Nghiên cứu ứng dụng công nghệ CRISPRCas9 trong tạo đột biến gen GmGOLS03, GmGOLS19 trên cây đậu tương (glycine max (l ) merrill) nhằm giảm lượng đường họ raffinose trong hạt

TỔNG QUAN 4

1 1 Tình hình sản xuất và chọn tạo giống đậu tương

Đậu tương, một cây thực phẩm ngắn ngày giàu dinh dưỡng và có giá trị kinh tế cao, được trồng rộng rãi trên toàn cầu nhờ khả năng thích nghi với nhiều điều kiện khí hậu khác nhau Từ năm 2009 đến 2018, sản lượng đậu tương toàn cầu đã tăng, với khoảng 91 triệu ha được gieo trồng hàng năm và năng suất trung bình đạt 22-23 tạ/ha 90% sản lượng đậu tương thế giới tập trung vào năm quốc gia chính là Mỹ, Brazil, Argentina, Trung Quốc và Ấn Độ, trong đó Mỹ dẫn đầu về diện tích và năng suất Đặc biệt, năm 2014, diện tích đậu tương chuyển gen ở Mỹ chiếm 82% tổng diện tích trồng đậu tương toàn cầu.

Hình 1 1 Biểu đồ thể hiện sản lượng cây đậu tương trên thế giới (2009-2018)

Nguồn: Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ (USDA)*số liệu dự báo

Nhu cầu tiêu thụ đậu tương toàn cầu đang gia tăng với mức trung bình 4-5% mỗi năm, trong đó Trung Quốc dẫn đầu với mức tăng 8%, đạt 36,2 kg/người/năm Châu Á tiêu thụ gần 90 triệu tấn đậu tương mỗi năm, chiếm 40% sản lượng toàn cầu, nhưng sản xuất trong khu vực chỉ đạt 26,6 triệu tấn, dẫn đến việc phải nhập khẩu khoảng 63,3 triệu tấn, tương đương 70% nhu cầu Trung Quốc có diện tích trồng đậu tương lớn nhất tại châu Á với 8,8 triệu ha và năng suất cao nhất đạt 16,5 tạ/ha, đứng thứ tư thế giới Trong khi đó, Indonesia là nước có diện tích trồng đậu tương lớn nhất ở Đông Nam Á với 0,72 triệu ha, Thái Lan có năng suất cao nhất đạt 16,3 tạ/ha, tiếp theo là Việt Nam với 14,6 tạ/ha, và Philippines có năng suất thấp nhất chỉ 10,0 tạ/ha Theo FAO, năm 2019, diện tích trồng đậu tương toàn cầu đạt 121 triệu ha với sản lượng 2,8 tấn/ha.

Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam đã phát triển từ rất sớm, với giống đậu tương đầu tiên được thuần hóa từ cây hoang dại, mang lại giá trị dinh dưỡng cao Từ năm 1993, cả nước đã hình thành sáu vùng sản xuất đậu tương chủ lực, trong đó vùng Đông Nam Bộ có diện tích lớn nhất, chiếm 26,2% tổng diện tích đậu tương Các vùng khác bao gồm miền núi Bắc Bộ (24,7%), đồng bằng sông Hồng (17,5%), và đồng bằng sông Cửu Long (12,4%) Tổng diện tích của sáu vùng này chiếm 66,6% tổng diện tích đậu tương cả nước Về mùa vụ, đậu tương được trồng chủ yếu vào vụ hè thu (31,2%) và vụ đông xuân (29,7%), trong khi vụ xuân chỉ chiếm 14,2% và vụ mùa 2,68%.

Hình 1 2 Biểu đồ thể hiện sản lượng cây đậu tương ở Việt Nam (2009-2018)

Nguồn: Tổng cục thống kê *số liệu dự báo

Phương pháp canh tác truyền thống cùng với bộ giống năng suất thấp đã dẫn đến sản xuất đậu tương nhỏ lẻ, giá thành cao và lãi suất thấp, khiến giá đậu tương trong nước không thể cạnh tranh với hàng nhập khẩu Điều này làm nông dân không mặn mà với cây đậu tương, dẫn đến diện tích và sản lượng phát triển chậm Năm 2012, sản lượng đậu tương giảm 34,3% so với năm trước, xuống còn 173,7 nghìn tấn do thời tiết lạnh khắc nghiệt Từ 2012 đến 2016, sản lượng tiếp tục giảm trước khi tăng trở lại vào năm 2017, nhưng quy mô sản xuất vẫn rất nhỏ so với nhu cầu trong nước và mục tiêu 2020 của Chính phủ Việt Nam là 265 nghìn tấn trên diện tích 166 nghìn ha Theo số liệu năm 2020, diện tích trồng đậu tương đạt 41,6 nghìn ha và sản lượng chỉ đạt 65,4 nghìn tấn.

Đậu tương là cây công nghiệp ngắn ngày với thị trường tiêu thụ lớn, nhưng sản lượng trong nước không đủ đáp ứng nhu cầu, dẫn đến việc phải nhập khẩu Việc trồng đậu tương chủ yếu diễn ra theo hình thức canh tác nhỏ lẻ, với chi phí sản xuất cao và giá trị kinh tế thấp so với các cây trồng khác, khiến người dân ít quan tâm mở rộng diện tích Thêm vào đó, sâu bệnh và thiếu giống chất lượng phù hợp với từng vùng miền cũng là nguyên nhân chính ảnh hưởng đến năng suất và sản lượng đậu tương tại Việt Nam.

Sản xuất đậu tương trong nước mang lại lợi thế lớn nhờ thị trường tiêu thụ gần gũi, giúp giảm chi phí vận chuyển và đảm bảo chất lượng hạt tươi mới, phù hợp với khẩu vị người tiêu dùng Để phát triển ngành đậu tương nội địa, cần tập trung vào việc giảm giá thành sản xuất thông qua việc mở rộng diện tích trồng, nâng cao năng suất và cải thiện chất lượng hạt Đặc biệt, việc chọn giống có vai trò quan trọng trong chiến lược phát triển cây đậu tương tại Việt Nam, với các giống bản địa phù hợp với điều kiện sinh thái và khả năng thích nghi tốt sẽ là lợi thế so với giống ngoại nhập.

Mặc dù nhiều giống đậu tương trong nước đã được phát triển, nhưng năng suất và chất lượng hạt vẫn chưa đủ cạnh tranh với các giống ngoại nhập Do đó, cải tạo giống đậu tương nội địa nhằm nâng cao năng suất, chất lượng và khả năng chống chịu đã trở thành một chiến lược quan trọng trong công tác chọn tạo giống đậu tương tại Việt Nam trong những năm gần đây.

1 1 2 Các phương pháp phổ biến sử dụng trong chọn tạo giống đậu tương

1 1 2 1 Các phương pháp chọn tạo giống truyền thống

Phương pháp chọn lọc giống cây trồng tập trung vào việc lựa chọn các giống có năng suất cao, chất lượng tốt và khả năng kháng sâu bệnh, cũng như khả năng chịu đựng các điều kiện môi trường khắc nghiệt Đặc biệt, trong nghiên cứu về đậu tương, các nhà khoa học thường áp dụng phương pháp này để chọn lọc giống nhập nội hoặc trực tiếp từ nguồn vật liệu di truyền và gen của các giống địa phương.

Lai hữu tính là phương pháp cơ bản để tạo ra các vật liệu di truyền phục vụ cho chọn giống, cho phép kết hợp những đặc tính tốt từ các giống bố mẹ và con lai Đậu tương, với đặc điểm tự thụ phấn và tỷ lệ giao phấn chỉ từ 0,5% đến 1%, thường gặp khó khăn trong việc lai tạo do tỷ lệ thành công thấp Tuy nhiên, nhiều giống đậu tương năng suất cao đã được phát triển tại Việt Nam, như giống VN1, trong giai đoạn 1985 – 2005.

15 giống đậu tương được công nhận là giống quốc gia

Đột biến là phương pháp phổ biến trong chọn tạo giống cây trồng, giúp khắc phục các tính trạng không mong muốn và tổng hợp nhiều đặc tính nhằm nâng cao chất lượng, giá trị dinh dưỡng và kinh tế cho cây trồng Cụ thể, phương pháp này có thể cải thiện chất lượng hạt, tăng số lượng quả, điều chỉnh chiều cao cây và thời gian sinh trưởng Đậu tương là một trong những loại cây được nghiên cứu nhiều thông qua xử lý đột biến, với nhiều thành công trên toàn cầu Tại Việt Nam, các nhà nghiên cứu đã áp dụng tác nhân lý hóa để tạo ra giống đậu đột biến, mang lại kết quả khả quan với các giống mới như V70 và ĐT84, có năng suất cao, thời gian sinh trưởng ngắn, khả năng chống chịu sâu bệnh tốt và thích ứng rộng.

1 1 2 2 Chọn tạo giống đậu tương với sự trợ giúp của chỉ thị phân tử và công nghệ gen

 Sử dụng chỉ thị phân tử DNA trong chọn tạo giống đậu tương

Molecular DNA markers such as RFLP, RAPD, AFLP, SSR, and SNP, along with the use of QTL (Quantitative Trait Loci) mapping, have been effectively utilized in the breeding and selection of crop varieties, including soybean.

Nghiên cứu của Hwang và cộng sự đã phân tích 377 dấu hiệu lặp lại trình tự đơn giản (SSR) trong 87 loại đậu tương ưu tú và giống cây hoang dã tại Nhật Bản Kết quả cho thấy sự tương quan giữa các locus của các giống đậu tương có nguồn gốc địa lý tương đồng, điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc lập bản đồ di truyền cho các đặc điểm nông học thiết yếu và hỗ trợ quá trình chọn tạo giống hiệu quả.

[6] Nghiên cứu của Nguyễn Lộc Hiền (2017) về đánh giá sự đa dạng di truyền của

Nghiên cứu đã phân tích 22 giống đậu tương rau Nhật Bản dựa trên 15 tính trạng hình thái-nông học, sử dụng 40 primer RAPD và 26 primer SSR, cho thấy 62,85% đặc điểm hình thái-nông học là đa hình Các chỉ thị RAPD và SSR cho thấy mức độ khác biệt cao hơn so với chỉ thị hình thái, với 70,32% và 94% đa hình tương ứng Phân tích nhóm dựa trên ba loại chỉ thị phân tử này đã phân chia 22 giống thành 4 nhóm với khoảng cách Euclidean từ 4,47 đến 10,05 Mức độ đa dạng di truyền cho thấy sự khác biệt giữa các giống đủ lớn để phục vụ cho việc chọn tạo giống mới Bốn giống Wase edamame, Fusanari chamame, Chuse edamame và Yuusuzumi có quan hệ di truyền xa so với các giống khác, tạo thành nguồn vật liệu lai tạo quan trọng cho tương lai.

 Ứng dụng công nghệ gen trong chọn tạo giống đậu tương

Chuyển gen là kỹ thuật đưa DNA ngoại lai vào hệ gen tế bào chủ để cải biến các đặc tính mong muốn Ban đầu, ứng dụng chuyển gen trong cây trồng tập trung vào các đặc tính phục vụ sản xuất nông nghiệp như kháng thuốc diệt cỏ, kháng bệnh do côn trùng và chống lại các yếu tố bất thuận của môi trường như hạn hán, độ mặn và độ chua của đất Sau đó, kỹ thuật di truyền đã chuyển hướng chú trọng vào cải thiện chất lượng cây trồng, tạo ra sự đa dạng trong các thành tựu chuyển gen Một ví dụ điển hình là cây đậu tương chuyển gen với hàm lượng dầu Oleic và amino acid cao, hiện đang được thử nghiệm tại Mỹ.

Hai phương pháp chính để chuyển gen vào cây đậu tương là chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium và phương pháp sử dụng súng bắn gen Phương pháp Agrobacterium được ưa chuộng nhờ tính đơn giản, chi phí thấp và không yêu cầu thiết bị phức tạp, do đó được áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu giống đậu tương Các vật liệu chuyển gen phổ biến bao gồm gốc lá mầm, phôi chưa chín và mô lá, giúp cải thiện nhiều tính trạng quan trọng như kháng sâu bệnh và kháng thuốc diệt cỏ Trong đó, tính trạng kháng thuốc diệt cỏ được nghiên cứu và ứng dụng nhiều nhất, với các gen như CP4 EPSPS (kháng glyphosate) và gen bar hoặc pat (kháng glufosinate ammonium) Từ năm 2015 đến 2019, Mỹ dẫn đầu thế giới về diện tích cây trồng biến đổi gen, với 71,5 triệu ha, trong đó đậu tương biến đổi gen chiếm 48,2% Đến năm 2020, 94% giống cây đậu tương đã được biến đổi gen để kháng thuốc diệt cỏ.

1 2 Sinh tổng hợp đường khó tiêu RFOs trong cây đậu tương

1 2 1 Nhóm đường khó tiêu RFOs trong thành phần hạt đậu tương

1 2 1 1 Thành phần hạt đậu tương

VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

Việt Nam hiện có bốn giống đậu tương nổi bật, bao gồm hai giống nội địa ưu tú là ĐT22 và ĐT26, được phát triển bởi Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển đậu đỗ thuộc Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm Việt Nam Bên cạnh đó, hai giống đậu tương nhập khẩu từ nước ngoài là Maverick (Mr) và William82 (WL 82) được cung cấp bởi Đại học Missouri-Colombia, MO, Hoa Kỳ.

Giống đậu tương ĐT26, được phát triển bởi Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ thuộc Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm, là kết quả của sự lai tạo giữa ĐT2000 và ĐT12 Giống này có khả năng kháng bệnh gỉ sắt, đốm nâu, chịu ruồi đục thân và chống đổ tốt ĐT26 thích hợp cho vụ đông và vụ xuân, với năng suất trung bình từ 22-28 tạ/ha ở độ ẩm 12%, tùy thuộc vào mùa vụ và điều kiện thâm canh Trong điều kiện thâm canh cao, năng suất có thể đạt tới 30-32 tạ/ha Nghiên cứu này cũng sử dụng giống Maverick (Mr) để kiểm tra quy trình chuyển gen và giống William82 (WL 82) làm cơ sở so sánh trình tự gen đích của giống đậu tương thí nghiệm.

Chủng vi khuẩn A rhizogenes K599 chứa cấu trúc chuyển gen pFGC/gfp hoặc pZY102/gus, trong khi khuẩn A tumefaciens AGL1 mang hệ thống vector chuyển gen CRISPR/Cas9 Những vi khuẩn này được sử dụng trong nghiên cứu do phòng Công nghệ tế bào thực vật thuộc Viện Công nghệ sinh học cung cấp.

- Vector HBT-pcoCas9 được cung cấp từ phòng thí nghiệm Jen Sheen (RRID: Addgene_52254), vector pBlu/gRNA được cung cấp từ phòng thí nghiệm của Robert

Stupar (RRID: Addgene_59188) và vector pFGC5941 (RRID: Addgene_84084) được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm của giáo sư Stacey, Đại học Missouri-Columbia, Hoa Kỳ

- Các mồi đặc hiệu và DNA oligonucleotide được đặt tổng hợp nhân tạo bởi công ty TNHH MTV Sinh hóa Phù Sa (Cần Thơ, Việt Nam)

Trang thiết bị máy móc cần thiết bao gồm nồi hấp khử trùng, máy cất nước hai lần, tủ âm với nhiệt độ từ -4 đến -200 độ C, tủ cấy, máy đo pH, máy ly tâm, máy PCR, và các loại pippet Ngoài ra, còn có buồng sinh trưởng, nhà lưới và vườn ươm để hỗ trợ quá trình nghiên cứu và sản xuất.

- Môi trường và hóa chất: các loại môi trường cơ bản: MS, YEP Các hoa chất cơ bản: BAP, IAA, GA3

2 2 Nội dung nghiên cứu Đề tài nghiên cứu gồm 6 nội dung:

Nội dung 1: Thiết kế hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 nhằm gây tạo đột biến gen GmGOLS trên đậu tương

Nội dung 2: Phát triển hệ thống cảm ứng rễ tơ thông qua vi khuẩn A

Rhizogenes trên một số giống đậu tương Việt Nam, kiểm tra hoạt động của cấu trúc chuyển gen và chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9

Nội dung 3: Tạo cây đậu tương mang đột biến gen mã hóa Galactinol synthase thông qua hệ thống CRISPR/Cas9

Phân tích sự di truyền của các đột biến định hướng và gen chuyển là cần thiết để hiểu rõ hơn về cơ chế di truyền trong cây trồng Đồng thời, việc nghiên cứu sinh trưởng, phát triển và thành phần hạt của các dòng đậu tương mang đột biến định hướng giúp đánh giá tiềm năng ứng dụng trong nông nghiệp Những thông tin này không chỉ hỗ trợ trong việc cải thiện giống cây trồng mà còn góp phần nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm.

Nội dung 6: Kiểm tra đột biến ngoài định hướng và lựa chọn dòng đột biến tiềm năng không mang gen chuyển

2 3 1 Thiết kế vector chuyển gen mang hệ thống CRISPR/Cas9

Dựa trên các nghiên cứu trước đây và nguồn dữ liệu mở từ NCBI, Phytozome và SoyKB, chúng tôi đã phân tích trình tự và biểu hiện của hai gen mã hóa enzyme galactinol synthase, cho thấy chúng có mức độ biểu hiện cao trên hạt đậu tương Sử dụng chương trình tin sinh học CRISPR-PLANT và CRISPR Design Tool, chúng tôi đã xác định các trình tự định hướng (sgRNAs) theo phương pháp của Vibha Srivastava và cộng sự (2017) Từ 2-3 trình tự định hướng tối ưu với độ tương đồng cao ở hai gen quan tâm sẽ được thiết kế để tạo ra khung vector chuyển gen thực vật chứa gen cần thiết.

Cas9 nhận được từ nguồn Addgene

- Các cấu trúc bao gồm trình tự định hướng sgRNA của gen mã hoá cho enzyme

Galactinol synthase và promoter U6 (Arabidopsis U6 promoter) được kết nối sử dụng hệ thống cloning vector (NEB® Golden Gate Assembly Kit -BsaI-HF®v2)

Cấu trúc định hướng và promoter U6 đã được kết hợp vào vector chuyển gen pFGC-Cas9 thông qua hệ thống pFGC-Cas9-gateway, do phòng thí nghiệm của giáo sư Stacey tại đại học Missouri, Mỹ cung cấp.

Bước đầu tiên trong quá trình tạo vector pFGC5941(-)/Cas9 là ghép nối phân đoạn gen biểu hiện Cas9, bao gồm promoter 35S, gen Cas9 và terminator Nos, từ vector HBT-proCas9 sang vector đích pFGC5941(-) Quá trình này được thực hiện thông qua các phản ứng cắt và nối ghép gen tại vị trí của các enzyme cắt hạn chế XhoI và EcoRI.

Bước 2: Sử dụng phản ứng overlap PCR để khuếch đại các phân đoạn phiên mã của gRNAs, bao gồm PstI/U6 promoter-gRNA1-gRNA scaffold/EcoRI và EcoRI/U6 promoter-gRNA2-gRNA scaffold/PstI, với vector pBlu-gRNA làm khuôn và các cặp mồi được liệt kê trong bảng phụ lục 1.

Bước 3: Nối ghép đồng thời 2 phân đoạn phiên mã 2 gRNA vào vector pFGC5941(-)/Cas9 tạo thành vector hoàn chỉnh pFGC5941(-) /Cas9/gRNA1/gRNA2

+ Xử lý vector pFGC5941(-)/Cas9 bằng PstI

+ Xử lý đồng thời 2 phân đoạn PstI/U6 promoter-gRNA1-gRNA scaffold/EcoRI và EcoRI/U6 promoter-gRNA2-gRNA scaffold/PstI bằng cặp enzyme hạn chế PstI và EcoRI

Tiến hành phản ứng ligation với sự xúc tác của enzyme T4-DNA ligase để nối ghép đồng thời vector pFGC5941(-)/Cas9 đã được mở vòng và hai phân đoạn gRNA đã được xử lý bằng enzyme cắt hạn chế.

Sơ đồ thiết kế của vector chuyển gen hoàn chỉnh được mô phỏng như Hình 3 4

Vector chỉnh sửa gen sau khi hoàn thiện sẽ được chuyển vào chủng vi khuẩn A rhizogenes và A tumefaciens AGL1, được cung cấp bởi phòng Công nghệ tế bào thực vật, thông qua phương pháp sốc nhiệt theo nghiên cứu của David Neece (2013).

2 3 2 Cảm ứng rễ tơ thông qua vi khuẩn A rhizogenes

Hệ thống rễ tơ được phát triển trong điều kiện in vitro nhằm tối ưu hóa quy trình cảm ứng tạo rễ tơ trên cây đậu tương Mục tiêu của nghiên cứu này là kiểm tra hoạt động của cấu trúc chuyển gen và đánh giá hiệu quả chỉnh sửa hệ gen thông qua công nghệ CRISPR/Cas9.

Tên môi trường Thành phần

The Gieo hạt (GCM) medium, based on Murashige and Skoog (1962), consists of 20 g/l sucrose and 3 g/l phytagel with a pH of 5.6 For culturing YEP (Yeast Extract Peptone), the medium includes 12 g/l Bacto agar and antibiotics such as streptomycin, spectinomycin, and kanamycin at a concentration of 500 mg/l, maintaining a pH of 7.0 Additionally, the MS medium is prepared with 20 g/l sucrose and a pH of 5.6 for inoculation.

Nuôi cấy phát sinh rễ tơ (ICM) được thực hiện trong môi trường MS với 30 g/l sucrose, 3,0 g/l phytagel, và kháng sinh cefotaxime ở nồng độ 500 mg/l, pH 5,6 Để chọn lọc rễ tơ, sử dụng môi trường MS tương tự với 30 g/l sucrose, 3,0 g/l phytagel, nhưng điều chỉnh nồng độ cefotaxime xuống còn 250-500 mg/l và thêm glufosinate với nồng độ từ 1-3 mg/l.

Bảng 2 1 Thành phần các loại môi trường trong nuôi cấy tạo rễ tơ in vitro đậu tương

Quy trình chuyển gen tạo rễ tơ theo phương pháp nốt lá mầm được phát triển dựa trên nghiên cứu của Chen và cộng sự (2018), với các cải tiến về thành phần môi trường sử dụng, được trình bày chi tiết trong Bảng 2.1.

- Chuẩn bị nguyên liệu biến nạp