Các cây thuộc họ dâu tằm (Moraceae) thường chứa các nhóm hợp chất flavonoid, chalcone, stilbenoid, 2arylbenzofuran,…, và chúng có hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase mạnh. Cây Duối ô rô cũng là một loài cây thuộc họ dâu tằm nên cũng có hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase mạnh. Dựa vào kết quả sàng lọc đã phát hiện cao methanol toàn phần của cây Duối ô rô có hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase mạnh (IC50 0.63 µgmL) và mạnh hơn chất đối chứng dương, acid kojic (IC50 6.34 µgmL).phân lập các hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase để ứng dụng điều trị các bệnh về da. Từ đó, tìm ra nhiều hoạt chất có ứng dụng cao trong việc làm trắng da và dần thay thế các hoạt chất có nguồn gốc tổng hợp làm hạn chế phản ứng phụ cho người sử dụng và có lợi cho sức khỏe con người.
TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về cây duối ô rô
Phân loại thực vật
Duối ô rô còn có tên gọi khác là Gai quít hay Duối núi, tên khoa học là
Streblus ilicifolius (S Vidal) Corner Duối ô rô được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1914 tại Lushai Hills (bang Mizoram ngày nay ở India) với tên
Balanostreblus ilicifolia Kurz Đến năm 2008, Upadhaya G.K đã đổi tên thành Streblus ilicifolius (S Vidal) Corner
Giới Thực vật (Plantae) Ngành Thực vật Hạt kín (Agiosperms) Lớp Thực vật hai lá mầm (Eudicots)
Họ Dâu tằm (Moraceae)Chi Duối (Streblus)Loài Streblus ilicifolius
Đặc điểm sinh thái
Cây nhỏ mọc thành bụi có gai lớn và nhẵn, với chiều dài gai lên tới 25mm Lá cây có hình ngọn giáo hoặc thuôn, dài từ 3-10cm và rộng từ 2-4,5cm, với đầu lá nhọn và gốc lá cũng nhọn Bề mặt lá bóng và dai, có răng dạng gai lớn, cuống lá dài từ 3-5mm.
Hoa đực có kích thước dày đặc, dài từ 1-4cm và rộng 4mm, trong khi hoa cái thường xếp từ 1-3 cái ở nách lá mà không có cuống Quả có đường kính khoảng 8cm, được bao bọc bởi các lá đài đồng trưởng, với lớp vỏ ngoài mỏng manh và dễ vỡ Hạt của quả có hình cầu, màu vàng nhạt và có khía nâu.
Phân bố
Duối ô rô là loài cây phân bố rộng rãi ở nhiều nước Đông Nam Á như Myanmar, Trung Quốc, Lào, Campuchia, Thái Lan, Malaysia, Indonesia và Philippines Tại Việt Nam, cây thường xuất hiện ở miền Bắc, đặc biệt là ở các thung lũng đá vôi, với các quần thể nhỏ tại các tỉnh như Lạng Sơn, Hòa Bình, Hà Nội, Nam Hà, Ninh Bình, Bình Định, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Đồng Nai và Hồ Chí Minh.
Dược lý
Hiện nay, cây Duối ô rô chưa được sử dụng nhiều trong các bài thuốc Trong dân gian vỏ cây Duối ô rô được dùng làm thuốc tiêu độc mụn nhọt.
Thành phần hóa học
Năm 2016, Sukanya Dej-adisai và cộng sự đã tiến hành phân lập các hợp chất từ thân cây Duối ô rô ở tỉnh Rajjaprabha Dam và Surat Thani, Thailand Sau khi nghiền nhỏ thân cây, họ đã ly trích bằng các dung môi petroleum ether, ethyl acetate, ethanol và nước Từ cao ethanol, nhóm nghiên cứu đã phân lập được 5 hợp chất tinh khiết: 2,4-dihydroxy-3-geranyl benzaldehyde, trans-resveratrol, methyl p-hydroxybenzoate, umbelliferone và moracin M.
Methyl p -hydroxybenzoate Hình 1.3 Cấu trúc của các hợp chất phân lập từ cao ethanol Duối ô rô
Hoạt tính sinh học trên cây Duối ô rô
1.1.6.1 Hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase trên cây Duối ô rô
Vào năm 2016, Sukanya D và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu khả năng ức chế enzyme tyrosinase của các chiết xuất từ thân cây Duối ô rô, bao gồm các loại chiết xuất như cao petroleum ether, cao ethyl acetate, cao ethanol và cao nước, với acid kojic làm chất đối chứng dương Ngoài ra, các mẫu chiết xuất này cũng được kiểm tra cùng với ba hợp chất tinh khiết là 2,4-dihydroxy-3-geranylbenzaldehyde, methyl p-hydroxybenzoate và moracin M Quy trình thí nghiệm sử dụng L-DOPA làm chất nền và enzyme tyrosinase chiết xuất từ nấm Agaricus bisporus, với độ hấp thu quang được đo ở bước sóng 495 nm.
Kết quả thử nghiệm cho thấy cao ethanol có khả năng ức chế enzyme tyrosinase mạnh nhất, với tỷ lệ ức chế đạt 75.52 ± 5.42% ở nồng độ 20 µg/mL, gần tương đương với chất đối chứng dương acid kojic (80.86 ± 2.62%) (Bảng 1.1).
Bảng 1.1 trình bày tỷ lệ ức chế enzyme tyrosinase của các cao Duối ô rô ở nồng độ 20 µg/mL Các kết quả cho thấy khả năng ức chế enzyme này của các mẫu cao Duối ô rô khác nhau, góp phần vào việc nghiên cứu ứng dụng của chúng trong lĩnh vực y học và mỹ phẩm.
Cao chiết Phần trăm ức chế (%)
Moracin M, một hợp chất tinh khiết, thể hiện hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase mạnh mẽ nhất với giá trị IC50 là 67.69 µg/mL, so với chất đối chứng dương acid kojic có giá trị IC50 là 38.67 µg/mL (Bảng 1.2).
Bảng 1.2 trình bày kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase từ các cao Duối Ô Rô Các mẫu chiết xuất cho thấy khả năng ức chế enzyme này, cho thấy tiềm năng ứng dụng của Duối Ô Rô trong lĩnh vực làm đẹp và chăm sóc sức khỏe.
Hợp chất IC 50 (àg/mL)
(*) Chất đối chứng dương
1.1.6.2 Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm
In 2016, Sukanya D and colleagues conducted an experiment to evaluate the antibacterial and antifungal activity of the stem of the Duối ô rô plant The study tested its effectiveness against various bacterial strains, including Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Propionibacterium acnes, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), Escherichia coli, and Pseudomonas aeruginosa, as well as the fungal strain Candida albicans, which is commonly associated with oral and vaginal infections.
Microsporum gypseum, Trichophyton rubrum và Trichophyton mentagrophytes (các loại nấm gây bệnh ngoài da) [20]
Thí nghiệm của Sukanya D sử dụng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch để sàng lọc sơ bộ các cao chiết Các chất đối chứng dương bao gồm oxacillin cho vi khuẩn gram dương (với Staphylococcus aureus kháng methicillin sử dụng vancomycin), norfloxacin cho vi khuẩn gram âm, amphotericin B cho Candida albicans và ketoconazole cho các loại nấm còn lại.
Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn cho thấy chỉ có cao ethanol có khả năng ức chế vi khuẩn Staphylococcus aureus và Staphylococcus epidermidis, trong khi các mẫu cao chiết khác không có hoạt tính Cụ thể, đối với Staphylococcus aureus, cao ethanol tạo ra vòng kháng khuẩn với đường kính 8.47 ± 0.31 mm, thấp hơn so với chất đối chứng dương (18.73 ± 0.73 mm) Tương tự, đối với Staphylococcus epidermidis, cao ethanol có đường kính vòng kháng khuẩn là 9.25 ± 0.56 mm, cũng thấp hơn chất đối chứng dương (28.01 ± 0.55 mm) Các mẫu cao chiết còn lại không cho thấy hoạt tính kháng khuẩn.
Nhóm Sukanya D đã tiến hành thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của ba hợp chất tinh khiết: 2,4-dihydroxy-3-geranyl benzaldehyde, methyl p-hydroxybenzoate và moracin M Các hợp chất này được kiểm tra hiệu quả đối với các vi khuẩn Staphylococcus aureus, Staphylococcus aureus kháng methicillin và Staphylococcus epidermidis thông qua việc xác định giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt vi khuẩn tối thiểu (MBC).
Hợp chất 2,4-dihydroxy-3-geranyl benzaldehyde đã thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất trong số ba loại vi khuẩn được thử nghiệm, mặc dù vẫn yếu hơn so với chất đối chứng dương Hai hợp chất còn lại cho thấy hoạt tính kháng khuẩn rất yếu khi so sánh với chất đối chứng dương.
Bảng 1.3 trình bày giá trị MIC và MBC của các hợp chất tinh khiết từ cao Duối ô rô, được chiết xuất bằng enzyme tyrosinase, đối với các vi khuẩn ẩn kháng sát.
(*) Chất đối chứng dương
Tổng quan về melanin
Melanin là một sắc tố tự nhiên phổ biến, có mặt trong hầu hết các sinh vật và đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ chúng khỏi các tác nhân bên ngoài Ở động vật, melanin được hình thành từ enzyme tyrosinase và giúp bảo vệ chống lại tổn thương từ tia cực tím, hóa chất, và vi khuẩn có hại Đặc biệt, ở động vật không xương sống, melanin liên quan đến hệ thống miễn dịch, hỗ trợ tiêu diệt vi khuẩn sau khi bị nhiễm bệnh Hiện tượng trái cây và nấm bị hóa nâu khi tiếp xúc với không khí cũng minh chứng cho sự tạo thành melanin Ở con người, melanin xác định màu sắc da, tóc và mống mắt, đồng thời bảo vệ da khỏi tác hại của tia tử ngoại Tuy nhiên, sự tích lũy melanin không bình thường có thể gây mất thẩm mỹ cho làn da.
Sắc tố melanin hình thành qua quá trình oxy hóa tyrosin thành dopaquinone với sự xúc tác của enzyme tyrosinase Dopaquinone sau đó chuyển hóa thành L-DOPA và dopachrome, trong đó L-DOPA là chất nền cho tyrosinase và thực hiện phản ứng oxy hóa dopaquinone, giải phóng enzyme tyrosinase Cuối cùng, eumelanin (màu nâu, đen) được tạo ra từ chuỗi phản ứng oxy hóa các sản phẩm của dopachrome, bao gồm dihydroxyindol (DHI) và acid dihydroxyindol-2-carboxylic (DHICA).
Sự có mặt của cystein hoặc glutathion và dopaquinone dẫn đến sự hình thành cysteinyldopa hoặc glutathionyldopa, từ đó tạo ra pheomelanin, một dạng melanin màu vàng ánh đỏ Khi eumelanin và pheomelanin kết hợp, chúng tạo ra melanin Cả hai loại melanin này đều tồn tại trong da và tóc, nhưng eumelanin là dạng phổ biến nhất ở con người.
Eumelanin là một dạng sắc tố quan trọng, bao gồm nhiều liên kết 5,6-dihydroxy và 5,6-dihydroxyindol-2-acid carboxylic, và được tìm thấy trong mắt, quầng vú, da và màu tóc (vàng, nâu, xám, đen) Ở người, eumelanin chủ yếu có mặt ở những người có làn da tối màu, với hai loại chính là eumelanin màu đen và eumelanin màu nâu Sự hiện diện của eumelanin màu đen, kết hợp với sự thiếu hụt một số sắc tố khác, dẫn đến màu tóc xám, trong khi eumelanin màu nâu khi thiếu hụt các sắc tố khác sẽ tạo ra màu tóc vàng.
Pheomelanin là sắc tố xuất hiện trong da và tóc của cả người sáng da và người có màu da sậm hơn, đặc biệt phổ biến ở những người có mái tóc đỏ Tuy nhiên, pheomelanin có thể trở thành chất gây ung thư khi tiếp xúc với tia cực tím từ ánh sáng mặt trời.
Sơ đồ 1.1 Quy trình sinh tổng hợp melanin
Sự hình thành melanin trong biểu bì da có vai trò bảo vệ chống lại tác động của tia UV, nhưng khi tích tụ quá mức, nó có thể dẫn đến tình trạng sạm da và nám da Việc giảm hình thành dopachrome có thể hạn chế sản xuất eumelanin, từ đó giảm lượng sắc tố melanin trong cơ thể Hiện nay, nhiều nhà khoa học đang nghiên cứu biện pháp điều trị nám da thông qua việc ức chế hoạt động của enzyme tyrosinase.
Có 6 nhóm chất ức chế tổng hợp melanin: [6]
Nhóm chất khử như acid ascorbic khử dopaquinone thành dopa trì hoãn sự tạo thành dopachrome và melanin.
Nhóm chất phản ứng với dopaquinone như glutathione, cysteine, …
Nhóm cơ chất thay thế tyrosine, vẫn có sự tạo thành quinone nhưng không phải dopaquinone như các hợp chất phenol.
Nhóm chất bất hoạt enzyme tyrosinase không đặc hiệu ví dụ như acid hoặc base, phá hủy cấu trúc các loại protein trong đó có enzyme tyrosinase.
Nhóm chất ức chế enzyme tyrosinase đặc hiệu và thuận nghịch có khả năng phục hồi sau khi bị ức chế Mặc dù enzyme tyrosinase vẫn có thể tạo ra dopaquinone, nhưng tốc độ phản ứng sẽ chậm lại.
Nhóm chất ức chế enzyme tyrosinase đặc hiệu, không thuận nghịch, enzyme tyrosinase bị biến đổi cấu trúc và bị bất hoạt vĩnh viễn.
Tổng quan về enzyme tyrosinase
Trong cơ thể sống, quá trình trao đổi chất diễn ra liên tục thông qua nhiều phản ứng hóa học khác nhau Enzyme, là các phân tử protein, đóng vai trò xúc tác cho những phản ứng này, do đó chúng được gọi là chất xúc tác sinh học Tuy nhiên, chất ức chế enzyme có thể làm giảm hoạt tính của enzyme bằng cách giảm ái lực của enzyme với cơ chất hoặc làm enzyme mất khả năng kết hợp với cơ chất.
Enzyme tyrosinase, ký hiệu EC 1.14.18.1, còn được gọi là polyphenol oxidase, phenolase hay catecholase, là một enzyme chứa hai nguyên tử đồng (Cu) và rất phổ biến trong tự nhiên Enzyme này đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành các sắc tố như melanin và các hợp chất polyphenol khác Tyrosinase xúc tác cho hai phản ứng liên tiếp: đầu tiên là oxy hóa monophenol thành o-diphenol, sau đó là dehydrogen hóa o-diphenol thành o-quinon Các quinon này là tiền chất thiết yếu trong tổng hợp sắc tố melanin, cho thấy vai trò đa dạng của enzyme này trong nhiều loại sinh vật.
Sơ đồ 1.2 Phản ứng xúc tác bởi enzyme tyrosinase
Nghiên cứu về cấu trúc hóa học và quang phổ của enzyme tyrosinase cho thấy rằng enzyme này có cấu trúc tương tự như sắc tố hemocyanin, với hai nguyên tử đồng làm trung tâm hoạt động Cấu trúc của tyrosinase gồm ba phần chính, trong đó hai nguyên tử Cu liên kết qua cầu nối oxy là phần quan trọng nhất Các nguyên tử đồng còn lại liên kết với acid amin, mỗi nguyên tử đồng tạo nối với nguyên tử nitrogen của ba phân tử histidine Ở dạng thông thường, tyrosinase bao gồm 85% mettyrosinase và 15% oxytyrosinase, và cơ chế xúc tác cho phản ứng hidroxy hóa monophenol và oxy hóa diphenol phụ thuộc vào trung tâm hoạt động của từng loại enzyme này.
Hình 1.4 Cấu trúc của enzyme tyrosinase
Enzyme tyrosinase tồn tại dưới ba dạng khác nhau: oxytyrosinase, mettyrosinase và deoxytyrosinase, tùy thuộc vào vị trí của hai nguyên tử đồng (Cu) trung tâm trong cấu trúc hoạt động của enzyme.
Cấu trúc oxytyrosinase (E oxy) bao gồm hai nguyên tử đồng Cu (II) có hình dạng tứ diện, trong đó mỗi nguyên tử đồng tạo liên kết phối trí với hai nguyên tử nitơ từ hai phân tử histidin theo phương xích đạo và một liên kết theo phương thẳng đứng Hai nguyên tử Cu (II) được kết nối với nhau thông qua cầu đôi oxy ngoại sinh, nghĩa là phân tử oxygen liên kết với Cu (II) dưới dạng peroxide.
Cấu trúc của mettyrosinase (E met) tương tự như cấu trúc Eoxy, nhưng có sự khác biệt ở chỗ mettyrosinase liên kết hai nguyên tử đồng (Cu II) thông qua cầu oxy ngoại sinh Điều này có nghĩa là phân tử oxy kết hợp với Cu (II) dưới dạng hydroxyl (Cu 2+ )2(OH) -.
Cấu trúc deoxytyrosinase (E deoxy ): có cấu trúc giống dạng deoxyhemocyanin với tâm hoạt chứa hai nguyên tử Cu (I) nhưng không có cầu nối oxo (ion Cu (I) không gắn oxy) [29]
Sơ đồ 1.3 mô tả cơ chế xúc tác của enzyme tyrosinase trong quá trình phản ứng tạo ra monophenol và diphenol Các loại enzyme tyrosinase bao gồm oxytyrosinase (E oxy), mettyrosinase (E met) và deoxytyrosinase (E deoxy) Các phức hợp tương ứng như E oxy M, E oxy D và E met M đại diện cho oxytyrosinase kết hợp với monophenol, oxytyrosinase kết hợp với diphenol, và mettyrosinase kết hợp với monophenol.
Sơ đồ 1.3 mô tả cơ chế xúc tác của enzyme tyrosinase trong quá trình oxy hóa monophenol và diphenol Trong phản ứng với monophenol, enzyme oxytyrosinase (Eoxy) oxy hóa monophenol thành o-quinon, tạo ra dạng deoxytyrosinase (Edeoxy), sau đó Edeoxy phản ứng với oxy để tái tạo Eoxy Đối với diphenol, cả dạng mettyrosinase (Emet) và Eoxy đều phản ứng để hình thành o-quinon o-Diphenol liên kết với Eoxy và được oxy hóa thành o-quinon, đồng thời tạo ra Emet, dạng enzyme mới này sẽ tiếp tục phản ứng với một o-diphenol khác để sản xuất o-quinon và giải phóng Edeoxy liên kết với hai nguyên tử Cu.
Sơ đồ xúc tác cho phản ứng của diphenol
Sơ đồ xúc tác cho phản ứng của monophenol
O 2 tác nhân khử chuyển enzyme về dạng deoxytyrosinase, là dạng duy nhất có thể kết hợp với oxy, tiếp tục vòng tuần hoàn xúc tác enzyme [29]
Nghiên cứu về enzyme tyrosinase đã bắt đầu từ hơn 100 năm trước, với những khám phá đầu tiên vào năm 1895 trên loài nấm Russula nigricans Enzyme này thu hút sự quan tâm từ nhiều lĩnh vực, bao gồm sinh học, hóa học, di truyền học, hóa sinh, quang phổ học, y học, nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm và hóa học ứng dụng.
1.3.2 Chất ức chế enzyme tyrosinase
1.3.2.1 Chất ức chế eyzyme tyrosinase có nguồn gốc từ tự nhiên
Acid kojic là một chất ức chế tyrosinase nổi bật, được ứng dụng rộng rãi trong ngành mỹ phẩm như một thành phần làm trắng da và trong thực phẩm để ngăn ngừa hiện tượng hóa nâu Hợp chất này có nguồn gốc từ nhiều loại nấm thuộc các chi Aspergillus, Penicillium và trực khuẩn acid acetic Ngoài ra, acid kojic thường được sử dụng làm chất đối chứng dương trong các thử nghiệm kiểm tra hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase.
Acid kojic là một hợp chất có cấu trúc độc đáo, được tìm thấy trong nhiều loại thực vật Trong số các hợp chất hoạt tính, polyphenol nổi bật với khả năng ức chế enzyme tyrosinase, giúp bảo vệ thực vật khỏi tác động của tia UV và các tác nhân gây bệnh.
Among the Moraceae family of plants, compounds that exhibit stronger tyrosinase inhibition than kojic acid primarily belong to the flavone, flavanone, flavane, 2-arylbenzofuran, stilbenoid, diphenylpropanoid, and triterpene groups, with a few compounds from the chalcone, phenylpropanoid, and xanthone categories.
Vào năm 2012, Zhenzhong Yang và các cộng sự đã phân lập nhiều hợp chất từ lá cây Dâu tằm trắng (Morus alba) có khả năng ức chế enzyme tyrosinase, trong đó quercetin, moracin N, moracin C, norartocarpetin và euchrenone A7 là những hợp chất có hoạt tính mạnh nhất Cấu trúc và giá trị IC50 của các hợp chất này được trình bày trong bảng 1.4, đặc biệt, norartocarpetin cho thấy hoạt tính ấn tượng với giá trị IC50 chỉ 0.082 àM, mạnh gấp 200 lần so với acid kojic (IC50 15.9 àM).
Bảng 1.4 Khả năng ức chế enzyme tyrosinase của một số hợp chất được tìm thấy trong lá cây Dâu tằm trắng ( Morus alba )
Hợp chất IC 50 (àM) Khả năng ức chế *
Acid kojic (chất đối chứng dương) 15.9
* Khả năng ức chế là số lần mà hoạt tính của hợp chất mạnh hơn acid kojic = IC 50 acid kojic / IC 50 hợp chất
Năm 2017, E Chaita và cộng sự đã phân lập thành công 7 hợp chất ức chế enzyme tyrosinase từ cây Dâu tằm trắng (Morus alba), bao gồm oxyresveratrol, dihydrooxyresveratrol, 2,4,3ʹ-trihydroxydihydrostilbene, moracin M, kuwanon C, kuwanon G và trans-dihydromorin Trong số đó, dihydroxyresveratrol nổi bật với hoạt tính mạnh mẽ, có giá trị IC50 đạt 0.3 µM.
54 lần so với chất đối chứng dương acid kojic (IC50 16.1 àM) Cấu trỳc cỏc hợp chất và giá trị IC50 tương ứng được thể hiện ở bảng 1.5 [9]
Bảng 1.5 Khả năng ức chế enzyme tyrosinase của một số hợp chất được tìm thấy trong thân cây Dâu tằm trắng ( Morus alba )
Hợp chất IC 50 (àM) Khả năng ức chế *
Acid kojic (chất đối chứng dương) 16.1
Năm 2012, Xiao Hu và cộng sự đã nghiên cứu lá cây Dâu tằm Vân Nam (Morus mogolica) và phân lập được nhiều hợp chất có khả năng ức chế enzyme tyrosinase Trong số đó, morus yunnansin E và morus yunnansin là những hợp chất có hoạt tính mạnh nhất.
Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase
Thử nghiệm hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase được thực hiện thông qua phương pháp trắc quang, trong đó enzyme này xúc tác quá trình oxy hóa L-DOPA thành dopachrome có màu cam đỏ, với bước sóng hấp thu cực đại tại 475 nm Sự hiện diện của chất ức chế sẽ làm giảm cường độ hấp thu quang tại bước sóng này Bằng cách so sánh độ hấp thu của dung dịch có và không có mẫu thử, khả năng ức chế enzyme tyrosinase của mẫu khảo sát sẽ được xác định.
Sơ đồ 1.4 Phản ứng tạo thành dopachrome
1.4.2 Đánh giá khả năng ức chế enzyme tyrosinase Để đánh giá được khả năng ức chế enzyme tyrosinase người ta dựa vào giá trị phần trăm ức chế (I%) Giá trị phần trăm ức chế được tính toán thông qua biểu thức:
Acontrol: giá trị mật độ quang của dung dịch khi không có mẫu thử.
Amau: giá trị mật độ quang của dung dịch khi có mẫu thử.
Giá trị phần trăm ức chế (I%) của dược tính được xác định cho từng nồng độ khảo sát, với mỗi nồng độ được thử nghiệm ba lần Từ ba giá trị I% thu được, tính toán giá trị phần trăm ức chế trung bình cho từng nồng độ Nếu hoạt tính của mẫu thử dưới 10 µg/ml, tiếp tục thử nghiệm ở các nồng độ thấp hơn Dựa trên giá trị phần trăm ức chế, có thể tính được giá trị IC50.
1.4.3 Giá trị IC 50 và cách tính Đây là đại lượng đánh giá khả năng ức chế mạnh hay yếu của các hoạt chất. Giá trị IC50 (Inhibitory concentration) được định nghĩa là nồng độ của một mẫu mà tại đó nó có thể ức chế được 50% enzyme Mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị IC50 càng thấp [27]
Đối với các mẫu có hoạt tính ức chế tỷ lệ thuận với nồng độ, có thể xây dựng một đường thẳng y = ax + b đi qua tất cả các điểm, trong đó y đại diện cho phần trăm ức chế và x là nồng độ của chất ức chế.
Đối với các mẫu có hoạt tính không biến thiên tuyến tính theo nồng độ, ta có thể chọn hai nồng độ ức chế nằm trên và dưới 50% Sau đó, tiến hành thiết lập đường thẳng theo phương trình y = ax + b Từ phương trình này, với hai hệ số a và b đã được xác định, ta có thể thay thế giá trị y để tiếp tục phân tích.
= 50% vào phương trình, thu được giá trị x Đó chính là nồng độ ức chế được 50% enzyme (IC50) [27]
Plants in the Moraceae family, such as the Duối ô rô, are known to contain various compounds including flavonoids, chalcones, stilbenoids, and 2-arylbenzofurans, which exhibit strong tyrosinase inhibitory activity.
Kết quả sàng lọc cho thấy cây Duối ụ rụ có hàm lượng methanol cao và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase mạnh, với giá trị IC50 đạt 0.63 µg/mL, vượt trội hơn so với acid kojic (IC50 6.34 µg/mL), cho thấy tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực làm đẹp và chăm sóc da.
Nhóm nghiên cứu đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase trong phân đoạn H, K, N của cao ethyl acetate từ thân cây Duối ô rô (Streblus ilicifolius)” Mục tiêu là phân lập các hợp chất có khả năng ức chế enzyme tyrosinase, nhằm ứng dụng trong điều trị các bệnh về da Nghiên cứu này hướng đến việc tìm ra những hoạt chất có tiềm năng cao trong việc làm trắng da, thay thế các hợp chất tổng hợp, từ đó hạn chế phản ứng phụ và mang lại lợi ích cho sức khỏe người sử dụng.
THỰC NGHIỆM 2.1 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
Hóa chất
Ethyl acetate (Chemsol, Việt Nam)
Enzyme tyrosinase (Sigma-Aldrich, Germany).
Na2HPO4.12H2O (Xilong Chemical, China).
NaH2PO4 2H2O (Xilong Chemical, China).
Silica gel pha thường 60 (HiMedia, India).
Bản mỏng pha thường 60 F254 (Merck, Đức).
Dụng cụ
Becher 50 mL, 100 mL, 250 mL, 500 mL.
Erlen 50 mL, 100 mL. Ống đong 100 mL, 20 mL, 10 mL.
Các dụng cụ khác như đũa thủy tinh, giấy lọc, phễu lọc,…
Thiết bị
Cân phân tích Mettler Toledo AG245.
Hệ thống cô quay chân không Eyela. Đèn UV-VIS Asia 254nm.
Máy đo quang phổ Shimadzu 1800.
Máy đánh siêu âm Power sonic 410.
Máy ghi phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR 500 MHz Bruker.
Hệ thống sắc ký lỏng điều chế Buchi.
Hệ thống HR-ESI-MS Bruker.
Phân lập các hợp chất từ thân và cành duối ô rô
2.2.1 Nguyên liệu, ly trích và điều chế cao thô
Vào tháng 10 năm 2017, thân cây Duối ô rô đã được thu thập tại Thị trấn Bồng Sơn, Huyện Hoài Nhơn, Tỉnh Bình Định Sau khi phơi khô và xay nhỏ, mẫu cây đạt khối lượng 10.5 kg và được chiết xuất bằng phương pháp Soxhlet với các dung môi n-hexane, ethyl acetate và methanol Quá trình cô quay thu hồi dung môi đã cho ra cao n-hexane với khối lượng 64.8 g, cao ethyl acetate 117.2 g và cao methanol 378.0 g.
Sơ đồ 2.1 Quy trình ly trích và điều chế cao thô từ thân cây Duối ô rô
Kết quả thử nghiệm cho thấy cao ethyl acetate có hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase mạnh nhất, vì vậy nó được chọn để phân lập hợp chất Cao ethyl acetate được nạp vào cột sắc ký silica gel pha thường, sử dụng hệ dung môi chloroform : methanol với độ phân cực tăng dần từ 0 - 100% methanol Dung dịch thu được từ cột được hứng trong erlen 500 mL, sau đó cô quay chân không và tiến hành sắc ký bản mỏng Kết quả sắc ký lớp mỏng cho thấy đã thu được 18 phân đoạn, bao gồm các phân đoạn A (0.9 g), B (1.2 g), C (0.4 g), D (1.9 g), và E.
2.2.2.1 Phân lập hợp chất từ phân đoạn H
Kỹ thuật MPLC pha thường được thực hiện với hệ dung môi chloroform và methanol, trong đó độ phân cực tăng dần từ 0 đến 100% methanol Qua quá trình sắc ký lớp mỏng với các mẫu, kết quả cho thấy đã thu được hai phân đoạn H1 (445.6 mg) và H2 (179.5 mg).
Kỹ thuật MPLC được thực hiện với phân đoạn H1 (445.6 mg) bằng hệ dung môi chloroform : methanol với độ phân cực tăng dần từ 0 đến 100% methanol Sau khi tiến hành sắc ký lớp mỏng, các mẫu đã được phân tách thành 2 phân đoạn H1.1 (315.5 mg) và H1.2 (18.7 mg).
Tiến hành kỹ thuật sắc ký cột pha thường với phân đoạn H1.1 (315.5 mg) bằng cách sử dụng hệ dung môi chloroform và ethyl acetate với độ phân cực tăng dần.
Sử dụng 0 - 100% ethyl acetate, tiến hành sắc ký lớp mỏng với các mẫu, kết quả cho thấy đã phân chia thành 5 phân đoạn: H1.1.1 (34.8 mg), H1.1.2 (95.5 mg), H1.1.3 (79.8 mg), H1.1.4 (50.9 mg), và H1.1.5 (55.4 mg).
Tiến hành kỹ thuật PTLC với phân đoạn H1.1.4 (50.9 mg), sử dụng hệ dung môi giải ly chloroform : ethyl acetate = 70 : 30 Kết quả thu được hợp chất 3 (Sơ đồ2.3).
Sơ đồ 2.2 Quy trình ly trích và điều chế các phân đoạn từ cao ethyl acetate
Sơ đồ 2.3 Quy trình ly trích và điều chế từ phân đoạn H
Tiến hành kỹ thuật sắc ký cột pha thường với phân đoạn H1.1.2 (95.5 mg) sử dụng dung môi chloroform : ethyl acetate với độ phân cực tăng dần từ 0 - 100% ethyl acetate Sau đó, thực hiện sắc ký lớp mỏng với các mẫu, từ kết quả này, đã gom thành 5 phân đoạn: H1.1.2.1 (17.0 mg), H1.1.2.2 (53.1 mg), H1.1.2.3 (6.2 mg), H1.1.2.4 (15.2 mg), và H1.1.2.5 (15.0 mg).
Tiếp tục tiến hành kỹ thuật PTLC với phân đoạn H1.1.2.2 với hệ dung môi giải ly chloroform : ethyl acetate = 85 : 15 Kết quả thu được hợp chất 2 (Sơ đồ
Sơ đồ 2.4 Quy trình ly trích và điều chế từ phân đoạn H1.1.2
2.2.2.2 Phân lập hợp chất từ phân đoạn K
Tiến hành kỹ thuật MPLC pha thường với hệ dung môi chloroform và methanol, tăng dần độ phân cực từ 0 đến 100% methanol Qua quá trình sắc ký lớp mỏng, các mẫu được phân tích và gom thành 6 phân đoạn, cụ thể là K1 (18.2 mg), K2 (270.9 mg), K3 (234.3 mg), và K4 (1223.8 mg).
Tiếp tục thực hiện kỹ thuật MPLC pha thường với phân đoạn K5, sử dụng hệ dung môi chloroform : methanol với độ phân cực tăng dần từ 0 đến 100% methanol Sau khi tiến hành sắc ký lớp mỏng với các mẫu, kết quả cho thấy đã gom được 2 phân đoạn là K5.1 (646.2 mg) và K5.2 (145.0 mg).
Tiến hành kỹ thuật MPLC pha thường với phân đoạn K5.1 sử dụng dung môi chloroform : ethyl acetate với độ phân cực tăng dần từ 0 - 100% ethyl acetate Qua sắc ký lớp mỏng, thu được 2 phân đoạn K5.1.1 (517.0 mg) và K5.1.2 (72.0 mg) Tiếp tục với sắc ký cột pha thường cho phân đoạn K5.1.1, cũng sử dụng hệ dung môi chloroform : ethyl acetate với độ phân cực tăng dần Kết quả sắc ký lớp mỏng đã gom thành 4 phân đoạn K5.1.1.1 (20.7 mg) và K5.1.1.2 (177.5 mg).
Tiếp tục thực hiện sắc ký cột pha thường cho phân đoạn K5.1.1.2 sử dụng hệ dung môi n-hexane : acetone với tỷ lệ acetone tăng dần từ 0 - 100% Sau đó, tiến hành sắc ký lớp mỏng với các mẫu thu được, từ đó phân chia thành 4 phân đoạn: K5.1.1.2.1 (77.7 mg), K5.1.1.2.2 (30.7 mg), K5.1.1.2.3 (40.8 mg), và K5.1.1.2.4 (12.2 mg) như thể hiện trong Sơ đồ 2.5.
Sơ đồ 2.5 Quy trình ly trích và điều chế từ phân đoạn K
Chloroform : ethyl acetate n-Hexane : acetone
Tiếp tục tiến hành sắc ký cột pha thường với phân đoạn K5.1.1.2.1 (77.7 mg) với hệ dung môi giải ly n-hexane : ethyl acetate với độ phân cực tăng dần từ 0
- 100% ethyl acetate Tiến hành sắc ký lớp mỏng với các mẫu, dựa trên kết quả sắc ký lớp mỏng gom thành 5 phân đoạn lần lượt là K5.1.1.2.1.1 (12.4 mg),
Tiếp tục tiến hành kỹ thuật PTLC với phân đoạn K5.1.1.2.1.2 với hệ dung môi giải ly n-hexane : ethyl acetate = 50 : 50 Kết quả thu được hợp chất 6 (Sơ đồ
Sơ đồ 2.6 Quy trình ly trích và điều chế từ phân đoạn K5.1.1.2.1
Tiếp tục tiến hành sắc ký cột pha thường với phân đoạn K5.1.1.2.3 (40.8 mg) với hệ dung môi giải ly n-hexane : ethyl acetate với độ phân cực tăng dần từ 0
- 100% ethyl acetate Tiến hành sắc ký lớp mỏng với các mẫu, dựa trên kết quả sắc ký lớp mỏng gom thành 3 phân đoạn lần lượt là K5.1.1.2.3.1 (4.7 mg), K5.1.1.2.3.2 (24.4 mg), K5.1.1.2.3.3 (6.0 mg).
Tiếp tục tiến hành kỹ thuật PTLC với phân đoạn K5.1.1.2.3.1 với hệ dung môi giải ly n-hexane : ethyl acetate = 50 : 50 Kết quả thu được hợp chất 1 (Sơ đồ
(6.5 mg) n-Hexane : ethyl acetate n-Hexane : ethyl acetate
Sơ đồ 2.7 Quy trình ly trích và điều chế từ phân đoạn K5.1.1.2.3
2.2.2.3 Phân lập hợp chất từ phân đoạn N
Tiến hành sắc ký cột pha thường sử dụng hệ dung môi chloroform và methanol với độ phân cực tăng dần từ 0 đến 100% methanol Sau đó, thực hiện sắc ký lớp mỏng với các mẫu, từ kết quả sắc ký lớp mỏng, đã gom thành 11 phân đoạn, cụ thể là N1 (17.7 mg), N2 (69.0 mg), N3 (10.9 mg), N4 (97.9 mg), và N5 (140.4 mg).
N6 (202.7 mg), N7 (325.5 mg), N8 (201.0 mg), N9 (8.8 g), N10 (6.0 g), N11 (914.1 mg) (sơ đồ 2.8).
Sơ đồ 2.8 Quy trình ly trích và điều chế từ phân đoạn N
(6.0 mg) n-Hexane : ethyl acetate n-Hexane : ethyl acetate
Phân đoạn N7 (325.5 mg) được tách chiết bằng phương pháp sắc ký cột pha thường, sử dụng hệ dung môi n-hexane và acetone với độ phân cực tăng dần từ 0 đến 100% acetone Sau đó, tiến hành sắc ký lớp mỏng để phân tích các mẫu, từ đó thu được 7 phân đoạn N7.1 (24.6 mg), N7.2 (44.8 mg), N7.3 (41.3 mg), N7.4 (39.2 mg), N7.5 (15.9 mg), N7.6 (52.7 mg) và N7.7 (64.4 mg) như thể hiện trong Sơ đồ 2.9.
Tiếp tục thực hiện sắc ký cột pha thường cho phân đoạn N7.3 bằng hệ dung môi n-hexane : acetone với độ phân cực tăng dần từ 0 đến 100% acetone Kết quả thu được hợp chất 5 (Sơ đồ 2.9).
Sơ đồ 2.9 Quy trình ly trích và điều chế từ phân đoạn N7
Phân đoạn N4 được thực hiện bằng phương pháp sắc ký cột pha thường với hệ dung môi n-hexane và ethyl acetate, tăng dần độ phân cực từ 0 đến 100% ethyl acetate Sau đó, tiến hành sắc ký lớp mỏng để phân tích các mẫu, kết quả thu được đã phân chia thành 5 phân đoạn: N4.1 (55.0 mg), N4.2 (9.9 mg), N4.3 (5.1 mg), N4.4 (39.9 mg), và N4.5 (9.0 mg).
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Nghiên cứu thành phần hóa học
3.1.1 Phân lập và xác định cấu trúc hợp chất
Từ các phân đoạn H, K và N đã phân lập được 7 hợp chất như trong hình 3.1.
Hình 3.1 Cấu trúc các hợp chất phân lập được 3.1.2 Biện luận cấu trúc hợp chất 1
Hợp chất 1 (Hình 3.2) có dạng bột, màu vàng nhạt, tan tốt trong dung môi acetone.
Hình 3.2 Công thức cấu tạo của hợp chất 1
Phổ 1 H-NMR (Phụ lục 3.1) của hợp chất 1 xuất hiện tín hiệu của 3 proton hương phương ghép hệ ABX [δ H 7.38 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-4)], [δ H 6.95 (d, J = 2.1
Hz, H-7)], [δ H 6.80 (1H, dd, J = 8.4 và 2.1 Hz, H-5)]; 2 proton hương phương ghép meta [δ H 6.92 (1H, brs, H-2′)], [δ H 6.92 (1H, brs, H-6′)]; 2 proton olefin [δ H 6.91 (1H, brs, H-3)], [δ H 5.66 (1H, t, J=7.2, H-2′′)]; 2 proton oxymethylene [δ H 4.41 (2H, s, H-4′′)]; 2 proton methylene [δ H 3.45 (2H, d, J = 7.2 Hz, H-1′′)], 2 nhóm methyl [δ H 1.82 (3H, s, H-5′′)], [δ H 1.98 (3H, s, 4′′-OCO-CH3)] (Bảng 3.1).
Phổ 13 C-NMR (Phụ lục 3.2) và DEPT (Phụ lục 3.3) của hợp chất 1 xuất hiện tín hiệu của 21 carbon Trong đó có 1 carbon carbonyl của nhóm ester [δ C 170.85, 4′
′-OCO-CH3]; 4 carbon hương phương trí hoán nối với oxygen [δ C 157.3, C-3′], [δ C
157.3, C-5′], [δ C 156 2, C-6], [δ C 156.6, C-7a]; 3 carbon hương phương trí hoán [δ C
121.9, C-4], [δ C 113.2, C-5], [δ C 103.9, C-2′], [δ C 103.9, C-6′], [δ C 98.4, C-7]; 1 carbon olefin trí hoán nối với oxygen [δ C 155.7, C-2]; 1 carbon olefin trí hoán [δ C
130.2, C-3′′]; 2 carbon methine olefin [δ C 128.5, C-2′′], [δ C 101.6, C-3]; 1 carbon oxymethylene [δ C 70.5, C-4′′]; 1 carbon methylene [δ C 22.8, C-1′′]; 2 carbon methyl [δ C 20.8, 4′′-OCO-CH3], [δ C 14.1, C-5′′] (Bảng 3.1).
Vị trí Loại C Hợp chất 1 Tương quan HMBC δ H δ C 2 J 3 J
Bảng 3.1 Dữ liệu phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR và tương quan HMBC của hợp chất 1 trong dung môi acetone- d 6
Từ dữ liệu phổ 1D-NMR cho thấy hợp chất 1 có cấu trúc của một khung 2- aryllbenzofuran liên kết với dẫn xuất prenyl và một nhóm acetoxyl Phân tích phổ
1H- 1 H COSY (Phụ lục 3.4), HSQC (Phụ lục 3.5), HMBC (Phụ lục 3.6) của hợp chất
1 cho thấy khung 2-arylbenzofuran có ba nhóm hydroxyl ở vị trí C-6, C-3′, C-5′.
Dẫn xuất prenyl có chứa nhóm acetoxyl tại vị trí C-4′′, được xác định qua tương quan HMBC giữa H-4′′ và proton của nhóm methyl acetyl với carbon carbonyl của nhóm ester Đồng thời, dẫn xuất prenyl cũng gắn với khung 2-arylbenzofuran tại vị trí C-4′ thông qua tương quan HMBC giữa H-1′′ với C-3′/5′, C-4′ và H-2′′ với C-4′.
Hình 3.3 Tương quan HMBC và COSY của hợp chất 1
Phân tích phổ 1 H- 1 H NOESY (Phụ lục 3.7) của hợp chất 1 cho thấy có tương quan NOE giữa H-4 với H-3, H-3 với H-2′/6′ Ngoài ra, còn có tương quan của H-2′
′ với H-4′′ và H-1′′ với H-5′′ cho thấy nối đôi giữa C-2′′ và C-3′′ của dây dẫn xuất prenyl có cấu hình E (Hình 3.4).
Hình 3.4 Tương quan NOESY của hợp chất 1
Phân tích phổ HR-ESI-MS của hợp chất 1 cho thấy mũi ion phân tử giả tại m/z 391.1151, gần với giá trị lý thuyết m/z 391.1158, với sai lệch chỉ 0.7 mMass, tương ứng với công thức phân tử [C21H20O6Na] +.
Cấu trúc của hợp chất 1 đã được xác định như hình 3.5 Qua việc tra cứu phần mềm SciFinder vào ngày 10/11/2019 tại Đại học Houston, Texas, USA, chúng tôi nhận thấy hợp chất 1 là một chất mới, lần đầu tiên được công bố trên thế giới và được đặt tên là streblus F (Hình 3.5).
Hình 3.5 Công thức cấu tạo của streblus F
3.1.3 Biện luận cấu trúc hợp chất 2
Hợp chất 2 (Hình 3.6) có dạng bột, màu vàng cam, tan tốt trong dung môi acetone.
Hình 3.6 Công thức cấu tạo của hợp chất 2
Phổ 1 H-NMR (Phụ lục 3.9) của hợp chất 2 xuất hiện tín hiệu của 3 proton hương phương ghép hệ ABX [δ H 7.52 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-4)], [δ H 7.00 (d, J = 2.1
Hz, H-7)], [δ H 6.87 (1H, dd, J = 8.5 và 2.1 Hz, H-5)]; 3 proton olefin cô lập [δ H 7.31 (1H, s, H-3)], [δ H 6.48 (1H, d, J = 2.1, H-2′)], [δ H 5.22 (1H, t, J =7.5, H-2′′)]; 1 proton oxymethine [δ H 4.27 (1H, dd, J = 2.7 và 2.9, H-5′)]; 4 proton methylene [δ H
3.08 (1H, dd, J = 18.5 và 2.7, H-6′α)], [δ H 3.15 (1H, ddd, J = 18.5, 5.9 và 2.1, H- 6′β)], [δ H 2.42 (2H, dd, J = 14.5 và 7.5, H-1′′)]; 2 nhóm methyl [δ H 1.67 (3H, s, H-4′
Phổ 13 C-NMR (Phụ lục 3.10) và DEPT (Phụ lục 3.11) của hợp chất 2 xuất hiện tín hiệu carbon của 19 carbon Trong đó có 1 carbon carbonyl của nhóm ketone tiếp cách [δ C 200.6, C-3′]; 2 carbon hương phương trí hoán nối với oxygen [δ C 158.9, C-
5], [δ C 98.3, C-7]; 1 carbon hương phương trí hoán [δ C 122.0, C-3a]; 1 carbon olefin trí hoán nối oxygen [δ C 153.2, C-2]; 2 carbon olefin trí hoán [δ C 143.6, C-1′], [δ C
135.0, C-3′′]; 3 carbon methine olefin [δ C 110.7, C-3], [δ C 118.8, C-2′], [δ C 118.7, C- 2′′]; 1 carbon sp 3 trí hoán nối oxygen [δ C 79.7, C-4′]; 1 carbon oxymethine [δ C 73.0, C-5′]; 2 carbon methylene [δ C 35.3, C-1′′], [δ C 32.0, C-6′]; 2 carbon methyl [δ C 26.1, C-4′′], [δ C 18.1, C-5′′] (Bảng 3.2).
Bảng 3.2 Dữ liệu phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR và tương quan HMBC của hợp chất 2 trong dung môi acetone- d 6
Vị trí Loại C Hợp chất 2 Tương quan HMBC δ H δ C 2 J 3 J
Dữ liệu phổ 1D-NMR cho thấy hợp chất 2 có cấu trúc khung benzofuran liên kết với vòng cyclohexenone và dây prenyl Phân tích phổ 1H-1H COSY, HSQC, và HMBC cho thấy khung benzofuran mang một nhóm hydroxyl tại vị trí C-6, trong khi vòng cyclohexenone có nối đôi giữa C-1′ và C-2′, hai nhóm hydroxyl tại C-4′ và C-5′, cùng một nhóm ketone tại C-3′ Vòng cyclohexenone kết nối với khung benzofuran tại vị trí C-2 thông qua tương quan HMBC của H-2′ và H-6′ với C-2, H-3 với C-1′ Dây prenyl gắn vào vị trí C-4′ của vòng cyclohexenone qua tương quan HMBC giữa H-1′′ với C-3′, C-4′ và C-5′.
Hình 3.7 Tương quan COSY, HMBC của hợp chất 2
Phân tích phổ NOESY của hợp chất 2 cho thấy H-6′α có tương quan NOE với H-5′, trong khi proton H-5′ chẻ mũi dd với H-6′α (J = 2.7 Hz) và H-6′β (J = 5.9 Hz), cho thấy H-5′ định hướng α cùng phía với H-6′α H-6′β định hướng β ở vị trí xích đạo trong cấu trạng nửa ghế của vòng cyclohexenone, dẫn đến nhóm hydroxyl tại vị trí C-5′ cũng sẽ định hướng β ở vị trí trục Tương quan NOE của H-6′β với H-1′′ cho thấy H-1′′ định hướng β ở vị trí xích đạo trong cấu trạng nửa ghế của vòng cyclohexenone.
4′ sẽ định hướng β ở vị trí trục Ngoài ra, tương quan H-2′′ với H-4′′ và H-1′′ với H- 5′′ cho thấy nối đôi giữa C-2′′ và C-3′′ của dây dẫn xuất prenyl có cấu hình E (Hình 3.8).
Hình 3.8 Tương quan NOESY của hợp chất 2
Phân tích phổ HR-ESI-MS của hợp chất 2 cho thấy mũi ion phân tử giả tại m/z 351.1224, gần với giá trị lý thuyết m/z 351.1208, với sai lệch chỉ 1.6 mMass, tương ứng với công thức phân tử [C19H20O5Na]+.
Cấu trúc của hợp chất 2 đã được xác định như hình 3.9 Sau khi tra cứu trên phần mềm SciFinder vào ngày 10/11/2019 tại Đại học Houston, Texas, USA, hợp chất 2 được công nhận là chất mới, lần đầu tiên được công bố trên toàn cầu và được đặt tên là streblus G (Hình 3.9).
Hình 3.9 Công thức cấu tạo của streblus G
3.1.4 Biện luận cấu trúc hợp chất 3
Hợp chất 3 (Hình 3.10) có dạng bột, màu vàng cam, tan tốt trong dung môi acetone.
Hình 3.10 Công thức cấu tạo của hợp chất 3
Phổ 1 H-NMR (Phụ lục 3.17) của hợp chất 3 xuất hiện tín hiệu của 3 proton hương phương ghép hệ ABX [δ H 7.52 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-4)], [δ H 7.00 (1H, d, J 2.1 Hz, H-7)], [δ H 6.87 (1H, dd, J = 8.5 và 2.1 Hz, H-5)]; 2 proton olefin ghép trans [δ H 6.10 (1H, d, J = 15.5 Hz, H-2′′)], [δ H 5.91 (1H, d, J = 15.5 Hz, H-1′′)]; 2 proton olefin cô lập [δ H 7.33 (1H, s, H-3)], [δ H 6.55 (1H, d, J = 2.5, H-2′)]; 1 proton oxymethine [δ H 4.15 (1H, dd, J = 5.6 và 2.5 Hz, H-5′)]; 2 proton methylene [δ H 3.15 (1H, dd, J = 18.3 và 2.5 Hz, H-6′α], [], [δ H 3.08 (1H, ddd, J = 18.3, 5.6, 2.5 Hz, H-6′β];];
Phổ 13 C-NMR (Phụ lục 3.18) và DEPT (Phụ lục 3.19) của hợp chất 3 xuất hiện tín hiệu của 19 carbon Trong đó có 1 carbon carbonyl của nhóm ketone tiếp cách [δ C 199.1, C-3′]; 2 carbon hương phương trí hoán nối với oxygen [δ C 158.9, C-6], [δ C 158.0, C-7a]; 3 carbon methine hương phương [δ C 123.4, C-4], [δ C 114.3, C-5], [δ C 98.3, C-7]; 1 carbon hương phương trí hoán [δ C 122.0, C-3a]; 1 carbon olefin trí hoán nối oxygen [δ C 153.2, C-2], 1 carbon olefin trí hoán [δ C 144.2, C-1′]; 4 carbon methine olefin [δ C 142.4, C-2′′], [δ C 124.6, C-1′′], [δ C 119.0, C-2′], [δ C 111.0, C-3]; 2 carbon sp 3 trí hoán nối oxygen [δ C 80.4, C-4′], [δ C 70.3, C-3′′], 1 carbon oxymethine [δ C 74.5, C-5′]; 1 carbon methylene [δ C 32.1, C-6′]; 2 carbon methyl [δ C 30.4, C-4′′], [δ C 30.2, C-5′′] (Bảng 3.3).
Bảng 3.3 Dữ liệu phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR và tương quan HMBC của hợp chất 3 trong dung môi acetone- d 6
Vị trí Loại C Hợp chất 3 Tương quan HMBC δ H δ C 2 J 3 J
Dữ liệu từ phổ 1D-NMR cho thấy hợp chất 3 có cấu trúc khung benzofuran liên kết với vòng cyclohexenone, tương tự như hợp chất 2, nhưng có sự khác biệt ở các tín hiệu của dây nhánh dẫn xuất prenyl Phân tích phổ 1H-1H COSY, HSQC và HMBC của hợp chất đã được thực hiện để xác định cấu trúc chi tiết.
Vòng cyclohexenone được gắn vào vị trí C-2 của khung benzofuran, trong khi dây nhánh dẫn xuất prenyl được gắn vào vị trí C-4′ của vòng cyclohexenone Dây nhánh này được xác định là 3-methyl-3-hydroxylbutenyl thông qua tương quan HMBC giữa H-1′′ với C2′′ và C-3′′, cũng như giữa H-4′′ với H-5′′ và C-2′′, C-3′′ (Hình 3.11).
Hình 3.11 Tương quan COSY, HMBC của hợp chất 3
Phân tích phổ 1H-1H NOESY của hợp chất 3 cho thấy mối tương quan NOE giữa H-6′α và H-5′, với H-5′ tạo mối liên hệ chẻ mũi dd với H-6′α (J = 2.5 Hz) và H-6′β (J = 5.6 Hz) Điều này chỉ ra rằng H-5′ định hướng α và cùng phía với H-6′α, trong khi H-6′β định hướng β ở vị trí xích đạo trong cấu trạng nửa ghế của vòng cyclohexenone Nhóm hydroxyl tại C-5′ do đó sẽ định hướng β ở vị trí trục Thêm vào đó, mối tương quan NOE giữa H-6′β và H-1′′ cho thấy H-1′′ cũng định hướng β ở vị trí xích đạo trong cấu trạng nửa ghế của vòng cyclohexenone, dẫn đến nhóm hydroxyl tại C-4′ định hướng β ở vị trí trục.
Hình 3.12 Tương quan NOESY của hợp chất 3
Phổ HR-ESI-MS của hợp chất 3 cho thấy sự xuất hiện của mũi ion phân tử giả tại m/z 367.1169, gần với giá trị lý thuyết m/z 367.1158, với sai lệch chỉ 1.1 mMass, tương ứng với công thức phân tử [C19H20O6Na]+.
Từ các phân tích trên, cấu trúc hợp chất 3 được xác định như hình 3.13 Tiến hành tra cứu phần mềm SciFinder vào ngày 10/11/2019 tại University of Houston,
Texas, USA cho thấy hợp chất 3 là chất mới, lần đầu tiên được công bố trên thế giới và được gọi tên là streblus H (Hình 3.13).
Hình 3.13 Công thức cấu tạo của streblus H 3.1.5 Biện luận cấu trúc hợp chất 4
Hợp chất 4 (Hình 3.14) có dạng bột, màu vàng cam, tan tốt trong dung môi acetone.
Hình 3.14 Công thức cấu tạo của hợp chất 4
Phổ 1 H-NMR (Phụ lục 3.25) của hợp chất 4 xuất hiện tín hiệu của 3 proton hương phương hệ ABX [δ H 7.48 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-6)], [δ H 6.46 (1H, d, J = 2.4
Hz, H-3)], [δ H 6.42 (1H, dd, J = 8.5 và 2.4 Hz, H-5)]; 2 proton olefin ghép trans [δ H
7.40 (1H, d, J = 16.4 Hz, H-α)], [δ H 7.01 (1H, d, J = 16.4 Hz, H-β)]; 2 proton olefin cô lập [δ H 5.97 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2′)], [δ H 5.18 (1H, brs, H-2′′)]; 1 proton oxymethine [δ H 4.48 (1H, dd, J = 4.3 và 1.6 Hz, H-5′)]; 4 proton methylene [δ H 3.19 (1H, dd, J = 18.8 và 1.6 Hz, H-6′α)], [δ H 2.82 (1H, ddd, J = 18.8, 4.3 và 2.0 Hz, H- 6′β)], [δ H 2.54 (1H, dd, J = 14.4 và 8.0 Hz, H-1′′α), [δ H 2.39 (1H, dd, J = 14.4 và 7.2
Phổ 13 C-NMR (Phụ lục 3.26) và DEPT (Phụ lục 3.27) của hợp chất 4 xuất hiện tín hiệu của 22 carbon Trong đó của 1 carbon carbonyl của nhóm ketone tiếp cách [δ C 199.2, C-3′]; 2 carbon hương phương trí hoán nối với oxygen [δ C 158.3, C-2], [δ C 160.8, C-4]; 3 carbon methine hương phương [δ C 129.6, C-6], [δ C 108.9, C-5], [δ C 103.6, C-3]; 1 carbon hương phương trí hoán [δ C 116.3, C-1]; 2 carbon olefin trí hoán [δ C 153.9, C-1′], [δ C 136.0, C-3′′]; 4 carbon methine olefin [δ C 132.3, C-α] , [δ C
126.4, C-β], [δ C 125.0, C-2′], [δ C 118.1, C-2′′]; 1 carbon cetal [δ C 108.0, C-1′′′]; 1 carbon sp 3 trí hoán nối oxygen [δ C 82.8, C-4′], 1 carbon oxymethine [δ C 77.3, C-5′];
Bảng 3.4 Dữ liệu phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR và tương quan HMBC của hợp chất 4 trong dung môi acetone- d 6
Vị trí Loại C Hợp chất 4 Tương quan HMBC δ H δ C 2 J 3 J
Thử nghiệm hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase
Hình 3.24 Tương quan HMBC của hợp chất 7
Phổ HR-ESI-MS của hợp chất 7 cho thấy mũi ion phân tử giả ở m/z 413.2643, tương ứng với n = 13, xác định rằng dây nhánh gắn tại vị trí C-4 của vòng benzene là heptadecanoate So với giá trị lý thuyết m/z 413.2668, sai lệch là 2.5 mMass, công thức phân tử được xác định là [C24H38O4Na]+.
Cấu trúc của hợp chất 7 được xác định như hình 3.25 Theo kết quả tra cứu trên phần mềm SciFinder vào ngày 10/11/2019 tại University of Houston, Texas, USA, hợp chất 7 là một chất mới, lần đầu tiên được công bố trên thế giới và được đặt tên là streblus J (Hình 3.25).
Hình 3.25 Công thức cấu tạo của streblus J 3.2 THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYME TYROSINASE
3.2.1 Kết quả thử hoạt tính của cao phân đoạn
Kết quả thử hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của các cao phân đoạn được thể hiện ở bảng 3.9.
Bảng 3.9 Kết quả thử hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của các cao phân đoạn
Cao phân Phần trăm ức chế I (%) IC 50 n: số nhóm -CH 2 đoạn (àg/mL)
100 (àg/mL) 50 (àg/mL) 25 (àg/mL) 10 (àg/mL) n-Hexane 27.72 ± 0.98 9.7 ± 1.1 - - > 100
1.0 (àg/mL) 0.5 (àg/mL) 0.25 (àg/mL) 0.1 (àg/mL)
Cao methanol toàn phần, cao ethyl acetate và cao methanol phân đoạn đều thể hiện hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase mạnh mẽ, vượt trội hơn so với acid kojic (IC50 = 6.34 µg/mL) với giá trị IC50 lần lượt là 0.63, 0.49 và 0.88 µg/mL Dựa trên kết quả này, các thử nghiệm tiếp theo sẽ được thực hiện để đánh giá hoạt tính của các cao phân đoạn từ cao ethyl acetate.
8.2 Kết quả thử hoạt tính các cao phân đoạn của cao ethyl acetate
Kết quả thử hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase các cao phân đoạn của cao ethyl acetate được thể hiện ở bảng 3.10.
Bảng 3.10 Kết quả thử hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của các phân đoạn ethyl acetate
Mẫu cao Phần trăm ức chế I (%) IC 50
100 (àg/mL) 50 (àg/mL) 25 (àg/mL) 10 (àg/mL)
10 (àg/mL) 5.0 (àg/mL) 2.5 (àg/mL) 1.0 (àg/mL)
1.0 (àg/mL) 0.5 (àg/mL) 0.25 (àg/mL) 0.1 (àg/mL)
0.1 (àg/mL) 0.05 (àg/mL) 0.025 (àg/mL) 0.01 (àg/mL)
Các cao từ phân đoạn A đến E cho thấy hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase yếu với nồng độ thử (IC50 > 100 µg/mL), trong khi các cao phân đoạn F, G và R có hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase tương đối mạnh (IC50: 13.2 - 62.8 µg/mL) Các cao phân đoạn này mạnh hơn so với chất đối chứng dương acid kojic (IC50 = 6.34 µg/mL) Đặc biệt, cao phân đoạn N có hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase mạnh nhất với giá trị IC50 là 0.048 µg/mL, mạnh gấp 132 lần so với acid kojic.
3.2.3 Kết quả thử hoạt tính các hợp chất phân lập được
Kết quả thử hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của 7 hợp chất phân lập được thể hiện trên bảng 3.11.
Bảng 3.11 Kết quả thử hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của 7 hợp chất phân lập được
Hợp chất Phần trăm ức chế (%) IC 50
100 àM 50 àM 25 àM 10 àM (àM)
Theo bảng 8.3, hợp chất 2, 3, 7 cho thấy hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase yếu với giá trị IC50 lớn hơn 100 àM Trong khi đó, hợp chất 1 và 5 có hoạt tính ức chế enzyme này tương đối mạnh, với giá trị IC50 lần lượt là 100 và 31.5 àM Đặc biệt, hợp chất 4 cũng được nhấn mạnh trong nghiên cứu này.
Hợp chất 4 có hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase rất mạnh với giá trị IC50 chỉ 0.01 àM, mạnh hơn hơn 4000 lần so với acid kojic (IC50 44.6 àM) Điều này được giải thích bởi cấu trúc stilbene trans của hợp chất 4, cần thiết cho khả năng ức chế enzyme Ngoài ra, cấu trúc 4-resorcinol (2,4-dihydroxy trong vòng hương phương) và nhóm prenyl cũng đóng vai trò quan trọng trong khả năng ức chế enzyme tyrosinase của hợp chất này.
Hình 3.26 Cấu trúc của hợp chất 4
Từ thân cây Duối ô rô, các loại cao n-hexane, ethyl acetate và methanol đã được điều chế, trong đó cao ethyl acetate thể hiện hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase mạnh nhất Do đó, cao ethyl acetate được chọn để phân lập hợp chất, dẫn đến việc điều chế 18 cao phân đoạn Qua thử nghiệm, các cao phân đoạn H, K và N cho thấy hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase mạnh, đặc biệt phân đoạn N có hoạt tính mạnh nhất, từ đó được chọn để khảo sát thành phần hóa học Từ ba cao phân đoạn H, K và N, đã phân lập được 7 hợp chất.
Trong 7 hợp chất phân lập được, 5 hợp chất lần đầu tiên được công bố trên thế giới và được gọi tên là streblus F (1), streblus G (2), streblus H (3), streblus I (4),