Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu và cảm ứng tạo protocorm của loài lan hải yến (rhynchostyis coelestis)

Tính cấp thiết của đề tài

Hoa lan, một loài hoa đẹp và quý giá, lần đầu tiên được biết đến ở phương Đông qua Khổng Tử (551 – 479 TCN) và sau đó phổ biến ở phương Tây và Địa Trung Hải Ngày nay, hoa lan không chỉ khẳng định giá trị thẩm mỹ mà còn có ứng dụng trong y học, cùng với việc nhân giống mang lại hiệu quả kinh tế cao Hoa lan trở thành một loại hoa trang trí quan trọng và là mặt hàng xuất khẩu chiến lược của nhiều quốc gia Đặc biệt, loài Lan Hải Yến (Rhynchostylis coelestis) thuộc chi lan Ngọc Điểm (Rhynchostylis) nổi bật với hình thái đẹp, hương thơm ngọt ngào và dễ chăm sóc, được ưa chuộng bởi nhiều người.

(Monocotyledoneae) Ngoài tên lan Hải Yến ra loài lan này còn đƣợc gọi với cái tên là lan Hải Âu [7]

Hoa có đặc điểm phát hoa đứng thẳng, mọc thành chùm cụm với màu trắng, đầu vòi hoa có màu xanh lam hoặc hồng nhạt, và môi hoa màu xanh tím nhạt Đặc biệt, hoa tỏa ra hương thơm rất dễ chịu và quý phái.

Hoa lan Hải Yến sở hữu vẻ đẹp kiêu sa và nữ tính, dẫn đến nhu cầu sử dụng ngày càng tăng Tuy nhiên, do khai thác bừa bãi, số lượng lan Hải Yến trong tự nhiên đang suy giảm Để bảo vệ loài lan này, việc nhân giống bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật (in vitro) đang được chú trọng Hiện tại, vẫn chưa có nghiên cứu cụ thể nào về việc tạo vật liệu khởi đầu và cảm ứng protocorm trên môi trường tối ưu cho hoa lan Hải Yến (Rhynchostylis coelestis) từ quả đến giai đoạn tạo protocorm.

Nghiên cứu về việc tạo ra vật liệu khởi đầu và cảm ứng protocorm từ mô sẹo trong các môi trường khác nhau của loài lan Hải Yến (Rhynchostylis coelestis) mang lại ý nghĩa quan trọng, cung cấp thông tin khoa học hữu ích và hỗ trợ phát triển các biện pháp kỹ thuật nuôi cấy cây hiệu quả với tỷ lệ sống cao.

Xuất phát từ những lý do trên, tôi xin tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Nghiêncứu tạo vật liệu khởi đầu và cảm ứng tạo protocorm của loài lan Hải Yến ( Rhynchostylis coelestis )”.

Mục tiêu nghiên cứu

- Trong giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu, tìm ra hóa chất khử trùng tối ƣu nhất

- Nghiên cứu môi trường nuôi cấy phù hợp nhất với đối tượng cây lan Hải Yến trong giai đoạn tạo protocorm.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu này cung cấp bằng chứng khoa học về các phương pháp khử trùng và xác định môi trường tối ưu trong giai đoạn tạo protocorm của loài lan Hải Yến (Rhynchostylis coelestis).

Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cung cấp tài liệu hữu ích cho nhà nghiên cứu, giáo viên và sinh viên ngành Sinh học, nông nghiệp, cũng như các đơn vị sản xuất hoa lan Nghiên cứu này giúp xây dựng quy trình và hóa chất khử trùng tối ưu cho loài lan Hải Yến trong giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu Đồng thời, nó cũng xác định môi trường nuôi cấy phù hợp cho lan Hải Yến trong giai đoạn phát sinh protocorm và tạo chồi, nhằm mục đích nhân giống và bảo tồn, phát triển loài lan có giá trị kinh tế và sinh học cao này.

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Phân loại học thực vật

Chi lan Ngọc Điểm Rhynchostylis, viết tắt là Rhy, thuộc họ Lan (Orchideaceae) và bao gồm 6 loài đặc hữu tại Ấn Độ, Malaysia, Indonesia và Philippines.

Chi lan Ngọc Điểm là một trong những loài lan rừng được ưa chuộng và trồng phổ biến hiện nay, thường nở hoa vào dịp Tết, nên còn được gọi là Nghinh Xuân Ngoài ra, loài này còn có một số tên gọi khác như Lan Đai Châu, lan Tai Trâu, lan Đại Châu và lan Me, trước năm 1975 thường mọc trên những cây me ở một số đường phố Sài Gòn.

Chi lan Ngọc Điểm là một loại lan rừng phổ biến tại Việt Nam, chủ yếu phân bố ở các cao nguyên Nam Trung Bộ, đặc biệt là ở những khu vực giáp biên giới với Lào và Campuchia Loại lan này thường xuất hiện nhiều hơn ở những vùng có khí hậu nóng.

Chi này bao gồm các cây đơn thân không có giả hành, phát triển theo chiều thẳng đứng với nhiều rễ mọc trực tiếp từ thân Hạt của chi lan Ngọc Điểm có khả năng nảy mầm rất mạnh trong điều kiện tự nhiên.

Chi lan Ngọc Điểm được xem là biểu tượng của hoa lan trong dịp Tết cổ truyền, với thời gian nở vào khoảng tháng 12 âm lịch, có thể sớm hơn trong những năm nhuận Các loài lan này không chỉ có mùi thơm nhẹ nhàng mà còn được ưa chuộng vì giá trị kinh tế và tâm linh cao.

Đặc điểm sinh học

Chi lan Ngọc Điểm gồm các loại lan chịu nóng, nhiệt độ thích hợp từ 26 –

Chi lan Ngọc Điểm, thuộc chi lan quý hiếm, hiện đang được bày bán rộng rãi tại các nhà vườn và cửa hàng Phong Lan Loài này chủ yếu được khai thác từ các khu vực Campuchia, Lào và một số vùng ở Việt Nam như Đông Nam Bộ và miền cao nguyên Nam Trung Bộ, với độ cao trung bình dưới 600m, bao gồm các khu vực như Nha Trang và Bình Thuận.

Các loài thuộc chi Ngọc Điểm chịu hạn khá tốt, nhƣng thích ẩm, ẩm độ càng cao, rễmọc nhanh và phát triển rất tốt, ẩm độ lý tưởng khoảng 40 – 70%

Chi Ngọc Điểm là loại lan ưa sáng, cần khoảng 60% ánh sáng để phát triển tốt Ánh sáng trực tiếp có thể gây bỏng lá cho cây, với cường độ ánh sáng lý tưởng từ 15.000 – 20.000 lux/m2 Nếu trồng trong điều kiện quá rợp, cây sẽ tăng trưởng chậm, yếu ớt, bộ rễ phát triển kém và khó ra hoa.

Giới thiệu về loài lan Hải Yến

1.2.1 Phân loại học thực vật

Hình 1.1 Lan Hải Yến ( Rhynchostylis coelestis)

Lan Hải yến (Rhynchostylis coelestis) là một loài trong chi Ngọc Điểm (Rhynchostylis), thuộc họ Phong lan Chi Ngọc Điểm hiện tại bao gồm 6 loài, được phân chia thành các nhóm khác nhau trong dòng Rhynchostylis.

Chi Rhynchostylis đƣợc phân bố rộng rãi nhiều ở vùng Đông Nam Á và có thể đƣợc tìm thấy ở Thái Lan, Ấn Độ và Miến Điện

Lan Hải Yến (Rhynchostylis coelestis) là loàithuộc một trong 6 loài của chi lan Ngọc Điểm (Rhynchostylis), họ Lan (Orchideaceae), bộ Lan

(Orchidales), lớpMột lá mầm (Monocotyledoneae), ngành Ngọc Lan: Mangoliophyta

Ngoài tên lan Hải Yến ra loài lan này còn đƣợc gọi với cái tên là lan Hải Âu, Lƣỡi Bò, Cờ Lao[7]

1.2.2 Đặc điểm hình thái – giải phẫu

Lan Hải yến (Rhynchostylis coelestis) là loài cây có thân hình ống, cao khoảng 20 cm với phần gốc hóa gỗ Loài này sở hữu 10-12 lá hình mũi giáo, dày, dai và mọng nước, dài từ 10-20 cm Lá có màu xanh mướt, gân lá nhỏ, được xếp theo rãnh và có chiều hướng cong xuống, với hai thùy lá không đều nhau.

Phát hoa lan Hải yến mọc thẳng, thành chùm dày đặc với số lượng lên tới 50 bông trên cần hoa ngắn Hoa có kích thước khoảng 2 cm, cánh hoa màu trắng với phần đỉnh màu lam hoặc tím, cánh đai và cánh hoa dạng thuôn hoặc hình cầu cỡ 0.7 cm, trong đó hai cánh bên lớn hơn một chút Cánh môi hình trứng, dày và cong xuống, hoa trắng với phần cuối vòi hoa có màu xanh lam hoặc hồng nhạt, môi màu xanh tím nhạt Hoa tỏa hương thơm quyến rũ, mang vẻ đẹp kiêu sa và nữ tính.

Cây nở hoa vào mùa hè và thu, thường từ tháng 3 đến tháng 5, và được tìm thấy chủ yếu ở Thái Lan, Campuchia và Việt Nam Loài cây này sinh sống trong các khu rừng đất thấp và rừng savan, thường ở độ cao khoảng 700m so với mực nước biển.

Các điều kiện sinh thái cho cây trồng bao gồm ánh sáng chiếm 60% Ánh sáng lý tưởng dao động từ 2.000 đến 4.000 foot candles, tương đương với lượng ánh sáng phát ra từ khoảng cách 1 foot Vào mùa hè, cửa sổ hướng Đông là lựa chọn tốt, trong khi cửa sổ hướng Nam là tối ưu cho mùa đông Độ sáng từ đèn được đo bằng lumen, và vào ban đêm, khoảng 5-20 foot candles là đủ cho cây phát triển.

Lan hải yến phát triển tốt trong khoảng nhiệt độ 20-25°C, với điều kiện lý tưởng là ấm áp Vào mùa đông, nhiệt độ ban đêm nên giữ ở mức tối thiểu 58-64°F (14-18°C) và ban ngày đạt từ 70-80°F (21-27°C) để cây phát triển khỏe mạnh.

F Độ ẩm: 40-70% Độ ẩm 50% hoặc 60% là lý tưởng.Lan hải yến có thể chịu đƣợc độ ẩm thấp hơn một chút trong những tháng mùa đông Việc sử dụng các khay độ ẩm hoặc độ ẩm phòng là có lợi

Nước là yếu tố quan trọng trong quá trình trồng cây, và cách tốt nhất là sử dụng nước mưa hoặc nước cất Nước máy với độ pH từ 7,5 trở xuống cũng có thể được sử dụng Trong giai đoạn ra hoa hoặc đỉnh đầu, nên kết hợp các phương pháp tưới khô Khi không có hoa, hãy để hỗn hợp đất trở nên khô giữa các lần tưới Tưới quá nhiều nước có thể dẫn đến các vấn đề như thối rễ và nhiễm trùng nấm trong môi trường bầu.

Khái quát chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro đã được thực hiện tại Việt Nam từ giữa những năm 70, và hiện nay có nhiều phòng thí nghiệm chuyên về lĩnh vực này Phần lớn các phòng thí nghiệm đang tập trung vào nghiên cứu ứng dụng, chủ yếu là vi nhân giống trong ống nghiệm Bên cạnh đó, nuôi cấy mô và tế bào thực vật còn có tiềm năng đóng góp cho các nghiên cứu và ứng dụng khác, đặc biệt trong cải biến di truyền như chọn dòng tế bào, đột biến tế bào, nuôi cấy bao/hạt phấn, lai tế bào và chuyển gen, cũng như trong công nghệ thu nhận các hoạt tính sinh học.

1.3.1 Lịch sử phát triển của kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật

Vào năm 1902, Haberlandt đã tiên phong giới thiệu khái niệm cấy mô sinh vật ra ngoài cơ thể Tuy nhiên, các thí nghiệm của ông với tế bào mô biểu bì đã không thành công do chúng không thể phân chia.

Năm 1922, Kotte và Robbins, học trò của Haberlandt, đã lặp lại thí nghiệm của ông với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ cây ngô Hai tác giả đã nuôi cấy thành công hệ rễ nhỏ trong môi trường lỏng chứa đường glucose và muối khoáng chỉ sau 12 ngày Kết quả này đã dẫn đến việc hoàn thiện môi trường nuôi cấy cho đầu rễ.

Năm 1934 đánh dấu giai đoạn thứ 2 trong lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật, khi White thành công trong việc phát hiện ra khả năng sống vô hạn của việc nuôi cấy tế bào rễ cà chua.

Trong thời gian 1941-1952, nhiều chất điều kích thích sinh trưởng thuộc nhóm Auxin đƣợc nuôi cấy và tổng hợp thành công: axit napthalen axetic (NAA), axit 2,4 D- dichlorophenoxy axetic (2,4 D)…

Năm 1951, Skoog và Miller phát hiện các hợp chất điều khiển sự nhân chồi, đánh dấu bước khởi đầu quan trọng trong nghiên cứu nuôi cấy mô Đến năm 1962, Murashige và Skoog cải tiến môi trường nuôi cấy, tạo ra một nền tảng vững chắc cho việc nuôi cấy nhiều loại cây Môi trường này vẫn được áp dụng rộng rãi trong kỹ thuật nuôi cấy mô cho đến ngày nay.

Năm 1954, Skoog phát hiện rằng chế phẩm thủy phân từ tinh dịch cá bẹ có khả năng kích thích sự sinh trưởng trong nuôi cấy mô thân cây thuốc lá Đến năm 1955, chất này được tổng hợp thành công và được Skoog đặt tên là Kinetin, có tác dụng kích thích quá trình phân bào.

Từ năm 1954 đến 1959, kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn đã được phát triển và hoàn thiện Melcher và Beckman đã thực hiện nuôi cấy tế bào đơn trong các bình dung tích lớn, kết hợp với việc sục khí và bổ sung chất dinh dưỡng định kỳ.

Khả năng nuôi cấy tế bào thực vật và tái tạo cây hoàn chỉnh từ tế bào đã tạo ra cơ hội mới trong việc chọn lọc dòng đột biến và sản xuất các hợp chất trao đổi thứ cấp.

Trong giai đoạn 1960 - 1964, Morel đã phát hiện ra khả năng nhân giống vô tính địa lan thông qua phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Kết quả này đã đưa địa lan trở thành loại cây đầu tiên được thương mại hóa thông qua kỹ thuật nuôi cấy mô.

Vào năm 1966, Guha và cộng sự đã thành công trong việc tạo ra cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn của cây cà độc dược Tiếp theo, Bourin và Nitsch (1967) cũng đạt được thành công tương tự với cây thuốc lá Việc tạo ra cây đơn bội ở nhiều loài thực vật thông qua nuôi cấy bao phấn và hạt phấn đã đóng góp quan trọng cho nghiên cứu di truyền và lai tạo giống.

Từ những năm 1970, kỹ thuật nuôi cấy protoplast đã thu hút sự chú ý của các nhà khoa học, đặc biệt khi Nagata và Takebe thành công trong việc tái tạo cellulose từ protoplast thuốc lá Năm 1978, Melchers và cộng sự đã lai tạo thành công protoplast của cà chua với protoplast của khoai tây, mở ra triển vọng mới trong lai xa ở thực vật Ngoài ra, dưới những điều kiện nhất định, protoplast có khả năng hấp thụ các phân tử lớn và cơ quan tử từ bên ngoài, làm cho chúng trở thành đối tượng lý tưởng cho các nghiên cứu về di truyền thực vật.

Công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã phát triển nhanh chóng và được áp dụng rộng rãi trong nhân giống nhiều loài thực vật, chọn lọc dòng chống chịu, lai xa và chuyển gen.

1.3.2 Cơ sở sinh lí của công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật in vitro

Tất cả tế bào trong cơ thể thực vật đều chứa bộ gen giống nhau, cho phép chúng có khả năng tổng hợp các loại protein-enzym giống nhau Khi được nuôi trong môi trường thích hợp, các tế bào này có thể phát triển thành cây nguyên vẹn, đặc trưng cho loài và thực hiện quá trình ra hoa, kết trái bình thường.

- Tế bào thực vật có khả năng phân hóa và mất phân hóa:

Tế bào thực vật có khả năng phân hóa thành các mô và cơ quan chuyên biệt, đồng thời cũng có thể mất phân hóa và chuyển sang trạng thái phân chia Hai quá trình này được thể hiện qua một sơ đồ minh họa.

Hình 1.2 Sơ đồ quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào

Sự phân hóa và phản phân hóa là quá trình điều hòa hoạt hóa gen, trong đó một số gen được kích hoạt để tạo ra tính trạng mới, trong khi một số gen khác lại bị ngừng hoạt động Quá trình này diễn ra theo một chương trình được mã hóa trong cấu trúc DNA của mỗi tế bào.

Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước Ở Việt Nam, nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ngày càng đƣợc áp dụng rộng rãi đối với nhiều loài cây trồng nói chung và cây hoa lan nói riêng

Nguyễn Tiến Thăng (2004) đã nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy mô tế bào để nhân giống Lan nhập ngoại ở Tỉnh Sơn La [3]

Tháng 9 năm 2004, Tiến sĩ Dương Tất Nhựt đã nhân giống vô tính thành công loài lan Hải Hồng, đây là một trong những loài đặc hữu của Việt Nam [6] Năm 2006 đến 2008, trường Đại học An Giang thực hiện đề tài với 2 quy trình vi nhân giống lan Dendrobium Anosmum và Dendrobium Mini, thử nghiệm ra cây lan Dendrobium Mini trên nhiều loại giá thể khác nhau [12]

Năm 2011, Nguyễn Văn Song và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu về nhân giống in vitro lan Kim Điệp (Dendrobium Chrysotoxum) Kết quả cho thấy hạt của quả lan 3 tháng tuổi là nguyên liệu tối ưu cho việc nảy mầm và phát sinh protocorm Môi trường thích hợp cho quá trình này là MS cơ bản với 20 g/l sucrose, 8 g/l agar, 15% nước dừa và 2,0 mg/l BAP Để nhân nhanh protocorm, môi trường tốt nhất cũng là MS cơ bản với cùng các thành phần trên.

MS cơ bản bao gồm 30g/l sucrose, 8 g/l agar, 1g/l than hoạt tính, 15% nước dừa, 2,0 mg/l BAP và 1,0 mg/l NAA, là công thức tối ưu cho việc tái sinh chồi từ protocorm và sinh trưởng của chồi in vitro.

Năm 2012, Nguyễn Thị Lài đã nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất khử trùng (H2O2, NaOCl ) đến loài lan Kim Tuyến (Anoectochilus roxburghii (wall.) Lindl.) [4]

Năm 2013, Vũ Ngọc Lan và Nguyễn Thị Lý Anh đã nghiên cứu môi trường nhân nhanh protocorm của loài lan Thạch hộc (Dendrobium nobile Lindl.) Kết quả nghiên cứu cho thấy môi trường tối ưu để nhân nhanh protocorm là KC + (100ml nước dừa + 10g saccharose + 6,0g agar)/lít.

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Việc nhân giống vô tính cây hoa lan, đặc biệt là các loại lan đơn thân như lan Hải Yến, thường không áp dụng hình thức sinh sản vô tính thông thường như ươm hay giâm cây keiki Thay vào đó, phương pháp nuôi cấy mô tế bào đã được phát triển, với môi trường dinh dưỡng chủ yếu là môi trường MS (Murashige – Shoog, 1962), 1/2 MS, V.W (Vacine – Went, 1949) và KC (Knudsone) Gần đây, một số nghiên cứu đã tập trung vào việc nuôi cấy từ hạt quả lan đến giai đoạn tạo protocorm của các loài lan như lan Ngọc Điểm (Rhynchostylis), lan Hồ Điệp (Phalaenopsis Orchids) và lan Sơn Thủy Tiên (Dendrobium Chrysotoxum).

Vào năm 1902, Haberlandt đã tiên phong trong việc đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Ông đã cố gắng nuôi cấy tế bào phân hóa từ lá của một số cây một lá mầm, nhưng không đạt được thành công Đặc biệt, ông đã sử dụng các tế bào đã mất khả năng tái sinh.

Năm 1922, nhà nghiên cứu Knudson đã thành công trong việc thay thế nấm bằng đường trong môi trường thạch để gieo hạt Nghiên cứu của ông cho thấy hạt của các loài Cattleya, Epidendrum và nhiều loài lan khác có khả năng nảy mầm mà không cần sự hỗ trợ của nấm trong quá trình nuôi cấy in vitro.

Năm 1997, Nayka và cộng sự đã nghiên cứu sự nhân nhanh chồi của hai loài Dendrobium Aphyllum và Dendrobium Moschatum bằng cách kết hợp cytokinin và auxin, cho thấy nồng độ tối ưu để đạt tần số tái sinh chồi là 9,91 mg/l BA.

Năm 2003, Nasiruddin và cộng sự đã tiến hành nuôi cấy lá giống lan Dendrobium Formosum trên môi trường có bổ sung BAP và NAA, đạt số chồi cao nhất là 2.68 sau 60 ngày với nồng độ BAP = 2.5mg/l và NAA = 1mg/l Cùng năm, Taluker và Nasiruddin cũng đã nuôi cấy từ chồi, thu được số chồi cao nhất là 1.9 sau 40 ngày với nồng độ BAP = 2.5mg/l và NAA = 0.5mg/l Những nghiên cứu này đánh dấu bước khởi đầu quan trọng cho quá trình nhân giống in vitro và tạo nền tảng cho các nghiên cứu tiếp theo về giống lan Dendrobium.

Một bài báo tổng quan năm 2015 về nuôi cấy in vitro từ hạt quả của chi hoa lan Hoàng Thảo (Dendrobium) đã chỉ ra rằng các phương pháp khử trùng phổ biến cho quả lan bao gồm: EtOH 70° với HgCl2 0,1-1,0% (chiếm 28,3%), EtOH 70° kết hợp với NaOCl 1,0-10% (15,1%), và EtOH 70° với chất kháng sinh (9,4%).

Cùng với đó, nghiên cứu cũng chỉ ra một số môi trường nuôi cấy hạt lan đƣợc sử dụng nhiều nhất trong cỏc nghiờn cứu là: MS (30,2%), ẵ MS (13,2%), KC(11,3%) [13].

ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

Lan Hải Yến (Rhynchostylis coelestis) là loàithuộc một trong 6 loài của chi lan Ngọc Điểm (Rhynchostylis), họ Lan (Orchideaceae), bộ Lan

(Orchidales), lớpMột lá mầm (Monocotyledoneae) Ngoài tên lan Hải Yến ra loài lan này còn đƣợc gọi với cái tên là lan Hải Âu [7]

Nghiên cứu này tập trung vào việc phân tích độ nhiễm mẫu và sự nảy mầm của cây lan Hải Yến (Rhynchostylis coelestis) trong các môi trường nuôi cấy khác nhau, nhằm mục tiêu đạt được giai đoạn tạo protocorm.

- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 10/2016 đến tháng 05/2017

Nghiên cứu được thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu Công nghệ sinh học và Phòng thực hành Sinh học thuộc Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Hùng Vương, tọa lạc tại thị xã Phú Thọ, tỉnh Phú Thọ.

Phương pháp nghiên cứu

*Nguyên vật liệu, thiết bị

- Quả lan Hải Yến (chất lƣợng nhƣ nhau, đã đến độ tuổi thu hoạch là 5 tháng)

- Hóa chất: cồn 70 , NaOCl (3%, 5%), HgCl2 0,1%, chất kháng sinh (Rifampicin, polymicin, vancomycin),

- Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học

- Máy móc: Nồi hấp khử trùng, tủ sấy, máy đo pH, Box cấy,

- Dụng cụ cấy: Dao, kéo, khay sắt, panh kẹp, bình tam giác, ống nghiệm, giấy cấy,

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu lý thuyết

Để hiểu rõ về cây lan Hải Yến và quy trình nuôi cấy mô tế bào thực vật, cần thu thập, đọc và nghiên cứu tài liệu tham khảo từ sách, báo và internet Việc này giúp cung cấp kiến thức sâu sắc và cập nhật về loài cây này cũng như các kỹ thuật nuôi cấy tiên tiến.

- Các nhân tố chỉ tiêu nghiên cứu phải chia thành các công thức khác nhau

(03 công thức khử trùng; 03 công thức môi trường)

- Số mẫu(bình nuôi cấy) của mỗi công thức thí nghiệm phải đủ lớn

- Tuân thủ nguyên tắc lặp lại (mỗi công thức thí nghiệm đều lặp lại 3 lần)

2.2.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm

- Thí nghiệm 1: Trong giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu, xác định hóa chất khử trùng tối ƣu nhất

 Vật liệu sử dụng: Quả lan Hải Yến

 CT1: EtOH 70 o (30 giây) + NaOCl 3% (5 phút)

 CT2: EtOH 70 o (30 giây) + NaOCl 3% (10 phút)

 CT3: EtOH 70 o (30 giây) + HgCl 2 0,1% (5 phút)

 CT4: EtOH 70 o (30 giây) + 10 mg/l hỗn hợp chất kháng sinh (Rifampicin, polymicin, vancomycin) (30 phút)

 Chỉ tiêu đánh giá: Độ nhiễm mẫu

 Thời gian đánh giá: Sau 30 ngày

- Thí nghiệm 2: Xác định môi trường nuôi cấy tạo protocorm phù hợp nhất với đối tƣợng cây lan Hải Yến

 Vật liệu sử dụng: Hạt lan Hải Yến

 MT2: MS bổ sung (2 mg/l BAP, 0,5 mg/l NAA)

 MT4: ẵ MS bổ sung (2 mg/l BAP, 0,5 mg/l NAA)

 MT6: KC bổ sung (2 mg/l BAP, 0,5 mg/l NAA)

 Chỉ tiêu đánh giá: Sự nảy mầm của hạt Màu sắc, hình thái, tỉ lệ phát sinh protocorm

 Thời gian thu thập: Sau 90 ngày

Mỗi môi trường đều bổ sung thêm: 100ml/l nước dừa + 20g/l saccarozo + 6,5g/l agar + 100g/l khoai tây + 0,5g/l than hoạt tính

- Thí nghiệm 3: Nghiên cứu môi trường có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng với nồng phù hợp nhất trong giai đoạn tạo chồi

+ Vật liệu sử dụng: Protocorm lấy từ thí nghiệm 2 (có đặc điểm kích thước to đều, màu xanh, hình thái đuôi cá, sức sống nhƣ nhau)

 MTa: KC+2mg/l BAP+1mg/l KN

 MTb: KC+2mg/l BAP +2mg/l KN

 MTc: KC +2mg/l BAP +3mg/l KN + Chỉ tiêu đánh giá: Chiều cao chồi/chồi, số lá/chồi, số rễ/chồi

+ Thời gian thu thập: Sau 90 ngày

2.2.4 Phương pháp phân tích và xử lí số liệu

Chỉ tiêu thu thập số liệu:

Tổng số mẫu ban đầu

 Đặc điểm protocorm phát sinh: màu sắc, hình thái

Số mẫu tái sinh chồi

 Tỷ lệ mẫu tái sinh (%) = x 100

Tổng số mẫu ban đầu

 Đặc điểm chồi tái sinh: chiều cao, số rễ, số lá của chồi

Số liệu được phân tích bằng phương pháp thống kê sinh học, với quá trình xử lý được thực hiện trên máy tính thông qua ứng dụng Data Analysis trong Excel Phân tích phương sai được thực hiện bằng cách sử dụng hàm thống kê với ba lần lặp để đảm bảo tính chính xác của kết quả.

Các phương pháp thống kê sinh học

Cho mẫu số liệu có kích thước N là  x 1 ; x 2 ; ; x N 

+ Giá trị trung bình mẫu: ̅ = = ∑

+ Phương sai (kí hiệu: s 2 ) của mẫu số liệu được tính bởi công thức:

+ Độ lệch chuẩn (kí hiệu:s) của mẫu số liệu là:

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tạo protocorm của lan Hải Yến

Nghiên cứu các môi trường nuôi cấy khác nhau đã được thực hiện để xác định môi trường tối ưu cho cây lan Hải Yến trong giai đoạn phát sinh protocorm Kết quả cho thấy môi trường phù hợp nhất giúp cây phát triển tốt và đạt hiệu quả cao trong quá trình nuôi cấy.

Bảng 3.6.Đặc điểm về màu sắc và hình thái protocorm lan Hải Yến trên công thức môi trườngMT1

Mẫu phát sinh protocorm (Bình)

CT1+MT1 3/4 Xanh nhạt Hình cầu, hình tim, hình đuôi cá

CT2+MT1 1/4 Xanh nhạt Hình cầu, hình tim

CT4+MT1 4/4 Xanh nhạt Hình cầu, hình đuôi cá (trong đó X: hết mẫu)

Bảng 3.7.Đặc điểm về màu sắc và hình thái protocorm lan Hải Yến trên công thức môi trường MT2

CT1+MT2 4/4 Vàng nhạt, xanh nhạt

CT2+MT2 1/4 Vàng cam, xanh nhạt

CT4+MT2 1/4 Vàng nhạt, xanh nhạt

Hình cầu, hình tim (trong đó X: hết mẫu)

Bảng 3.8 Đặc điểm về màu sắc và hình thái protocorm lan Hải Yến trên công thức môi trường MT3

CT1+MT3 1/4 Vàng xanh Hình cầu, hình tim

CT2+MT3 2/4 Vàng thẫm, xanh

CT4+MT3 3/4 Vàng, xanh nhạt Hình cầu, hình tim

CT1+MT4 2/4 Xanh Hình tim, hình đuôi cá

CT4+MT4 2/4 Xanh, vàng thẫm

Hình tim, hình đuôi cá

CT1+MT5 4/4 Xanh nhạt Hình tim, hình đuôi cá

CT2+MT5 1/4 Xanh nhạt, vàng

CT4+MT5 3/4 Xanh Hình tim, hình đuôi cá (Trong đó X: hết mẫu)

CT2+MT6 ẳ Vàng cam Hỡnh cầu

CT4+MT6 ẳ Vàng cam, trắng sữa Hình cầu

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến tỉ lệphát sinh protocorm Chỉ tiêu

Tổng số bình nuôi cấy (bình)

Tỉ lệ phát sinh protocorm (%)

Tỉ lệ không phát sinh protocorm (%)

Hình3.3: Biểu đồ tỉ lệ các mẫu phát sinh protocorm (đơn vị : %)

Nghiên cứu đã xác định môi trường nuôi cấy tối ưu cho cây lan Hải Yến trong giai đoạn phát sinh protocorm, được thể hiện qua các bảng số liệu từ 3.6 đến 3.12 và hình 3.3.

Môi trường KC bổ sung (2 mg/l BAP, 0,5 mg/l NAA) và môi trường MS bổ sung (2 mg/l BAP, 0,5 mg/l NAA) cho thấy tỉ lệ phát sinh protocorm thấp nhất, với MT6 đạt 0.5/4 bình (13% tổng số) và MT2 đạt 1.5/4 bình (38% tổng số) Protocorm có màu vàng nhạt và sức sống chưa cao, chủ yếu ở giai đoạn 1,2 với hình dạng cầu và hình tim, chưa phát triển đến giai đoạn hình đuôi cá.

MT3 sử dụng môi trường MS cho kết quả tốt hơn so với MT6 và MT2, với tỷ lệ 1.8/4 bình, chiếm 45% tổng số bình nuôi cấy phát sinh protocorm MT1 với môi trường MS và MT5 với môi trường KC đều cho tỷ lệ mẫu phát sinh protocorm bằng nhau, đạt 2/4 bình, tương đương 50% tổng số mẫu Các mẫu protocorm trong ba công thức môi trường này cho thấy sự khác biệt rõ rệt trong hiệu quả phát triển.

MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 MT6

MT3, MT1, và MT5 có màu xanh nhạt với ít vàng, cho thấy sắc tố quang hợp rõ ràng hơn Hình thái protocorm của giai đoạn 3 đã xuất hiện, mang hình dạng đuôi cá, tuy nhiên số lượng vẫn còn hạn chế (Bảng 3.6; 3.8; 3.10)

Môi trường nuôi cấy MT4 bổ sung với 2 mg/l BAP và 0,5 mg/l NAA cho kết quả tối ưu, khi 63% mẫu nuôi cấy phát sinh protocorm, với 2,5/4 bình nuôi cấy có sự phát triển đồng đều Tất cả protocorm đều đạt màu xanh và có sức sống cao, đồng thời thể hiện đầy đủ ba giai đoạn phát triển tốt nhất (Bảng 3.9)

Sau khi nghiên cứu, chúng tôi đã xác định môi trường nuôi cấy tối ưu cho cây lan Hải Yến đến giai đoạn phát sinh protocorm Trong tổng số 6 công thức môi trường, công thức MT4 với thành phần môi trường MS bổ sung (2 mg/l BAP, 0,5 mg/l NAA) là lựa chọn phù hợp nhất cho loài lan này.

Protocorm MT1 Protocormhình cầu Protocorm hình tim

Hình 3.4: Một số hình ảnh các giai đoạn phát sinh protocorm

Nghiên cứu môi trường có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng với nồng độ khác nhau trong giai đoạn tạo chồi

độ khác nhau trong giai đoạn tạo chồi

Môi trường KC được bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BAP 2mg/l và KN với các nồng độ khác nhau (1 mg/l; 2mg/l; 3mg/l) đã được nghiên cứu nhằm xác định môi trường tối ưu cho loài lan Hải Yến trong giai đoạn tạo chồi Kết quả nghiên cứu cho thấy sự ảnh hưởng của các nồng độ khác nhau đến sự phát triển của loài lan này.

Bảng 3.13 Đặc điểm chiều cao lan Hải Yến trong giai đoạn tạo chồi

Chiều cao chồi Trung Bình

Hình 3.5: Biểu đồ đặc điểm chiều cao lan Hải Yến trong giai đoạn tạo chồi

(đơn vị: mm) Qua số liệu đƣợc thể hiện trong các bảng 3.13 và hình 3.5 ta có nhận xét nhƣ sau:

Môi trường MTa với công thức KC bổ sung 2mg/l BAP và 1mg/l KN cho chỉ số chiều cao thấp nhất, chỉ đạt 1.76mm/chồi Trong khi đó, môi trường MTb, cũng với công thức KC nhưng bổ sung 2mg/l BAP và 2mg/l KN, cho chiều cao trung bình đạt 3.16mm/chồi Đặc biệt, môi trường MTc với 2mg/l BAP và 3mg/l KN đạt chiều cao lớn nhất, trung bình 4.6mm/chồi, vượt trội hơn hẳn cả MTa và MTb.

Sử dụng chất điều hòa sinh trưởng BAP và KN có tác động tích cực đến chiều cao chồi của lan Hải Yến Nồng độ tối ưu là 2mg/l BAP và 3mg/l KN, mang lại kết quả tốt nhất trong giai đoạn tạo chồi.

Bảng 3.14 Số lá lan Hải Yến trong giai đoạn tạo chồi(Đơn vị: Lá)

Số lá/Chồi Trung Bình

Hình 3.6: Biểu đồ số lá lan Hải Yến trong giai đoạn tạo chồi

Theo số liệu từ bảng 3.14 và hình 3.6, môi trường MTa với công thức bổ sung 2mg/l BAP và 1mg/l KN cho chỉ số lá thấp nhất, chỉ đạt 2.25 lá/chồi Môi trường MTb, với 2mg/l BAP và 2mg/l KN, có kết quả tốt hơn, đạt 2.75 lá/chồi Môi trường MTc, bổ sung 2mg/l BAP và 3mg/l KN, cho chỉ số lá cao nhất với 4.25 lá/chồi, vượt trội so với MTa và MTb.

Sử dụng chất điều hòa sinh trưởng BAP và KN có tác động tích cực đến số lượng lá và chồi của lan Hải Yến Nồng độ tối ưu là 2mg/l BAP và 3mg/l KN, mang lại kết quả tốt nhất trong giai đoạn tạo chồi.

Bảng 3.15.Số rễ lan Hải Yến trong giai đoạn tạo chồi (đơn vị: mm)

Số rễ/Chồi Trung bình

Hình 3.7: Biểu đồ số rễ lan Hải Yến trong giai đoạn tạo chồi (đơn vị: mm)

Theo nghiên cứu từ bảng 3.15 và hình 3.7, môi trường MTa với công thức KC bổ sung 2mg/l BAP và 1mg/l KN cho thấy chỉ số giá trị trung bình rễ thấp nhất, chỉ đạt 2 rễ/chồi Môi trường MTb, với 2mg/l BAP và 2mg/l KN, cho kết quả tốt hơn với trung bình 3 rễ/chồi Đặc biệt, môi trường MTc bổ sung 2mg/l BAP và 3mg/l KN mang lại số lượng rễ cao nhất, đạt trung bình 3.5 rễ/chồi Kết quả cho thấy rằng việc sử dụng chất điều hòa sinh trưởng BAP và KN ảnh hưởng rõ rệt đến số lượng rễ của chồi, với nồng độ 2mg/l BAP và 3mg/l KN mang lại hiệu quả tốt nhất.

Trong nghiên cứu về loài lan Hải Yến, môi trường MTc đã cho kết quả tốt nhất với các chỉ tiêu như số lá, số rễ và chiều cao Cụ thể, công thức môi trường KC với 2 mg/l BAP và 3 mg/l KN được xác định là môi trường tối ưu nhất trong giai đoạn tạo chồi.

Môi trường MTa Môi trường MTb Môi trường MTc

Hình 3.8: Một số hình ảnh mẫu qua các công thức môi trường

Hình 3.9: Các mẫu thu được qua 3 công thức môi trường khác nhau

PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Công thức khử trùng hiệu quả nhất cho vật liệu khởi đầu của loài lan Hải Yến được xác định là sử dụng EtOH 70% trong 30 giây kết hợp với HgCl2 0,1% trong 5 phút, đạt tỷ lệ mẫu sạch và mẫu tái sinh lên đến 84%.

Mụi trường tạo protocorm phự hợp nhất là mụi trường MT4: ẵ MS bổ sung

2 mg/l BAP và 0.5 mg/l NAA, tỷ lệ protocormđạt 63%,protocorm phát triển đồng đều, tròn, to, bóng đẹp

Môi trường tạo chồi tối ưu nhất là MTc, với thành phần bổ sung 2 mg/l BAP và 3 mg/l KN, cùng với 2 mg/l BAP Môi trường này mang lại tỷ lệ chồi hình thành cao với các cơ quan rễ, thân và lá phát triển tốt, trung bình có 3.5 rễ, 4.25 lá và chiều cao thân đạt 4.6 mm.

Mở rộng nghiên cứu với các chỉ tiêu, môi trường ở các giai đoạn khác nhau trên loài lan Hải Yến

Tiếp tục nghiên cứu trên các loài lan và thực vật khác để phát triển quy trình tạo vật liệu khởi đầu, protocorm, chồi và các giai đoạn phát triển khác, nhằm nâng cao hiệu quả sinh trưởng và tỉ lệ sống sót của cây.

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt

[1] Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam(1), NXB Trẻ

[2] Nguyễn Nhƣ Khanh, Cao Phi Bằng (2009), Giáo trình sinh lý thực vật,

Nhà xuất bản Giáo Dục

[3] Nguyễn Mộng Hùng , Vũ Văn Vụ, Lê Hồng Điệp (2008), Công nghệ sinh học (Tập 2), NXB Giáo dục

[4] Nguyễn Thị Lài (2012), Nghiên cứu nhân nhanh loài lan Kim Tuyến

(Anoectochilus roxburghii (wall.) lindl.) của Việt Nam bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, Luận văn thạc sĩ nông nghiệp, Trường Đại học nông nghiệp Hà Nội

[5] Vũ Ngọc Lan, Nguyễn Thị Lý Anh (2013), “Nhân giống in vitro loài Lan bản địa Dendrobium nobile Lindl”, Tạp chí Khoa học và Phát triển, 11(7), tr 917-925

[6] Nguyễn Công Nghiệp (2000) Trồng hoa lan, NXB trẻ, trang 17 – 268

[7] Hoàng Thị Sản, Hoàng Thị Bé (1998), Phân loại học Thực vật, NXB Giáo

[8] Nguyễn Văn Song (2011) “Nhân nhanh in vitro lan Kim Điệp

(Dendrobium Chrysotoxum) – một loài lan rừng có nguy cơ tuyệt chủng”, tạp chí khoa học, Đại học Huế, Số 64, 2011

[9] Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật- Nghiên cứu và ứng dụng, NXB Nông Nghiệp Hà Nội

Lê Đặng Trung Tuyến (2007) đã thực hiện một nghiên cứu về hiện trạng sản xuất hoa lan, đặc biệt là hoa lan Hồ Điệp, tại tỉnh Khánh Hòa Luận văn thạc sĩ nông nghiệp của ông tại Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội tập trung vào việc đề xuất các biện pháp nhằm nâng cao chất lượng lan Hồ Điệp trong giai đoạn vườn ươm Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc cải thiện sản xuất hoa lan tại khu vực này.

[11] Đào Thanh Vân (2008), Giáo trình hoa lan, NXB Nông Nghiệp

[12] Sách đỏ Việt Nam năm 2007 - phần thực vật – trang 423

Tài liệu tiếng nước ngoài

[13] Aracama CV, Michael E Kane, Sandra B Wilson and Nancy L Philman

(2008), “Comparative growth, morphology, and anatomy of easy and difﬁcult to acclimatize Sea oats (Uniola paniculata) genotypes during in vitro culture and ex vitro Acclimatization”, J AMER.SOC.HORT.SCI

[14] Kee Yoeup Paek, Eun Joo Hahn, and So Young Park (2011),

“Micropropagation of Phalaenopsis Orchids via Protocorms and Protocorm-Like Bodies”, Methods in Molecular Biology, vol 710, pp.293-

[15] Maria JM., Debora SO., Marciel TO., Lilia W, Laureen H., Mauro GS.,

(2015), “Ecophysiological, anatomical and biochemical aspects of in vitro culture of zygoticSyagrus coronataembryos and of young plants under drought stress”, Trees, 29, pp.1219–1233 DOI 10.1007/s00468-015-1202-

[16] Potshangbam Nongdam and Leimapokpam Tikendra (2014), “Research

Article Establishment of an Efficient In Vitro Regeneration Protocol for Rapid and Mass Propagation of Dendrobiumchrysotoxum Lindl, Using Seed Culture” , The Scientific World Journal, (Vol 2014), pp.150-170

Zhi-Ying Li and Li Xu (2009) conducted a study on the in vitro propagation of a white-flower mutant of Rhynchostylis gigantea Their research, published in the Journal of Horticulture and Forestry, focused on utilizing immature seed-derived protocorm-like bodies for propagation This innovative approach highlights the potential for cultivating unique floral variants in horticulture.

[18] Jaime A Teixeira da Silva, Elena A Tsavkelova (2015),“Asymbiotic in vitro seed propagation of Dendrobium”, Plant Cell Report, 34(10), pp.1685-706

Chất kháng sinh Kính soi nổi

Phòng bảo quản mẫu Khử trùng mẫu

Tách mẫu quả Thước đo điện tử

Quả lan Hải Yến Protocormtạo chồi sau 5 tháng

Phụ biểu 1: Môi trường MS (Murashige & Skoog)

Dung dịch mẹ Hóa chất

Khối lƣợng cần lấy cho

Nồng độ pha môi trường (ml/l)

Tiêu đề	Nghiên Cứu Tạo Vật Liệu Khởi Đầu Và Cảm Ứng Tạo Protocorm Của Loài Lan Hải Yến (Rhynchostylis Coelestis)
Tác giả	Phạm Quỳnh Trang
Người hướng dẫn	TS. Trần Trung Kiến
Trường học	Trường Đại Học Hùng Vương
Chuyên ngành	Sư Phạm Sinh Học
Thể loại	Khóa Luận Tốt Nghiệp Đại Học
Năm xuất bản	2017
Thành phố	Phú Thọ

Định dạng
Số trang	58
Dung lượng	2,07 MB