộng từ 0 đến 230 ppm.

✓ Phổ DEPT (Distortionless Enhancement By Polarisation Transfer)

Phổ này cho ta tín hiệu phân loại các loại carbon khác nhau Trên phổ DEPT

135 o , carbon bậc 4 không có tín hiệu, tín hiệu CH và CH3 quay lên phía trên và

CH2 quay xuống phía dưới Trên phổ DEPT 90 0 chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của các

✓ Phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence)

Thông tin tín hiệu trên phổ HSQC cho biết các tương tác trực tiếp H-C trong phân tử Trên phổ một là trục phổ 1 H-NMR, còn trục kia là 13 C-NMR

Phổ này cung cấp thông tin về tín hiệu của các proton liên kết trực tiếp với carbon kề nhau, cho phép phân tích và kết nối các phần cấu trúc trong phân tử một cách hiệu quả.

✓ Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation)

Phổ HMBC cung cấp thông tin về các tương tác xa giữa các dị hạt nhân thông qua 2-3 liên kết Việc phân tích các tín hiệu trên phổ này cho phép xác định cấu trúc của từng phần hoặc toàn bộ phân tử.

✓ Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy)

Phổ này cung cấp thông tin về tín hiệu của các proton tương tác trong không gian không bị che khuất, cho phép xác định cấu trúc không gian và cấu hình của một nhóm nguyên tử trong phân tử.

✓ Phổ lưỡng sắc tròn (CD)

Phổ CD được ghi nhận bằng máy quang phổ Chirascan TM CD (Applied Photophysics Ltd., Surrey, UK) tại Viện Hóa sinh biển thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

✓ Độ quay cực ([α]) Độ quay cực được đo trên máy Jasco DIP-370 automatic polarimeter của Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2.2.3 Phân lập các hợp chất từ lá cây thuốc Thượng

Lá cây thuốc Thượng (P vietnamensis Ban) được xử lý bằng cách phơi khô và nghiền nhỏ (3,0 kg), sau đó chiết siêu âm với methanol (3 lần × 10 L, 2 giờ ở 50°C) Sau khi cất loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được 210 g cặn chiết methanol Cặn này được phân bố trong dung dịch acetic acid 5% (3,0 L) và chiết lần lượt với n-hexan, chloroform và EtOAc, thu được các cặn chiết tương ứng là n-hexan (PL1; 14,0 g), chloroform (PL2; 25,0 g), EtOAc (PL3; 3,0 g) và H2O (PL4).

168,0 g) Lớp nước được trung hòa bằng dung dịch NH4OH, sau đó chiết với chloroform, cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cặn chloroform (PL4A;

30,0 g) và lớp nước còn lại

Cặn chiết PL2 được phân tách trên cột silica gel bằng hệ dung môi n-hexan-aceton (40:1→1:1, v/v), tạo ra 5 phân đoạn PL2A-PL2E Phân đoạn PL2B được tiếp tục phân tách trên cột sắc ký silica gel pha đảo RP-18, sử dụng dung môi MeOH-H2O (7:1, v/v) để thu được 4 phân đoạn PL2B1-PL2B4 Cuối cùng, sắc ký phân đoạn PL2B2 được thực hiện trên hệ thống HPLC với cột J’sphere, ODS H-80.

250 × 20 mm, với tốc độ dòng 4 mL/phút, pha động 45 % acetonitril thu được các hợp chất PV10 (3,4 mg) và PV12 (4,0 mg)

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Kết quả nghiên cứu về thực vật

3.1.1 Đặc điểm hình thái thực vật Đặc điểm hình thái của loài thuốc Thượng-Phaeanthus vietnamensis Ban

Hình 3.1 Một số đặc điểm hình thái cây thuốc Thượng

1 Cành mang lá; 2 Nụ hoa; 3 Cuống hoa và đế hoa; 4 Các cánh hoa; 5 Bộ nhụy; 6 Các lá noãn đính trên đế hoa; 7 Nhị hoa; 8 Lá noãn ; 9 Cụm quả non; 10 Cụm quả chín; 11 Quả;

Cây bụi hoặc cây gỗ nhỏ, cao từ 3-7 m, có thân phân cành và vỏ hơi xù xì, không có lông Lá cây đơn, mọc cách, không có lá kèm, có hình mác-thuôn với đầu lá thuôn nhọn hoặc có đuôi, gốc lá hình nêm hơi lệch hoặc tù Hai mặt lá không có lông, mép lá nguyên và gân lá dạng lông chim nổi rõ ở mặt dưới, với 7-11 đôi gân bên cong hình cung và hơi vấn hợp gần mép, gân phụ hình mạng, cuống lá ngắn.

Hoa có kích thước 5-8 mm, không có lông, lưỡng tính và mọc so le với lá, thường thành xim 2 hoa Cuống chung dài từ 0,5-1,0 cm, cuống hoa dài 1,5-3,0 cm, có lông thưa và mang 4-6 lá bắc nhỏ hình mác hoặc tam giác Lá bắc dưới cùng dài 3-4 mm, trong khi các lá bắc còn lại dài từ 1-2,5 mm Hoa có 6 cánh, không đều nhau, xếp van thành 2 vòng; cánh hoa ngoài nhỏ giống lá đài, hình mác, dài trên 1 mm và có lông Cánh hoa trong lớn hơn, kích thước 10-15×5-10 mm, hình trứng, bên ngoài màu vàng, mặt trong hơi trắng và gốc cánh hoa có màu tía hoặc hơi tím, các cánh hoa đính nhau bởi mép tạo thành mũ.

Nhị nhiều, dài từ 0,6-1,0 mm; mào trung đới hình đĩa hơi lồi Lá noãn nhiều (trên

Kích thước của quả từ 1,2-1,8×0,5-0,7 mm, với bầu có lông và nhụy hình đầu có túm lông mảnh, không có vòi lá noãn Quả phân rời nhau, có cuống dài từ 2-2,5 cm, hình bầu dục hoặc trái xoan, kích thước 1,5-1,8×0,8-1,2 cm, không có lông và khi chín có màu vàng, với 2 khía hằn sâu dọc theo 2 lá mầm khi khô Vỏ quả mỏng và tách biệt với vỏ hạt, hạt hình bầu dục, kích thước 1,5-1,8×0,8-1,2 cm, có 2 khía dọc nông.

3.1.2 Thẩm định tên khoa học

Phân tích đặc điểm hình thái của các mẫu thuốc được thu thập tại xã Hòa Nhơn, huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng diễn ra vào tháng 4 và tháng 6 năm 2015, trong thời điểm cây ra hoa và có quả.

Kết quả phân tích cho thấy các mẫu nghiên cứu thuộc họ Annonaceae-Na có đặc điểm như lá nguyên mọc cách, xếp thành 2 dãy trên một mặt phẳng, bao hoa mẫu 3, nhị nhiều hướng ngoài, lá noãn nhiều và rời, cùng quả gồm nhiều phân quả rời trên đế quả lồi So sánh với khóa phân loại và bản mô tả các chi của họ Annonaceae, các mẫu này được xác định thuộc chi Phaeanthus nhờ vào các đặc điểm như cánh hoa hình 3 cạnh, gốc rộng, cánh hoa ngoài tương tự lá đài, noãn 1-2 đính gốc và vỏ quả mỏng.

Sử dụng khóa phân loại của Mols & Kessler cùng với bản mô tả đã xác định tên khoa học của mẫu nghiên cứu là Phaeanthus vietnamensis Ban Loài này có những đặc điểm đặc trưng như lá bắc dưới cùng dài 3-4 mm, các lá bắc còn lại dài từ 1-2,5 mm, nhị có mào trung đới hình đĩa hơi lồi và lá noãn nhiều hơn 10.

Kết quả nghiên cứu đã được kiểm định bởi TS Bùi Văn Thanh từ Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật (tiêu bản PV 152206) cùng với ThS Nguyễn Quỳnh Nga và ThS Hoàng Văn Toán thuộc Khoa Tài nguyên Dược liệu - Viện Dược liệu (tiêu bản DL-130415).

3.1.3 Đặc điểm giải phẫu 3.1.3.1 Rễ

Lớp bần là lớp ngoài cùng, bong tróc và uốn lượn, bao gồm nhiều lớp tế bào hình chữ nhật Mô mềm vỏ chứa nhiều lớp tế bào hình bầu dục hoặc đa giác, với thành mỏng và chứa các bó libe Bó sợi libe có tế bào thành dày, kết tầng tạo thành chùy không đều Gỗ cấp 2 được cấu tạo từ các tế bào hình đa giác tròn, có thành dày và liên kết với nhau thành các dải, ngăn cách bởi tia tủy Tia tủy bao gồm 2-4 hàng tế bào hình chữ nhật với thành hóa gỗ Cuối cùng, gỗ cấp 1 tạo thành cụm 2-3 bó mạch.

Hình 3.2 Vi phẫu rễ cây thuốc Thượng

Hình 3.3 Vi phẫu thân cây thuốc Thượng

Vi phẫu thân có cấu trúc với diện tích tròn, trong đó biểu bì bong tróc dính với bần, bao gồm nhiều lớp tế bào hình chữ nhật với vách uốn lượn Mô dày chứa các tế bào hình bầu dục hoặc đa giác, có kích thước không đồng nhất Mô mềm vỏ được cấu thành từ các tế bào thành mỏng Bó sợi libe nằm trên đầu các bó libe hoặc tạo thành các lớp sợi xen kẽ với mô mềm Gỗ cấp 2 liên tục tạo thành các dải vòng đồng tâm, chiếm phần lớn diện tích vi phẫu, với mạch gỗ hình đa giác tròn, kích thước không đều và thành dày, bị phân cắt bởi tia tủy Tia tủy bao gồm 2-4 hàng tế bào hình chữ nhật, có thành tế bào hóa gỗ Gỗ cấp 1 tập trung thành cụm 2-3 bó, mỗi bó chứa 2-3 mạch, nằm rải rác Vùng mô mềm tủy chứa các tế bào đa giác hoặc gần tròn, kích thước không đều và sắp xếp lộn xộn.

2 Mô mềm trên 7 Mô cứng dưới

3 Mô cứng trên 8 Mô mềm dưới

4 Mô mềm ruột 9 Biểu bì dưới

Hình 3.4 Cấu tạo giải phẫu lá cây thuốc Thượng

Gân lá có cấu trúc đặc trưng với mặt trên hơi lõm và mặt dưới lồi rõ Từ ngoài vào trong, lớp biểu bì (1) được tạo thành từ một hàng tế bào có màng ngoài phủ lớp cutin mỏng và có lông che chở đa bào (10) Bên dưới là mô mềm (2), (8) với các tế bào hình đa giác không đều nhau và thành tế bào mỏng Bao quanh bó mạch của gân lá là mô cứng với các tế bào hóa gỗ có thành dày (3), (7) Mạch gỗ (5) chứa các tế bào hình đa giác hoặc hình bầu dục có kích thước không đều, sắp xếp chồng hoặc so le Libe (6) là các đám tế bào nhỏ không liên tục, nằm xen giữa lớp tế bào mô cứng và gỗ Cuối cùng, mô mềm ruột (4) gồm các tế bào hình đa giác hoặc gần tròn, với khoảng gian bào nhỏ ở giữa và các tế bào ở tâm có thành dày hóa gỗ.

3.1.4 Đặc điểm bột rễ , thân, lá 3.1.4.1 Bột rễ

Cảm quan: Bột rễ có màu ghi xám hơi vàng, nhiều xơ, mùi thơm nhẹ, vị đắng

- Soi dưới kính hiển vi thấy: (1) sợi gỗ và (2) bó sợi; (3) mảnh bần; (4) lông hút;

Mảnh mạch điểm và mảnh mạch xoắn là hai loại cấu trúc quan trọng trong nghiên cứu thực vật Bên cạnh đó, tinh thể canxi oxalat hình khối cũng đóng vai trò thiết yếu Ngoài ra, các hạt tinh bột hình cầu, có rốn hạt phân nhánh, thường xuất hiện đơn lẻ hoặc theo nhóm từ hai đến bốn, với kích thước dao động từ 30-50 μm, là những yếu tố cần được chú ý trong quá trình phân tích.

1 Sợi gỗ 5 Mảnh mạch điểm

2 Bó sợi 6 Mảnh mạch xoắn

Hình 3.5 Đặc điểm bột rễ cây thuốc Thượng 3.1.4.2 Bột thân

Cảm quan: Bột thân có màu ghi sáng hơi vàng, nhiều xơ, mùi thơm nhẹ, vị đắng

Dưới kính hiển vi, có thể quan sát thấy nhiều thành phần quan trọng như mảnh mạch vạch, mảnh mạch điểm, mảnh mạch xoắn, inh bột hình cầu với rốn hạt phân nhánh có kích thước từ 30-50 μm, inulin hình khối, mảnh vỏ (biểu bì) thân, sợi gỗ và mảnh màu nâu đỏ.

2 Mảnh mạch điểm 6 Biểu bì

3 Mảnh mạch xoắn 7 Sợi gỗ

Hình 3.6 Đặc điểm bột thân cây thuốc Thượng

1 Mảnh mô giậu 6 Calci oxalat

2 Mảnh mạch xoắn 7 Biểu bì

4 Mảnh màu 9 Lông che chở

Hình 3.7 Đặc điểm bột lá cây thuốc Thượng

- Cảm quan: Bột lá có màu xanh đen, mùi thơm, vị đắng

Dưới kính hiển vi, có thể quan sát thấy các thành phần sau: mảnh mô giậu, mảnh mạch xoắn, các hạt tinh bột hình cầu có đường kính từ 30-50 μm và có rốn hạt phân nhánh, mảnh màu nâu đỏ, mảnh mô mềm, tinh thể calci oxalat hình khối, biểu bì mang lỗ khí, inulin dạng hình khối, và lông che chở đa bào.

Kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học

Từ lá loài thuốc Thượng đã phân lập được 15 hợp chất, PV1 - PV15

Từ thân cành loài thuốc Thượng đã phân lập được 06 hợp chất, TC1 - TC6

Phân tích phổ 1 H-NMR cho thấy có 6 hợp chất được phân lập từ thân cành của thuốc Thượng, tương ứng với 6 hợp chất đã được phân lập từ lá.

TC1 = PV8, TC2 = PV13, TC3 = PV14, TC4 = PV15, TC5 = PV2, TC6 = PV3

Hình 3.8 Cấu trúc hóa học của PV1 và hợp chất tham khảo (PV1a)

Hợp chất PV1 là bột màu trắng, vô định hình với độ quay cực [α]25D là -10,0 (c=0,01, CHCl3) Công thức phân tử của nó được xác định là C22H28O8 thông qua phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS tại m/z 443,1683 [M+Na]+, gần với giá trị tính toán lý thuyết 443,1676 cho công thức [C22H28O8Na]+ Phổ 1H-NMR cho thấy sự có mặt của 2 cặp proton thơm tại δH 6,02 và 6,41 (2H, s) cùng với 4 nhóm methoxy tại 3,70 (6H, s) và 3,81 (6H, s).

Phổ 13 C-NMR và HSQC cho thấy tín hiệu của 22 carbon, gồm có: 8 carbon không liên kết với hydro tại 131,2, 132,7, 134,3, 134,8, 146,8 × 2 và 146,9 × 2; 7 carbon methin tại 44,0, 51,8, 77,0, 103,0 × 2 và 105,0 × 2; 3 carbon methylen tại 40,1, 70,7 và 73,4; 4 carbon methyl tại 56,0 × 2 và 56,2 × 2

Dữ liệu phổ 1 H- và 13 C-NMR của PV1 rất giống với của hợp chất

(7S,8R,8'R)-3,3′-dimethoxy-9,9'-epoxylignan-4,4',7-triol (PV1a) [98] ngoại trừ sự có mặt thêm 2 nhóm methoxy tại C-5 và C-5 Tương tác HMBC giữa H-9 (δ H

4,33) và C-8 (δ C 51,8)/C-9 (δ C 70,7) gợi ý sự có mặt của vòng tetrahydrofuran trong PV1 và nhóm hydroxyl tại C-7 Điều này cũng được xác nhận bởi tương tác

COSY giữa H-7 (δ H 4,33)/H-8 (δ H 2,20)/H-9 (δ H 3,99), cũng như H-7ʹ (δ H 2,19 và 2,42)/H-8ʹ (δ H 2,06)/H-9ʹ (δ H 3,48 và 3,89) Tương tác HMBC giữa H-2(6) (δ H

Cấu trúc của hợp chất mới PV1 đã được xác định với vị trí của hai nhóm methoxy và một nhóm hydroxyl tại các vị trí C-3, C-5 và C-4 của vòng benzen Cụ thể, hợp chất này được xác định là 3,5-dimethoxy-4-hydroxybenzen tại C-7ʹ Cấu hình tuyệt đối của PV1 được xác định thông qua phân tích phổ NOESY và CD, cho thấy hiệu ứng Cotton dương tại 208 nm, tương tự như hợp chất ligalbumosid D (PV1b), khẳng định cấu hình tại C-7 là R Sự tương tác NOESY giữa H-7 và các proton H-2/H-6 cũng như H-8ʹ đã giúp xác định chúng nằm cùng phía của vòng tetrahydrofuran (cấu hình β) Từ những dữ liệu này, PV1 được xác định là (7S,8R,8'R)-3,5,3′,5'-tetramethoxy-4,4',7-trihydroxy-9,9'-epoxylignan.

Hình 3.9 Các tương tác HMBC và NOESY chính của hợp chất PV1

Hình 3.10 Phổ CD của hợp chất PV1

Bảng 3.1 Số liệu phổ 1 H- và 13 C-NMR của PV1

Hình 3.11 Phổ HR-ESI-MS của hợp chất PV1

Hình 3.12 Phổ 1 H-NMR của hợp chất PV1

Hình 3.13 Phổ 13 C-NMR của hợp chất PV1

Hình 3.14 Phổ HSQC của hợp chất PV1

Hình 3.15 Phổ HMBC của hợp chất PV1

Hình 3.16 Phổ COSY của hợp chất PV1

Hình 3.17 Phổ NOESY của hợp chất PV1

Hình 3.18 Cấu trúc hóa học của hợp chất PV2

Hợp chất PV2 được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu trắng với độ quay cực [α]25D là +30,6 (c=0,1, CHCl3) Phân tích phổ NMR cho thấy hợp chất này có cấu trúc đối xứng Cụ thể, trong phổ 1H-NMR của PV2, tín hiệu 3,5-dimethoxy-4-hydroxyphenyl xuất hiện tại δH 6,30 (s, 2H) và 3,72 (s, 6H).

Phổ 13 C-NMR và DEPT cho thấy tín hiệu cộng hưởng của 11 carbon, gồm có: 4 carbon không liên kết với H tại δ C 133,1, 134,4 và 149,0 × 2; 3 nhóm methin tại δ C 44,0 và 107,1 × 2; 2 nhóm methylen tại δ C 36,7 và 62,2; 2 nhóm methoxy đối xứng tại δ C 56,5 Phân tích số liệu phổ NMR của PV2 gợi ý sự có mặt của phần aglycon syringoyl, đồng thời so sánh 1D-NMR của PV2 rất giống với của hợp chất 8R,8Rʹ-bishydrosyringenin [81]

Trên phổ HMBC nhận thấy tương tác HMBC giữa H-7 (δH 2,50 và 2,68) với C-2/C-6 (δC 107,1) của vòng thơm và C-8 (δC 44,0), C-9 (δC 62,2) Bên cạnh đó, tương tác giữa H-2/H-6 (δ H 6,30) với C-1 (δ C 133,1), C-3/C-5 (δ C 149,0), C-

Hợp chất PV2, có công thức phân tử C22H30O8, được xác định thông qua phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS với giá trị m/z tại 421,1853 [M-H] - và 457,1621 [M+Cl] - Sự tương tác HMBC giữa H-9 và các carbon C-7, C-8 cho thấy vị trí của hai nhóm hydroxy tự do tại C-9 Theo tài liệu tham khảo, PV2 có cấu trúc đối xứng qua liên kết C-8-C-8ʹ Cấu trúc của PV2 được xác định là 8R,8ʹR-bishydrosyringenin, đây là hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ chi Phaeanthus.

Bảng 3.2 Số liệu phổ 1 H- và 13 C-NMR của PV2 và hợp chất tham khảo

9 61,7 62,2 3,54 (dd, 5,6, 10,8) 3,5-OMe 56,0 56,5 3,72 (s) a) Đo trong CD 3 OD, # δ C của 8R,8Rʹ-bishydrosyringenin đo trong CD 3 OD [81]

Hình 3.19 Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC chính của PV3

Hợp chất PV3 được tinh chế dưới dạng tinh thể không màu với độ quay cực [ ] 25 D : +20,0 (c=0,12, MeOH) Công thức phân tử của PV3 được xác định là C22H28O8 dựa trên phân tích phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS, cho giá trị m/z 419,1711 [M-H] - (so với giá trị tính toán cho công thức [C22H27O8] - là 419,1718) Phổ 1 H-NMR của PV3 cho thấy sự xuất hiện của các tín hiệu đặc trưng.

Bài viết mô tả cấu trúc hóa học của một hợp chất, trong đó có 2 cặp proton olefin tại δH 6,60 (2H, s) và 6,48 (2H, s), cùng với ba proton oxymethin tại δH 4,75 (1H, d, J = 6,8 Hz), 2,72 (1H, m) và 2,36 (1H, m) Ngoài ra, hợp chất còn chứa 4 nhóm methoxy với tín hiệu tại δH 3,72 (6H, s) và 3,81 (6H, s) Phổ 13C-NMR và DEPT của PV3 cho thấy sự hiện diện của 22 carbon, bao gồm 8 carbon không liên kết với hydro tại δC.

Hợp chất PV3 có thể được dự đoán là tetrahydrofuran lignan dựa trên các số liệu phổ, bao gồm các giá trị δC 132,8, 134,8, 135,8, 135,9, 149,2 × 2, 149,3 × 2 cho methin carbon, cũng như δC 43,8, 54,2, 84,2, 104,2 × 2, 106,9 × 2 cho methin carbon Các nhóm methoxy được xác định với 2 nhóm đối xứng tại δC 56,7 × 2 trong mỗi vòng Vị trí của các nhóm methoxy tại C-3/C-5 và hydroxy tại C-4 được khẳng định thông qua các tương tác HMBC giữa proton methoxy (δH 3,81) với C-3/C-5 (δC 149,2) và giữa H-2/H-6 (δH 6,60) với C-4 (δC 135,9), cũng như giữa H-7 (δH 4,75) với C-1 (δC 135,0)/C-2/C-6.

104,2) Tương tự, tương tác HMBC giữa proton methoxy (δH 3,72) với C-3/C-5

Sự tương tác giữa δC 149,3 và H-2’/H-6’ (δH 6,48) với C-4’ (δC 134,8) chỉ ra rằng hai nhóm methoxy nằm ở vị trí C-3’/C-5’, trong khi nhóm hydroxy được xác định nằm tại C-4’ của vòng thơm Vị trí của nhóm hydroxy tại C-9 được xác định thông qua độ chuyển dịch hóa học 13C-NMR của C-9 (δC 60,5) cùng với tương tác HMBC giữa H-9 (δH 3,64).

3,83) với C-7 (δC 84,2)/C-8 (δC 34,2)/C-8 (δC 43,8) Từ số liệu phổ của hợp chất

Hợp chất PV3 được so sánh với (+)-5,5'-dimethoxylariciresinol và cho thấy sự tương đồng, do đó được xác định là (+)-5,5'-dimethoxylariciresinol Đây là lần đầu tiên hợp chất này được phát hiện trong chi Phaeanthus.

3,98 (dd, 6,4, 8,4) 3,5-OMe 56,3 56,7 3,72 (s) a) Đo trong CD 3 OD, # δ C của (+)-5,5'-dimethoxylariciresinol đo trong CDCl 3 [50]

Hình 3.20 Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC chính của PV4

Hợp chất PV4 được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu trắng với độ quay cực [ ]α 25 D : +69,0 (c=0,1, MeOH) Phổ 1H-NMR của PV4 cho thấy tín hiệu ba proton trong hệ tương tác ABX tại các hóa trị δH 6,75 (1H, d, J = 8,0 Hz), 6,78 (1H, dd, J = 2,0, 8,0 Hz), 6,92 (1H, d, J = 2,0 Hz) và ba proton của nhóm methoxy tại 3,83 (s).

Phổ 13 C-NMR và DEPT cho thấy tín hiệu cộng hưởng của 10 carbon, gồm có: 3 carbon không liên kết với H tại δ C 133,8, 149,1 và 147,3; 5 nhóm methin tại δ C 55,4, 87,5, 111,1, 116,1 và 120,0; 1 nhóm methylen tại δ C 72,6; 1 nhóm methoxy tại δ C 56,4 Phân tích số liệu phổ NMR của PV4 gợi ý sự có mặt của phần aglycon syringoyl Trên phổ HMBC nhận thấy tương tác giữa H-7 (δH 4,68) với C-2 (δC 111,1)/C-6 (δC 120,0) của vòng thơm và C-8 (δC 55,4), C-9 (δC 72,6) cho phép xác định vị trí và quy kết giá trị độ dịch chuyển hóa học tại C-2, C-

Tương tác giữa H-2 (δH 6,92) và H-6 (δH 6,78) với các carbon C-1 (δC 133,8), C-3 (149,1), C-4 (δC 147,3) và C-5 (δC 116,1) đã xác định vị trí và giá trị độ chuyển dịch của các carbon trong vòng thơm Các nhóm methoxy và hydroxy được xác định lần lượt tại C-3 và C-4 thông qua tương tác HMBC giữa proton của nhóm methoxy (δH 3,83) với C-3 (δC 149,1) và từ H-2 (δH 6,92), H-5 (δH 6,75), H-6 (δH 6,78) tới C-4 (δC 147,3) Dựa vào số liệu phổ, cùng với sự hiện diện của nhóm oxymethin tại C-7 (δC 87,5) và oximethylen tại C-9 (δC 72,6), có thể dự đoán hợp chất là tetrahydrofuran lignan với cấu trúc đối xứng So sánh số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của PV4 với hợp chất (+)-pinoresinol cho thấy sự tương đồng hoàn toàn.

Từ những dữ liệu trên xác nhận PV4 chính là hợp chất (+)-pinoresinol

3ʹ-OMe 56,4 56,4 3,83 (s) a) Đo trong CD 3 OD, # δ C của (+)-pinoresinol đo trong CD 3 OD [94]

3.2.5 H ợ p ch ấ t PV5: 8 α -hydroxyoplop-11(12)-en-14-on (ch ấ t m ớ i)

Hình 3.21 Cấu trúc hóa học của hợp chất PV5 và hợp chất tham khảo

Kết quả nghiên cứu độc tính và tác dụng sinh học

3.3.1 Độc tính cấp và bán trường diễn của CL1 và CL2 3.3.1.1 Độc tính cấp của cao lỏng CL1 (cao lỏng lá cây thuốc Thượng)

Kết quả được trình bày ở Bảng 3.16

Bảng 3.16 Độc tính cấp theo đường uống của CL1 trên chuột nhắt trắng

TT Lô Liều sử dụng

(g /kg) Số chuột chết* % chuột chết*

*Số chuột chết đếm được sau khi uống CL1 đến ngày thứ 3;

Các lô chuột được cho uống với các liều dược liệu tăng dần từ 75 đến 210 g/kg Tại các liều này, chuột bị kích thích, tăng vận động, một số xuất hiện co giật mạnh và tử vong trong vòng 20 phút, trong khi một số khác chỉ co giật nhẹ và hồi phục Những chuột không chết thường hồi phục nhanh chóng, phân khuôn và hoạt động bình thường Giải phẫu các chuột chết ngay lập tức và những chuột sống sau thí nghiệm cho thấy các tạng đều bình thường, không có dấu hiệu xung huyết hay hoại tử Nguyên nhân tử vong có thể do liều cao gây kích thích mạnh hệ thần kinh, dẫn đến co giật, suy hô hấp và tử vong.

Kết quả về số chuột chết phụ thuộc vào mức liều dùng của CL1, được thể hiện qua Hình 3.50 Trục tung biểu thị mức liều dùng của CL1 (g/kg), trong khi trục hoành thể hiện tỷ lệ phần trăm chuột chết ở mỗi mức liều Mối tương quan giữa mức liều và phần trăm chuột chết rất chặt chẽ với hệ số R² = 0,9632, được mô tả bằng phương trình y = 84,35e^(0,0095x).

Từ đó tính được giá trị LD 50 : LD50 = 84,35 × 2,720,0095 × 50 = 135,63 (g/kg)

Giới hạn tin cậy của LD50 được xác định với hệ số tin cậy f = 1,14 Tại ngưỡng xác suất p = 0,05, giới hạn tin cậy dưới (ld) và giới hạn tin cậy trên (lt) của LD50 được tính toán như sau: giới hạn tin cậy dưới là lt = LD50 : f = 135,63 : 1,14 = 118,97 (g/kg), trong khi giới hạn tin cậy trên là ld = LD50 × f = 135,63 × 1,14 = 154,62 (g/kg).

Vậy giá trị LD50 của CL1 theo đường uống trên chuột nhắt là:

Hình 3.50 Ảnh hưởng của cao lỏng CL1 lên số chuột chết

Theo thang đo độc tính của Sterner, giá trị LD50 > 15g dược liệu/kg được coi là tương đối vô hại Dân gian thường sử dụng 10g dược liệu/người/ngày, tương đương với 0,2g dược liệu/kg/ngày cho người có cân nặng trung bình 50kg Khi quy đổi sang chuột nhắt, liều tương ứng cao gấp 12 lần, tức là 2,4g/kg/ngày Điều này cho thấy LD50 cao gấp khoảng 56 lần liều dự kiến có tác dụng, chứng minh rằng cao chiết CL1 là an toàn về độc tính cấp.

3.3.1.2 Độc tính cấp của cao lỏng CL2 (cao lỏng thân cành cây thuốc Thượng)

Bảng 3.17 Độc tính cấp theo đường uống của CL2 trên chuột nhắt trắng

TT Lô Liều sử dụng

Số chuột chết (sau 3 ngày)

Số chuột chết (sau 7 ngày)

Các lô chuột được uống với liều tăng dần từ 250 đến 550 g/kg, trong đó liều tối đa là 550 g/kg Ở các mức liều này, chuột có hiện tượng đi ngoài phân nát nhưng vẫn duy trì hoạt động ăn uống và vận động bình thường Sau 3 ngày theo dõi, không có chuột nào chết sau 7 ngày uống thuốc Chưa xác định được LD50 của cao lỏng thân cành, nhưng liều tối đa chuột có thể dung nạp là 550 g/kg Theo thang đo của Sterner về độc tính, giá trị LD50 > 15 g thân cành/kg được phân loại là tương đối vô hại.

3.3.1.3 Kết quả nghiên cứu độc tính bán trường diễn của CL1 và CL2

✓ Ảnh hưởng của cao lỏng CL1 và CL2 lên tình trạng chung và sự thay đổi thể trọng của chuột cống khi dùng dài ngày a Tình trạng chung

Các chuột nghiên cứu được theo dõi hàng ngày về tình trạng sức khỏe tổng quát, bao gồm hoạt động, chế độ ăn uống, tình trạng lông, da, niêm mạc và chất tiết Kết quả cho thấy cả chuột trong nhóm chứng và nhóm sử dụng cao lỏng CL1 và CL2 (liều 1 là 2 g dược liệu/kg; liều 2 là 4 g dược liệu/kg) đều hoạt động bình thường, với lông mượt, da và niêm mạc khỏe mạnh, chế độ ăn uống ổn định và phân thành khuôn.

Kết quả được trình bày ở hình dưới đây

Hình 3.51 Ảnh hưởng của cao lỏng CL1 và CL2 lên thể trọng chuột cống

So sánh giữa các thời điểm cho thấy trọng lượng chuột ở tất cả các lô đều tăng, với sự thay đổi có ý nghĩa thống kê đạt p0,05).

Cao lỏng CL1 và CL2, với các liều lượng và thời gian sử dụng được nghiên cứu, không gây ảnh hưởng đến sự phát triển thể trọng của chuột.

✓ Ảnh hưởng của cao lỏng CL1 và CL2 đối với điện tim chuột

Bảng 3.18 Ảnh hưởng của cao lỏng CL1 và CL2 đối với điện tim chuột cống

Chỉ số Lô TN Ngày 0 Ngày 30 Ngày 60

LC 484,31±12,94 485,53±13,62 487,45±22,57 CL1.1 489,25±16,02 490,25±15,32 489,63±13,79 CL1.2 490,44±15,24 482,15±13,50 482,07±18,98 CL2.1 486,25±15,97 488,25±16,09 489,75±17,14 CL2.2 488,50±19,26 485,25±13,31 483,75±16,50

LC 0,310±0,048 0,310±0,043 0,314±0,044 CL1.1 0,309±0,035 0,313±0,025 0,313±0,035 CL1.2 0,313±0,038 0,311±0,038 0,316±0,048 CL2.1 0,311±0,024 0,314±0,022 0,313±0,027 CL2.2 0,314±0,043 0,311±0,045 0,316±0,048

LC = Lô chứng (chuột uống nước cất); CL1.1 = Lô CL1 liều 2 g/kg;

CL1.2 = Lô CL1 liều 4 g/kg; CL2.1 = Lô CL2 liều 2 g/kg; CL2.2 = Lô CL2 liều 4g/kg;

- So sánh các lô với nhau trong cùng một thời điểm, tần số và biên độ của điện tim chuột không có sự thay đổi có ý nghĩa thống kê (p>0,05)

- So sánh trong từng lô giữa các thời điểm thí nghiệm, tần số và biên độ của điện tim chuột không có sự thay đổi ý nghĩa thống kê (p>0,05)

- Không có sóng bất thường trên điện tim của các lô chuột

Cao lỏng CL1 và CL2, khi được sử dụng với các liều lượng và thời gian nghiên cứu đã xác định, không gây ra sự thay đổi nào trên điện tim của chuột.

✓ Ảnh hưởng của cao lỏng CL1 và CL2 đối với một số chỉ tiêu huyết học

Kết quả được trình bày ở bảng dưới đây

Bảng 3.19 Ảnh hưởng của cao lỏng CL1 và CL2 lên một số chỉ tiêu huyết học

LC 7,43±4,18 8,16±1,89 7,53±2,23 CL1.1 7,94±2,90 7,73±1,59 7,84±2,11 CL1.2 7,34±2,54 7,95±2,57 7,50±1,55 CL2.1 7,74±1,98 7,63±2,47 7,49±3,48 CL2.2 8,11±3,39 8,03±1,90 7,99±2,25

LC 6,94±1,43 7,24±0,42 6,84±0,57 CL1.1 7,27±0,62 6,74±0,55 7,02±0,91 CL1.2 7,92±0,24 7,44±0,46 7,18±0,48 CL2.1 7,51±0,72 6,89±0,44 7,15±0,56 CL2.2 7,72±0,51 7,07±0,42 6,95±0,69

LC 400,25±15,06 406,63±0,22 478,25±53,52 CL1.1 417,13±141,94 434,63±87,53 503,88±35,17 CL1.2 433,00±103,60 430,38±61,85 495,88±101,26 CL2.1 472,13±98,13 417,75±59,59 474,25±208,14 CL2.2 432,25±96,72 456,88±78,04 495,25±80,66

LC 118,88±26,54 123,25±9,78 118,88±1,41 CL1.1 128,63±11,36 119,63 ±8,00 126,13±14,88 CL1.2 136,63±14,34 131,25 ±8,24 129,13±7,43 CL2.1 131,88±17,14 120,00 ±9,94 126,00±2,18 CL2.2 133,88±15,86 125,63 ±8,33 125,00±8,80

Kết quả theo dõi các chỉ tiêu huyết học cho thấy, sau 30 và 60 ngày sử dụng cao lỏng CL1 và CL2, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở các xét nghiệm như số lượng bạch cầu, hồng cầu, tiểu cầu và nồng độ hemoglobin so với lô chứng cũng như so với giá trị ban đầu trước khi dùng thuốc (p>0,05) Điều này cho thấy cao lỏng CL1 và CL2, với liều lượng và thời gian sử dụng trong nghiên cứu, không gây ra thay đổi nào đáng kể trên các chỉ tiêu huyết học.

✓ Đánh giá ảnh hưởng của cao lỏng CL1 và CL2 đối với các chỉ số thuộc chức năng gan và thận

Kết quả được trình bày ở bảng dưới đây

Bảng 3.20 Ảnh hưởng của cao lỏng CL1 và CL2 đối với chức năng gan và thận

LC 59,36±12,96 59,80±20,83 57,89±19,30 CL1.1 63,49±21,49 62,59±13,65 64,89±15,29 CL1.2 53,63±9,75 62,24±23,59 63,48±12,25 CL2.1 54,51±13,05 60,41±19,69 56,46±13,78 CL2.2 60,35±21,82 57,88±13,04 61,13±19,55

LC 144,58±32,54 128,91±22,80 145,31±23,11 CL1.1 153,10±16,35 146,31±27,07 150,09±28,49 CL1.2 155,60±29,45 130,53±33,12 149,23±33,32 CL2.1 157,78±24,50 145,53±28,43 136,23±18,87 CL2.2 157,08±27,23 143,08±12,72 140,36±34,64

LC 21,79±13,92 24,00±8,83 28,61±25,03 CL1.1 25,69±20,54 24,53±7,78 29,45±21,28 CL1.2 24,68±20,40 23,14±17,63 22,24±21,70 CL2.1 20,89±15,87 25,25±14,94 24,66±15,41 CL2.2 23,86±18,70 21,36±17,93 33,60±11,06

LC 2,61±0,32 2,72±0,11 2,75±0,35 CL1.1 2,63±0,15 2,73±0,25 2,74±0,21 CL1.2 2,65±0,23 2,89±0,37 2,86±0,54 CL2.1 2,59±0,29 2,91±0,35 2,70±0,11 CL2.2 2,82±0,39 2,67±0,14 2,95±0,53

LC 77,34±16,65 69,54±4,35 77,18±14,34 CL1.1 81,41±24,83 70,44±5,12 72,76±13,14 CL1.2 84,95±13,06 75,01±11,04 71,66±13,46 CL2.1 77,85±22,67 69,99±8,67 66,05±24,58 CL2.2 82,58±10,30 77,51±11,58 74,65±15,18

Kết quả nghiên cứu cho thấy, sau 30 và 60 ngày sử dụng cao lỏng thuốc thượng, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về chức năng gan và thận so với nhóm chứng, cũng như so với các chỉ số trước khi sử dụng (p>0,05) Điều này chỉ ra rằng cao lỏng CL1 và CL2, với các liều lượng và thời gian sử dụng trong nghiên cứu, không làm thay đổi các chỉ số chức năng gan (AST, ALT, cholesterol, albumin) và thận (creatinin).

✓ Kết quả mô bệnh học tạng của chuột thí nghiệm

Quan sát bằng mắt thường và kính lúp với độ phóng đại 25 lần cho thấy màu sắc và hình thái của gan, lách và thận ở các lô dùng cao lỏng CL1 và CL2 không khác biệt so với lô chứng.

Nghiên cứu mô bệnh học trên gan, lách và thận của chuột cho thấy rằng việc sử dụng cao lỏng trong thí nghiệm không gây tổn thương cho các cơ quan này.

Hình 3.52 Hình ảnh giải phẫu mô bệnh học gan, lách, thận chuột (HE x 400)

GLC = Gan lô chứng; LLC = Lách lô chứng; TLC = Thận lô chứng;

GCL1.1 = Gan Lô CL1 liều 2 g/kg; GCL1.2 = Gan Lô CL1 liều 4 g/kg;

LCL1.1 = Lách Lô CL1 liều 2 g/kg; LCL1.2 = Lách Lô CL1 liều 4 g/kg;

TCL1.1 = Thận Lô CL1 liều 2 g/kg; TCL1.2 = Thận Lô CL1 liều 4 g/kg;

3.3.2 Kết quả nghiên cứu tác dụng chống viêm của cao lỏng CL1 và CL2 3.3.2.1 Tác dụng chống viêm khớp do CFA trên chuột cống

Kết quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.21

Bảng 3.21 Đường kính khớp cổ chân của chuột cống trắng (n)

TN Đường kính khớp cổ chân tiêm CFA gây viêm (mm)

Ngày 0 Ngày 7 Ngày 14 Ngày 21 Ngày 28

CĐ 4,05 ± 0,16 4,95 ± 0,14 4,82 ± 0,22 4,74 ± 0,21 4,38 ± 0,18 CL1.1 4,01 ± 0,16 4,96 ± 0,21 4,89 ± 0,17 4,79 ± 0,20 4,53 ± 0,28 CL1.2 3,99 ± 0,22 4,90 ± 0,20 4,80 ± 0,18 4,73 ± 0,17 4,41 ± 0,21 CL2.1 3,97 ± 0,21 4,92 ± 0,27 4,83 ± 0,35 4,76 ± 0,28 4,42 ± 0,31 CL2.2 4,03 ± 0,13 4,86 ± 0,32 4,77 ± 0,31 4,69 ± 0,26 4,33 ± 0,32

LC = Lô chứng (chuột uống nước cất); CĐ = Chứng dương (indomethacin, liều 10 mg/kg);

CL1.1 = Lô CL1 liều 1,4 g/kg; CL1.2 = Lô CL1 liều 2,8 g/kg;

CL2.1 = Lô CL2 liều 1,4 g/kg; CL2.2 = Lô CL2 liều 2,8 g/kg;

- Tại thời điểm ban đầu trước khi gây viêm, đường kính khớp cổ chân chuột cống ở các lô không có sự khác biệt (p>0,05)

Sau khi chuột cống được gây viêm bằng CFA, hiện tượng sưng viêm ở chân sau bên trái bắt đầu xuất hiện sau 3 ngày và đạt mức rõ rệt nhất sau khoảng 7 ngày Tại các thời điểm đo sau đó, đường kính khớp cổ chân của chuột cống ở tất cả các lô đều tăng cao một cách có ý nghĩa thống kê so với trước khi gây viêm, với p

Tiêu đề	Nghiên Cứu Đặc Điểm Thực Vật, Thành Phần Hóa Học Và Một Số Tác Dụng Sinh Học Của Cây Thuốc Thượng (Phaeanthus vietnamensis Ban, họ Na – Annonaceace)
Tác giả	Nguyễn Trung Tường
Người hướng dẫn	GS.TS. Phạm Thanh Kỳ, TS. Nguyễn Xuân Nhiệm
Trường học	Viện Dược Liệu
Chuyên ngành	Dược Liệu - Dược Học Cổ Truyền
Thể loại	luận án tiến sĩ
Năm xuất bản	2019
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	251
Dung lượng	12,58 MB