Nghiên cứu ứng dụng công nghệ CRISPRCas9 trong tạo đột biến gen GmGOLS03, GmGOLS19 trên cây đậu tương (glycine max (l ) merrill) nhằm giảm lượng đường họ raffinose trong hạt

TỔNG QUAN 4

1 1 Tình hình sản xuất và chọn tạo giống đậu tương

Đậu tương, một cây thực phẩm ngắn ngày giàu dinh dưỡng và có giá trị kinh tế cao, được trồng rộng rãi trên toàn cầu nhờ khả năng thích nghi với nhiều điều kiện khí hậu khác nhau Từ năm 2009 đến 2018, sản lượng đậu tương toàn cầu đã tăng trưởng ổn định, với diện tích gieo trồng trung bình khoảng 91 triệu ha và năng suất đạt 22-23 tạ/ha Năm nước dẫn đầu về sản xuất đậu tương là Mỹ, Brazil, Argentina, Trung Quốc và Ấn Độ, trong đó Mỹ chiếm ưu thế với diện tích và năng suất cao Đặc biệt, vào năm 2014, 82% diện tích đậu tương trồng tại Mỹ là giống chuyển gen, đạt 90,7 triệu ha trong tổng số 111 triệu ha đậu tương trên toàn thế giới.

Hình 1 1 Biểu đồ thể hiện sản lượng cây đậu tương trên thế giới (2009-2018)

Nguồn: Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ (USDA)*số liệu dự báo

Nhu cầu tiêu thụ đậu tương toàn cầu tăng từ 4-5% mỗi năm, đặc biệt tại Trung Quốc với mức tăng 8%, trung bình tiêu dùng đạt 36,2 kg/người/năm Châu Á tiêu thụ gần 90 triệu tấn đậu tương mỗi năm, chiếm 40% sản lượng toàn cầu, nhưng sản xuất nội địa chỉ đạt 26,6 triệu tấn, dẫn đến việc phụ thuộc 70% vào nhập khẩu (khoảng 63,3 triệu tấn/năm) Trung Quốc có diện tích trồng đậu tương lớn nhất châu Á với 8,8 triệu ha và năng suất cao nhất đạt 16,5 tạ/ha, đứng thứ tư thế giới Tại Đông Nam Á, Indonesia có diện tích trồng lớn nhất với 0,72 triệu ha, trong khi Thái Lan có năng suất cao nhất đạt 16,3 tạ/ha, Việt Nam đạt 14,6 tạ/ha và Philippines thấp nhất với 10,0 tạ/ha Theo FAO năm 2019, diện tích trồng đậu tương toàn cầu đạt 121 triệu ha với sản lượng 2,8 tấn/ha.

Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam đã phát triển từ rất sớm, bắt nguồn từ giống đậu hoang dại được thuần hóa và trồng như một cây có giá trị dinh dưỡng cao Từ năm 1993, cả nước đã hình thành sáu vùng sản xuất đậu tương chủ lực, trong đó vùng Đông Nam Bộ chiếm diện tích lớn nhất với 26,2%, tiếp theo là khu vực miền núi Bắc Bộ (24,7%), đồng bằng sông Hồng (17,5%), và đồng bằng sông Cửu Long (12,4%) Tổng diện tích của sáu vùng này chiếm 66,6% tổng diện tích đậu tương cả nước Về mùa vụ, đậu tương được trồng chủ yếu vào vụ hè thu (31,2%) và vụ đông xuân (29,7%), với các vụ còn lại chiếm tỷ lệ nhỏ hơn.

Hình 1 2 Biểu đồ thể hiện sản lượng cây đậu tương ở Việt Nam (2009-2018)

Nguồn: Tổng cục thống kê *số liệu dự báo

Phương pháp canh tác truyền thống, giống cây năng suất thấp và sản xuất nhỏ lẻ đã dẫn đến giá thành sản xuất đậu tương cao, khiến sản phẩm trong nước không thể cạnh tranh với đậu tương nhập khẩu Điều này làm nông dân ít quan tâm đến việc trồng đậu tương, dẫn đến sự phát triển chậm về diện tích và sản lượng Năm 2012, sản lượng đậu tương giảm 34,3% so với năm trước, chỉ còn 173,7 nghìn tấn do thời tiết lạnh khắc nghiệt Từ 2012 đến 2016, sản lượng tiếp tục giảm trước khi tăng trở lại vào năm 2017, nhưng quy mô sản xuất vẫn nhỏ so với nhu cầu và mục tiêu 2020 của Chính phủ Việt Nam là 265 nghìn tấn trên diện tích 166 nghìn ha Theo số liệu năm 2020, diện tích trồng đậu tương đạt 41,6 nghìn ha với sản lượng 65,4 nghìn tấn.

Đậu tương là cây công nghiệp ngắn ngày có thị trường tiêu thụ lớn, nhưng sản lượng trong nước không đủ đáp ứng nhu cầu, dẫn đến việc phải nhập khẩu Việc trồng đậu tương chủ yếu diễn ra ở quy mô hộ gia đình với chi phí sản xuất cao, trong khi giá trị kinh tế không cạnh tranh bằng các cây trồng khác, khiến nông dân ít quan tâm mở rộng diện tích Ngoài ra, sự tấn công của sâu bệnh và thiếu giống chất lượng phù hợp với từng vùng cũng là nguyên nhân chính ảnh hưởng đến năng suất và sản lượng đậu tương ở Việt Nam.

Sản xuất đậu tương trong nước mang lại lợi thế lớn nhờ vào thị trường tiêu thụ tại chỗ, giúp giảm chi phí vận chuyển và đảm bảo chất lượng hạt tươi mới, phù hợp với khẩu vị người tiêu dùng Để phát triển sản xuất đậu tương, cần tập trung vào việc giảm giá thành sản xuất thông qua việc mở rộng diện tích trồng, nâng cao năng suất và cải thiện phẩm chất hạt Đặc biệt, việc chọn giống là yếu tố quan trọng trong chiến lược phát triển cây đậu tương tại Việt Nam, với các giống đậu tương bản địa có khả năng thích nghi tốt với điều kiện sinh thái của từng vùng miền, sẽ tạo ra lợi thế cạnh tranh so với giống ngoại nhập.

Mặc dù nhiều giống đậu tương trong nước đã được phát triển, nhưng năng suất và chất lượng hạt vẫn chưa đạt yêu cầu cạnh tranh với các giống ngoại nhập Do đó, cải tạo giống đậu tương nội địa nhằm nâng cao năng suất, chất lượng và khả năng chống chịu là một chiến lược quan trọng trong công tác chọn tạo giống đậu tương tại Việt Nam trong những năm gần đây.

1 1 2 Các phương pháp phổ biến sử dụng trong chọn tạo giống đậu tương

1 1 2 1 Các phương pháp chọn tạo giống truyền thống

Phương pháp chọn lọc là quá trình lựa chọn giống cây trồng có năng suất cao, chất lượng tốt và khả năng kháng sâu bệnh, cũng như chịu đựng các điều kiện môi trường khắc nghiệt Đặc biệt, trong nghiên cứu đậu tương, các nhà khoa học thường áp dụng phương pháp này để chọn lọc giống từ nguồn vật liệu di truyền và gen của giống địa phương, nhằm cải thiện các đặc tính nông học và thời gian chín của cây.

Lai hữu tính là phương pháp cơ bản để tạo ra các vật liệu và biến dị di truyền trong chọn giống, cho phép kết hợp những đặc tính ưu việt từ bố mẹ và con lai Đậu tương, với khả năng tự thụ phấn và tỷ lệ giao phấn chỉ từ 0,5% đến 1%, thường gặp khó khăn trong việc lai tạo tổ hợp Tuy nhiên, nhiều giống đậu tương tại Việt Nam đã được phát triển thành công qua phương pháp này, như giống VN1, với năng suất cao Trong giai đoạn 1985 – 2005, các nhà chọn tạo giống đậu tương Việt Nam đã đạt được nhiều thành tựu đáng kể.

15 giống đậu tương được công nhận là giống quốc gia

Đột biến là phương pháp phổ biến trong nghiên cứu và chọn tạo giống cây trồng, giúp khắc phục các tính trạng không mong muốn và tổng hợp nhiều đặc tính để nâng cao phẩm chất, giá trị dinh dưỡng và kinh tế của cây trồng Cụ thể, phương pháp này có thể cải thiện chất lượng hạt, tăng số lượng quả, điều chỉnh chiều cao cây, và thay đổi thời gian sinh trưởng, đồng thời bảo tồn các đặc tính quý của giống gốc Đậu tương là một trong những đối tượng nghiên cứu chính với phương pháp xử lý đột biến nhằm phát triển giống và nguồn vật liệu mới Nhiều nước đã đạt được thành công trong việc sử dụng tác nhân gây đột biến trên đậu tương Tại Việt Nam, các nhà nghiên cứu đã ứng dụng tác nhân lý hóa để tạo ra giống đậu đột biến, với những giống mới như V70 và ĐT84 có năng suất cao, thời gian sinh trưởng ngắn, khả năng chống chịu sâu bệnh tốt và thích ứng rộng.

1 1 2 2 Chọn tạo giống đậu tương với sự trợ giúp của chỉ thị phân tử và công nghệ gen

 Sử dụng chỉ thị phân tử DNA trong chọn tạo giống đậu tương

Molecular DNA markers such as RFLP, RAPD, AFLP, SSR, and SNP, combined with QTL (Quantitative Trait Loci) mapping, have been effectively utilized in the breeding and selection process for crops, including soybean.

Các nghiên cứu về chọn tạo giống đậu tương, như công trình của Hwang và cộng sự, đã phân tích đa hình của 377 dấu hiệu lặp lại trình tự đơn giản (SSR) trong 87 loại đậu tương ưu tú tại Nhật Bản và giống cây hoang dã Nghiên cứu này đã xác định mối tương quan giữa các locus của các giống đậu tương có nguồn gốc địa lý tương đồng, mang lại ý nghĩa quan trọng trong việc lập bản đồ di truyền cho các đặc điểm nông học thiết yếu và hỗ trợ quá trình chọn tạo giống hiệu quả.

[6] Nghiên cứu của Nguyễn Lộc Hiền (2017) về đánh giá sự đa dạng di truyền của

Nghiên cứu về 22 giống đậu tương rau Nhật Bản cho thấy 62,85% đặc điểm hình thái-nông học là đa hình, với chỉ thị RAPD và SSR cho kết quả phân tích đa dạng di truyền cao hơn so với chỉ thị hình thái Cụ thể, chỉ thị RAPD đạt 70,32% đa hình và chỉ thị SSR đạt 94% Phân tích nhóm dựa trên ba loại chỉ thị phân tử đã phân chia 22 giống thành 4 nhóm với khoảng cách Euclidean từ 4,47 đến 10,05 Mức độ đa dạng di truyền cho thấy sự khác biệt giữa các giống, mở ra cơ hội cho việc chọn tạo giống mới Bốn giống Wase edamame, Fusanari chamame, Chuse edamame và Yuusuzumi có mối quan hệ di truyền xa so với các giống khác, tạo thành nguồn vật liệu lai tạo quan trọng cho tương lai.

 Ứng dụng công nghệ gen trong chọn tạo giống đậu tương

Chuyển gen là kỹ thuật đưa DNA ngoại lai vào hệ gen tế bào chủ để cải thiện các đặc tính mong muốn Ban đầu, ứng dụng chuyển gen trong cây trồng tập trung vào các đặc tính hỗ trợ sản xuất nông nghiệp như kháng thuốc diệt cỏ, kháng bệnh do côn trùng và khả năng chịu đựng các điều kiện môi trường khắc nghiệt như hạn hán, mặn và chua Hiện nay, kỹ thuật di truyền đã chú trọng đến việc nâng cao chất lượng cây trồng chuyển gen, tạo ra sự đa dạng trong thành tựu, ví dụ như cây đậu tương chuyển gen với hàm lượng dầu Oleic và amino acid cao đang được thử nghiệm tại Mỹ.

Hai phương pháp chính trong chuyển gen vào cây đậu tương là chuyển gen qua vi khuẩn Agrobacterium và sử dụng súng bắn gen Phương pháp Agrobacterium đơn giản, chi phí thấp, và được áp dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm nghiên cứu giống đậu tương Các vật liệu chuyển gen phổ biến bao gồm gốc lá mầm, phôi chưa chín, và mô lá, giúp cải tạo nhiều tính trạng quan trọng như kháng sâu bệnh và kháng thuốc diệt cỏ Trong đó, tính trạng kháng thuốc diệt cỏ, với các gen như CP4 EPSPS (kháng glyphosate) và gen bar hoặc pat (kháng glufosinate ammonium), được nghiên cứu và ứng dụng phổ biến nhất Từ năm 2015 đến 2019, Mỹ có diện tích trồng cây biến đổi gen lớn nhất thế giới, đạt 71,5 triệu ha, trong đó đậu tương biến đổi gen chiếm 48,2% Đến năm 2020, 94% giống cây đậu tương đã được biến đổi gen để kháng thuốc diệt cỏ.

1 2 Sinh tổng hợp đường khó tiêu RFOs trong cây đậu tương

1 2 1 Nhóm đường khó tiêu RFOs trong thành phần hạt đậu tương

1 2 1 1 Thành phần hạt đậu tương

VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

Việt Nam hiện có bốn giống đậu tương nổi bật, bao gồm hai giống ưu tú trong nước là ĐT22 và ĐT26, được cung cấp bởi Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển đậu đỗ thuộc Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm Việt Nam Bên cạnh đó, hai giống đậu tương nước ngoài là Maverick (Mr) và William82 (WL 82) được cung cấp từ Đại học Missouri-Colombia, MO, Hoa Kỳ.

Giống đậu tương ĐT26, được phát triển bởi Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ thuộc Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm – Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, là kết quả của sự chọn lọc từ tổ hợp lai giữa ĐT2000 và ĐT12 Giống này có khả năng kháng bệnh gỉ sắt, đốm nâu, và chịu ruồi đục thân, đồng thời chống đổ tốt ĐT26 thích hợp cho vụ đông và vụ xuân, với năng suất trung bình từ 22-28 tạ/ha ở độ ẩm 12%, tùy thuộc vào mùa vụ và điều kiện thâm canh, có thể đạt tới 30-32 tạ/ha trong điều kiện thâm canh cao Nghiên cứu này cũng sử dụng giống Maverick (Mr) để kiểm tra quy trình chuyển gen và giống William82 (WL 82) làm cơ sở so sánh trình tự gen đích của giống đậu tương thí nghiệm.

Chủng vi khuẩn A rhizogenes K599 mang cấu trúc chuyển gen pFGC/gfp hoặc pZY102/gus, trong khi khuẩn A tumefaciens AGL1 sử dụng hệ thống vector chuyển gen CRISPR/Cas9 Những vi khuẩn này được ứng dụng trong nghiên cứu tại phòng Công nghệ tế bào thực vật thuộc Viện Công nghệ sinh học.

- Vector HBT-pcoCas9 được cung cấp từ phòng thí nghiệm Jen Sheen (RRID: Addgene_52254), vector pBlu/gRNA được cung cấp từ phòng thí nghiệm của Robert

Stupar (RRID: Addgene_59188) và vector pFGC5941 (RRID: Addgene_84084) được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm của giáo sư Stacey, Đại học Missouri-Columbia, Hoa Kỳ

- Các mồi đặc hiệu và DNA oligonucleotide được đặt tổng hợp nhân tạo bởi công ty TNHH MTV Sinh hóa Phù Sa (Cần Thơ, Việt Nam)

Trang thiết bị máy móc cần thiết cho nghiên cứu và sản xuất bao gồm nồi hấp khử trùng, máy cất nước 2 lần, tủ âm với dải nhiệt độ từ -4 đến -200°C, tủ cấy, máy đo pH, máy ly tâm, máy PCR, và pipet các loại Ngoài ra, buồng sinh trưởng, nhà lưới và vườn ươm cũng là những thiết bị quan trọng hỗ trợ quá trình phát triển cây trồng và thí nghiệm.

- Môi trường và hóa chất: các loại môi trường cơ bản: MS, YEP Các hoa chất cơ bản: BAP, IAA, GA3

2 2 Nội dung nghiên cứu Đề tài nghiên cứu gồm 6 nội dung:

Nội dung 1: Thiết kế hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 nhằm gây tạo đột biến gen GmGOLS trên đậu tương

Nội dung 2: Phát triển hệ thống cảm ứng rễ tơ thông qua vi khuẩn A

Rhizogenes trên một số giống đậu tương Việt Nam, kiểm tra hoạt động của cấu trúc chuyển gen và chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9

Nội dung 3: Tạo cây đậu tương mang đột biến gen mã hóa Galactinol synthase thông qua hệ thống CRISPR/Cas9

Phân tích sự di truyền của các đột biến định hướng và gen chuyển là cần thiết để hiểu rõ hơn về cơ chế di truyền trong cây trồng Đồng thời, việc nghiên cứu sinh trưởng, phát triển và thành phần hạt của các dòng đậu tương mang đột biến định hướng giúp xác định những đặc điểm ưu việt, từ đó cải thiện năng suất và chất lượng sản phẩm nông nghiệp.

Nội dung 6: Kiểm tra đột biến ngoài định hướng và lựa chọn dòng đột biến tiềm năng không mang gen chuyển

2 3 1 Thiết kế vector chuyển gen mang hệ thống CRISPR/Cas9

Nghiên cứu về trình tự và biểu hiện gen Galactinol synthase đã xác định hai gen mã hóa enzyme này có mức độ biểu hiện cao trong hạt đậu tương, dựa trên dữ liệu từ NCBI, Phytozome và SoyKB Sử dụng các công cụ tin sinh học như CRISPR-PLANT và CRISPR Design Tool, các trình tự định hướng (sgRNAs) đã được xác định theo phương pháp của Vibha Srivastava và cộng sự (2017) Từ đó, 2-3 trình tự định hướng tối ưu với độ tương đồng cao trên hai gen quan tâm sẽ được thiết kế để tạo ra khung vector chuyển gen thực vật chứa gen Galactinol synthase.

Cas9 nhận được từ nguồn Addgene

- Các cấu trúc bao gồm trình tự định hướng sgRNA của gen mã hoá cho enzyme

Galactinol synthase và promoter U6 (Arabidopsis U6 promoter) được kết nối sử dụng hệ thống cloning vector (NEB® Golden Gate Assembly Kit -BsaI-HF®v2)

Các cấu trúc định hướng và promoter U6 được kết hợp vào vector chuyển gen pFGC-Cas9 thông qua hệ thống pFGC-Cas9-gateway, do phòng thí nghiệm của giáo sư Stacey tại đại học Missouri, Mỹ cung cấp.

Bước đầu tiên trong quy trình là ghép nối phân đoạn gen biểu hiện Cas9, bao gồm 35S promoter, Cas9 và Nos terminator, từ vector HBT-proCas9 sang vector đích pFGC5941 (-) Quá trình này được thực hiện thông qua các phản ứng cắt và nối ghép gen tại vị trí của các enzyme cắt hạn chế XhoI và EcoRI, tạo ra vector pFGC5941(-)/Cas9.

Bước 2: Sử dụng phản ứng overlap PCR để khuếch đại các phân đoạn phiên mã của gRNAs, bao gồm PstI/U6 promoter-gRNA1-gRNA scaffold/EcoRI và EcoRI/U6 promoter-gRNA2-gRNA scaffold/PstI, với khuôn là vector pBlu-gRNA và các cặp mồi được chỉ định trong bảng phụ lục 1.

Bước 3: Nối ghép đồng thời 2 phân đoạn phiên mã 2 gRNA vào vector pFGC5941(-)/Cas9 tạo thành vector hoàn chỉnh pFGC5941(-) /Cas9/gRNA1/gRNA2

+ Xử lý vector pFGC5941(-)/Cas9 bằng PstI

+ Xử lý đồng thời 2 phân đoạn PstI/U6 promoter-gRNA1-gRNA scaffold/EcoRI và EcoRI/U6 promoter-gRNA2-gRNA scaffold/PstI bằng cặp enzyme hạn chế PstI và EcoRI

Tiến hành phản ứng ligation với sự xúc tác của enzyme T4-DNA ligase để nối ghép vector pFGC5941(-)/Cas9 đã được mở vòng cùng với hai phân đoạn gRNA đã qua xử lý bằng enzyme cắt hạn chế.

Sơ đồ thiết kế của vector chuyển gen hoàn chỉnh được mô phỏng như Hình 3 4

Sau khi hoàn thiện, vector chỉnh sửa gen sẽ được chuyển vào chủng vi khuẩn A rhizogenes và A tumefaciens AGL1, theo phương pháp sốc nhiệt do David Neece (2013) cung cấp, từ phòng Công nghệ tế bào thực vật.

2 3 2 Cảm ứng rễ tơ thông qua vi khuẩn A rhizogenes

Hệ thống rễ tơ được phát triển trong điều kiện in vitro nhằm tối ưu hóa quy trình cảm ứng tạo rễ tơ trên cây đậu tương Mục đích của nghiên cứu này là kiểm tra hoạt động của cấu trúc chuyển gen và đánh giá hiệu quả chỉnh sửa gen thông qua công nghệ CRISPR/Cas9.

Tên môi trường Thành phần

The article outlines the preparation of growth media for plant tissue culture, specifically using Murashige and Skoog (MS) medium, which consists of 20 g/l sucrose and 3 g/l phytagel at a pH of 5.6 Additionally, it describes the cultivation of YEP (Yeast Extract Peptone) medium, incorporating 12 g/l Bacto agar and antibiotics such as streptomycin, spectinomycin, and kanamycin at a concentration of 500 mg/l, with a pH of 7.0 Lastly, it mentions the contamination control using MS medium with 20 g/l sucrose at a pH of 5.6.

Nuôi cấy phát sinh rễ tơ (ICM) được thực hiện với môi trường MS, bao gồm 30 g/l sucrose, 3,0 g/l phytagel và kháng sinh cefotaxime với nồng độ 500 mg/l, pH được điều chỉnh ở mức 5,6 Để chọn lọc rễ tơ, môi trường MS cũng được sử dụng với 30 g/l sucrose, 3,0 g/l phytagel, kháng sinh cefotaxime ở nồng độ từ 250-500 mg/l và glufosinate với nồng độ 1-3 mg/l.

Bảng 2 1 Thành phần các loại môi trường trong nuôi cấy tạo rễ tơ in vitro đậu tương

Quy trình chuyển gen tạo rễ tơ theo phương pháp nốt lá mầm được phát triển dựa trên nghiên cứu của Chen và cộng sự (2018), với những điều chỉnh về thành phần môi trường sử dụng, như được trình bày trong Bảng 2.1.

- Chuẩn bị nguyên liệu biến nạp