KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA VÀ ỨC CHẾ ENZYME TYROSINASE CỦA CÂY DỨA (Ananas comosus).KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA VÀ ỨC CHẾ ENZYME TYROSINASE CỦA CÂY DỨA (Ananas comosus).KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA VÀ ỨC CHẾ ENZYME TYROSINASE CỦA CÂY DỨA (Ananas comosus).KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA VÀ ỨC CHẾ ENZYME TYROSINASE CỦA CÂY DỨA (Ananas comosus).KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA VÀ ỨC CHẾ ENZYME TYROSINASE CỦA CÂY DỨA (Ananas comosus).KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA VÀ ỨC CHẾ ENZYME TYROSINASE CỦA CÂY DỨA (Ananas comosus).KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA VÀ ỨC CHẾ ENZYME TYROSINASE CỦA CÂY DỨA (Ananas comosus).KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA VÀ ỨC CHẾ ENZYME TYROSINASE CỦA CÂY DỨA (Ananas comosus).KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA VÀ ỨC CHẾ ENZYME TYROSINASE CỦA CÂY DỨA (Ananas comosus).
GIỚI THIỆU
Đặt vấn đề
Pineapple (Ananas comosus) belongs to the Bromeliaceae family and originates from Paraguay, ranking as the third most nutritious fruit in the world, following bananas and citrus fruits (Vrianty et al., 2019) The flesh of the pineapple is rich in bioactive compounds, including manganese, vitamins A, B (B1, B6, folates), C, and various organic acids, particularly malic acid, citric acid, folic acid, β-carotene, and the enzyme bromelain (Ramsden & Riley, 2014).
Trong cơ thể sinh vật, bao gồm cả con người, luôn có sự sản sinh các gốc tự do Những gốc tự do này có khả năng phản ứng với các gốc khác, dẫn đến việc hình thành các gốc tự do mới, gây ra sự phá hủy bào quan và cấu trúc bên trong tế bào, từ đó gây ra đột biến Đột biến là nguyên nhân chính dẫn đến sự thoái hóa tế bào, góp phần làm xuất hiện các bệnh hiểm nghèo.
Các hợp chất kháng oxy hoá có khả năng làm chậm hoặc ngăn chặn sự phát triển của các gốc tự do, từ đó bảo vệ tế bào và cơ thể Hệ thống kháng oxy hóa tự nhiên trong cơ thể giúp loại bỏ các gốc tự do và duy trì sự cân bằng giữa quá trình oxy hóa và kháng oxy hóa Bên cạnh đó, việc bổ sung các chất kháng oxy hóa từ thực phẩm và dược liệu có thể ngăn ngừa những tác động tiêu cực của sự thoái hóa tế bào.
Tyrosinase là enzyme chủ yếu trong quá trình tổng hợp melanin, một hợp chất sắc tố quan trọng có mặt trong da, tóc và niêm mạc võng mạc, giúp bảo vệ cơ thể khỏi tác động của tia cực tím Nám da xảy ra khi hàm lượng melanin tăng lên, phản ứng tự nhiên nhằm bảo vệ da Do đó, nghiên cứu về cấu trúc của tyrosinase và các chất ức chế enzyme này là cần thiết để tìm kiếm và phát triển nguyên liệu cho ngành dược liệu và mỹ phẩm.
Các hoạt chất ức chế tyrosinase tổng hợp bằng phương pháp hóa học chưa đảm bảo an toàn và hiệu quả, do đó, việc tìm kiếm các hợp chất ức chế tyrosinase từ thiên nhiên đang được nghiên cứu trong lĩnh vực sinh hóa Mục tiêu là lựa chọn nguyên liệu phù hợp để ứng dụng trong y học, ngành công nghiệp thực phẩm, xử lý môi trường và mỹ phẩm.
Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra khả năng kháng oxy hóa của cao chiết trích ly từ thịt quả, lá và vỏ quả dứa Tuy nhiên, vẫn chưa có đánh giá tổng thể về vấn đề này.
Luận án Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ sinh 17 học
Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc so sánh về khả năng kháng oxy hóa về cao chiết được trích ly từ nguyên liệu là lá,
Luận án Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ sinh 18 học
Viện NC&PT Công nghệ sinh học đang nghiên cứu về thân, thịt quả và vỏ dứa, tuy nhiên, hiện tại có rất ít nghiên cứu tập trung vào khả năng ức chế hoạt động của enzyme tyrosinase từ các loại cao chiết từ dứa.
Trong những năm gần đây, nghiên cứu về khả năng ức chế tyrosinase từ các hợp chất thiên nhiên đã thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới Tại Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu chỉ ra khả năng ức chế tyrosinase của các chiết xuất từ củ cải trắng, cây huỳnh anh, vi tảo, nấm rơm, mít dai, hoa hòe và lá tía tô (Hưng, 2014; L Q Loan et al., 2018; Mai & Mai, 2018; Phú, 2019; Trúc et al., 2020).
Chưa có nghiên cứu nào về khả năng ức chế tyrosinase của cao chiết cây dứa Hàm lượng các hợp chất thiên nhiên, hoạt tính kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm loại hợp chất có trong tế bào của từng loại cây, vùng sinh thái, và độ tuổi của cây Ngay cả trên cùng một cây, hàm lượng và hoạt tính sinh học cũng có thể khác nhau giữa các bộ phận khác nhau.
Mục tiêu của luận án là nghiên cứu về “Khả năng kháng oxy hóa và ức chế enzyme tyrosinase của cây dứa (Ananas comosus (L.) Merr.)”.
Mục tiêu luận án
Bài viết đánh giá khả năng kháng oxy hóa và ức chế enzyme tyrosinase của cao chiết từ dứa (Ananas comosus (L.) Merr.), nhằm khảo sát tiềm năng của nguồn nguyên liệu từ cây dứa Nghiên cứu này có thể mở ra hướng đi mới trong việc sử dụng dứa như một nguyên liệu tự nhiên trong ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm.
Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Khảo sát chọn vùng nguyên liệu và dung môi chiết xuất cao và định danh loài dứa vùng Tắc Cậu.
Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của cao methanol dứa Tắc Cậu được thực hiện thông qua các phương pháp đo hoạt tính khử DPPH, hoạt tính khử ion Fe 3+ thành ion Fe 2+, và hoạt tính khử ion Cu 2+ thành ion Cu + Ngoài ra, nghiên cứu cũng đánh giá khả năng ức chế enzyme tyrosinase của cao dứa này.
Sắc ký tách phân đoạn cao chiết methanol từ vỏ dứa đã được thực hiện để khảo sát khả năng kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase của các phân đoạn có hoạt tính cao Đặc biệt, nghiên cứu cũng tập trung vào khả năng ức chế sự sản sinh melanin của cao phân đoạn F1 từ cao chiết methanol trên dòng tế bào, nhằm đánh giá hiệu quả của nó trong việc ngăn chặn quá trình tạo melanin.
B16F10.Nội dung 5: Khảo sát các hợp chất trong cao phân đoạn F1 methanol vỏ dứa có khả năng kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase thông qua phân tích phổ
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
1.4.1 Đối tượng nghiên cứu Đề tài nghiên cứu trên đối tượng cây dứa (lá, thân, thịt quả và vỏ quả) thu hái tại Tắc Cậu (vùng sinh thái Tây Sông Hậu) của tỉnh Kiên Giang.
1.4.2 Phạm vi nghiên cứu Đề tài tập trung nghiên cứu về khả năng kháng oxy hóa (được tiến hành bằng 3 phương pháp khử DPPH, khử ion Fe 3+ , khử ion Cu 2+ ) và khả năng ức chế hoạt tính của enzyme tyrosinase của cao chiết từ lá, thân, thịt quả và vỏ cây dứa Các nghiên cứu được thực hiện từ tháng 5/2018 đến tháng 1/2021 tại Viên nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ và Trung tâm Quản lý thực hành thí nghiệm, Trường Đại học Kiên Giang.
Ý nghĩa của nghiên cứu
Luận án này trình bày thông tin khoa học quan trọng về khả năng kháng oxy hóa và ức chế enzyme tyrosinase của cao chiết từ cây dứa Mục tiêu là khai thác nguyên liệu từ cây dứa để ứng dụng trong các lĩnh vực y dược và hóa mỹ phẩm.
Nghiên cứu cho thấy việc sử dụng phụ phế phẩm từ công nghiệp chế biến dứa, đặc biệt là chiết xuất từ vỏ dứa, không chỉ giúp giảm ô nhiễm môi trường mà còn nâng cao giá trị sản phẩm dứa trong nông nghiệp Việc ứng dụng nguồn nguyên liệu này trong y dược học mở ra tiềm năng mới cho ngành chế biến dứa.
Tính mới của luận án
Luận án đã chỉ ra rằng lá, thân, thịt quả và vỏ dứa đều có hoạt tính kháng oxy hóa và ức chế enzyme tyrosinase Đặc biệt, cao chiết methanol từ vỏ dứa cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase cao nhất Kết quả nghiên cứu cung cấp thông tin quý giá cho ngành y dược và hóa mỹ phẩm Việc ức chế sản sinh melanin trên dòng tế bào hắc tố B16F10 từ cao phân đoạn F1 tách ra từ cao methanol vỏ dứa mở ra hướng ứng dụng mới cho phụ phẩm quả dứa trong y dược, giúp phòng và điều trị các bệnh liên quan đến hình thành melanin như Alzheimer, Parkinson, tàn nhang, nám da và các bệnh liên quan đến tế bào u hắc tố.
Hình 1.1: Sơ đồ tóm tắt các nội dung nghiên cứu luận án
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương tiện nghiên cứu
3.1.1 Thời gian và địa điểm
Từ tháng 5/2018 đến tháng 01/2021, nghiên cứu được thực hiện tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học thuộc Trường Đại học Cần Thơ và Trung tâm Quản lý Thực hành Thí nghiệm của Trường Đại học Kiên Giang.
Lá, thân, thịt quả và vỏ dứa (Ananas comosus (L.) Merr.) được thu hái từ hai vùng sinh thái khác nhau ở Kiên Giang, Việt Nam, gồm vùng Tây Sông Hậu (dứa Tắc Cậu) và Tứ Giác Long Xuyên (dứa Hòn Đất) Các mẫu dứa được xác định dựa trên đặc điểm hình thái theo hệ thống phân loại thực vật Việt Nam với sự hỗ trợ của Nguyễn Văn Phước từ Khoa học cây trồng, trường Đại học Kiên Giang, theo tiêu chí phân loại của Phạm Hoàng Hộ (1993) Tiêu chuẩn chọn mẫu bao gồm lá ở đỉnh, vỏ dứa thu cùng với quả có độ tuổi từ 24 - 26 tuần sau khi ra hoa, và thân dứa có độ tuổi từ 3-5 năm, tất cả mẫu đều tươi và không bị sâu bệnh Tế bào B16F10 được cung cấp bởi ngân hàng tế bào ATCC (Mỹ).
3.1.3 Dụng cụ và thiết bị
Các thiết bị sử dụng bao gồm:
Hệ thống Máy PCR 9700 và Máy giải trình tự tự động ABI PRISM 3730xl của Applied Biosystems (Mỹ) là những thiết bị chính trong phòng thí nghiệm, bên cạnh Máy cô quay chân không RE 301 và Tủ sấy IN110 từ Yamato và Memmert (Đức) Các thiết bị khác bao gồm Bồn đánh sóng siêu âm ELMA S100H (Đức), Máy đo quang phổ Shimadzu 1800 (Nhật Bản), Máy khuấy từ (Mỹ), Cân phân tích Ohaus và Cân điện tử Startorius (Đức) Ngoài ra, phòng thí nghiệm còn sử dụng Máy nghiền mẫu RT 08 (Đài Loan), Cân sấy ẩm hồng ngoại MX50 AND 63u/Shimadzu (Nhật) và Máy đo pH để bàn MI150 MARTINI (Rumani), cùng với Hệ thống GCMSQP2010 Series của Shimadzu (Nhật) và một số thiết bị khác.
Các dụng cụ sử dụng bao gồm:
Cột sắc ký 10 x 50 cm, ống nghiệm, micro pipet, pipet thủy tinh, giá đỡ ống nghiệm, đèn cồn, que cấy, dụng cụ đục giếng thạch, ống đong, cốc thủy tinh (becker), cốc nhựa, cuvette thạch anh, cuvette thủy tinh, chai lọ thủy tinh, đĩa petri, tuýp eppendorf, đầu tuýp nhựa và một số dụng cụ khác là những thiết bị quan trọng trong phòng thí nghiệm, phục vụ cho các nghiên cứu và thí nghiệm khoa học.
CTAB (cetyl trimethyl ammonium bromide), EB (extraction buffer), and SDS (sodium dodecyl sulfate) are essential reagents used in molecular biology Nitrogen liquid, Tris-EDTA, and agarose play critical roles in various laboratory procedures Additionally, solvents such as isoamyl alcohol, isopropanol, and 96% ethanol, methanol, and ethyl acetate sourced from Vietnam, along with hexane, are commonly utilized in extraction processes Other important chemicals include silica gel from India, anhydrous sodium sulfate (Na2SO4), ferric chloride (FeCl3.6H2O), lead acetate (Pb(CH3COO)2), sodium carbonate (Na2CO3), and dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4).
CH3COOK, I2, KI, AlCl3.6H2O, NaH2PO4.2H2O, Na2HPO4.12H2O 30%, NaOH, H2SO4 đậm đặc, CuSO4.5H2O; Enzyme tyrosinase (Sigma, Mỹ); DMSO (Merck (95%); L_dopa (Sigma, Mỹ (99%); Acid Kojic (Sigma (99%);
Cell culture environment typically utilizes DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) or MEME (Minimum Essential Medium with Eagle salts), supplemented with L-glutamine, sodium pyruvate, NaHCO3, penicillin/streptomycin, 10% Fetal Bovine Serum (FBS), and Trypsin-EDTA (0.05%).
- Các hóa chất cơ bản khác: TCA (Trichloroacetic acid ), Tris base, PBS(phosphate buffered saline) …
Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Nội dung 1: Khảo sát chọn vùng nguyên liệu và dung môi trích ly cao chiết.
Hoạt tính sinh học, bao gồm hoạt tính kháng oxy hóa và ức chế enzyme tyrosinase, phụ thuộc vào nhiều yếu tố như loại hợp chất trong tế bào, loài cây, vùng sinh thái, và độ tuổi của cây Ngay cả trên cùng một cây, hàm lượng và hoạt tính sinh học cũng có sự khác biệt giữa các bộ phận khác nhau.
Trước khi tiến hành thí nghiệm cho luận án về khả năng kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase của cây dứa, cần khảo sát vùng nguyên liệu tại hai khu vực sinh thái: Tứ giác Long Xuyên (vùng Hòn Đất) và Tây sông Hậu (vùng Tắc Cậu) Đồng thời, việc lựa chọn dung môi trích ly, cụ thể là ethanol hoặc methanol, cũng rất quan trọng để xác định nguồn nguyên liệu và phương pháp chiết xuất phù hợp cho các nghiên cứu tiếp theo.
Phương pháp thu, xử lý mẫu
Thu hoạch lá dứa (bao gồm cả lá trên đỉnh quả) và thân cây từ 3 đến 5 năm tuổi, cùng lúc với việc thu hoạch thịt và vỏ quả dứa khi trái đạt từ 24 tháng tuổi trở lên.
Sau 26 tuần, khi trái đạt độ chín 2/3, chúng được thu hoạch từ hai vùng sinh thái Tắc Cậu và Hòn Đất Sau khi thu về, mẫu sẽ được loại bỏ những phần hư hỏng, rửa sạch và để khô tự nhiên Tiếp theo, vỏ trái sẽ được lấy ra với độ dày thích hợp.
0,5 cm, tất cả các mẫu được cắt nhỏ với kích thước (0,5 x 0,5) x 3 cm (dày, rộng), Hình 3.2.
Hình 3.1 trình bày mẫu lá ở đỉnh (a), thân (b), thịt quả (c) và vỏ (d) của cây dứa (Ananas comosus (L.) Merr.) Nghiên cứu này đánh giá khả năng kháng oxy hóa của cao chiết ethanol từ dứa được thu thập tại Hòn Đất và Tắc Cậu Quá trình trích ly cao được thực hiện từ các bộ phận của cây dứa sử dụng dung môi ethanol.
Mục tiêu của nghiên cứu là trích ly các hợp chất thiên nhiên từ lá, thân, thịt quả và vỏ dứa thu tại Hòn Đất và Tắc Cậu bằng dung môi ethanol Các cao chiết từ dứa sẽ được sử dụng để xác định khả năng kháng oxy hóa, từ đó tìm ra vùng thu nguyên liệu tối ưu.
Tiến hành xác định độ ẩm nguyên liệu theo phương pháp sấy khô (Phụ lục 9.6, Dược điển Việt Nam V) bằng cân sấy ẩm hồng ngoại MX50 AND (Nhật), Hình 3.3.
Hình 3.2: Đo độ ẩm nguyên liệu
Thí nghiệm được bố trí và tiến hành theo Phụng, 2007; Rodriguez., 2017; Vrianty et al., 2019 có hiệu chỉnh.
Bố trí của thí nghiệm theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 8 nghiệm thức:
Bài nghiên cứu đã tiến hành trích ly 4 loại mẫu (lá, thân, thịt quả và vỏ dứa) từ 2 vùng sinh thái khác nhau là Hòn Đất và Tắc Cậu bằng dung môi ethanol tuyệt đối với tỉ lệ mẫu:dung môi là 1:4, kèm theo sự hỗ trợ của sóng siêu âm Kết quả của thí nghiệm được trình bày chi tiết trong Bảng 3.1.
Hình 3.3: Mẫu dứa thu tại Hòn Đất và Tắc Cậu trích ly trong ethanol
Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm trích ly cao chiết lá, thân, thịt và vỏ dứa ở Hòn Đất và
Nghiệm thức Bộ phận Vùng sinh thái Dung môi
Tỷ lệ mẫu/dung môi
Tất cả các cao thô được xử lý bằng sóng siêu âm với công suất 120W trong 60 phút, bao gồm các thành phần như lá (L), thân (T), thịt quả (TQ), vỏ (V), ethanol (E), Hòn Đất (HĐ) và Tắc Cậu (TC).
Chuẩn bị dụng cụ chứa và nghiền nhỏ 1000 g mẫu bằng máy xay với dung môi, sau đó cho vào từng becker Tiến hành xử lý bằng sóng siêu âm ở công suất 120 W trong 60 phút.
Các dịch chiết được xử lý bằng cách lọc qua muối Na2SO4 khan để loại bỏ nước trong mẫu Sau đó, quá trình cô quay chân không được thực hiện ở nhiệt độ 47 oC nhằm loại bỏ dung môi Hệ thống cô quay được kết nối với hệ thống làm lạnh để thu hồi dung môi, trong khi bơm áp được duy trì ở điều kiện -25 bar.
Dịch chiết được cô quay cho cạn hết dung môi sau đó sấy ở 40 - 45 o C để thu nhận CT Cuối cùng, CT thu được sẽ được bảo quản trong tủ đông ở -4 o C.
Sau khi sấy cao chiết ở nhiệt độ 40 – 45 °C cho đến khi hoàn toàn bay hơi dung môi, tiến hành cân cao chiết bằng cân phân tích với đơn vị gram (g) để tính toán hiệu suất điều chế CT theo công thức (1).
Hiệu suất (%) = (Khối lượng CT (g)/Khối lượng mẫu (g)) x 100 (1) b.Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của cao chiết ethanol dứa ở vùng Hòn Đất và Tắc Cậu
Mục tiêu của nghiên cứu là xác định hoạt tính kháng oxy hóa thông qua phương pháp khử DPPH, một kỹ thuật phổ biến và chính xác để đánh giá khả năng chống oxy hóa Nghiên cứu sẽ tiến hành thử nghiệm trên các cao chiết từ lá, thân, thịt quả và vỏ dứa được thu thập từ hai vùng sinh thái khác nhau, Hòn Đất và Tắc Cậu Các mẫu sẽ được chiết xuất bằng dung môi ethanol, một phương pháp phổ biến để thu hồi các hoạt chất thiên nhiên, nhằm xác định vùng thu mẫu phù hợp nhất.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được thực hiện theo mô tả của (Jovanović et al., 2018; Li et al., 2014) có hiệu chỉnh.
Thí nghiệm được thực hiện hoàn toàn ngẫu nhiên với ba lần lặp lại Cao chiết ethanol từ lá được thu thập từ cả vùng Hòn Đất và Tắc Cậu, sau đó được pha chế thành dãy nồng độ khác nhau.
Cao thõn vựng Tắc Cậu có nồng độ từ 25 - 200 àg/mL, trong khi đó, vỏ của cả vựng Tắc Cậu và Hũn Đất được pha với nồng độ từ 50 - 250 àg/mL Đối với cao thõn vựng Hũn Đất, nồng độ pha chế đạt từ 100 - 300 àg/mL, và cao thịt quả vựng Hũn Đất cũng được pha chế với nồng độ tương tự.
(100 - 800 àg/mL), cao thịt quả Tắc Cậu thành nồng độ (100 - 1000 àg/mL). Chất chuẩn làm đối chứng là vitamin C nồng độ (12,5 - 150 àg/mL).
Pha dung dịch DPPH 0,1 mM.
Pha cao chiết ethanol từ lá thu ở vùng Hòn Đất và Tắc Cậu (L_EHĐ, L_ETC) với nồng độ từ 25 - 200 µg/mL Cao thỏ vựng Tắc Cậu (T_ETC) có nồng độ từ 50 - 250 µg/mL, trong khi cao vỏ từ cả hai vùng Tắc Cậu và Hòn Đất (V_ETC, V_EHĐ) cũng được pha với nồng độ tương tự Cao thỏ vựng Hòn Đất (T_EHĐ) có nồng độ từ 100 - 300 µg/mL Cao thịt quả từ Hòn Đất (TQ_EHĐ) được pha với nồng độ từ 100 - 800 µg/mL, và cao thịt quả Tắc Cậu (TQ_ETC) có nồng độ cao từ 100 - 1000 µg/mL, được pha với methanol.
Pha dung dịch vitamin C chuẩn thành dóy nồng độ (12,5 - 150 àg/mL) (pha với methanol).
Quy trình thực hiện thí nghiệm đối với cao chiết:
Lần lượt cho 1 mL cao chiết ở các nồng độ đã chuẩn bị vào ống nghiệm, tiếp tục thêm vào 1 mL DPPH 0,1 mM Sau 30 phút ủ trong tối, tiến hành đo
OD bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 517 nm.
Mẫu đối chứng được thực hiện giống với quy trình thực hiện đối với cao chiết nhưng thay thế cao chiết bằng methanol.
Xây dựng đường chuẩn vitamin C:
Xây dựng đường chuẩn vitamin C với quy trình thực hiện như đối với cao chiết.
Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thô được tính toán, xử lý và vẽ biểu đồ bằng phần mềm Excel
Vào năm 2016, chúng tôi đã sử dụng phần mềm Minitab 16 để xử lý số liệu thống kê, bao gồm phân tích phương sai ANOVA, tính toán hệ số biến động (CV%) và so sánh trung bình sự khác biệt thông qua kiểm định Tukey.