ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH ĐỀ TÀI: KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH TRÍCH LY ANTHOCYANIN TỪ BÃ BỤP GIẤM ĐỀ TÀI: KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH TRÍCH LY ANTHOCYANIN TỪ BÃ BỤP GIẤM KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH TRÍCH LY ANTHOCYANIN TỪ BÃ BỤP GIẤM
TỔNG QUAN
TỔNG QUAN VỀ CÂY BỤP GIẤM
Tên khoa học: Hibiscus sabdariffa Linn
Tên thường gọi: Atiso đỏ, , hoa vô thường, bụp giấm, hoa lạc thần, cây me chua, lạc tể quỳ, me chua đỏ, mai côi gia
Tên đồng nghĩa: Sabdariffa rubra, Abelmoschus cruentus, Hibiscus gossypiifolius, Hibiscus digitatus
1.1.2 Hình thái, đă ̣c điểm sinh trưởng
Bụp giấm là cây thân thảo cao khoảng 1,5 – 2m, mọc thành bụi nhỏ với thân mịn gần như nhẵn và rễ ăn sâu vào đất Cây có màu thân xanh lá hoặc đỏ thẫm, ra hoa từ tháng 7 đến tháng 10 hàng năm với hoa đơn độc có đường kính 8 - 10cm, màu vàng hoặc màu da bò, chuyển sang màu hồng vào cuối ngày Lá cây có màu xanh với gân đỏ, cuống dài 7,5 – 12,5cm, hình trứng và mép răng cưa Quả có lông nhung, màu xanh lá khi chưa trưởng thành, chia thành các van chứa từ 3-4 hạt màu nâu, tách ra khi quả chín và khô.
Hoa là một trong những loài cây phổ biến nhất, thích nghi tốt với khí hậu cận nhiệt đới và nhiệt đới Chúng phát triển mạnh trong đất tơi xốp, đặc biệt là đất thịt pha cát và một ít mùn, nhưng vẫn có khả năng sinh trưởng ở vùng đất khô cằn Hoa có thể chịu được nhiệt độ cao và khí hậu ẩm ướt, với nhiệt độ ban đêm không xuống dưới 21°C, nhưng dễ chết khi nhiệt độ quá thấp, có băng và sương muối (Robert, 2005).
Bụp giấm là loài cây trồng phổ biến ở các vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới như Malaysia, Việt Nam, và Thái Lan Xuất xứ từ Angola, cây đã lan rộng sang Ấn Độ, Philippines, và Trung Mỹ, hiện nay được trồng thương mại tại Malaysia Tại Việt Nam, bụp giấm chủ yếu được trồng ở các tỉnh miền Trung, thích hợp với đất đồi núi và trung du Cây được thử nghiệm trồng để phủ đất trống ở Đồng Nai, Ba Vì, Thái Nguyên và không đòi hỏi kỹ thuật chăm sóc cao, nên thường được trồng xen canh với các cây trồng chủ lực như lúa, mè, ngô, và đậu.
1.1.4 Giá tri ̣ sử du ̣ng của cây bu ̣p giấm
Theo các nghiên cứu khoa học, hoa bụp giấm mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe và hiện đang được ứng dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm và dược phẩm.
Hạ huyết áp: kết quả nghiên cứu của Herrera và cộng sự (Herrera-Arellano và cộng sự,
Nghiên cứu năm 2004 cho thấy việc uống 10g đài hoa bụp giấm khô hãm với 519ml nước nóng mỗi ngày trước bữa sáng trong bốn tuần liên tiếp giúp giảm huyết áp tâm thu 11% và huyết áp tâm trương 12,5%.
Bảo vệ gan là một vấn đề quan trọng, và nghiên cứu cho thấy dịch chiết nước và anthocyanin (200mg/kg) từ đài hoa bụp giấm có khả năng giảm men gan ALS và AST ở bệnh nhân rối loạn chuyển hóa Ngoài ra, dịch chiết ethanol cũng cho thấy hiệu quả tích cực trong việc hỗ trợ sức khỏe gan.
3 giảm đáng kể peroxide lipid trên mô hình hoại tử gan bằ ng carbon tetracholorid (Dahiru và cộng sự, 2003)
Bụp giấm có khả năng ức chế enzyme alpha-glucoside và alpha-amylase, giúp điều chỉnh chuyển hóa carbohydrate trong cơ thể Nghiên cứu cho thấy, trên mô hình tăng đường huyết do streptozotocin hoặc alloxan, việc uống 100 - 200mg/kg/ngày có thể giảm nồng độ glucose trong máu từ 60 đến 65%.
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các chế phẩm từ cây bụp giấm, như đài hoa khô, dịch chiết cồn, viên nang và trà, có tác dụng giảm cholesterol toàn phần từ 7,6 - 26%, giảm LDL-C từ 8 - 32%, giảm triglyceride từ 23 - 48%, và tăng HDL-C từ 10 - 16,7% sau thời gian thử nghiệm từ 1 - 3 tháng Bên cạnh đó, bụp giấm còn có tác dụng chống viêm, sưng và tăng cường chức năng tiêu hóa Ở Ai Cập và Sudan, hoa bụp giấm được sử dụng như một loại thức uống giúp giảm nhiệt độ cơ thể trong thời tiết nóng và hỗ trợ điều trị các bệnh về tim mạch Trong y học dân gian Châu Phi, hoa bụp giấm được dùng để trị các bệnh như chống co thắt, lợi tiểu và trị giun sán Tại một số khu vực Bắc Phi, hoa bụp giấm còn được sử dụng để trị ho và đau họng, trong khi bột lá được dùng để chữa vết thương ngoài da.
Cây bụp giấm không chỉ được sử dụng trong thực phẩm và dược phẩm mà còn có thể làm cây hoa cảnh để trang trí Với điều kiện khí hậu thuận lợi ở nước ta, cây bụp giấm có thể được trồng trong vườn nhà để lấy hoa làm trà và làm thuốc sử dụng.
1.1.5 Thành phần hóa ho ̣c của hoa bu ̣p giấm
Hoa búp giấm là loại cây có giá trị dinh dưỡng cao, chứa khoảng 1,5% anthocyanin, 15-30% acid hữu cơ và nhiều vitamin như A, B1, B2, C, E Ngoài ra, cây còn cung cấp nhiều khoáng chất cần thiết như sắt, kẽm, và magiê Thành phần dinh dưỡng chủ yếu tập trung ở đài hoa.
Sau khi thu hoạch, hoa búp giấm chỉ lấy phần đài hoa màu đỏ, loại bỏ các hạt và cánh hoa Màu đỏ từ đài hoa búp giấm không chỉ mang lại hương vị độc đáo mà còn được sử dụng trong thực phẩm, làm tăng tính cảm quan cho sản phẩm.
Ở một số nơi, đài hoa được sử dụng để chế biến mứt, đồ uống và bánh ngọt Không chỉ được ứng dụng trong thực phẩm, đài hoa còn có nhiều công dụng hữu ích khác.
Đài hoa bụp giấm mang lại nhiều lợi ích, bao gồm giảm triệu chứng viêm phế quản, tiêu chảy và ho (Chewonarin và cộng sự, 1999) Theo nghiên cứu của Duke và cộng sự, trong 100g đài hoa có chứa 85% độ ẩm, 1,9g protein, 2,3g chất xơ, 1,2g tro, 0,1g chất béo, 2,85mg vitamin D, 0,5mg vitamin B và 14mg acid ascorbic Ngược lại, đài hoa khô chứa từ 280-360mg acid ascorbic/100g (Mat Isa và cộng sự, 1985), cho thấy hàm lượng acid ascorbic ở hoa bụp giấm cao hơn cam và ổi Ngoài ra, theo Morton (1987), đài hoa bụp giấm khô còn chứa các flavonoid như gosypetine và daretine, cùng với các sắc tố như anthocyanin, delphinidin, cyanidin và hibiscin.
Các hợp chất chủ yếu trong hoa bu ̣p giấ m:
Anthocyanin là hợp chất tạo ra màu sắc cho thực vật ở các pH khác nhau, bao gồm đỏ, cam, vàng và hồng Trong hoa búp giấm, anthocyanin chủ yếu gồm delphidin-3-glucoside, cyanidin-3-sambubiosid, cyanidin-3-glucoside và một số sắc tố khác Khi anthocyanin mất nhóm đường, nó được gọi là anthocyadin hoặc aglycon.
Gossypetin: là mô ̣t loa ̣i flavonoid Hợp chất này được chiết xuất từ hoa bu ̣p giấ m nó có tính kháng khuẩn cao
Quercetin là một sắc tố thực vật có nguồn gốc từ flavone, nổi bật với khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ Nó được biết đến như một chất ức chế tính thẩm thấu mạch, có tác dụng chống viêm và kháng khuẩn hiệu quả.
Tổng quan về Anthocyanin
Anthocyanin là nhóm chất màu tự nhiên hòa tan trong nước có mặt trong thực vật, góp phần tạo ra nhiều màu sắc phong phú như cam, hồng và đỏ.
Anthocyanin là một loại sắc tố thực vật có màu sắc đa dạng, thường xuất hiện trong các gam màu trung gian Khi mất hết các nhóm đường, anthocyanin được gọi là anthocyanidin hay aglycon Mỗi anthocyanin có khả năng bị glycosyl hóa acylate bởi các axit và loại đường khác nhau tại các vị trí nhất định, dẫn đến hàm lượng anthocyanin thường cao hơn từ 15 đến 20 lần so với anthocyanidin.
1.2.2 Cấu trú c hóa ho ̣c của Anthocyanin
Anthocyanins có sự đa dạng tự nhiên dựa trên cấu trúc của anthocyanidin, tạo ra nhiều màu sắc khác nhau từ sự kết hợp của anthocyanidin C-6-C-3-C-6 với đường và các nhóm acyl Để hình thành anthocyanin, anthocyanidin cần kết hợp với ít nhất một phân tử đường, dẫn đến việc phân loại anthocyanin theo số lượng phân tử đường (như monoside, biosides, triosides) Sự đa dạng này còn phụ thuộc vào các loại đường như galactose, arabinose, glucose, rhamnose, xylose và fructose, cùng với sự kết hợp hóa học với các acid hữu cơ như coumaric, synapic và caffeic để tạo ra anthocyanin acyl hóa Màu sắc của anthocyanin cũng bị ảnh hưởng bởi số lượng nhóm methoxyl và hydroxyl; nhiều nhóm hydroxyl sẽ tạo màu xanh, trong khi nhiều nhóm methoxyl sẽ làm tăng màu đỏ Ngoài ra, màu sắc còn phụ thuộc vào sự tương tác giữa các phân tử anthocyanin với môi trường xung quanh.
Anthocyanin rất hiếm gặp ở trạng thái tự do trong tự nhiên, do nhóm hydroxyl tự do tại vị trí C-3 làm cho phân tử này trở nên không ổn định và giảm khả năng hòa tan Do đó, sự glycosyl hóa thường xảy ra tại vị trí nhóm 3-hydroxy Nếu có thêm một phân tử đường, vị trí glycosyl hóa tiếp theo thường gặp là C-5, ngoài ra cũng có thể xảy ra ở các vị trí khác như C-7, C-3’ và C-5’.
Cấu trúc của anthocyanin dựa trên bộ khung C15, bao gồm một vòng chromane và một vòng thơm thứ hai B ở vị trí 2 Các cấu trúc này được sắp xếp theo mẫu C-6-C-3-C-6 (phenyl-2-benzopyrilium) Anthocyanin được bổ sung bởi một hoặc nhiều phân tử đường liên kết tại các vị trí hydroxyl hóa khác nhau của cấu trúc cơ bản, dẫn đến việc anthocyanin được thay thế bằng glycoside của muối phenyl-2-benzopyrilium (anthocyanidin) (Harborne và cộng sự, 2013).
Bảng 1 1: Sự phu ̣ thuô ̣c màu sắc anthocyanin vào vi ̣ trí và nhóm thế thế
Tên hợp chất Nhó m thế Vi ̣ trí Màu sắ c
Cyanidin 3, 5, 7, 3’, 4’ Đỏ tươi và đỏ thẫm
Delphynidin 3, 5, 7, 3’, 4’, 5’ Tím, tím nha ̣t, xanh 8-Hydroxycyanidin 3, 5, 6, 7, 3’, 4’, Đỏ
Pelargonidin 3, 5, 7, 4’ Cam, cam hồng
Hình 1 2: Cấu trú c của mô ̣t số Anthocyanins
1.2.3 Sự phân bố của Anthocyanins
Anthocyanin là một hợp chất tạo ra nhiều màu sắc từ đỏ tươi đến xanh, xuất hiện rõ rệt trong hoa, trái cây, lá và các cơ quan lưu trữ của cây Mặc dù anthocyanin không có ở một số thực vật bậc thấp như rêu tản và tảo, nhưng nó thường gặp ở thực vật bậc cao Trong tự nhiên, có những thực vật chứa một loại anthocyanin chính như hoa trà my và nhân sâm, trong khi những thực vật khác có hỗn hợp anthocyanin như giống hoa thược dược và củ cải đường Nồng độ anthocyanin trong hầu hết các loại trái cây và rau quả dao động từ 0.1% đến 1% trọng lượng khô.
Anthocyanin là hợp chất tập trung chủ yếu ở các cây hạt kín và thực vật có hoa, thường có mặt ở hoa, quả, lá và rễ Trong các loài thực vật này, anthocyanin chủ yếu được tìm thấy ở lớp tế bào bên ngoài như biểu bì Hợp chất này xuất hiện rộng rãi trong ít nhất 27 họ và 73 loài, thường có trong các loại rau quả có màu đỏ, xanh và tím như dâu tây, bắp cải và nho.
Bảng 1 2: Anthocyanins trong một số loại cây
Cây Thành phần anthocyanin
Hành tím Cyanidin 3-glucoside và 3-laminariobioside, không acyl hóa và acyl hóa với malonyl ester, cyanidin 3-galactose và 3-glucoside; peonidin 3- glucoside
Quả sung Cyanidin 3-glucoside, 3-rutinoside và 3,5-diglucoside, pelargonidin
3- rutinoside Dâu tây Pelargonidin và Cyanidin 3-glucosides
Nho Cyanidin, peonidin, delphinidin, petunidin và malvidin mono và diglucosides, tự do và acyl hóa
Mận Cyanidin và peonidin 3-glucosides và 3-rutinosides
Cyanidin và peonidin 3-galactosides, 3-arabinosides và 3-glucosides
Cy và Pn 3-sophoroside-5–5-glucosides acyl hóa với ester feruloyl và caffeoyl
Anthocyanin là các chất hòa tan trong nước, xuất hiện tự nhiên và giúp thực vật chống lại tia cực tím, thu hút côn trùng để thụ phấn và phát tán hạt (R E Wrolstad, 2004) Một số anthocyanin như cyanidin-3-glucoside còn có chức năng kiểm soát sinh học, ức chế sự phát triển của ấu trùng Heliothis viriscens trong cây thuốc lá (Harborne, 1988) Chúng đã được sử dụng trong chế độ ăn uống của con người từ xa xưa và ngày càng được quan tâm hơn nhờ vào những lợi ích sức khỏe mà chúng mang lại (Bridle và Timberlake, 1997).
Mặc dù anthocyanin chỉ được hấp thu một lượng nhỏ vào cơ thể, nhưng chúng có tác dụng bảo vệ và chống lại nhiều loại bệnh như ung thư, xơ vữa động mạch, các bệnh về tim mạch, và viêm Các hợp chất này giảm mức độ thẩm thấu, thúc đẩy sự tạo thành cytokine để điều hòa các phản ứng miễn dịch, đồng thời ức chế sự đông tụ của tiểu huyết cầu Tất cả những hoạt tính này đều dựa trên khả năng chống oxy hóa của anthocyanin Ngoài ra, anthocyanin còn giúp bảo vệ màng dạ dày khỏi tổn thương và phòng tránh một số bệnh về đường ruột và hệ tiêu hóa.
Hoạt tính chống oxy hóa
Anthocyanin có khả năng ức chế các gốc tự do, vì vậy được xem là hợp chất chống oxy hóa hiệu quả (Wrolstad, 2004) Hầu hết các lợi ích về sức khỏe liên quan đến anthocyanin đều gắn liền với cơ chế chống oxy hóa của chúng (Kong và cộng sự, 2003) Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra cơ chế chống oxy hóa của anthocyanin, khẳng định vai trò quan trọng của chúng trong việc bảo vệ sức khỏe.
Ngăn chă ̣n các gốc hoạt động bằng cách cho hydro
Chelate các ion kim loại xúc tác cho các phản ứng oxy hóa
Liên kết với các protein, tạo phức chất bền
Hoạt tính chống ung thư
Nghiên cứu cho thấy các hợp chất anthocyanin có khả năng giảm sự tăng trưởng của tế bào và ức chế đáng kể sự hình thành khối u Một số nghiên cứu đã chỉ ra khả năng chống ung thư tiềm năng của anthocyanin.
Các hợp chất anthocyanin có trong bắ p cải tím và khoai lang ức chế ung thu ruột kết ở chuột
Các aglycon trong anthocyanin như cyanidin, malvidin và delphinidin có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư ở dạ dày, ruột kết, phổi và lồng ngực Nghiên cứu của Mahadevan và Kamboj (2009) đã chỉ ra tác dụng tiềm năng của các hợp chất này trong việc hỗ trợ phòng ngừa ung thư.
1.2.5 Cá c yếu tố ảnh hưởng đến chiết xuất anthocyanin
Anthocyanin là chất màu có độ bền kém, chỉ duy trì tính bền trong môi trường acid và dễ bị phân hủy thành dạng không màu hoặc màu nâu cùng với các sản phẩm không tan Cường độ và độ bền màu của anthocyanin phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm thành phần cấu trúc, nồng độ chất màu, pH, nhiệt độ, ánh sáng, sự hiện diện của các chất màu khác, ion kim loại, enzyme, oxy, vitamin, đường và SO2.
Anthocyanin trong môi trường nước hoạt động như một chất chỉ thị pH, thể hiện màu sắc khác nhau tùy thuộc vào độ pH Cụ thể, ở pH thấp, anthocyanin có màu đỏ, chuyển sang màu đỏ xanh ở pH trung gian và không màu khi pH cao Khi pH dưới 2,0, anthocyanin chủ yếu tồn tại dưới dạng cation với màu đỏ hoặc vàng Khi pH tăng, proton bị mất và màu sắc chuyển sang xanh dương hoặc đỏ.
Cấu trúc hóa học của các hợp chất ảnh hưởng đến cường độ và độ bền màu, điều này phụ thuộc vào vị trí và số lượng các nhóm methoxyl, đường, hydroxyl và các đường acyl hóa Khi số lượng nhóm hydroxyl tăng lên, sự dịch chuyển về phía bước sóng dài hơn sẽ xảy ra, dẫn đến sự thay đổi màu sắc từ cam sang xanh dương (Cúc, 2015).
Ti ̀nh hình nghiên cứu trong và trên thế giới
Với nhiều lợi ích và công dụng nổi bật, việc chiết xuất anthocyanin từ đài hoa bụp giấm hiện đang thu hút sự quan tâm và nghiên cứu của các nhà khoa học trên toàn cầu.
Năm 2014, nghiên cứu của Abbas Hemmati Kakhki và cộng sự (Khazaei và cộng sự, 2016) đã tối ưu hóa quá trình chiết xuất anthocyanin từ cánh hoa nghệ tây bằng phương pháp phản ứng bề mặt Các điều kiện chiết xuất tối ưu được xác định với dung môi etanol có tính acid, với tỉ lệ dung môi trên mẫu từ 20 đến 80ml, tỉ lệ phần trăm etanol từ 75 đến 25%, và nhiệt độ từ 25 đến 45 độ C Phương pháp này nhằm tạo ra lượng anthocyanin cao nhất Các thí nghiệm được thiết kế dựa trên phương pháp Benken với bốn biến độc lập, cho thấy nhiệt độ ảnh hưởng đến lượng anthocyanin chiết xuất lên đến 95% Kết quả cho thấy tỉ lệ dung môi 20 mg/lít, ethanol 25,02%, nhiệt độ 25,8 độ C và thời gian chiết là 24 giờ.
Hình 1 5: Sơ đồ Jurd đối vớ i phản ứng thuâ ̣n nghi ̣ch giữa SO 2 và anthocyanin
12 điều kiê ̣n chiết tối ưu Với điều kiê ̣n tối ưu trên thì 1609,11 mg trên mô ̣t lít di ̣ch chiết từ cánh hoa nghê ̣ tây
Nghiên cứu của J.E Cacace và G Mazza (1993) cho thấy việc tối ưu hóa chiết xuất anthocyanin từ quả nho đen bằng dung dịch nước ethanol đã nâng cao năng suất và hoạt động chống oxy hóa Tỷ lệ dung môi so với chất rắn là yếu tố quan trọng nhất trong quá trình chiết xuất phenol, với tổng số phenol tăng lên khoảng 60% khi nồng độ ethanol đạt mức tối đa, sau đó giảm khi nồng độ dung môi tăng thêm Nhiệt độ cũng ảnh hưởng đến chiết xuất anthocyanin; khi nhiệt độ vượt quá 30-35 độ C, anthocyanin bắt đầu phân hủy, dẫn đến giảm năng suất Tuy nhiên, sự thay đổi trong thành phần chiết xuất không đủ lớn để ảnh hưởng đến hoạt động chống oxy hóa.
Năm 2012, Nguyễn Thị Lan và cộng sự đã nghiên cứu chiết xuất anthocyanin từ đài hoa bụp giấm để sản xuất giấy chỉ thị phát hiện nhanh hàn the trong thực phẩm Tác giả sử dụng dung môi etanol và nước (tỷ lệ 50:50) với 1% HCl, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu là 14 ml/1 gam, và thời gian chiết là 6 ngày Kết quả cho thấy giấy chỉ thị này có khả năng phát hiện hàn the với ngưỡng tối thiểu tốt hơn so với giấy nghệ, mở ra nhiều ứng dụng cho chất màu từ thực vật trong ngành thực phẩm.
Nghiên cứu của Kiều Thị Nhi và cộng sự (2020) về quy trình chiết tách anthocyanin từ hành tím, hành lá, tỏi tía, cần tây và cần ta đã xác định được điều kiện tối ưu để thu được sản phẩm có hàm lượng anthocyanin cao nhất Sử dụng phương pháp pH vi sai, nhóm nghiên cứu đã tìm ra rằng dung môi ethanol/nước 50/50 bổ sung 1% HCl, với tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là 15/1 (v/w) và thời gian chiết tách là 3 ngày là điều kiện lý tưởng Ngoài ra, nghiên cứu cũng mở rộng phạm vi sang tỏi tía, cần tây, hành lá và cần ta, trong đó thời gian chiết tách anthocyanin ở tỏi tía tương tự như hành tím, là 2 ngày.
Cò n ở cần tây, cần ta và hành lá là 3 ngày; cùng hê ̣ dung môi như trên với tỉ lê ̣ dung
13 môi/ nguyên liệu lần lượt là 10/1 Mu ̣c đích của nghiên cứu nhằ m thu nhâ ̣n chế phẩm anthocyanin đa ̣ng bô ̣t để ứng du ̣ng trong thực phẩm
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu
Bã hoa bụp giấm được thu thập từ phòng thí nghiệm, sau đó được rửa sạch và sấy khô ở nhiệt độ 70°C trong 16 giờ cho đến khi độ ẩm còn dưới 5% Tiếp theo, bã được xay nhỏ và lọc qua rây có kích thước 4mm (Linh và cộng sự, 2019) Các hóa chất sử dụng trong quá trình này bao gồm ethanol, đệm kali clorua pH=1, và đệm acetat pH=4,5.
Thiết bị và dụng cụ: Ống ly tâm, ống nghiệm, tủ ấm, tủ sấy, máy ly tâm,…
Phương pháp nghiên cứu
Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến quá trình tách chiết Anthocyanin Chuẩn bị mẫu nguyên liệu
Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình tách chiết
Hình 2 1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm
2.2.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến quá trình tách chiết anthocyanin từ bã bụp giấm
Dung môi dùng tách chiết anthocyanin là ethanol với các nồng độ: 20°, 40°, 60°, 80°,
Trong một nghiên cứu được thực hiện bởi Nhi và cộng sự (2020), thí nghiệm đã được tiến hành ở nhiệt độ phòng với tỷ lệ bã bụp giấm và ethanol là 1:10 Thời gian chiết xuất được thiết lập là 120 phút, như đã chỉ ra trong nghiên cứu của Nguyễn và Trần (2019).
Cho 25g bã bụp giấm vào 5 bình tam giác 250 ml, thêm 50ml ethanol với các nồng độ 20°, 40°, 60°, 80°, 98° vào từng bình và đậy kín, để ở nhiệt độ phòng trong 120 phút Sau đó, ly tâm ở 5000 vòng/phút trong 15 phút để thu dịch, bổ sung dung dịch đệm pH 1 và pH 4,5, rồi xác định hàm lượng Anthocyanin bằng phương pháp pH vi sai Thí nghiệm được lặp lại 3 lần để chọn nồng độ ethanol có hàm lượng anthocyanin cao nhất cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian chiết đến quá trình tách chiết anthocyanin từ bã bụp giấm
Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết xuất từ 60 phút đến 180 phút đến khả năng trích ly anthocyanin nhằm xác định khoảng thời gian tối ưu cho hiệu suất trích ly cao nhất Tiến hành thí nghiệm để thu thập dữ liệu và phân tích kết quả.
Cho 25g bã bụp giấm vào 5 bình tam giác 250 ml, thêm 50ml dung môi ethanol với nồng độ đã xác định Đậy kín và để ở nhiệt độ phòng trong các khoảng thời gian 60, 90, 120, 150 và 180 phút Sau đó, ly tâm ở 5000 vòng/phút trong 15 phút để thu dịch, bổ sung dung dịch đệm pH 1 và pH 4,5, rồi xác định hàm lượng Anthocyanin bằng phương pháp pH vi sai Thí nghiệm được lặp lại 3 lần để đảm bảo độ chính xác.
Các phương pháp sinh hóa sử dụng trong đề tài
Xác định hàm lượng anthocyanin bằng phương pháp pH vi sai (Wrolstad, 1976)
Chất màu anthocyanin có khả năng thay đổi theo pH, với sự chuyển đổi giữa các dạng khác nhau Ở pH 1,0, anthocyanin tồn tại dưới dạng oxonium hoặc flavium với độ hấp thụ cực đại, trong khi ở pH 4,5, chúng chuyển sang dạng carbinol không màu Để xác định hàm lượng sắc tố anthocyanin, cần đo mật độ quang của mẫu tại pH 1,0 và pH 4,5 ở bước sóng hấp thụ cực đại, so sánh với độ hấp thụ tại bước sóng 700 nm.
𝑔×𝑙 (g) Trong đó: a: hàm lượng Anthocyanin, (g)
A: Mật độ quang, A = {(𝐴𝜆Max,pH=1 − 𝐴𝜆700,pH=1) − (𝐴𝜆Max,pH=4,5 − 𝐴𝜆700,pH=4,5)}
𝐴𝜆520,pH=1,0, 𝐴𝜆700,pH=4,5: Độ hấp thụ tại bước sóng cực đại 520 nm và 700 nm ở pH 1,0 và pH 4,5
M: Khối lượng phân tử của Anthocyanin (g/mol), M = 449,2 (g/mol)
V: Thể tích dịch chiết, (lít)
𝑔: Hệ số hấp thụ phân tử, 𝑔= 26900 (mol -1 cm -1 )
L: Là chiều dày cuvet (1 cm)
Phần trăm Anthocyanin toàn phần:
𝑚×(100−𝑤)×10 −2 × 100 Trong đó: a: Lượng Anthocyanin (g) m: Khối lượng nguyên liệu ban đầu (g) w: Độ ẩm nguyên liệu (%)
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến khả năng trích ly anthocyanin từ bã bụp giấm
Anthocyanin là một hợp chất phân cực, do đó nó dễ dàng tan trong các dung môi phân cực Việc chọn lựa dung môi phù hợp để chiết xuất anthocyanin không chỉ giúp đạt được hàm lượng cao mà còn giữ cho màu sắc của nó bền lâu hơn Để tìm ra nồng độ dung môi cồn tối ưu, cần xác định hàm lượng anthocyanin bằng phương pháp pH vi sai, với kết quả được trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1 trình bày phần trăm anthocyanin trong dịch chiết với các nồng độ dung môi khác nhau Các ký hiệu a, b, c theo sau giá trị trung bình trong cùng một cột cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nghiệm thức với mức ý nghĩa P≤0,05.
STT Nồng độ cồn % Anthocyanin toàn phần
Ph ần t ră m An th ocya ni n to àn p hầ n (% )
Hình 3 1: Biểu đồ thể hiện phần trăm Anthocyanin trong dịch chiết với các nồng độ dung môi khác nhau
Kết quả từ bảng 3.1 cho thấy phần trăm anthocyanin tăng lên 0,864% khi sử dụng nồng độ dung môi 60% Tuy nhiên, giá trị này giảm xuống 0,729% ở nồng độ dung môi 80% và đạt mức thấp nhất là 0,352% khi sử dụng nồng độ cồn 99%.
Anthocyanin là một hợp chất hữu cơ đa vòng có khả năng hòa tan tốt trong dung môi hữu cơ như ethanol, do đó khi nồng độ ethanol tăng, lượng anthocyanin chiết xuất cũng gia tăng Tuy nhiên, với nhóm chức OH-, anthocyanin cũng có khả năng hòa tan trong nước và các dung môi phân cực khác Khi nồng độ ethanol quá cao, tính phân cực của hệ dung môi giảm, dẫn đến khả năng hòa tan anthocyanin cũng bị giảm Vì vậy, hàm lượng anthocyanin thu được tăng khi nồng độ ethanol tăng lên, đạt đỉnh tại nồng độ 60°, sau đó giảm xuống.
Ethanol 60° là nồng độ lý tưởng để chiết xuất anthocyanin từ bã bụp giấm Nghiên cứu của Ghasemzadeh và cộng sự (2018) chỉ ra rằng nồng độ dung môi 6 ethanol/ 4 nước mang lại hiệu quả tách chiết flavonoid cao nhất từ gạo lức và gạo huyết rồng Kết quả này cũng tương đồng với nghiên cứu của Bae và cộng sự (2017), trong đó nồng độ ethanol 50,78% (v/v) được xác định là tối ưu cho quá trình chiết xuất anthocyanin từ gạo đen và ảnh hưởng của nó đến khả năng tiêu hóa trong ống nghiệm.
Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng trích ly anthocyanin từ bã bụp giấm
Bã bụp giấm được ngâm trong ethanol 60° với tỷ lệ 1:10 và để ở nhiệt độ phòng trong các khoảng thời gian 30, 60, 90, 120 và 150 phút Kết quả thí nghiệm được trình bày chi tiết trong bảng 3.2 và hình 3.2.
Bảng 3 2: Phần trăm anthocyanin trong dịch chiết với các thời gian chiết khác nhau
STT Thời gian chiết % Anthocyanin toàn phần
19 a, b, c, d theo sau giá trị trung bình trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt giữa các nghiệm thức với mức ý nghĩa P≤0,05
Qua kết quả ở bảng 3.2 ta thấy phần trăm Anthocyanin thấp nhất là 0,441% ở 30 phút, tăng dần đến 0,904% ở 90 phút, sau đó giảm xuống
Thời gian chiết xuất anthocyanin là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất thu được Nghiên cứu cho thấy, sau 30 phút, dung môi chưa hòa tan hết anthocyanin, dẫn đến tỷ lệ thu hồi thấp Khi thời gian chiết xuất được tăng lên, tỷ lệ anthocyanin thu được tăng cao nhất ở 90 phút, sau đó giảm dần ở các mốc 120 phút và 150 phút Jaafar NF và cộng sự (2020) cũng xác nhận rằng thời gian tối ưu để tách chiết anthocyanin là 90 phút.
Thời gian trích ly đóng vai trò quan trọng trong việc chiết xuất anthocyanin Nếu thời gian trích ly quá ngắn, dung môi sẽ không hòa tan hết anthocyanin có trong nguyên liệu Ngược lại, nếu thời gian quá dài, chất lượng sản phẩm sẽ bị ảnh hưởng do dung môi có thể hòa tan các hợp chất không mong muốn Hơn nữa, thời gian trích ly kéo dài cũng có thể làm giảm lượng anthocyanin thu được, vì anthocyanin dễ bị phân hủy khi tiếp xúc với không khí và ánh sáng trong thời gian dài.
Ph ần t ră m An th ocya ni n to àn p hầ n (% )
Thời gian trích ly (phút)
Hình 3 2: Biểu đồ thể hiện phần trăm Anthocyanin trong dịch chiết với các thời gian chiết khác nhau