Bệnh Tiêu Chảy Cấp Trên Heo (Porcine Epidemic Diarrhea) Tại Đồng Bằng Sông Cửu Long Đặc Điểm Bệnh Học và Di Truyền Virus.Bệnh Tiêu Chảy Cấp Trên Heo (Porcine Epidemic Diarrhea) Tại Đồng Bằng Sông Cửu Long Đặc Điểm Bệnh Học và Di Truyền Virus.Bệnh Tiêu Chảy Cấp Trên Heo (Porcine Epidemic Diarrhea) Tại Đồng Bằng Sông Cửu Long Đặc Điểm Bệnh Học và Di Truyền Virus.Bệnh Tiêu Chảy Cấp Trên Heo (Porcine Epidemic Diarrhea) Tại Đồng Bằng Sông Cửu Long Đặc Điểm Bệnh Học và Di Truyền Virus.Bệnh Tiêu Chảy Cấp Trên Heo (Porcine Epidemic Diarrhea) Tại Đồng Bằng Sông Cửu Long Đặc Điểm Bệnh Học và Di Truyền Virus.Bệnh Tiêu Chảy Cấp Trên Heo (Porcine Epidemic Diarrhea) Tại Đồng Bằng Sông Cửu Long Đặc Điểm Bệnh Học và Di Truyền Virus.Bệnh Tiêu Chảy Cấp Trên Heo (Porcine Epidemic Diarrhea) Tại Đồng Bằng Sông Cửu Long Đặc Điểm Bệnh Học và Di Truyền Virus.Bệnh Tiêu Chảy Cấp Trên Heo (Porcine Epidemic Diarrhea) Tại Đồng Bằng Sông Cửu Long Đặc Điểm Bệnh Học và Di Truyền Virus.
GIỚI THIỆU
Đặt vấn đề
Bệnh tiêu chảy cấp trên heo (Porcine epidemic diarrhea - PED) là một bệnh truyền nhiễm do virus Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) thuộc loài Coronavirus gây ra, lây lan nhanh chóng và có tỷ lệ bệnh lên đến 100%, đặc biệt nguy hiểm với heo con theo mẹ, tỷ lệ chết có thể từ 30 – 90%, thậm chí lên đến 100% trong các ổ dịch tại châu Á như Hàn Quốc, Thái Lan và Philippines Mặc dù PEDV không gây chết trên heo trưởng thành, nhưng nó ảnh hưởng tiêu cực đến năng suất sinh sản, với tỷ lệ đẻ giảm 12,6%, tỷ lệ không lên giống lại 5,7%, sảy thai 1,3% và thai khô 2,0% Những heo nái mang thai lần đầu nhiễm PEDV sẽ gặp khó khăn trong việc duy trì năng suất sinh sản ở các lứa sau.
Nhiều nghiên cứu về gene và đặc điểm dịch tễ phân tử của virus gây tiêu chảy cấp trên heo (PEDV) đã chỉ ra sự đa dạng cao về gene do đột biến nhanh của virus và sự lây lan từ các quốc gia khác Các nghiên cứu này được thực hiện bởi nhiều tác giả, bao gồm Duarte và Laude (1994), Kocherhans et al (2001), Yeo et al (2003), Park et al (2007), Puranaveja et al (2009), Lee et al (2010) và Duy et al (2011).
Cuối năm 2008, dịch tiêu chảy cấp bùng phát đầu tiên tại Đồng Nai, sau đó lan rộng ra nhiều tỉnh thành khác ở Việt Nam Dịch bệnh đã gây thiệt hại nghiêm trọng cho đàn heo ở các tỉnh miền Đông Nam bộ, với tỷ lệ mắc bệnh có thể lên đến 100% ở mọi lứa tuổi Tỷ lệ tử vong giữa các lứa tuổi cũng khác nhau, nhưng đặc biệt cao ở nhóm heo con theo mẹ, dao động từ 50-100%.
Các chủng virus PEDV ở Việt Nam có sự tương đồng gene cao với các chủng từ Trung Quốc và Thái Lan, với mức khác biệt chỉ từ 0,00-2,86% Sự đa dạng của các chủng PEDV bắt đầu xuất hiện tại các địa phương như Bình Dương, Đồng Nai và TP HCM Phân tích trình tự nucleotide và amino acid của gene S cho thấy các chủng PEDV ở phía Bắc Việt Nam có tỷ lệ tương đồng cao với các chủng tham chiếu trước đó.
Bệnh tiêu chảy cấp do PEDV đang gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi heo ở Việt Nam, với nghiên cứu chủ yếu tập trung ở Miền Đông Nam bộ và một số tỉnh phía Bắc Việc phòng chống bệnh này chủ yếu dựa vào vaccine, nhưng tỷ lệ sử dụng vaccine còn hạn chế Các chủng virus PEDV thường xuyên biến đổi di truyền, vì vậy việc cập nhật đặc tính phân tử của các chủng này là cần thiết để lựa chọn vaccine hiệu quả Tuy nhiên, việc đánh giá di truyền của các chủng PEDV tại Việt Nam còn yếu kém, gây khó khăn trong việc sử dụng vaccine Dịch bệnh cũng đã lan đến Đồng bằng sông Cửu Long, khu vực chăn nuôi heo quan trọng Do đó, nghiên cứu về sự hiện diện của PEDV, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích và kiểu gene của virus là rất cần thiết, nhằm xác định nguồn gốc tiến hóa và biến đổi di truyền của các chủng PEDV, từ đó định hướng chiến lược sản xuất vaccine trong tương lai.
(Porcine Epidemic Diarrhea) Tại Đồng Bằng Sông Cửu Long: Đặc ĐiểmBệnh Học và Di Truyền Virus” được tiến hành.
Mục tiêu của nghiên cứu
Đánh giá sự lưu hành của virus gây bệnh tiêu chảy ở heo (PEDV) và các yếu tố nguy cơ liên quan đến bệnh tiêu chảy ở heo (PED) tại một số tỉnh ở đồng bằng sông Cửu Long là cần thiết để nâng cao hiệu quả kiểm soát dịch bệnh Nghiên cứu này nhằm xác định mức độ lây lan của PEDV và các yếu tố ảnh hưởng, từ đó đề xuất các biện pháp phòng ngừa và kiểm soát dịch bệnh hiệu quả hơn cho ngành chăn nuôi heo trong khu vực.
Xác định đặc điểm bệnh học của bệnh tiêu chảy do virus (PED) tại một số tỉnh ở Đồng bằng sông Cửu Long nhằm hỗ trợ chẩn đoán bệnh Đồng thời, đánh giá sự biến đổi di truyền của virus PEDV trong khu vực này sẽ cung cấp cơ sở dữ liệu quan trọng cho các nghiên cứu về dịch tễ học và phát triển vaccine.
Nội dung nghiên cứu
Khảo sát sự lưu hành virus gây bệnh tiêu chảy ở heo (PEDV) trên đàn heo nái tại các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long cho thấy sự hiện diện của kháng thể dịch thể trong các đàn heo chưa được tiêm vaccine phòng PED Nghiên cứu này nhằm đánh giá mức độ lây nhiễm và tác động của PEDV đối với sức khỏe đàn heo tại khu vực.
Khảo sát các yếu tố nguy cơ có liên quan đến bệnh PED tại một số tỉnh ở Đồng bằng sông Cửu Long.
Khảo sát tỷ lệ bệnh do PEDV trên các đàn heo con theo mẹ và heo nái mắc bệnh tiêu chảy.
Khảo sát tần suất xuất hiện triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể, vi thể ở các ca bệnh PED tại một số tỉnh thuộc Đồng bằng sông Cửu Long Nghiên cứu này nhằm cung cấp cái nhìn tổng quan về tình hình dịch bệnh và hỗ trợ trong việc quản lý và điều trị bệnh hiệu quả hơn.
Phân tích di truyền của virus PEDV tại các tỉnh thuộc Đồng bằng sông Cửu Long cho thấy sự đa dạng di truyền đáng kể Nghiên cứu này so sánh các chủng virus PEDV đã được phân lập tại Việt Nam với các chủng từ các quốc gia khác, dựa trên dữ liệu từ ngân hàng gene Kết quả cho thấy sự tương đồng và khác biệt giữa các chủng, cung cấp thông tin quan trọng cho việc kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh.
Ý nghĩa của luận án
- Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả của Luận án đã xác nhận sự hiện diện của
PED (Bệnh tiêu chảy do virus) tại các trại chăn nuôi heo ở đồng bằng sông Cửu Long có những đặc điểm lâm sàng quan trọng giúp người chăn nuôi dễ dàng chẩn đoán dịch bệnh Việc nhận diện các yếu tố nguy cơ liên quan đến PED sẽ góp phần vào việc xây dựng các giải pháp kiểm soát dịch bệnh hiệu quả cho đàn heo trong khu vực này.
Nghiên cứu này cung cấp cái nhìn sâu sắc về tình hình lưu hành virus gây bệnh tiêu chảy trên heo (PEDV) và các yếu tố nguy cơ liên quan đến bệnh PED tại một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long Kết quả phân tích di truyền cho thấy sự biến đổi phức tạp của các chủng PEDV trong khu vực này, từ đó tạo nền tảng khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo về đặc điểm dịch tễ và phát triển vaccine phòng ngừa bệnh PED.
Bệnh tiêu chảy cấp do virus (PED) ở heo có các triệu chứng lâm sàng đặc trưng, bao gồm tiêu chảy nặng, mất nước và suy yếu nhanh chóng Các bệnh tích vi thể và đại thể khi heo mắc PED cũng thể hiện rõ rệt, tạo cơ sở vững chắc cho việc chẩn đoán bệnh Việc nhận diện sớm các triệu chứng và tổn thương này là rất quan trọng để kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh hiệu quả.
Những điểm mới của luận án
- Nghiên cứu đầu tiên tương đối toàn diện về PED trên đàn heo ở Đồng bằng sông Cửu Long.
- Nghiên cứu hồi cứu đầu tiên về PED trên đàn nái qua xét nghiệm kháng thể kháng PEDV bằng kỹ thuật ELISA.
- Phân tích được tương đối đầy đủ các yếu tố nguy cơ có liên quan đến bệnh PED.
- Phân tích di truyền đầu tiên, tương đối đầy đủ cả về 4 gene cấu trúc S,
E, N và M của các chủng PEDV tại một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu nghiên cứu
3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
3.1.1.1 Thời gian nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ tháng 01/2015 đến tháng 06/2018
3.1.1.2 Địa điểm nghiên cứu Địa điểm lấy mẫu: Các mẫu huyết thanh heo nái chưa tiêm phòng vaccine PED, mẫu phân heo tiêu chảy, các mẫu bệnh phẩm (phân, ruột…) của heo con mắc bệnh tiêu chảy do PEDV được thu thập tại các cơ sở chăn nuôi ở tỉnh Tiền Giang, Bến Tre, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Cần Thơ, Hậu Giang và Sóc Trăng. Địa điểm nghiên cứu:
Xét nghiệm tìm kháng thể kháng PEDV được thực hiện tại Phòng thí nghiệm tại Trung tâm nghiên cứu và phát triển Vemedim
Xét nghiệm RT-PCR và giải trình tự gene được thực hiện tại Phòng Chẩn đoán xét nghiệm Thú Y Hàn Việt thuộc Đại học Nông Lâm TP HCM, phối hợp với công ty Macrogen từ Hàn Quốc.
Theo dõi triệu chứng lâm sàng và mổ khám quan sát các bệnh tích đại thể được thực hiện tại các ổ dịch PED tại cơ sở chăn nuôi.
Mẫu tiêu bản vi thể được thực hiện tại Phòng thí nghiệm bệnh học – Đại học Y Dược Cần Thơ
3.1.2.1 Thiết bị, dụng cụ Ống tiêm 5 và kim 23, 18 Tube đựng huyết thanh, micropipetle, pipetle Đĩa 96 giếng dùng pha loãng mẫu.
Các ống đong chia độ: 5-50 ml và 500 ml.
Máy ly tâm và tủ đông trữ mẫu -20 o C đến -86 o C.
Máy đọc ELISA, máy lắc vortex, tủ ấm.
Hệ thống PCR (Máy luân nhiệt, máy khuếch đại gene, hệ thống chạy điện di và chụp ảnh…)
Máy đúc block, khuôn đúc, máy cắt, phiến kính, lamen, dao, kéo, panh, kẹp, cốc đựng hóa chất
3.1.2.2 Hóa chất và sinh phẩm dùng cho phản ứng ELISA và test nhanh
Bộ kit thương mại ELISA Porcine epidemic diarrhea virus antibody test kit, Swinecheck R PED indirect của hãng Biovet – Canada
Test nhanh Anigen rapid PED Ag test Kit của hảng Bionote - Hàn Quốc.
3.1.2.3 Hóa chất và sinh phẩm dùng cho RT – PCR
GeneJET Viral DNA and RNA Purification Kit (Thermo Scientific, Mỹ) RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, Mỹ) GoTaq Green master mix (Promega, Mỹ)
3.1.2.4 Hóa chất và sinh phẩm dùng cho khảo sát bệnh tích vi thể
Formol 10%, cồn các loại, xylen paraffin, thuốc nhuộm eosin, hematoxylin
3.1.2.5 Hóa chất và sinh phẩm dùng cho giải trình tự gene
Hóa chất ly trích RNA: GenJET Viral DNA and RNA Purification Kit (Thermo, Mỹ)
Hóa chất phản ứng tạo cDNA: RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo, Mỹ)
Hóa chất phản ứng PCR: GoTaq G2 Green Master Mix (Promega, Mỹ)
Hóa chất tinh sạch sản phẩm PCR: GeneJET Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit (Thermo, Mỹ)
Hóa chất điện di DNA: Agarose (Promega, Mỹ); Ethidium bromide 10 mg/ml (Sigma, Mỹ); dung dịch đệm TBE 10X (Promega, Mỹ); thang DNA
Hóa chất phản ứng nối: Enzyme T4 DNA ligase và buffer ligase (10X) (Promega, Mỹ).
Hóa chất biến nạp: Dung dịch CaCl2; dung dịch glycerol
Hóa chất khác: IPTG (isopropylthio-β-galactoside) (Thermo, Mỹ); X- Gal (5-bromo-4-chloro-indolyl-β-D-galactopyranoside) (Thermo, Mỹ); ampicillin (100 mg/ml)
Môi trường LB (Luria-Bertani), môi trường SOC (2 g tryptone; 0,5 g yeast extract; 1 ml NaCl 1M; 0,25 ml KCl 1M; 97 ml nước cất), LB/ampicillin/IPTG/X-Gal
Chủng E coli DH5αIFN (Genotype: F– Φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)M15 ΔM15 Δ(lacZYA-argF)(lacZYA-argF)U169 recA1 endA1 hsdR17 (rK–, mK+) phoA supE44 λ– thi-1 gyrA96 relA1)(Takara Bio Inc).
Vector tạo dòng TA: pGEM-T Easy (Promega, Mỹ)
Hình 3.1 Vector tạo dòng TA: pGEM-T Easy (Promega, Mỹ)
Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Nội dung 1: Khảo sát sự lưu hành của PEDV bằng phương pháp ELISA và phân tích các yếu tố nguy cơ Đối tượng điều tra: Các cơ sở chăn nuôi heo tại một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long chưa tiêm phòng vaccine PED cho heo
Thông tư liên tịch số 69/2000/TTLT/BNN-TCTK quy định các cơ sở chăn nuôi đạt tiêu chí trang trại phải có từ 20 nái hoặc 100 heo thịt trở lên, được phân chia thành ba mức: 20 – dưới 50 nái, 50 – 100 nái và trên 100 nái Các cơ sở chăn nuôi nhỏ lẻ được chia thành hai mức độ: dưới 10 nái và từ 10 đến dưới 20 nái Tại một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long, dữ liệu điều tra về bệnh PED đã được thu thập thông qua phiếu điều tra (phụ lục 10) và lấy mẫu máu từ đàn heo nái để đánh giá tình trạng lưu hành bệnh Mẫu máu được lấy từ các đàn heo nái chưa sử dụng vaccine phòng bệnh PED theo bảng 3.1.
Theo nghiên cứu gần đây về tình hình nhiễm PEDV ở heo tại miền Nam Việt Nam, tỷ lệ nhiễm PEDV qua xét nghiệm mẫu phân đạt 16,96% Chúng tôi ước tính tỷ lệ nhiễm PEDV tại Đồng bằng sông Cửu Long khoảng 20% Sử dụng công thức của Thrusfield (1997) với độ tin cậy 95% và độ chính xác 5%, số mẫu tối thiểu cần lấy là 246 mẫu Chúng tôi cũng kết hợp dữ liệu tổng đàn nái của từng tỉnh để thực hiện việc thu thập mẫu.
Bảng 3.1: Số mẫu thu thập trong nghiên cứu Địa điểm Tổng đàn heo
Số mẫu đã thu thập
Để thực hiện việc lấy máu ở heo, trước tiên sử dụng dây dù để cố định mõm heo Tiếp theo, dùng bông gòn tẩm cồn 70 độ để sát trùng vị trí lấy máu Sử dụng ống tiêm 5 hoặc 10 ml với kim số 18 hoặc 23 để tiến hành lấy mẫu máu, mỗi lần lấy từ 2-5 ml ở tĩnh mạch chủ trước.
Gỡ kim và bơm nhẹ để máu chảy vào ống nghiệm vô trùng đã được dán nhãn với số tai và ngày lấy mẫu Sau đó, máu được để đông và bảo quản trong thùng đá trước khi chuyển về phòng thí nghiệm Tại đây, huyết thanh được tách ra và ly tâm ở tốc độ 3.000 vòng/phút trong 10 phút để làm sạch Cuối cùng, huyết thanh được chiết vào ống nhựa vô trùng, ghi rõ ký hiệu mẫu và bảo quản ở nhiệt độ -20°C chờ xét nghiệm.
Phương pháp thực hiện phản ứng ELISA (Theo bộ kít Porcine epidemic diarrhea virus antibody test kit, Swinecheck R PED indirect của hãng Biovet – Canada)
* Thành phần của bộ kit ELISA thương phẩm Đĩa 96 giếng đã gắn kháng nguyên Đối chứng dương, đối chứng âm
Dung dịch pha loãng mẫu
Dung dịch ngừng phản ứng
*Chuẩn bị dung dịch rửa
Pha loãng dung dịch rửa đậm đặc với nước cất theo tỷ lệ 1/10 (40 ml dung dịch rửa đậm đặc với 360 ml nước cất dùng cho một đĩa phản ứng).
Để chuẩn bị huyết thanh, đầu tiên lấy huyết thanh ra và để ở nhiệt độ phòng Sau đó, huyết thanh được pha loãng 200 lần theo hướng dẫn của bộ kit Cụ thể, pha 10 µl mẫu với 190 µl dung dịch pha loãng mẫu để có dung dịch pha loãng 1/20 Tiếp theo, pha 20 µl dung dịch pha loãng lần 1 với 180 µl dung dịch pha loãng mẫu để đạt nồng độ 1/200.
Huyết thanh âm tính và dương tính đối chứng không pha loãng.
Hãy cẩn thận thay đổi các đầu týp cho từng mẫu và ghi lại vị trí của từng mẫu trên đĩa theo bảng 3.2 Trước khi đưa mẫu vào các giếng đã được phủ sẵn kháng nguyên PEDV, hãy trộn đều mẫu.
Mang tất cả các thuốc thử để nhiệt độ phòng trước khi sử dụng
Pha loãng dung dịch Concentrate conjugate A và Concentrate conjugate
B với dung dịch pha loãng mẫu theo tỷ lệ 1/250.
Thực hiện theo các bước sau
Bảng 3.2 Bảng phân phối mẫu trong xét nghiệm ELISA
PC: Positive control – đối chứng dương.
NC: Negative control – đối chứng âm
S1, S2, S3, : Mẫu huyết thanh kiểm tra.
1 Làm bảng sơ đồ phân bố của các mẫu kiểm tra và đối chứng.
2 Cho 100 àl mẫu đó được pha loóng, đối chứng dương và đối chứng õm vào các giếng đã phủ sẵn kháng nguyên PEDV.
3 Che các giếng và ủ ở nhiệt độ 23 ± 2 0 C trong 60 phút.
4 Cho 300 àl dung dịch rửa vào mỗi giếng cho 1 lần rửa, khoảng 10 giõy đổ bỏ dung dịch rửa Làm ráo giếng bằng cách đập đĩa nhẹ lên giấy thấm Lập lại 3-5 lần (tránh làm khô giếng giữa các lần rửa và trước khi cho dung dịch conjugate vào).
5 Cho vào mỗi giếng 100 àl dung dịch conjugates A.
6 Che các giếng và ủ ở nhiệt độ 23 ± 2 0 C trong 60 phút.
8 Cho vào mỗi giếng 100 àl dung dịch conjugates B.
9 Che các giếng và ủ ở nhiệt độ 23 ± 2 0 C trong 60 phút.
11 Cho vào mỗi giếng 100 àl dung dịch substrate
12 Che các giếng và ủ trong tối ở nhiệt độ 23 ± 2 0 C trong 10 phút.
13 Cho vào mỗi giếng 100 àl dung dịch ngừng phản ứng
14 Đọc kết quả bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 450 nm Nên đọc kết quả trong khoảng 15 phút sau khi bổ sung các dung dịch ngừng phản ứng
ODs: Giá trị OD của mẫu
M ODN: Trung bình giá trị OD của đối chứng âm
M ODP: Trung bình giá trị OD của đối chứng dương Điều kiện
Các tiêu chí sau đây phải được đáp ứng để xác nhận kết quả:
• Đối chứng âm phải có giá trị OD nhỏ hơn 0,40
• Đối chứng dương phải có giá trị OD lớn hơn 0,70
• Tỷ số S/P < 0,4 được coi là âm tính.
• Tỷ số S/P ≥ 0,4 được coi là dương tính.
Hình 3.2 Bộ kit ELISA phát hiện kháng thể IgG của PEDV (hãng
Hình 3.3 Kết quả phản ứng ELISA
Phân tích các yếu tố nguy cơ
Phương pháp điều tra hồi cứu được áp dụng thông qua phỏng vấn người chăn nuôi về nguồn giống, điều kiện vệ sinh thú y và công tác phòng trị bệnh Bên cạnh đó, kết quả xét nghiệm kháng thể kháng PEDV từ các mẫu huyết thanh thu thập tại các cơ sở chăn nuôi cũng được phân tích Từ đó, chúng tôi sẽ đánh giá tình hình dịch bệnh và các yếu tố liên quan đến bệnh PED dựa trên phân tích yếu tố nguy cơ OR.
3.3.2 Nội dung 2: Đánh giá tỷ lệ bệnh do PEDV Đối tượng lấy mẫu: 191 đàn (2.262 con) heo con theo mẹ con và 525 heo nái (Nái nuôi con: 110, mang thai: 96, chờ phối: 153, hậu bị: 166) trong các cơ sở chăn nuôi ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long mắc bệnh tiêu chảy được thu thập mẫu để xét nghiệm đánh giá tỷ lệ bệnh do PEDV.
Phương pháp lấy mẫu bao gồm việc thu thập mẫu phân từ heo con và heo nái mắc bệnh tiêu chảy qua hậu môn, sau đó sử dụng bộ xét nghiệm PED – Ag để kiểm tra Ngoài ra, một số heo con theo mẹ trong các đàn dương tính với PEDV được chọn ngẫu nhiên để mổ khám và thu thập mẫu ruột, nhằm thực hiện xét nghiệm khẳng định bằng phương pháp chuyên sâu.
Phương pháp chẩn đoán bệnh bằng PED-Ag test kit (hãng Biovet -
Để thực hiện phản ứng bằng bộ kít PED-Ag, các bước cần tuân theo được mô tả trong Hình 3.4 Kết quả được đọc như sau: mẫu âm tính chỉ hiển thị vạch màu đỏ tím ở vị trí C (control), trong khi mẫu dương tính có vạch màu đỏ ở cả vị trí C và T (test) với kháng nguyên PEDV.
Phương pháp RT-PCR dùng để chẩn đoán các ca tiêu chảy nghi bệnh do PEDV
Mẫu ruột heo, bao gồm tá tràng, không tràng, hồi tràng và ruột già, bị tiêu chảy trong các đàn heo dương tính với PEDV (được kiểm tra bằng bộ kit PED – Ag) được thu thập qua phương pháp mổ khám định kỳ Các mẫu này cần được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 đến 8ºC nếu tiến hành ngay, hoặc có thể được lưu trữ ở -86ºC để sử dụng trong các ngày sau.
Mẫu dịch của ruột được nghiền bằng cối vô trùng và pha loãng với dung dịch đệm PBS thành huyễn dịch 10% Sau đó, huyễn dịch được ly tâm lạnh ở tốc độ 3.000 vòng/phút, nhiệt độ 4ºC trong thời gian 5-10 phút Cuối cùng, lấy 1 ml dung dịch ở phần trên ống ly tâm cho vào ống nhựa vô trùng để chuẩn bị cho quá trình ly trích RNA theo hướng dẫn đã được cung cấp.
Quy trình ly trích RNA (Thermo Scientific):
1 Thờm 50 àl Column Preparation Liquid vào giữa cột Spin Column để làm ẩm màng.
2 Cho 200 àl mẫu vào tube 1,5 ml.
3 Thờm 200 àl Lysis Solution (đó thờm Carrier RNA), và 50 àl Proteinase K, trộn đều bằng cách vortex Ủ ở 56°C trong 15 phút Ly tâm nhanh 3-5 giây.
4 Thờm 300 àl ethanol (96-100%), trộn đều bằng cỏch vortex Ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 phút Ly tâm nhanh 3-5 giây.
5 Chuyển dịch tan vào cột Spin Column Ly tâm trong 1 phút ở 6.000 vòng/phút Thay tube 2 ml mới.
6 Thờm 700 àl Wash Buffer 1 vào cột Spin Column Ly tõm trong 1 phút ở 6.000 vòng/phút Thay tube 2 ml mới.
7 Thờm 500 àl Wash Buffer 2 vào cột Spin Column Ly tõm trong 1 phút ở 6.000 vòng/phút Thay tube 2 ml mới.
8 Lặp lại bước 7 thêm 1 lần.
9 Ly tâm cột trong 3 phút ở 16.000 vòng/phút Loại bỏ tube chứa dịch lọc.
10 Cho cột Spin Column vào tube 1,5 ml mới Thờm 50 àl dung dịch Eluent (đã ủ ở 56°C) vào giữa cột Ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút Ly tâm trong 1 phút ở 13.000 vòng/phút Loại bỏ cột Bảo quản nucleic acid ở -20°C hay - 70°C.
Bảng 3.3 Thành phần phản ứng Reverse RNA thành cDNA:
Thành phần Thể tớch (àl)
Tổng thể tích 20 Ủ hỗn hợp phản ứng ở 25°C trong 5 phút, 42°C trong 60 phút Bất hoạt phản ứng ở 70°C trong 5 phút.
Bảng 3.4 Trình tự Primer (Li et al., 2016)
Tên primer Trình tự (5’ – 3’) Kích thước sản phẩm
PED-F GGG CGC CTG TAT AGA GTT TA
PED-R AGA CCA CCA AGA ATG TGT CC
Bảng 3.5 Thành phần phản ứng PCR
Thành phần Thể tớch (àl)
Bảng 3.6 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR (Li et al., 2016)
Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra kèm với thang DNA 100 bp (Enzynomics) trên gel agarose 1%, ở hiệu điện thế 100V trong 30 phút.
3.2.3 Nội dung 3: Khảo sát tần suất xuất hiện các biểu hiện bệnh lý của bệnh PED
Các chỉ tiêu theo dõi
Khảo sát tỷ lệ nhiễm PEDV
- Theo cơ sở chăn nuôi
Số cơ sở có heo nái có kháng thể kháng PEDV
Tổng số cơ sở thu thập mẫu
- Theo từng cá thể nái, theo từng địa phương, lứa đẻ, qui mô trại
Số mẫu huyết thanh có kháng thể kháng PEDV
Tổng số mẫu huyết thanh xét nghiệm
ODs: Giá trị OD của mẫu
M ODN: Trung bình giá trị OD của đối chứng âm
M ODP: Trung bình giá trị OD của đối chứng dương
Phân tích các yếu tố nguy cơ
Các yếu tố liên quan đến bệnh PED bao gồm chợ mua bán động vật, lò giết mổ gia súc, đường giao thông chính, việc tiêu độc sát trùng chuồng trại, nguồn nước chăn nuôi, và việc nhập con giống từ bên ngoài cũng như các hộ chăn nuôi liền kề Để đánh giá nguy cơ mắc bệnh, cần tính toán yếu tố nguy cơ OR (odds ratio) dựa trên xác suất mắc bệnh của nhóm phơi nhiễm với các yếu tố này.
1- P1: Xác suất không mắc bệnh của nhóm phơi nhiễm với yếu tố nguy cơ
P2: Xác suất mắc bệnh của nhóm không phơi nhiễm với yếu tố nguy cơ 1- P2: Xác suất không mắc bệnh của nhóm không phơi nhiễm với yếu tố nguy cơ
Khảo sát tỷ lệ bệnh do PEDV trên heo tiêu chảy
Số heo tiêu chảy do PEDV
Tỷ lệ bệnh do nhiễm PEDV = x 100
Tổng số heo tiêu chảy khảo sát
Khảo sát tỷ lệ bệnh và tỷ lệ chết trên các đàn heo dương tính PEDV
Số heo tiêu chảy dương tính với PEDV
Tổng số heo trong đàn có heo dương tính với PEDV
Số heo chết do PEDV
Tổng số heo bệnh dương tính với PEDV
Khảo sát tần suất xuất hiện triệu chứng, bệnh tích
Số con có biểu hiện Tần suất xuất hiện triệu chứng, bệnh tích = x 100
Tổng số con khảo sát
Phân tích tương đồng gene
Phân tích và so sánh tương đồng các trình tự gene bằng phần mềm Bioedit 7.2.6 (Hall, 1999).
Xây dựng cây phả hệ theo phương pháp Maximum likelihood bằng phần mềm MEGA 6.06 (Tamura et al., 2013) Chỉ số bootstrap được tính toán dựa trên 1000 lần lặp lại.
Phương pháp xử lý số liệu
Dữ liệu thô được xử lý và tính toán bằng Excel, trong khi dữ liệu tổng hợp được phân tích bằng phần mềm thống kê Minitab 16.0 Phân tích chi bình phương (χ²) được thực hiện để xác định tỷ lệ nhiễm PED trên nái theo từng địa phương, quy mô tổng đàn nái, lứa đẻ, tỷ lệ nhiễm PEDV, cũng như tỷ lệ bệnh và tử vong do nhiễm PEDV cùng các yếu tố nguy cơ Ngoài ra, phương pháp Anova one way cũng được áp dụng để phân tích tỷ số S/P.