Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học và đánh giá hiệu quả của các chủng nấm Beauveriavà Paecilomyces ký sinh trên côn trùng gây hại được phân lập tại Đồng bằng Sông Cửu Long.

Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học và đánh giá hiệu quả của các chủng nấm Beauveriavà Paecilomyces ký sinh trên côn trùng gây hại được phân lập tại Đồng bằng Sông Cửu Long.Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học và đánh giá hiệu quả của các chủng nấm Beauveriavà Paecilomyces ký sinh trên côn trùng gây hại được phân lập tại Đồng bằng Sông Cửu Long.Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học và đánh giá hiệu quả của các chủng nấm Beauveriavà Paecilomyces ký sinh trên côn trùng gây hại được phân lập tại Đồng bằng Sông Cửu Long.

GIỚI THIỆU

Tính cấp thiết của nghiên cứu

Sự phát triển của tính kháng thuốc trừ sâu hóa học ở côn trùng và lo ngại về tác động tiêu cực của hóa chất đối với môi trường và sức khỏe con người đã thúc đẩy nghiên cứu các tác nhân vi sinh vật trong kiểm soát côn trùng gây hại Điều này đã dẫn đến sự thay đổi trong chiến lược bảo vệ cây trồng tại Việt Nam, khi nhận thấy hạn chế của thuốc hóa học Với sự phát triển kinh tế xã hội và yêu cầu chất lượng nông sản ngày càng cao, các mô hình canh tác theo tiêu chuẩn GAP như VietGAP, EuroGAP và GlobalGAP đang phát triển mạnh mẽ ở Đồng bằng sông Cửu Long Những yếu tố này đã mở ra hướng đi mới cho ngành Bảo vệ thực vật Việt Nam, bao gồm nghiên cứu và sản xuất chế phẩm sinh học nhằm giảm thiểu hóa chất trong nông nghiệp Bên cạnh đó, các chương trình quản lý tổng hợp như IPM và ICM cũng được áp dụng rộng rãi, trong đó biện pháp sinh học đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì sự cân bằng sinh học của quần thể.

Một tập hợp đa dạng các vi sinh vật, bao gồm virus, vi khuẩn, động vật nguyên sinh và nấm, đang được nghiên cứu như các tác nhân sinh học kiểm soát côn trùng Theo ước tính, có khoảng 1,5 triệu loài nấm, trong đó khoảng 110.000 loài đã được mô tả.

Tính đến năm 2008, có khoảng 700 loài nấm thuộc 90 chi được xác định là tác nhân gây bệnh cho côn trùng (Roberts và Humber, 1981) Ngoài ra, đã có khoảng 170 sản phẩm kiểm soát dịch hại được phát triển dựa trên ít nhất 12 loài nấm ký sinh côn trùng (De Faria và Wraight, 2007).

Nghiên cứu về các loài ký sinh côn trùng thuộc bộ Hyphomycetes, đặc biệt là nấm Beauveria bassiana và Paecilomyces, đang thu hút sự quan tâm lớn Nấm Beauveria bassiana có khả năng gây bệnh cho hơn 700 loài côn trùng thuộc bộ cánh cứng, nhờ vào phổ ký chủ rộng và hiệu quả trong việc kiểm soát các loài côn trùng gây hại trong nông lâm nghiệp Loài nấm này đã và đang được ứng dụng rộng rãi trên toàn cầu như một giải pháp phòng trừ sinh học hiệu quả.

Nấm Beauveria bassiana, được sử dụng rộng rãi trên toàn cầu, đã chứng minh hiệu quả trong việc phòng trừ nhiều loại sâu hại cây trồng như bọ hung hại mía và sâu róm thông Nghiên cứu của Viện Bảo vệ Thực vật cho thấy nấm này có thể kiểm soát các đối tượng như rầy nâu hại lúa và châu chấu hại bắp, đạt được kết quả khả quan Hiện nay, nhiều quốc gia đã sản xuất và thương mại hóa các chế phẩm sinh học từ nấm Beauveria bassiana như Ostrinil và BotaniGard Bên cạnh đó, nấm Paecilomyces spp cũng đóng vai trò quan trọng trong phòng trừ sinh học, thường xuất hiện ở đất tơi xốp và các khu vực ẩm ướt, với một số loài như Paecilomyces javanicus và Paecilomyces carneus có giá trị ứng dụng cao.

Paecilomyces farinosus, Pacilomyces fumosoroseus, Paecilomyces lilacinus

Chế phẩm Pelomin đã được phát triển để phòng trừ ngài đục quả táo và sâu róm thông (CABI, 2002; Ferron, 1978; Trần Văn Mão, 2004) Hiện nay, Nhật Bản, Mỹ, Ấn Độ và Bỉ đã sản xuất nấm Paecilomyces fumosoroseus với các tên thương mại như PreFeRal, Priority, Pae-Sin để kiểm soát rệp sáp và rầy mềm (Kunimi, 2005) Nghiên cứu ứng dụng nấm Paecilomyces đã được cấp bằng sáng chế tại Trung Quốc Chủng nấm Paecilomyces javanicus kết hợp với hoạt chất Azadirachtin (tỷ lệ 100:0,05-0,25) dưới dạng bột hòa nước giúp phòng trừ nhiều loại sâu hại như sâu tơ và rầy phấn trắng Việc kết hợp này không chỉ tăng hiệu lực của nấm ký sinh mà còn giảm lượng Azadirachtin cần thiết (Huang Zhen và Ren Shunxiang, 2008a, 2008b) Ngoài ra, nghiên cứu của Huang Zhen và Ren Shunxiang (2008c) cũng chỉ ra rằng nấm Paecilomyces javanicus kết hợp với Cypermethrin và Acetamiprid có hiệu quả trong việc phòng trừ sâu hại, đặc biệt là các loài chích hút và ngăn ngừa tốt các dịch hại như bướm sâu tơ và bọ trĩ.

Việc sử dụng nấm ký sinh côn trùng như một phương pháp phòng trừ sinh học gặp nhiều hạn chế do sự phức tạp trong tương tác giữa các tác nhân gây bệnh, côn trùng ký chủ, môi trường và thời gian Hiểu rõ mối liên hệ giữa các yếu tố này là cần thiết để khắc phục khó khăn trong kiểm soát côn trùng gây hại Tuy nhiên, hiện nay chúng ta vẫn thiếu thông tin về sinh thái học, đặc tính sinh học và cấu trúc di truyền của các chủng nấm tại Việt Nam Gần đây, sự phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử đã giúp phân tích cấu trúc và biến động di truyền của các cá thể trong quần thể, đặc biệt là qua việc ứng dụng kỹ thuật phân tích rDNA của nấm Beauveria sp.

Paecilomyces spp (Isaria spp.) cho phép nhận diện sự khác biệt di truyền và mối quan hệ giữa các chủng nấm trong cùng một loài một cách rõ ràng hơn Trình tự vùng ITS-rDNA đã được áp dụng hiệu quả trong việc xác định và định danh các loài nấm thuộc chi Beauveria và Paecilomyces.

Đề tài nghiên cứu "Đặc điểm hình thái, sinh học và hiệu quả của các chủng nấm Beauveria và Paecilomyces ký sinh trên côn trùng gây hại tại Đồng bằng Sông Cửu Long" đã được thực hiện nhằm đánh giá tiềm năng ứng dụng của các loại nấm này trong kiểm soát dịch hại.

Lý do lựa chọn đề tài

Tại Đồng bằng Sông Cửu Long, khoai lang và cây ăn trái chiếm diện tích lớn, nhưng dịch hại như sùng và rệp sáp gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng sản phẩm Nông dân thường sử dụng nhiều thuốc bảo vệ thực vật để quản lý các loại côn trùng này, dẫn đến tồn dư hóa chất trong sản phẩm, ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng Do đó, nghiên cứu các phương pháp phòng trừ sinh học để quản lý côn trùng gây hại là cần thiết để giảm dần việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật trong sản xuất hiện nay.

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

Thu thập và định danh đến loài của các chủng nấm thuộc hai chi

Beauveria và Paecilomyces ký sinh trên một số loài côn trùng gây hại tại các tỉnh vùng ĐBSCL.

Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và khả năng ký sinh gây bệnh của các chủng nấm Beauveria và Paecilomyces đã được xác định loài, đồng thời phân tích các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của chúng.

Chúng tôi tiến hành tuyển chọn các chủng nấm Beauveria có khả năng ký sinh cao đối với sùng khoai lang C formicarius Fabricius trong điều kiện phòng thí nghiệm nhằm sản xuất chế phẩm hiệu quả Đồng thời, chúng tôi cũng đánh giá hiệu quả của chế phẩm nấm Beauveria ký sinh SKL trong các điều kiện khác nhau, bao gồm phòng thí nghiệm, nhà lưới và ngoài đồng.

Chúng tôi đã tiến hành tuyển chọn các chủng nấm Paecilomyces có khả năng ký sinh cao đối với rệp sáp P lilacinus trong điều kiện phòng thí nghiệm nhằm mục đích sản xuất chế phẩm Đồng thời, chúng tôi cũng đánh giá hiệu quả của chế phẩm nấm Paecilomyces này trong việc kiểm soát rệp sáp P lilacinus tại các môi trường khác nhau như phòng thí nghiệm, nhà lưới và ngoài đồng.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

1.3.1 Ý nghĩa khoa học Đề tài có ý nghĩa khoa học cao vì nghiên cứu về nấm ký sinh côn trùng thuộc chi nấm Beauveria và Paecilomyces có hệ thống từ thu thập các chủng nấm ngoài tự nhiên trên các loài côn trùng gây hại nông nghiệp tại ĐBSCL, tiến đến định danh loài nấm, nghiên cứu đặc tính hình thái, sinh học và đánh giá hiệu quả của các chủng nấm phân lập Ngoài ra, đề tài còn hướng tới việc sản xuất thử nghiệm chế phẩm nấm ký sinh cho hiệu quả cao ở điều kiện ngoài đồng để từ đó có cơ sở khuyến cáo nông dân sử dụng thay thế dần cho các loại thuốc BVTV đang sử dụng.

Nghiên cứu chi tiết từ phòng thí nghiệm đến thực địa đã cung cấp số liệu khoa học về đặc điểm hình thái và sinh học của nấm Beauveria bassiana và Paecilomyces javanicus, nhằm thiết lập thông tin cơ bản về các chủng nấm tại ĐBSCL Kết quả nghiên cứu cũng mở ra hướng quản lý và phòng trừ côn trùng gây hại cây trồng theo phương pháp IPM, thay thế thuốc hóa học và tạo cơ sở cho nghiên cứu tiếp theo về biện pháp đấu tranh sinh học với côn trùng.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

1.4.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu chính của đề tài là thu thập các chủng nấm

Beauveria và Paecilomyces ký sinh trên một số loài côn trùng gây hại tại ĐBSCL.

Thu thập và định danh xác định các loài từ chi Beauveria và

Nghiên cứu về Paecilomyces được thực hiện bằng phương pháp truyền thống dựa trên đặc điểm hình thái học và công nghệ sinh học phân tử thông qua trình tự DNA vùng ITS - rDNA Nghiên cứu này đã xác định một số đặc điểm sinh học và các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của các chủng nấm Beauveria và Paecilomyces Đồng thời, nghiên cứu cũng đánh giá hiệu lực của chế phẩm nấm trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhà lưới và ngoài đồng, cụ thể trên ruộng khoai lang và vườn mãng cầu xiêm tại Vĩnh Long Thời gian thực hiện nghiên cứu kéo dài từ tháng 9 năm 2013 đến tháng 8 năm 2017.

1.4.3 Những đóng góp mới của luận án

Phân lập được 16 chủng nấm ký sinh trên côn trùng tại 7 tỉnh ĐBSCL thuộc loài Beauveria bassiana Trong đó, tuyển chọn được hai chủng

Bb4(SKL-VL) và Bb5(SKL-HG) để sản xuất chế phẩm.

Trong nghiên cứu, chúng tôi đã phân lập thành công 22 chủng nấm ký sinh trên côn trùng tại 6 tỉnh thuộc đồng bằng sông Cửu Long Trong số đó, 14 chủng được xác định là thuộc loài P javanicus và 8 chủng thuộc loài Purpureocillum lilacinum Cuối cùng, hai chủng nấm đã được tuyển chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.

Pj6(Pl-TG) và Pj8(Pl-CT) để sản xuất chế phẩm.

Xác định được một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm B bassiana và P javanicus trong điều kiện phòng thí nghiệm.

Nghiên cứu đã xác định một số hoạt chất hóa học trừ nấm như Metalaxyl, Fenoxanil và Validamycin có tác động vô hại hoặc ảnh hưởng vừa đến sự phát triển của nấm B bassiana ở nồng độ thấp Đối với nấm P javanicus, Fenoxanil, Kasugamycin và Picoxystrobin cũng cho thấy tương tự Tuy nhiên, nấm B bassiana rất nhạy cảm ngay cả với nồng độ thấp của các hợp chất này so với P javanicus Chế phẩm nấm B bassiana tươi có hiệu quả trong việc phòng trừ sâu bệnh SKL, trong khi chế phẩm nấm P javanicus tươi hiệu quả trong việc phòng trừ rệp sáp P lilacinus gây hại cho mãng cầu xiêm, với liều lượng sử dụng từ 3 - 3,5 kg/ha và mật độ bào tử khoảng > 10^8 bào tử/gram.

PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Quyết định công nhận Nghiên cứu sinh số 5160/QĐ - ĐHCT ngày 05 tháng 11 năm 2013 của Hiệu trưởng Trường Đại học Cần Thơ.

Thời gian đào tạo hệ không tập trung kéo dài 4 năm, từ tháng 11 năm 2013 đến tháng 11 năm 2017, theo Quyết định số 2774/QĐ-ĐHCT ngày 12 tháng 8 năm 2015 của Hiệu trưởng Trường Đại học Cần Thơ về việc giao đề tài và người hướng dẫn cho Nghiên cứu sinh.

Thời gian nghiên cứu của Nghiên cứu sinh cho đến khi hoàn thành các nội dung nghiên cứu theo đề cương của luận án là 9/2013 - 9/2017.

Chúng tôi đã thu thập các chủng nấm Beauveria và Paecilomyces từ côn trùng gây hại tại bảy tỉnh thành ở Đồng bằng sông Cửu Long, bao gồm Cần Thơ, Vĩnh Long, Hậu Giang, An Giang, Kiên Giang, Sóc Trăng và Trà Vinh.

Tại Phòng thí nghiệm phòng trừ sinh học, Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ, các mẫu nấm Beauveria và Paecilomyces đã được phân lập, nuôi cấy và nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học Nghiên cứu cũng đánh giá hiệu lực của chế phẩm nấm B bassiana và P javanicus trong điều kiện nhà lưới, cũng như hiệu quả quản lý sâu bệnh trên thực địa Cụ thể, chế phẩm nấm B bassiana đã được thử nghiệm để kiểm soát sùng khoai lang (C formicarius Fabricius) trên ruộng khoai của nông dân tại ấp Tân Qui, xã Tân Bình, huyện Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long Đồng thời, chế phẩm nấm P javanicus cũng được đánh giá hiệu lực trong việc quản lý rệp sáp (P lilacinus Cockerell) trên vườn mãng cầu xiêm của nông dân tại ấp Thành Khương, xã Thành Đông, huyện Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long.

Ly trích DNA và thực hiện phản ứng PCR đã được tiến hành tại Viện Công Nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ Sau đó, giải trình tự DNA được gửi đến công ty MacroGen tại Hàn Quốc để thực hiện.

Phương Tiện Nghiên Cứu

Bước đầu tiên là thu thập côn trùng gây hại bị nhiễm nấm ký sinh tại bảy tỉnh thuộc vùng Đồng bằng Sông Cửu Long, bao gồm Cần Thơ, Vĩnh Long, Hậu Giang, An Giang, Kiên Giang, Sóc Trăng và Trà Vinh.

Bước 2: Thu mẫu côn trùng bị nấm ký sinh từ tự nhiên tại 7 tỉnh ĐBSCL và chuyển về phòng thí nghiệm để tách dòng thuần Nấm được nuôi cấy trên môi trường PDA bằng phương pháp nuôi cấy đơn bào tử trên môi trường chọn lọc của nấm Beauveria và Paecilomyces Quy trình định danh và phân loại nấm được thực hiện theo khóa phân loại của Barnett và Barry (1972), Lawrence (1994).

De Hoog (1972), Luangsa-Ard et al.(2006)

Các chủng nấm được đặt tên theo quy tắc: tên nấm + số thứ tự + tên ký chủ + nơi thu mẫu, và được viết tắt bằng chữ cái đầu Ví dụ, Bea1(RN-AG) là nấm Beauveria ký sinh trên rầy nâu tại An Giang, trong khi Pae1(RS-CT) là nấm Paecilomyces ký sinh trên rệp sáp tại Cần Thơ.

Trong phòng thí nghiệm, các thiết bị quan trọng bao gồm kính hiển vi quang học Olympus BX51N-33-PH, máy vortex, máy ly tâm lạnh, máy khuếch đại PCR TAKARA từ Nhật Bản, máy electrophoresis, lò vi sóng, thiết bị thanh trùng, tủ lạnh, tủ đông, cân điện tử và buồng tối chụp hình gel Những thiết bị này hỗ trợ đắc lực cho các nghiên cứu và thí nghiệm sinh học.

Để tiến hành thí nghiệm nuôi sâu, bạn cần chuẩn bị một số dụng cụ thiết yếu như hộp nuôi sâu, giấy lót, beaker, bình tam giác và nước cất Ngoài ra, các vật dụng khác như giấy thấm, kẹp inox, cọ lông, kéo, keo dán, bút lông và lame đếm hiệu Thoma cũng rất quan trọng Đừng quên chuẩn bị pipette, cồn 70% để khử trùng dụng cụ, bọc giấy, cũng như dụng cụ đo nhiệt độ và ẩm độ để đảm bảo thí nghiệm diễn ra hiệu quả.

Các loại môi trường sử dụng trong nghiên cứu sinh học:

Môi trường phân lập ban đầu PDA (Potato Dextrose Agar): 200g khoai tây, 20g dextrose, 20g agar, 1000mL nước cất, pH 6,5.

Môi trường CDA (Czapek - Dox Agar): 2g NaNO3, 1g KH2PO4, 0,5g MgSO4.7H2O, 0,5g KCl, 0,01g FeSO4.7H2O, 30g sucrose, 20g agar, 1000mL nước cất.

Môi trường SDAY1 (Sabouraud Dextrose Agar Yeast): 10g pepton, 40g dextrose, 2g yeast extract, 20g agar, 1000mL nước cất, pH 6,5.

Môi trường SDAY3 (Sabouraud Dextrose Agar Yeast + khoáng chất): 10g pepton, 40g dextrose, 2g yeast extract, 2g NaNO3, 1g KH2PO4, 0,5g MgSO4.7H2O, 20g agar, 1000mL nước cất, pH 6,5.

Môi trường SDAY-Chitin (Sabouraud Dextrose Agar Yeast + Chitin): 2g yeast extract, 2g pepton, 20g dextrose, 20g agar, 5g Chitin, pH 6,5.

Các hóa chất dùng trong ly trích DNA từ khối sợi nấm:

Proteinase K (20 mg/mL) is used in conjunction with a lysis buffer composed of 100 mM Tris HCl, 20 mM EDTA, 5 M NaCl, and 1% SDS for effective cell lysis The extraction process involves phenol-chloroform-isoamyl alcohol (PCI) in a 25:24:1 ratio, followed by the use of 99.5% ethanol and 70% ethanol for precipitation Finally, purified samples are resuspended in TE buffer, which contains 10 nM Tris HCl and 0.5 M EDTA, utilizing Mili Q purified water for optimal results.

Các hóa chất dùng trong điện di:

Ethydum Bromide 1%, 6x loading buffer, ladder 100bp, agarose tinh khiết nồng độ 1%, 1x TAE buffer (40mM Tris acetate, 1mM EDTA, pH 8).

Các hóa chất dùng cho phản ứng PCR:

Milli Q (double-distilled water), 10x PCR buffer, dNTP mix, and Taq polymerase (1 UI/µl) are essential components for PCR reactions Primers used include ITS4 (5’- TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC - 3’) and ITS5 (5’- GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G - 3’), along with the DNA template sample.

Các loại thuốc hóa học dùng trong thí nghiệm:

The article discusses various types of fungicides, including Propiconazole combined with Tricyclazole (Tillage super 525SE), Azoxystrobin paired with Difenoconazole (Amistartop 325SC), Hexaconazole (Tecvil 50SC), Fenbuconazole (Indar 240SC), Picoxystrobin (Aproach 250SC), Fenoxnil (TaiYou 20SC), Metalaxyl (Mataxyl 500WP), Mancozeb (Dithane M - 45 80WP), Validamycin (Validan 5SL), and Kasugamycin (Kasumin 2L).

Nội dung nghiên cứu

Gồm 4 nội dung chính với các vấn đề nghiên cứu của từng nội dung được xây dựng như sau:

Nội dung 1: Thu thập và định danh các loài từ chi Beauveria và Paecilomyces được thực hiện thông qua phương pháp truyền thống, dựa trên các đặc điểm hình thái học cùng với các kỹ thuật công nghệ sinh học phân tử.

• Phân lập và định danh loài nấm ký sinh trên một số sâu hại cây trồng thuộc chi nấm Beauveria và Paecilomyces theo phương pháp truyền thống.

• Định danh loài và phân tích một số khác biệt di truyền của chủng nấm Beauveria và Paecilomyces dựa trên trình tự DNA vùng ITS - rDNA.

Nội dung 2: Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của nấm

Beauveria và Paecilomyces ký sinh trên một số loại sâu hại cây trồng.

• Xác định thời gian bào tử nẩy mầm.

• Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sự phát triển của nấm

• Khả năng hình thành bào tử của nấm Beauveria và Paecilomyces

• Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự hình thành bào tử của nấm Beauveria và Paecilomyces.

• Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển và hình thành bào tử của nấm Beauveria và Paecilomyces.

• Ảnh hưởng của một số loài thuốc trừ nấm đến sự phát triển và nẩy mầm của nấm Beauveria và Paecilomyces.

Nội dung 3: Bước đầu đánh giá độc tính của các chủng nấm

Beauveria và Paecilomyces trên một số loại sâu hại cây trồng ở điều kiện phòng thí nghiệm.

• Xác định hiệu lực trừ sùng hại khoai lang (Cylas formicarius Fabricius) của nấm Beauveria ở điều kiện phòng thí nghiệm.

• Xác định hiệu lực trừ rệp sáp (Planococcus lilacinus Cockerell) của nấm Paecilomyces ở điều kiện phòng thí nghiệm.

Nội dung 4: Khảo sát hiệu lực chế phẩm của nấm Beauveria và

Paecilomyces ký sinh trên sâu hại cây trồng.

• Khảo sát hiệu lực của chế phẩm nấm Beauveria ký sinh trên sùng khoai lang (C formicarius Fabricius) ở điều kiện phòng thí nghiệm, nhà lưới và ngoài đồng.

• Khảo sát hiệu lực của chế phẩm nấm Paecilomyces ký sinh trên rệp sáp (P lilacinus Cockerell) ở điều kiện phòng thí nghiệm, nhà lưới và ngoài đồng.

Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Thu thập và định danh các loài nấm ký sinh từ chi Beauveria và

Paecilomyces bằng phương pháp truyền thống dựa trên đặc điểm hình thái học và kỹ thuật công nghệ sinh học phân tử

3.4.1.1 Phân lập và định danh loài nấm ký sinh trên một số sâu hại cây trồng thuộc chi nấm Beauveria và Paecilomyces theo phương pháp truyền thống

Nghiên cứu mẫu côn trùng bị nấm ký sinh trong tự nhiên tập trung vào sùng khoai lang và rệp sáp, với các mẫu nấm được đưa về phòng thí nghiệm tại Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ để phân lập tác nhân Nấm được nuôi cấy trên môi trường PDA, sử dụng phương pháp nuôi cấy đơn bào tử để tạo dòng thuần cho nấm Beauveria và Paecilomyces, và được lưu trữ ở nhiệt độ -37 o C Quy trình định danh nấm được thực hiện theo các tài liệu của Barnett and Barry (1972), Lawrence (1994), De Hoog (1972) và Luangsa-Ard et al (2006).

Các chủng nấm Beauveria và Paecilomyces được nuôi cấy trên môi trường PDA trong đĩa petri (đường kính 9cm) ở nhiệt độ 27±2 o C và chế độ sáng tối 12 giờ Khoanh sợi nấm từ rìa mép tản nấm 3 ngày tuổi được đặt vào giữa đĩa petri chứa khoảng 10 mL môi trường nuôi cấy, với mặt dưới của đĩa hướng lên để sợi nấm tiếp xúc trực tiếp với môi trường Mỗi mẫu phân lập được thực hiện 5 lần Đặc điểm tản nấm như cách mọc, màu sắc và sự hình thành các vòng sinh bào tử được quan sát và ghi nhận sau 15 ngày nuôi cấy Đặc điểm của cơ quan sinh bào tử và hình dạng bào tử cũng được cấy từ từng chủng nấm.

Beauveria và Paecilomyces được phân lập thông qua phương pháp nuôi cấy trên lame cải tiến Sau đó, các chủng nấm này đã được nhận diện và mô tả đặc điểm cấu trúc của cơ quan sinh bào tử, hình dạng bào tử và cành bào đài dưới kính hiển vi quang học Olympus BX51N-33-PH.

Kích thước bào tử: thực hiện theo phương pháp của Reza et al (2006).

Các mẫu phân lập được nuôi cấy trên lame với lớp môi trường PDA (3mL/lame) ở nhiệt độ phòng trong 10 ngày Sử dụng kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần để tiến hành các phép đo, trung bình mỗi mẫu phân lập có khoảng 400 bào tử Đường kính trung bình của các bào tử được xác định từ số đo của hai đường chéo vuông góc của bào tử.

3.4.1.2 Định danh loài và phân tích một số khác biệt di truyền của chủng nấm Beauveria sp và Paecilomyces spp dựa trên trình tự DNA vùng ITS - rDNA

Để chiết xuất DNA tổng số từ các chủng nấm, trước tiên cần nuôi cấy nấm trong môi trường PDA trong khoảng 3 - 5 ngày ở nhiệt độ 25°C Khi nấm đã phát triển, có thể tiến hành các bước tiếp theo để thu thập DNA.

Sử dụng tăm nhọn đã được tiệt trùng, lấy khoảng 5 - 7 mm² sợi nấm cho vào ống Eppendorf chứa 500 µl dung dịch lysis buffer Nghiền nát sợi nấm và thêm 1/100V proteinase K, sau đó lắc nhẹ vài lần Cuối cùng, ủ mẫu ở nhiệt độ 55°C trong 3 giờ.

Để tiến hành tách chiết mẫu, cho 300 µl dung dịch phenol-chloroform-isoamyl (PCI) theo tỷ lệ 25:24:1 vào mẫu và lắc đều bằng máy vortex trong khoảng 15 - 20 giây Tiếp theo, ly tâm ở tốc độ 12.000 vòng/phút trong 5 phút tại nhiệt độ 4°C Sau khi ly tâm, sử dụng micropipette để cẩn thận hút lớp dung dịch trên cùng và chuyển vào ống mới, lặp lại quy trình này hai lần để đảm bảo độ tinh khiết của mẫu.

Cho 2 V ethanol 99,5% vào ống để loại bỏ tạp chất, lắc nhẹ và ly tâm ở 16000 vòng/phút trong 3 phút ở 4 o C Đổ bỏ phần nước trên và giữ lại phần cụ đặc dưới đáy Tiếp theo, thêm 300 µl ethanol 70%, lắc nhẹ vài lần và ly tâm lại ở 16000 vòng/phút trong 3 phút ở 4 o C Sau khi ly tâm, tiến hành bay hơi và giữ mẫu trong 50 µl MQ (hoặc TE buffer), ủ mẫu ở 65 o C khoảng 1 giờ Cuối cùng, thu nhận DNA và trữ ở 4 o C, kiểm tra nồng độ DNA bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 260 - 280 nm và tính tỷ lệ OD260/OD280 để đánh giá độ tinh sạch của mẫu đã được ly trích.

 Kiểm tra DNA bằng điện di gel agarose

Để chuẩn bị gel 1%, cân 1g agarose và 100 mL 1x TAE buffer, sau đó đun nóng trong lò vi sóng khoảng 3 - 4 phút cho đến khi dung dịch gel tan hoàn toàn và không còn bọt Sau khi lấy ra, để nguội xuống 50 - 60 độ C và đổ gel vào khuôn đã lắp ráp sẵn Cuối cùng, dùng lớp mủ trong đậy lại khoảng 20 - 30 phút để gel đông cứng.

Khi gel đã đông cứng, hãy đổ đệm 1x TAE buffer vào Từ từ nhấc lược ra và nâng khuôn lên Đặt khuôn vào bồn điện di, đảm bảo đệm ngập cao hơn mặt gel từ 3 đến 5 mm.

Để nạp DNA, bạn cần hút dung dịch DNA kết hợp với 6 lần dung dịch loading buffer theo tỷ lệ 5:1, sau đó chấm hỗn hợp lên giấy parafin và khuấy đều bằng cách hút lên xuống Cuối cùng, sử dụng micropipette để chuyển toàn bộ hỗn hợp vào “giếng” đã được khoét trong miếng agarose.

Chạy điện di trong 20 phút với hiệu điện thế 100 V, sau đó nhuộm gel bằng dung dịch ethidium bromua (EtBr) trong 30 phút Tiếp theo, lấy gel ra và đặt vào buồng ánh sáng UV để chụp ảnh huỳnh quang DNA Khi phát hiện mẫu có DNA, tiến hành phản ứng PCR.

 Phản ứng PCR khuếch đại vùng ITS - rDNA

Hình 3.1 Sơ đồ nguyên tắc định danh vi nấm bằng các primer dùng để khuyết đại vùng rDNA (http://nature.berkeley.edu)

Hai primer ITS4 (5’- TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC - 3 ’ ) và ITS5

Mẫu đoạn văn đã được tối ưu hóa cho SEO như sau: "Chuỗi DNA (5 ’ - GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G - 3 ’) được sử dụng để khuếch đại vùng ITS - rDNA, bao gồm các thành phần ITS1, 5.8S và ITS2 Thể tích phản ứng PCR là 25 µl, bao gồm dung dịch đệm PCR 1X, MgCl2 1,5 mM, dNTPs 400 µM và mỗi primer."

Phản ứng PCR được thực hiện với DNA khuôn và enzyme Taq DNA polymerase, sử dụng nồng độ 200 pM Quy trình nhiệt bao gồm giai đoạn khởi động ở 94 o C trong 5 phút, tiếp theo là 35 chu kỳ với 94 o C trong 1 phút, 55 o C trong 1,5 phút, và 72 o C trong 1 phút, kết thúc với giai đoạn kéo dài ở 72 o C trong 5 phút Sản phẩm PCR sau đó được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% trong dung dịch đệm TAE 0,5X, và gel được nhuộm với ethidium bromide để quan sát kết quả dưới ánh sáng UV.

 Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự DNA

Trước khi tiến hành giải trình tự, sản phẩm PCR được tinh sạch theo quy trình của nhà sản xuất và sau đó, mẫu giải trình tự được gửi đến công ty MacroGen tại Hàn Quốc.

 Giải trình tự vùng ITS - rDNA

Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu đo kích thước bào tử nấm được tính toán theo giá trị TB ±

SD, số lượng mẫu là 400, độ tin cậy 95%

Các số liệu về tỷ lệ nẩy mầm, hình thành bào tử, thuốc trừ sâu, thuốc trừ bệnh và tỷ lệ chết (%) được chuyển đổi bằng cách sử dụng giá trị cân bậc hai của hàm arcsine, log (x+1) hoặc √(x+0,5) để thực hiện phân tích thống kê qua phần mềm SPSS hoặc MSTATC.

Tính toán số liệu, vẽ đồ thị và biểu đồ bằng phầm mềm Microsoft Excel.

Sử dụng các chương trình Phylogentic (BioEdit, Clustalx 3.1, Mega 7 và Treeview) để quan sát mối quan hệ di truyền.