VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu sử dụng ba dòng ngô thuần mang gen chịu hạn ZmDREB2A ở thế hệ T6, được ký hiệu là D3, D14 và D21 Các sự kiện chuyển gen này được tạo ra bằng phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium.
Vector pCAMBIA1300 mang gen ZmDREB2A đã được chuyển vào phôi non của ba dòng ngô C436, C7N và V152, nổi bật với khả năng tái sinh cao Các sự kiện chuyển gen này đã được đánh giá thông qua các kỹ thuật phân tử, cho thấy sự hiện diện và biểu hiện ổn định của gen chuyển trong các dòng ngô.
Giống ngô 12 THL được phát triển thông qua thí nghiệm lai giữa ba dòng ngô chuyển gen và ba dòng ngô nền, kết hợp với hai cây thử nghiệm là các dòng ngô thuần ưu tú NT6745 và H45.
Bảng 3.1 Danh sách các THL đỉnh tham gia thí nghiệm
TT Ký hiệu THL Dòng mẹ Dòng bố Ghi chú
1 D3xNT D3 NT6745 THL chuyển gen
2 D14xNT D14 NT6745 THL chuyển gen
3 D21xNT D21 NT6745 THL chuyển gen
4 C436xNT C436 NT6745 THL nền (không chuyển gen)
5 C7NxNT C7N NT6745 THL nền (không chuyển gen)
6 V152xNT V152 NT6745 THL nền (không chuyển gen)
10 C436xH C436 H245 THL nền (không chuyển gen)
11 C7NxH C7N H245 THL nền (không chuyển gen)
12 V152xH V152 H245 THL nền (không chuyển gen)
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu đánh giá khả năng chịu hạn và các chỉ tiêu hóa sinh của các dòng cây mang gen ZmDREB2A so với dòng nền tương ứng Thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện nhà lưới, nhằm tạo ra tình trạng hạn hán nhân tạo ở giai đoạn cây con.
Nội dung 2: Đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng mang gen
ZmDREB2A và dòng nền tương ứng thông qua thí nghiệm gây hạn nhân tạo giai đoạn trước trỗ trong điều kiện nhà lưới
Đánh giá khả năng chịu hạn của các thể hiện gen ZmDREB2A và thể hiện nền tương ứng được thực hiện thông qua thí nghiệm gây hạn nhân tạo trong vụ Hè Thu 2019 tại Đan Phượng, Hà Nội Nghiên cứu này nhằm xác định hiệu quả của gen ZmDREB2A trong việc cải thiện khả năng chống chịu hạn cho cây trồng, từ đó cung cấp thông tin hữu ích cho việc phát triển giống cây chịu hạn trong tương lai.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thí nghiệm 1 nhằm đánh giá khả năng chịu hạn và một số chỉ tiêu hóa sinh của các dòng cây mang gen ZmDREB2A so với dòng nền tương ứng Thí nghiệm được thực hiện thông qua việc gây hạn nhân tạo ở giai đoạn cây con trong điều kiện nhà lưới.
Thí nghiệm đánh giá khả năng chịu hạn của cây con được thực hiện từ tháng 3 đến tháng 4 năm 2019, trong điều kiện nhà lưới, với 3 lần nhắc và 2 công thức khác nhau.
+ Công thức 1: Tưới nước đầy đủ
Khi cây con đạt giai đoạn 4-5 lá, tiến hành thí nghiệm chịu hạn nhân tạo bằng cách ngừng tưới nước trong 14 ngày Sau đó, phục hồi cây bằng cách tưới nước đầy đủ trong 7 ngày.
Các dòng ngô được gieo trong chậu chứa giá thể xỉ than đã được tưới nước bão hòa, mỗi chậu gieo một dòng với 10 hạt Dung dịch dinh dưỡng được sử dụng để đảm bảo cây phát triển đồng đều, sau đó tỉa bỏ các cây không đồng nhất, chỉ giữ lại 5 cây cho mỗi chậu Khi cây con đạt 4-5 lá, tiến hành thí nghiệm chịu hạn nhân tạo bằng cách không tưới nước trong 14 ngày, từ đó đánh giá đặc điểm hình thái và mức độ héo lá của các dòng ngô, so sánh với các dòng ngô không chuyển gen Các chỉ tiêu theo dõi sẽ được ghi nhận trong quá trình thí nghiệm.
- Đánh giá mức độ héo lá được theo dõi: đánh giá mức độ héo của lá sau 5 ngày, 10 ngày và 14 ngày sau gây hạn
Đánh giá khả năng phục hồi và tỷ lệ sống sót của các dòng ngô trong điều kiện hạn kéo dài 14 ngày, sau đó là 7 ngày tưới nước phục hồi Nghiên cứu này nhằm xác định sức chịu đựng và khả năng tái sinh của các dòng ngô trước tình trạng khô hạn, từ đó cung cấp thông tin quan trọng cho việc chọn giống và cải thiện năng suất trong điều kiện khí hậu khắc nghiệt.
Tỷ lệ cây sống (%) = (Số cây sống/ Tổng số cây xử lý)x100
- Các chỉ tiêu theo dõi liên quan đến khả năng chịu hạn của các dòng được đánh giá theo phương pháp của Camacho & Caraballo (1994)
Thể tích rễ (RV) được xác định bằng cách cho rễ vào ống đong và đổ nước ngập, ghi lại thể tích tổng (V(tổng)) Sau đó, vớt rễ ra và ghi lại thể tích nước (V(nước)) Công thức tính thể tích rễ là RV = V(tổng) - V(nước).
+ Chiều dài rễ dài nhất (LRL)(cm): đo từ đốt mang rễ đầu tiên đến rễ dài nhất;
+ Chiều cao cây (PH)(cm): đo từ đốt đầu tiên mang rễ đến lá dài nhất;
Khối lượng rễ tươi (RFW), khối lượng thân tươi (SFW), khối lượng rễ khô (RDW), khối lượng thân khô (SDW), tỷ lệ rễ khô/thân khô và tổng sinh khối khô (TMD) được xác định bằng cách sử dụng cân điện tử với độ chính xác 0,01g.
* Phương pháp đánh giá một số chỉ tiêu hóa sinh:
Quy trình phân tích hàm lượng chlorophyll trong lá bắt đầu bằng việc hút 10ml ethanol 96% vào ống falcon Sau đó, cắt một phần lá và xác định khối lượng hoặc diện tích của phần lá đó trước khi cho vào ống falcon chứa ethanol Ống falcon chứa mẫu cần được cất giữ ở nơi tối trong khoảng 24-48 giờ Cuối cùng, đem dịch thu được đi đo bằng máy quang phổ ở bước sóng 665 nm để xác định hàm lượng chlorophyll.
649 Lượng chlorophyll trong mẫu lá đc tính theo công thức: Chl a = 13.70 x A665 – 5.76 x A649 (àg/ml); Chl b = 25.8 x A649 – 7.60 x A665 (àg/ml);
Quy trình phân tích đạm tổng số theo phương pháp Kjeldahl (1883) được cải tiến và bao gồm ba bước chính: đầu tiên, công phá mẫu để chuyển đạm từ dạng liên kết sang dạng amoni sunfate; tiếp theo là chưng cất; và cuối cùng là chuẩn độ để tính hàm lượng đạm dựa trên số ion amonia có trong dung dịch.
Phương pháp phân tích NSC (Ohnichi & Horie, 1999) bắt đầu bằng việc cân 0.5 g mẫu khô đã nghiền nhỏ vào ống falcon 50ml, sau đó thêm 30ml nước cất và đun ở 100°C trong 60 phút Sau khi để nguội, thêm vào mỗi ống 20ml dung dịch Sodium phosphate-phosphoric acid buffer và lắc ở 200 vòng/phút ở nhiệt độ 40°C trong 24h để phân hủy NSC Sau đó, mẫu được lọc bằng giấy lọc và phần cặn thu được được làm khô ở 135°C trong 4h Cuối cùng, cân lượng mẫu còn lại và tính lượng NSC theo công thức: NSC (%) = (KL mẫu/KL mẫu sau sấy)/KL mẫu x 100.
Phương pháp phân tích proline tự do trong cây bắt đầu bằng việc nghiền 0,5g mẫu lá trong nito lỏng, sau đó trộn với 10ml axit sulfosalicylic 3% và lọc qua giấy lọc để loại bỏ cặn Tiếp theo, 2ml dung dịch mẫu được kết hợp với 2ml axit axetic glacial và 2ml axit ninhydrin, phản ứng diễn ra ở 100°C trong 1 giờ Sau khi phản ứng kết thúc, hỗn hợp được làm lạnh và thêm 4ml toluene, sau đó trộn đều bằng máy lắc vortex Khi hỗn hợp tách thành 2 pha, pha lỏng phía trên có màu hồng nhạt được hút ra và đo ở bước sóng 520nm Cuối cùng, lượng proline trong mẫu được tính toán dựa trên bước sóng đo được so với dãy proline chuẩn.
Thí nghiệm 2 nhằm đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng ngô mang gen ZmDREB2A so với dòng nền tương ứng Thí nghiệm được thực hiện thông qua việc gây hạn nhân tạo trong giai đoạn trước trỗ, trong điều kiện nhà lưới.
Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 2 đến tháng 5 năm 2019, trong điều kiện nhà lưới tại Viện Nghiên cứu Ngô
Phương pháp đánh giá khả năng chịu hạn của các cây chuyển gen giai đoạn trước trỗ (CIMMYT, 2004; Cains & cs., 2013)
Các dòng ngô được gieo trong xô chứa giá thể trong điều kiện nhà lưới Sau khi cây ngô đạt 3 lá, tiến hành tỉa bỏ các cây không đồng đều, chỉ giữ lại 1 cây/xô/dòng, với mỗi dòng có 5 xô, áp dụng hai công thức xử lý hạn và tưới nước đầy đủ Các xô thí nghiệm được bón phân và tưới nước đồng đều để cây sinh trưởng bình thường cho đến trước thời điểm trỗ, sau đó ngừng tưới nhằm tạo điều kiện hạn nhân tạo cho các dòng ngô trong công thức xử lý hạn, trong khi các dòng không xử lý hạn vẫn được tưới nước đầy đủ Thời gian xử lý hạn là 14 ngày, sau đó tưới nước trở lại để cây phát triển bình thường cho đến khi thu hoạch Các chỉ tiêu theo dõi trong quá trình thí nghiệm sẽ được ghi nhận.
- Ngày trỗ cờ: Ngày có trên 75% số cây có hoa nở ở 1/3 trục chính
- Ngày phun râu: Ngày có trên 75% số cây có râu nhú dài từ 2 đến 3cm
- Ngày chín: Ngày có trên 75% cây có lá bi khô hoặc chân hạt có chấm đen
Đánh giá độ cuộn của lá ngô được thực hiện theo thang điểm từ 1 đến 5 Điểm 1 biểu thị lá không cuộn, điểm 2 cho thấy mép lá mới bắt đầu cuộn, điểm 3 là khi mép lá cuộn hình chữ V, điểm 4 thể hiện mép lá cuộn vào trong, và điểm 5 là lá cuộn tròn hoàn toàn.
- Số lá thật: cắt đánh dấu lá thứ 5 và lá thứ 10 để tiện cho việc đếm tổng số lá cuối cùng
- Chiều cao cây: đo từ mặt xô thí nghiệm đến đốt phân nhánh cờ đầu tiên
- Chiều dài cờ: đo từ đốt phân nhánh cờ đầu tiên đến đỉnh của trục chính
- Số nhành cờ: đếm số nhánh cờ cấp 1
Các yếu tố cấu thành năng suất bao gồm chiều dài bắp, đường kính bắp, số hàng hạt, số hạt trên hàng, tỷ lệ khối lượng hạt so với bắp, khối lượng 1000 hạt và năng suất của các dòng giống Những yếu tố này đóng vai trò quan trọng trong việc xác định hiệu quả sản xuất nông nghiệp.
Năng suất (tạ/ha) (quy ra năng suất hạt ở độ ẩm 14%)
NSTT P.ô x KE × (100 - A 0 ) × 100 S.ô × (100 -14 0 ) trong đó: P.ô: khối lượng bắp tươi/ô (kg)
KE: tỷ lệ hạt tươi/bắp tươi (%)
A o : độ ẩm hạt khi thu hoạch (%); S.ô: diện tích ô thí nghiệm (m 2 )
PHÂN TÍCH SỐ LIỆU
Dữ liệu được thu thập và xử lý bằng các phần mềm chuyên dụng như Excel 2016 và IRRISTAT 5.0 Các chỉ tiêu về đặc điểm nông sinh học và khả năng chịu hạn của các dòng/THL ngô ở giai đoạn cây con và trước trỗ đã được đánh giá một cách chi tiết.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN VÀ MỘT SỐ CHỈ TIÊU HÓA SINH CỦA CÁC DÒNG MANG GEN ZMDREB2A VÀ DÒNG NỀN TƯƠNG ỨNG THÔNG QUA THÍ NGHIỆM GÂY HẠN NHÂN TẠO GIAI ĐOẠN CÂY CON
4.1.1 Kết quả đánh giá khả năng chịu hạn dòng mang gen z mDREB2A giai đoạn cây con
Thí nghiệm đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng ngô chuyển gen ZmDREB2A và dòng nền không chuyển gen được thực hiện trong nhà lưới Cây con ở giai đoạn 4-5 lá trải qua 14 ngày không tưới nước để gây hạn, sau đó được phục hồi bằng cách tưới nước đầy đủ trong 7 ngày Quá trình này bao gồm việc quan sát độ héo của lá vào các thời điểm 5, 10 và 14 ngày gây hạn, đánh giá khả năng phục hồi và tỷ lệ sống sót của cây sau hạn Các chỉ tiêu theo dõi khả năng chịu hạn bao gồm tỷ lệ rễ khô/thân khô, thể tích rễ, trọng lượng thân và rễ khô, cũng như chiều dài thân lá và chiều dài rễ.
4.1.1.1 Đánh giá mức độ héo lá của các dòng ngô trong điều kiện hạn nhân tạo
Trước thí nghiệm gây hạn, các dòng ngô cho thấy sự sinh trưởng đồng đều, không có sự khác biệt về hình thái giữa dòng chuyển gen và dòng nền không chuyển gen Kết quả này cho thấy trong điều kiện bình thường, với việc tưới nước và bón phân đầy đủ, không có sự khác biệt rõ rệt giữa các dòng ngô.
Sau 5 ngày gây hạn, các dòng ngô bắt đầu có hiện tượng héo lá, thể hiện đồng đều ở các dòng nền không chuyển gen, nhiều cây ở dòng chuyển gen D3 và D21 hầu như chưa có biểu hiện héo lá Sau 10 ngày gây hạn, các dòng chuyển gen và không chuyển gen đều có những biểu hiện rõ rệt tác động của stress hạn như: lá héo nhiều và xoăn lại, mép lá và đỉnh lá bắt đầu vàng, các lá dưới bị ảnh hưởng nhiều nhất Sau 14 ngày gây hạn, lá trên của hầu hết các dòng ngô bị cuộn tròn, các lá dưới biểu hiện khô vàng, bắt đầu xuất hiện nhiều cây chết, đặc biệt là ở các dòng không chuyển gen Các dòng chuyển gen cũng xuất hiện các cây héo nặng và cây chết không có khả năng phục hồi
4.1.1.2 Khả năng phục hồi và tỷ lệ cây sống của các dòng ngô
Sau 14 ngày gây hạn, chúng tôi tiến hành tưới nước phục hồi, quan sát khả năng phục hồi của các dòng ngô thí nghiệm Kết quả cho thấy, dòng chuyển gen D21 có khả năng phục hồi khá nhanh, quan sát sau 1 ngày tưới nước cây có biểu
29 hiện tươi trở lại, tiếp đến là 2 dòng chuyển gen D3 và D14 (sau 2 ngày tưới), các dòng không chuyển gen phục hồi sau 3 - 4 ngày tưới nước đầy đủ
Khi cây ngô trải qua thời kỳ hạn hán kéo dài, hoạt động tế bào và khả năng sống của cây sẽ bị ảnh hưởng nghiêm trọng Để đánh giá một giống ngô chịu hạn tốt, không chỉ cần cây sống sót sau giai đoạn hạn hán mà còn phải phục hồi và sinh trưởng bình thường Nếu cây ngô sống sót nhưng bị tổn thương tế bào nghiêm trọng, nó có thể không phát triển bình thường hoặc thậm chí chết sau khi phục hồi Do đó, tỷ lệ cây sống sót sau giai đoạn phục hồi là một chỉ tiêu rất quan trọng trong việc đánh giá khả năng chịu hạn của giống ngô.
Bảng 4.1 Tỷ lệ cây sống của các dòng ngô thí nghiệm trong điều kiện 14 ngày gây hạn nhân tạo và sau 7 ngày phục hồi ở giai đoạn cây con
TT Tên sự kiện/dòng nền Tỷ lệ cây sống (%)
Hình 4.1 Biểu đồ tỷ lệ cây sống của các dòng ngô thí nghiệm chịu hạn giai đoạn cây con
Tỷ lệ cây sống của các dòng ngô thí nghiệm được trình bày trong bảng 4.1 cho thấy rằng ba dòng nền C436, C7N và V152 có tỷ lệ cây sống sau phục hồi thấp hơn so với các dòng chuyển gen Trong số các dòng chuyển gen, dòng D14 có tỷ lệ cây sống thấp hơn so với hai dòng D3 và D21 Đặc biệt, dòng chuyển gen D21 đạt tỷ lệ cây sống 76,7%, trong khi dòng D3 đạt 71,7%.
Các phục hồi cao hơn đạt mức vượt trội so với các dòng nền V152 (35,0%) và C436 (33,3%), cho thấy rằng các nguồn vật liệu khác nhau sở hữu nền di truyền khác nhau Điều này dẫn đến khả năng chịu hạn không đồng nhất và sự tương tác giữa gen được chuyển giao với các nền di truyền cũng có sự khác biệt.
4.1.1.3 Khả năng chịu hạn của các dòng ngô qua một số chỉ tiêu theo dõi
Kết quả theo dõi các chỉ tiêu như chiều thân lá, chiều dài rễ, khối lượng thân tươi và khô, khối lượng rễ tươi và khô, thể tích rễ, cùng tỷ lệ rễ khô so với thân khô của 6 dòng ngô tham gia thí nghiệm được trình bày chi tiết trong các bảng 4.2, 4.3, 4.4 và 4.5.
Kết quả từ bảng 4.2 cho thấy chiều dài thân lá và chiều dài rễ ở công thức tưới nước đầy đủ giữa dòng chuyển gen và đối chứng tương đương nhau Tuy nhiên, tất cả các dòng tham gia thí nghiệm đều có sự giảm mạnh về chiều dài thân lá và chiều dài rễ ở công thức gây hạn CT2 so với CT1, với chiều dài thân lá giảm từ 23,5% đến 34,2% và chiều dài rễ giảm từ 16,7% đến 42,5%.
Bảng 4.2 Chiều dài thân lá, dài rễ và tỷ lệ suy giảm của các dòng ngô trong điều kiện hạn nhân tạo
Tỷ lệ giảm so với không hạn (%)
Tỷ lệ giảm so với không hạn
Chú thích: CT1- công thức tưới nước đầy đủ; CT2- công thức gây hạn
Dữ liệu từ bảng 4.2 cho thấy, trong điều kiện hạn, các dòng chuyển gen D3 và D21 có chiều dài thân lá và chiều dài rễ vượt trội so với dòng đối chứng không chuyển gen với độ tin cậy 95% Cụ thể, chiều dài thân lá của dòng chuyển gen D3 đạt 53,3 cm, trong khi dòng nền C436 chỉ đạt 47,2 cm, chênh lệch 6,1 cm, vượt quá chỉ số LSD0.05 là 4,05 Tương tự, dòng chuyển gen D21 có chiều dài thân lá là 45,5 cm so với dòng nền V152.
Chiều dài rễ của dòng chuyển gen D3 và D21 lần lượt đạt 26,5 cm và 27,4 cm, dài hơn so với dòng nền C436 (19,2 cm) và V152 (19,1 cm) Dòng chuyển gen D14 cũng cho thấy chiều dài thân lá và chiều dài rễ lớn hơn dòng C7N, với các số liệu tương ứng là 50,4 cm; 48,8 cm và 24,4 cm; 21,6 cm Tuy nhiên, sự chênh lệch này không có ý nghĩa thống kê ở mức độ tin cậy 95%.
Khối lượng thân tươi và rễ tươi của các dòng chuyển gen và dòng nền đối chứng không có sự khác biệt đáng kể trong điều kiện tưới nước đầy đủ Tuy nhiên, sau 14 ngày gây hạn, các dòng ngô cho thấy sự giảm rõ rệt về khối lượng, với khối lượng thân tươi giảm từ 70,3% đến 77,9% và khối lượng rễ tươi giảm từ 62,4% đến 78,1%.
Trong điều kiện hạn hán, dòng nền V152 cho thấy sự giảm sút rõ rệt về khối lượng thân và rễ tươi so với dòng chuyển gen D21 Cụ thể, khối lượng thân tươi của V152 chỉ đạt 2,27g, giảm 77,9%, trong khi D21 đạt 3,06g, giảm 71,7% Tương tự, khối lượng rễ tươi của V152 là 2,11g (giảm 78,1%), còn D21 là 2,72g (giảm 71,7%) Dòng chuyển gen D3 và đối chứng không chuyển gen cũng có kết quả tương tự với khối lượng thân tươi giảm 70,3% so với dòng nền (giảm 77,6%) và khối lượng rễ tươi giảm 62,4% so với dòng nền (giảm 69,0%) Dòng chuyển gen D14 và dòng nền C7N có tỷ lệ giảm khối lượng thân và rễ tươi tương đương, với khối lượng thân tươi đều giảm 74,8% và khối lượng rễ tươi giảm lần lượt 70,4% và 70,9%.
Các nhà khoa học đánh giá khả năng chịu hạn của cây ngô ở giai đoạn cây con thông qua một số chỉ tiêu quan trọng, bao gồm số lá trên mỗi cây (LA), thể tích rễ (RV), chiều dài rễ dài nhất (LRL), chiều cao cây (PH), khối lượng rễ tươi (RFW), khối lượng rễ khô (RDW), khối lượng thân khô (SDW), tỷ lệ giữa khối lượng rễ khô và thân khô (RDW/SDW) và tổng sinh khối khô (TMD) (Camacho & Caraballo, 1994; Rezaeieh & Eivazi, 2013).
Theo Camacho & Caraballo (1994), tốc độ tăng trưởng và các chỉ tiêu như tổng lượng chất khô, chiều dài và rộng của bộ rễ trong điều kiện hạn là những yếu tố quan trọng để chọn giống cây chịu hạn trong giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng Nghiên cứu của Zaidi và cộng sự (2000) cũng cho thấy rằng, những giống cây có bộ rễ phát triển tốt trong điều kiện thiếu nước ở giai đoạn cây con có khả năng tận dụng nước dưới sâu hiệu quả hơn, từ đó phát triển tốt hơn và có khả năng chịu hạn cao hơn.
Bảng 4.3 Khối lượng thân lá, rễ tươi và tỷ lệ suy giảm của các dòng ngô trong điều kiện hạn nhân tạo
Tỷ lệ giảm so với không hạn (%)
Tỷ lệ giảm so với không hạn
Chú thích: CT1- công thức tưới nước đầy đủ; CT2- công thức gây hạn
Khối lượng thân khô và rễ khô: Kết quả bảng 4.4 cho thấy, ở công thức
KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÁC DÒNG
Giai đoạn trước trỗ và sau trỗ 2 tuần là thời điểm nhạy cảm nhất với nước đối với cây ngô, ảnh hưởng tiêu cực đến năng suất Nghiên cứu cho thấy, hạn hán trong giai đoạn này có thể làm giảm năng suất đến 25% Hạn trước trỗ không chỉ làm giảm diện tích lá và tốc độ quang hợp, mà còn ảnh hưởng đến kích thước bắp và khả năng kết hạt, dẫn đến giảm khối lượng hạt Điều này xảy ra do sự giảm số lượng tế bào nội nhũ hoặc kích thước của các hạt tinh bột, từ đó làm giảm tổng năng suất hạt.
4.2.1 Kết quả chiều cao của các dòng tham gia thí nghiệm trước khi xử lý hạn nhân tạo
Phân tích thống kê cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các dòng chuyển gen và dòng nền trong điều kiện xử lý hạn và không xử lý hạn với độ tin cậy 95% Kết quả chiều cao của các dòng trong thí nghiệm nhà lưới được ghi nhận như sau.
Công thức tưới nước đầy đủ cho các dòng giống cây trồng cho thấy chiều cao thân lá ấn tượng, với dòng nền C436 và dòng chuyển gen D3 đạt 100.2 cm và 101.6 cm Tương tự, dòng nền C7N và dòng D14 có chiều cao thân lá lần lượt là 103.4 cm và 105.8 cm Bên cạnh đó, dòng nền V152 và D21 cũng không kém cạnh với chiều cao thân lá đạt 102.8 cm và 102 cm.
Công thức xử lý hạn cho các dòng nền cho thấy dòng C436 và D3 có chiều cao thân lá lần lượt là 100 cm và 100.54 cm; trong khi đó, dòng C7N và D14 đạt chiều cao thân lá 108 cm và 103.62 cm Đặc biệt, dòng V152 và dòng chuyển gen D21 có chiều cao thân lá lần lượt là 101 cm và 100.54 cm.
Bảng 4.10 Chiều dài thân lá của các dòng ngô trước khi gây hạn nhân tạo
TT Dòng Chiều dài thân lá (cm)
Chú thích: CT1- công thức tưới nước đầy đủ; CT2- công thức gây hạn
Dữ liệu chiều cao thân lá của các dòng ngô cho thấy rằng dòng ngô chuyển gen ZmDREB2A và dòng nền có sự sinh trưởng tương đương trong điều kiện chăm bón đầy đủ, từ giai đoạn gieo cho đến trước khi xử lý hạn trước trỗ.
4.2.2 Kết quả đánh giá các chỉ tiêu sau gây hạn nhân tạo và sau phục hồi
Trong quá trình gây hạn nhân tạo, các giống ngô tham gia thí nghiệm đang ở giai đoạn chuẩn bị trỗ, khi cây ngô đang xoáy nõn và hình thành bắp ngô, điều này quyết định tiềm năng năng suất sau này Giai đoạn này chứng kiến sự phát triển mạnh mẽ về chiều dài thân và sự kéo dài của lóng Hạn hán xảy ra trong giai đoạn này ảnh hưởng đáng kể đến chiều cao cây, bộ lá, và đặc biệt là thời điểm tung phấn và phun râu.
Cây ngô có cả hoa đực và hoa cái trên cùng một cây nhưng cách xa nhau, khiến chúng nhạy cảm hơn với hạn hán so với các cây trồng khác Stress hạn làm giảm tốc độ sinh trưởng của cây, kéo dài thời gian chuyển từ giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng sang sinh trưởng sinh thực, và gia tăng khoảng cách giữa thời điểm trỗ cờ và phun râu Điều này dẫn đến hiệu quả thụ tinh giảm, từ đó làm giảm năng suất thu hoạch Nghiên cứu cho thấy năng suất cây ngô bị ảnh hưởng nặng nề nhất khi hạn hán xảy ra trong giai đoạn cây tung phấn và phun râu, thậm chí có thể dẫn đến tình trạng bắp không có hạt.
Trong quá trình nghiên cứu về xử lý hạn nhân tạo, không có sự khác biệt đáng kể giữa các dòng ngô chuyển gen và dòng nền khi được tưới nước đầy đủ Sau 5 ngày áp dụng điều kiện hạn, sự sinh trưởng của các dòng ngô bị chậm lại, lá ngô chuyển từ màu xanh đậm sang xanh nhạt và mép lá bắt đầu cuộn lại Đến ngày thứ 14, việc đánh giá độ cuộn của lá ngô cho thấy kết quả rõ rệt, được trình bày trong bảng 4.11.
Sau 14 ngày xử lý hạn, tất cả các dòng chuyển gen ZmDREB2A và dòng ngô nền đều có hiện tượng cuộn tròn lá, đạt mức điểm 5 Tuy nhiên, các dòng ngô nền xuất hiện tình trạng cháy lá ở tầng lá dưới, trong khi các dòng chuyển gen chỉ bị cháy phần đỉnh mép lá ở tầng dưới.
Theo Banzinger (2000), hạn hán tác động mạnh mẽ đến sự phát triển của lá, tiếp theo là râu, thân, rễ và cuối cùng là kích thước hạt Trong giai đoạn trước khi trỗ lá, hạn hán gây ra hiện tượng già hóa, làm giảm mức độ che phủ đất và diện tích bề mặt hấp thụ ánh sáng mặt trời.
Bảng 4.11 Mức độ cuộn của lá và tổng số lá của các dòng ngô tham gia thí nghiệm
Dòng Công thức thí nghiệm Độ cuộn lá ngô
Chú thích: CT1- công thức tưới nước đầy đủ; CT2- công thức gây hạn
Thời gian sinh trưởng và khoảng cách tung phấp – phun râu
Các giống ngô có thời gian tung phấp – phun râu (TP-PR) đồng đều sẽ có khả năng chịu hạn tốt hơn Tính trạng này được các nhà khoa học toàn cầu đặc biệt chú ý, vì vật liệu chịu hạn tốt sẽ giúp TP-PR ngắn hơn và biểu hiện rõ ràng khi cây gặp hạn (Bolanos & cs., 1993).
Kết quả từ bảng 4.12 cho thấy việc xử lý hạn trước trỗ có ảnh hưởng rõ rệt đến sự sinh trưởng và phát triển của cây ngô Cả ba nguồn dòng ngô đều cho thấy thời gian tung phấn và phun râu kéo dài hơn so với công thức tưới nước đầy đủ Điều này có thể được giải thích là do trong điều kiện hạn, lá ngô ở tầng dưới bị cháy, dẫn đến giảm quang hợp, từ đó làm rút ngắn thời gian tích lũy chất khô trong hạt và thời gian chín sinh lý.
So sánh giữa các dòng chuyển gen ZmDREB và dòng nền khi xử lý hạn trước trỗ cho thấy các dòng ngô chuyển gen ít bị ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển hơn Thời gian tung phấn của cả ba dòng chuyển gen kéo dài hơn so với công thức tưới nước đầy đủ nhưng vẫn sớm hơn ba dòng nền tương ứng Khoảng cách tung phấn phun râu (ASI) giữa các cặp dòng có sự khác biệt, với dòng D14 là 4 ngày và dòng nền C7N là 6 ngày; dòng D3 là 5 ngày và dòng nền C436 là 6 ngày; dòng D21 là 3 ngày trong khi dòng nền V152 là 5 ngày Thời gian sinh trưởng của các dòng cũng khác nhau, với các dòng nền cho thấy thời gian từ gieo đến chín dài hơn.
Các dòng chuyển gen có thời gian chín sinh lý khác nhau, trong đó dòng nền C7N có thời gian chín 124 ngày, trong khi dòng D14 là 125 ngày Dòng C436 có thời gian chín 113 ngày, còn dòng D3 là 115 ngày Tương tự, dòng V152 có thời gian chín 117 ngày, trong khi sự kiện D21 đạt 123 ngày.
Bảng 4.12 Thời gian sinh trưởng và khoảng cách tung phấp phun râu của các dòng ngô tham gia thí nghiệm gây hạn nhân tạo giai đoạn trước trỗ (ngày)
Dòng Công thức thí nghiệm TP PR ASI CSL
Chú thích: TP: Tung phấn; PR: Phun râu; ASI: Khoảng cách TP-PR; CSL: Chín sinh lý; CT1- công thức tưới nước đầy đủ; CT2- công thức gây hạn
Trong các tính trạng hình thái, ASI (Anthesis-Silking Interval) là yếu tố quan trọng nhất và đã được nghiên cứu kỹ lưỡng (Hall & cs., 1982; Wesgate & Bussetti, 1990; Bolanos & Edmeades, 1993) Nghiên cứu cho thấy ASI có mối tương quan nghịch với năng suất hạt trong điều kiện hạn Việc chọn lọc năng suất dựa trên ASI trong điều kiện hạn mang lại kết quả khả quan nhất và có khả năng di truyền (Bolanos, 1993).
Chiều cao cây, chiều cao đóng bắp
ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÁC THL ĐỈNH MANG SỰ KIỆN CHUYỂN GEN ZMDREB2A VÀ THL NỀN TƯƠNG ỨNG THÔNG QUA THÍ NGHIỆM GÂY HẠN NHÂN TẠO NGOÀI ĐỒNG RUỘNG
SỰ KIỆN CHUYỂN GEN ZMDREB2A VÀ THL NỀN TƯƠNG ỨNG THÔNG QUA THÍ NGHIỆM GÂY HẠN NHÂN TẠO NGOÀI ĐỒNG RUỘNG
Chúng tôi đã tiến hành đánh giá khả năng di truyền về tính chịu hạn của các dòng ngô chuyển gen ZmDREB2A bằng cách sử dụng 3 dòng ngô chuyển gen D3, D14 và D21 cùng với 3 dòng ngô nền C436, C7N và V152 Thí nghiệm lai đỉnh được thực hiện với 2 dòng ngô thuần ưu tú NT6745 và H245, tạo ra 12 tổ hợp lai, bao gồm 6 tổ hợp mang dòng chuyển gen và 6 tổ hợp đối chứng Khả năng chịu hạn của các tổ hợp lai được đánh giá qua thí nghiệm gây hạn nhân tạo trong điều kiện kiểm soát vào vụ Hè Thu 2019.
4.3.1 Đặc điểm hình thái và thời gian sinh trưởng của các THL trong điều kiện hạn
Chiều cao cây và chiều cao đóng bắp
Chiều cao cây và chiều cao đóng bắp là những đặc điểm hình thái quan trọng của cây ngô, ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển và khả năng chống đổ, đồng thời được quyết định bởi tính di truyền của giống Tuy nhiên, các yếu tố như thời tiết, đất đai, mùa vụ, mật độ, phân bón và chăm sóc cũng tác động đến những tính trạng này Kết quả theo dõi chiều cao cây và chiều cao đóng bắp của các tổ hợp lai trong vụ Hè Thu 2019 đã được tổng hợp và so sánh chi tiết trong bảng 4.17.
Bảng 4.17 Đặc điểm hình thái và thời gian sinh trưởng của các tổ hợp lai trong điều kiện hạn
Ghi chú: CCC: Chiều cao cây; CCB: Chiều cao đóng bắp; ASI: Khoảng cách thời gian tung phấn phun râu
Trong điều kiện hạn, chiều cao của tất cả các tổ hợp lai giảm so với điều kiện tưới đủ, cho thấy hạn đã ảnh hưởng tiêu cực đến sự sinh trưởng của cây ngô Kết quả theo dõi cho thấy chiều cao cây của các tổ hợp lai từ các dòng chuyển gen cao hơn so với các tổ hợp lai nền, đặc biệt là các tổ hợp lai từ hai dòng chuyển gen D3 và D21 Mặc dù THL chuyển gen D14 có sự khác biệt so với THL nền, nhưng không có sự khác nhau có ý nghĩa Chiều cao đóng bắp của các THL cũng tương tự, với chiều cao dao động từ 180,9 – 206,2 cm và chiều cao đóng bắp từ 90,2 – 112,3 cm.
Chênh lệch thời gian tung phấn phun râu (ASI)
Chênh lệch thời gian tung phấn phun râu (ASI) đóng vai trò quan trọng trong chương trình chọn tạo giống ngô chịu hạn Nghiên cứu cho thấy ASI có mối tương quan chặt chẽ với năng suất cây ngô trong điều kiện hạn, với tương quan kiểu gen là 0,65 và kiểu hình là 0,53 (Bolanos).
1993) Nếu hạn xảy ra vào giai đoạn tung phấn phun râu, năng suất ngô giảm nhiều nhất (Zaidi, 2002)
Giai đoạn tung phấn và phun râu (khoảng 8-12 ngày) là thời kỳ quyết định năng suất của cây ngô, ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình thụ phấn và thụ tinh, từ đó xác định số hạt trên mỗi bắp Tính trạng này có mối tương quan chặt chẽ với năng suất, với hệ số tương quan gen là 0,86 và kiểu hình là 0,99 (Bolanos, 1993) Trong giai đoạn này, các chất dinh dưỡng từ thân lá sẽ tập trung vào cơ quan sinh sản, đồng thời các chất hữu cơ cũng bắt đầu được tổng hợp và tích lũy vào hạt.
Kết quả đánh giá 12 tổ hợp lai trong điều kiện hạn cho thấy, các tổ hợp lai từ dòng chuyển gen có thời gian tung phấn phun râu trung bình ngắn hơn từ 1-2 ngày so với các tổ hợp lai từ dòng nền, với khoảng thời gian lần lượt là 4,3-5,3 ngày và 5,3-6,7 ngày Sự biến động giữa các tổ hợp lai trong điều kiện hạn là khá lớn, từ 3-7 ngày, cho thấy thí nghiệm đã tạo ra mức độ bất thuận đáng kể về thiếu nước Kết quả này phù hợp với nhận định của Zaidi (2005) và cho thấy các tổ hợp lai từ dòng chuyển gen có khả năng chịu hạn tốt hơn so với các tổ hợp lai từ dòng nền.
Thời gian sinh trưởng của các tổ hợp lai
Sinh trưởng và phát triển của cây trồng là một quá trình sinh lý tổng hợp, bao gồm sự biến đổi về hình thái và cấu trúc bên trong Sinh trưởng liên quan đến việc tạo ra các yếu tố cấu trúc mới, dẫn đến sự gia tăng kích thước của cây Trong khi đó, phát triển là quá trình biến đổi về chất, cho phép cây trải qua chu kỳ sống của mình Hai quá trình này có mối quan hệ chặt chẽ, trong đó sinh trưởng đóng vai trò là tiền đề về lượng cho sự phát triển.
Nghiên cứu các giai đoạn sinh trưởng và phát triển của các tổ hợp lai giúp xác định thời gian hoàn thành từng giai đoạn, từ đó áp dụng các biện pháp kỹ thuật hiệu quả như cải thiện đất đai, lựa chọn thời vụ gieo trồng hợp lý, chăm sóc đúng cách và thiết lập chế độ tưới tiêu tiết kiệm Những biện pháp này không chỉ nâng cao hiệu quả kinh tế mà còn tối ưu hóa việc sử dụng nguồn nước.
Trong vụ Hè Thu 2019, thời gian sinh trưởng từ gieo đến chín sinh lý của 12 tổ hợp lai được đánh giá cho thấy thời gian chín sinh lý dao động từ 106 đến 112 ngày Các tổ hợp lai được tạo ra từ dòng chuyển gen và dòng nền có thời gian sinh trưởng tương đương, không có sự khác biệt có ý nghĩa ở mức tin cậy 95%.
4.3.2 Tốc độ già hoá bộ lá của các tổ hợp lai trong điều kiện hạn Độ già hóa bộ lá (LSE - Leaf senescence) phản ánh khả năng tránh hạn hoặc chịu hạn của cây trồng, có tương quan với năng suất và thường được sử dụng để đánh giá khả năng chịu hạn Trong thí nghiệm chịu hạn, tính trạng này là chỉ tiêu quan trọng đặc biệt là ở giai đoạn hình thành hạt ngô với biểu hiện mô lá bị khô vàng từ lá gốc lên lá bắp (M Zaman-Allah & cs., 2016)
Kết quả đánh giá độ già hoá bộ lá (LSE) ở các giai đoạn trước và sau khi ngô tung phấn cho thấy rằng các tổ hợp lai từ dòng chuyển gen có độ già hóa thấp hơn so với các tổ hợp lai từ dòng nền Cụ thể, ở giai đoạn 2 tuần sau tung phấn phun râu, mức độ hóa già của các tổ hợp lai từ dòng chuyển gen dao động từ 4,3 đến 5,7, tương đương với 43-57% diện tích lá bị chết Theo dõi cho thấy chỉ số hóa già tăng dần từ giai đoạn trước trỗ đến 2 tuần sau trỗ, cho thấy việc gây hạn đã xảy ra đúng vào thời điểm tung phấn phun râu.
Bảng 4.18 Tốc độ già hoá bộ lá của các tổ hợp lai trong điều kiện hạn
STT THL LSE_1 LSE_2 LSE_3
Ghi chú về độ già hoá của cây trồng bao gồm: LSE_1, thể hiện độ già hoá trước trỗ; LSE_2, thể hiện độ già hoá của bộ lá trong thời điểm tung phấn và phun râu; và LSE_3, phản ánh độ già hoá của bộ lá sau 15 ngày thụ phấn.
Một số tính trạng gián tiếp có mối tương quan chặt chẽ với năng suất và độ di truyền cao bao gồm số bắp trên cây, số hạt trên cây, khoảng cách giữa thời điểm tung phấn và phun râu, cùng với số hạt trên cây Các chỉ tiêu có độ tương quan vừa phải bao gồm độ bó tán lá, số nhánh cờ, chiều cao cây, tỷ lệ cây con chết, tốc độ hoá già của lá và độ héo lá.
4.3.3 Tỷ lệ đổ rễ, gãy thân và tỷ lệ bắp/cây
Trong điều kiện hạn, cây ngô tập trung dinh dưỡng vào việc hình thành bắp và hạt, dẫn đến tỷ lệ đổ rễ và gãy thân tăng cao Theo bảng 4.19, các tổ hợp lai từ dòng chuyển gen cho thấy tỷ lệ đổ rễ và gãy thân thấp hơn so với các tổ hợp lai từ dòng nền Đặc biệt, tổ hợp lai D3 x NT và D21 x có kết quả đáng chú ý.
NT có khả năng chống đổ và gẫy thân là tốt nhất trong điều kiện hạn
Trong điều kiện hạn, tỷ lệ số bắp trên mỗi cây là chỉ tiêu quan trọng để lựa chọn nguồn vật liệu chịu hạn tốt, với mối tương quan gen là 0,9 và kiểu hình là 0,77 (Bolanos, 1993) Kết quả đánh giá cho thấy tất cả các tổ hợp lai đều không đạt tỷ lệ 100% bắp trên cây, cho thấy hạn đã ảnh hưởng đến quá trình thụ phấn, thụ tinh, hình thành bắp và phát triển hạt Thí nghiệm đã đạt yêu cầu về mức độ gây hạn và thời điểm tung phấn Trong số các tổ hợp lai tham gia thí nghiệm, D3 x NT và D3 x H có tỷ lệ bắp trên cây lần lượt là 95% và 96%, cho thấy đây là các tổ hợp lai có khả năng chịu hạn tốt nhất.
Bảng 4.19 Tỷ lệ đổ rễ, gãy thân và tỷ lệ bắp/cây của các tổ hợp lai trong điều kiện hạn vụ Hè Thu 2019
TT THL Tỷ lệ đổ rễ Tỷ lệ gãy thân Tỷ lệ bắp/cây
4.3.4 Năng suất của các tổ hợp lai trong điều kiện hạn
