Khảo sát hiệu quả kháng oxy hóa và bảo vệ gan trên mô hình chuột của một số cây thuộc họ Cà phê (Rubiaceae).

Khảo sát hiệu quả kháng oxy hóa và bảo vệ gan trên mô hình chuột của một số cây thuộc họ Cà phê (Rubiaceae).Khảo sát hiệu quả kháng oxy hóa và bảo vệ gan trên mô hình chuột của một số cây thuộc họ Cà phê (Rubiaceae).Khảo sát hiệu quả kháng oxy hóa và bảo vệ gan trên mô hình chuột của một số cây thuộc họ Cà phê (Rubiaceae).Khảo sát hiệu quả kháng oxy hóa và bảo vệ gan trên mô hình chuột của một số cây thuộc họ Cà phê (Rubiaceae).Khảo sát hiệu quả kháng oxy hóa và bảo vệ gan trên mô hình chuột của một số cây thuộc họ Cà phê (Rubiaceae).Khảo sát hiệu quả kháng oxy hóa và bảo vệ gan trên mô hình chuột của một số cây thuộc họ Cà phê (Rubiaceae).Khảo sát hiệu quả kháng oxy hóa và bảo vệ gan trên mô hình chuột của một số cây thuộc họ Cà phê (Rubiaceae).Khảo sát hiệu quả kháng oxy hóa và bảo vệ gan trên mô hình chuột của một số cây thuộc họ Cà phê (Rubiaceae).

Giới thiệu

Gan là một trong những cơ quan lớn nhất trong cơ thể, có vai trò quan trọng trong trao đổi chất và bài tiết Trong quá trình giải độc và bài tiết, gan thường xuyên bị tấn công bởi các chất độc hại, dẫn đến tổn thương và rối loạn chức năng Tổn thương gan có thể gây ra nhiều vấn đề sức khỏe nghiêm trọng, do các nguyên nhân như hóa chất độc hại, thuốc, rượu, nhiễm trùng và rối loạn tự miễn Những tác nhân này gây stress oxy hóa, tạo ra gốc tự do tấn công tế bào gan, làm tổn hại các đại phân tử sinh học Các hóa chất độc hại chủ yếu gây ra sự peroxide hóa lipid và tổn thương oxy hóa trong tế bào gan Bệnh gan thường tiến triển từ gan nhiễm mỡ đến viêm gan, xơ hóa và xơ gan Nếu không được điều trị kịp thời, xơ hóa có thể dẫn đến xơ gan, suy gan và tử vong.

Bệnh gan hiện nay là một trong những vấn đề sức khỏe nghiêm trọng toàn cầu, mặc dù y học đã có nhiều tiến bộ Việc phòng ngừa và điều trị bệnh gan vẫn còn hạn chế do các độc tố gây tổn hại tế bào gan, chủ yếu từ sự peroxide hóa lipid và stress oxy hóa Sự suy giảm hệ thống chống oxy hóa nội sinh dẫn đến cái chết của tế bào gan Sử dụng chất kháng oxy hóa để giảm peroxide hóa và stress oxy hóa được coi là một trong những liệu pháp hiệu quả trong việc phòng ngừa và điều trị tổn thương gan.

Chất kháng oxy hóa tự nhiên như flavonoid, phenolic, tanin và terpenoid được tìm thấy trong nhiều loại thực vật khác nhau Các cây dược liệu có tác dụng đa dạng đối với các hệ thống sống, bao gồm các đặc tính như thuốc an thần, giảm đau, hạ sốt, bảo vệ tim mạch, kháng khuẩn, kháng virus và chống kí sinh trùng Ngoài ra, dược phẩm có nguồn gốc thực vật cũng được chứng minh là hiệu quả và an toàn cho gan.

Việc sử dụng phương thuốc tự nhiên để điều trị bệnh gan có lịch sử lâu dài, với nhiều loại cây thuốc và dẫn xuất của chúng vẫn được áp dụng rộng rãi trên toàn thế giới Các nghiên cứu về phát triển dược phẩm từ nguồn nguyên liệu tự nhiên đóng góp quan trọng vào việc bảo vệ gan Hiện nay, thuốc điều trị các rối loạn về gan chủ yếu được chiết xuất từ thực vật, tuy nhiên số lượng vẫn còn hạn chế Mục tiêu nghiên cứu là khảo sát hiệu quả kháng oxy hóa và bảo vệ gan của một số cây thuộc họ Cà phê, nhằm tìm kiếm loại cây hoặc bộ phận cây có khả năng kháng oxy hóa và bảo vệ gan tốt nhất, qua đó cung cấp thông tin về nguồn dược liệu mới cho việc phòng ngừa và điều trị bệnh gan Nghiên cứu sẽ tập trung vào các nội dung cụ thể để đạt được mục tiêu này.

(1) Điều tra cây dược liệu được sử dụng điều trị bệnh gan;

(2) Thu mẫu và chiết cao một số cây thuộc họ Cà phê;

(3) Sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa của các cao chiết;

(4) Khảo sát hiệu quả bảo vệ gan của các cao chiết;

(5) Thử nghiệm tính an toàn của các cao chiết;

(6) Chiết cao phân đoạn và thử hoạt tính sinh học của các cao phân đoạn;

(7) Phân lập chất từ phân đoạn có hoạt tính sinh học. Ý nghĩa của luận án

Luận án cung cấp cơ sở khoa học về khả năng kháng oxy hóa, kháng viêm và bảo vệ gan của cao chiết methanol từ 7 loại thực vật trong họ Cà phê, bao gồm Trang to, Mơ lông, Mơ leo, Gáo trắng, Gáo vàng, Lưỡi rắn và Lưỡi rắn trắng Nghiên cứu cho thấy rễ Gáo vàng có hiệu quả kháng oxy hóa và bảo vệ gan tốt nhất, đặc biệt là cao chiết phân đoạn ethyl acetate từ rễ Gáo vàng, có hoạt tính bảo vệ gan, kháng peroxide hóa lipid và tăng cường hàm lượng chất kháng oxy hóa trong gan Kết quả này mở ra cơ hội nghiên cứu và phát triển sản phẩm mới nhằm phòng ngừa và điều trị bệnh gan.

Nghiên cứu hệ thống đã khảo sát hoạt tính sinh học của thực vật họ Cà phê (Rubiaceae), bao gồm sàng lọc in vitro khả năng kháng oxy hóa và kháng viêm, cùng với thí nghiệm in vivo trên động vật Các cao methanol chiết xuất từ thực vật cho thấy khả năng bảo vệ gan thông qua xét nghiệm sinh hóa và quan sát mô bệnh học, nhằm giảm stress oxy hóa Các cao chiết có hoạt tính kháng oxy hóa và bảo vệ gan tốt được chọn để chiết phân đoạn, thử lại hoạt tính và phân lập chất để xác định cấu trúc hóa học Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học cho việc sử dụng thực vật họ Cà phê trong điều trị bệnh gan.

Phương pháp nghiên cứu

Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện trong khoảng thời gian từ tháng 06/2015 đến tháng 12/2020. Các địa điểm nghiên cứu:

Phòng thí nghiệm Sinh học thuộc Bộ môn Sinh học, Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Cần Thơ, thực hiện các nghiên cứu liên quan đến sàng lọc kháng oxy hóa in vitro, thí nghiệm bảo vệ gan và kiểm tra tính an toàn trên chuột.

Phòng thí nghiệm Hóa sinh, Bộ môn Hóa học, Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Cần Thơ: Thực hiện nội dung chiết cao và phân lập chất.

Phòng xét nghiệm 144, Đường Nguyễn An Ninh, Phường Tân An, Quận Ninh Kiều, Thành phố Cần Thơ chuyên thực hiện xét nghiệm enzyme ALT và AST trong huyết thanh chuột thí nghiệm nhằm bảo vệ gan.

Hội Đông y Thị xã Bình Minh tọa lạc tại Số 150, Tổ 1, Khóm 5, Phường Thành Phước, Thị xã Bình Minh, Vĩnh Long Đền thờ Nguyễn Trung Trực nằm trên Đường Nguyễn Công Trứ, phường Vĩnh Thanh, thành phố Rạch Giá, tỉnh Kiên Giang Chùa Tịnh Độ tọa lạc tại Khóm 2, Thị trấn Tri Tôn, tỉnh An Giang.

An Giang: Thực hiện nội dung điều tra các loại cây dược liệu được dùng điều trị bệnh gan.

Mơ Lông (VL_Pla201506010001), Mơ leo (VL_Psc201506010002), Trang to (VL_Idu201506010003), Lưỡi rắn (VL_Hco201506010004), Lưỡi rắn trắng (VL_Hdi201506010005), Gáo trắng (VL_Nca201507010007) và Gáo vàng (HG_Nor201507010007) là các mẫu thực vật được thu thập tại tỉnh Vĩnh Long và Hậu Giang Những mẫu này đã được định danh dựa vào đặc điểm hình thái theo tài liệu Cây Cỏ Việt Nam (quyển 3) của Phạm Hoàng Hộ.

(2003) dưới sự hỗ trợ của PGS TS Ngô Thanh Phong (phụ trách giảng dạy Thực vật học của

Bộ môn Sinh học thuộc Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Cần Thơ, hiện đang lưu giữ các mẫu động vật và thực vật tại Phòng thí nghiệm của bộ môn.

Tự nhiên, Trường Đại học Cần Thơ.

Nghiên cứu sử dụng chuột Mus musculus giống đực khỏe mạnh, nặng từ 20-30 g, được cung cấp bởi Viện Pasteur, TP Hồ Chí Minh Trước khi tiến hành thí nghiệm, chuột được nuôi ổn định trong môi trường thí nghiệm từ 3-5 ngày Trong suốt thời gian thí nghiệm, chuột được giữ ở điều kiện nhiệt độ phòng trong lồng kính có nắp lưới, và lồng nuôi cùng các thiết bị cho chuột ăn và uống nước được vệ sinh định kỳ.

3.1.3 Thiết bị và hóa chất

Trong nghiên cứu, các thiết bị quan trọng được sử dụng bao gồm máy ly tâm lạnh Mikro 12-24 (Hettich, Đức), cân phân tích AB104-S (Mettler Toledo, Thụy Sỹ), tủ sấy BE 200 (Memmert, Đức), bể ủ Memmert (Đức), máy đo quang phổ Thermo Scientific Multiskan GO (Phần Lan), máy cô quay chân không Heidolph (Đức), cùng với chuồng nuôi chuột và các dụng cụ uống cần thiết.

The article lists various chemicals including methanol from China, vitamin C and silymarin sourced from Sigma-Aldrich, carbon tetrachloride and formol from Xilong, gallic acid and Folin-Ciocalteu’s phenol reagent from Merck, and quercetin from Merck as well Additional substances mentioned are 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl from Sigma-Aldrich, thibarbituric acid from Merck, olive oil from Italy, paraffin and beeswax from Xilong, hematoxylin and eosin Y from Sigma-Aldrich, 1,1,3,3-tetramethoxypropane from Sigma-Aldrich, glutathione from Wako, atropine sulfate from Sigma-Aldrich, diclofenac sodium from Vietnam, and Baume Canada from Xilong, along with several other chemicals.

Phương pháp nghiên cứu

3.2.2 Điều tra các loại cây dược liệu được dùng điều trị bệnh gan

Nghiên cứu đã tiến hành phỏng vấn các lương y, người thu hái thuốc nam và thầy thuốc tại các chùa để thu thập thông tin về việc sử dụng cây thuốc điều trị bệnh gan Dựa trên mẫu phiếu điều tra cây thuốc trong cộng đồng của Viện Dược liệu, Bộ Y tế, kết quả thu được đã được thống kê theo họ và lập danh sách các loài cây thường được sử dụng Những thông tin này sẽ làm cơ sở cho việc chọn họ thực vật nghiên cứu tiếp theo.

Các địa điểm được khảo sát trong nghiên cứu này đều là những nơi chuyên sử dụng cây dược liệu để điều trị bệnh Ba địa điểm cụ thể bao gồm: (1) Hội Đông y Thị xã Bình Minh, tọa lạc tại số 150, tổ 1, khóm 5, Phường Thành Phước, Thị xã Bình Minh, Vĩnh Long; (2) Đền thờ Nguyễn Trung Trực, nằm trên đường Nguyễn Công Trứ, phường Vĩnh Thanh, thành phố Rạch Giá, tỉnh Kiên Giang; và (3) Chùa Tịnh Độ, tọa lạc tại Khóm 2, Thị trấn Tri Tôn, tỉnh An Giang.

3.2.3 Thu mẫu và chiết cao một số cây thuộc họ Cà phê

Dựa trên kết quả điều tra cây dược liệu cho điều trị bệnh gan tại mục 3.2.2, nghiên cứu đã lựa chọn họ Cà phê và thu mẫu các bộ phận của một số cây, bao gồm Trang to (lá, hoa).

Mơ lông, Mơ leo, Gáo trắng, Gáo vàng, Lưỡi rắn và Lưỡi rắn trắng là các loại thực vật được nghiên cứu để khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa và bảo vệ gan Các bộ phận của cây được thu mẫu, rửa sạch, loại bỏ phần hư hỏng và phơi khô ở nhiệt độ phòng Sau đó, mẫu khô được xay nhuyễn thành bột với kích thước khoảng 60 mesh Bột nguyên liệu được chiết xuất trong methanol bằng phương pháp ngâm, với 2000 g mẫu được ngâm 3 lần trong 5 lít methanol mỗi lần, trong khoảng 48 giờ Dịch chiết từ các lần ngâm được gom lại và cô quay đuổi dung môi để thu được cao methanol tổng, hiệu suất chiết cao được xác định theo công thức.

3.2.4 Sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa in vitro của các cao chiết

Để pha dung dịch cao chiết, mỗi loại cao chiết cần 0,1 gram hòa tan trong 1000 µL methanol Sau khi khuấy cho cao chiết tan hoàn toàn, tiến hành ly tâm mẫu ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 5 phút để loại bỏ cặn Các dung dịch này sẽ được sử dụng cho các thí nghiệm hoặc pha loãng thành các dung dịch có nồng độ khác nhau tùy thuộc vào phương pháp thử nghiệm.

3.2.4.1 Xác định hàm lượng polyphenol, flavonoid và alkaloid tổng của các cao chiết Định tính thành phần hóa học của các cao chiết

Các cao chiết đã được thực hiện kiểm tra định tính để xác định sự hiện diện của các thành phần hóa học như alkaloid, flavonoid, steroid, glycoside, saponin và tanin, theo nghiên cứu của Nguyễn Kim Phi Phụng (2007).

Phương pháp định lượng polyphenol tổng

Tổng hàm lượng polyphenol được xác định bằng phương pháp so màu Folin-Ciocalteu, theo quy trình của Singleton et al (1999) Phản ứng bao gồm 250 µL cao chiết, 250 µL nước khử ion và 250 µL thuốc thử Folin-Ciocalteu 25% Sau 8 phút, thêm vào 250 µL dung dịch sodium carbonate 10% và lắc đều Hỗn hợp được ủ trong 30 phút ở 40°C, sau đó đo độ hấp thu quang phổ tại bước sóng 765 nm Hàm lượng polyphenol được tính tương đương với miligam axit gallic trên mỗi gram cao chiết (mg GAE/g cao chiết).

Phương pháp định lượng flavonoid tổng

Tổng hàm lượng flavonoid được xác định theo quy trình được mô tả bởi Sultana et al.

Hỗn hợp phản ứng bao gồm 200 µL cao chiết, 200 µL nước khử ion và 200 µL NaNO2 5% được ủ trong 5 phút Sau đó, thêm 40 µL AlCl3 (10%) và ủ trong 6 phút, tiếp theo là 400 µL NaOH 1M Thể tích cuối cùng được điều chỉnh thành 1000 µL bằng nước khử ion và trộn kỹ Sau 15 phút, đo độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng 510 nm để xác định hàm lượng flavonoid tương đương miligam quercetin trên mỗi gram cao chiết (mg QE/g cao chiết).

Phương pháp định lượng alkaloid tổng

Hàm lượng alkaloid được xác định bằng phương pháp hình thành phức hợp với bromocresol green (BCG), tạo thành sản phẩm có màu vàng (Shamsa et al., 2008) Cao chiết

Để xác định hàm lượng alkaloid trong dịch ngoại bào, tiến hành phản ứng 1 mL với 1 mL dung dịch HCl 2N trong 5 phút, sau đó lọc bằng giấy lọc để loại bỏ cặn Tiếp theo, cho 5 mL BCG và 5 mL dung dịch đệm phosphate (pH 4,7) vào bình tách chiết, lắc mạnh với 10 mL dung dịch chloroform Sau 2 phút phản ứng ở nhiệt độ phòng, đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 470 nm Hàm lượng alkaloid được xác định dựa trên phương trình đường chuẩn atropine, với kết quả tính bằng mg AE/g cao chiết.

3.2.4.2 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa in vitro của các cao chiết

Khảo sát hiệu quả trung hòa gốc tự do DPPH

Nghiên cứu này khảo sát hiệu quả kháng oxy hóa của các cao chiết thông qua cơ chế trung hòa gốc tự do DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) Thử nghiệm DPPH được thực hiện theo phương pháp của Shekhar và Anju (2014) với các mẫu cao chiết được pha loãng ở các nồng độ khác nhau (10, 20, 40, 60, 80 và 100 µg/mL), phản ứng với DPPH (6 x 10^-4 M) trong điều kiện tối và nhiệt độ 30°C trong 60 phút Độ hấp thu quang phổ của hỗn hợp được đo ở bước sóng 517 nm, với vitamin C được sử dụng làm đối chứng dương Các nồng độ vitamin C khảo sát là 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36 và 40 µg/mL Thử nghiệm được lặp lại ba lần cho mỗi nồng độ, và hiệu suất trung hòa gốc tự do DPPH của các cao chiết cũng như vitamin C được xác định thông qua công thức tính toán.

Trong nghiên cứu này, Ac (A control) đại diện cho giá trị độ hấp thu quang phổ của mẫu đối chứng âm, cụ thể là methanol, trong khi As (A sample) là giá trị độ hấp thu quang phổ của dung dịch mẫu thử.

Hiệu quả kháng oxy hóa của các cao chiết và vitamin C được xác định qua nồng độ cần thiết để trung hòa 50% lượng gốc tự do DPPH, được gọi là giá trị EC50 Giá trị này được tính toán thông qua phương trình hồi quy tuyến tính liên quan đến hiệu suất trung hòa gốc tự do DPPH.

Khảo sát khả năng khử của các cao chiết

Dung dịch cao chiết được pha loãng thành các nồng độ: 100, 200, 300, 400, 500, 600 và

700 àg/mL Đồng thời, butylated hydroxyanisole (BHA) cũng được pha theo dóy nồng độ sau: 0, 10, 20, 40, 60, 80 và 100 àg/mL để làm đối chứng dương.

Khả năng khử của các cao chiết và BHA được thực hiện theo phương pháp của Oyaizu

Năm 1986, quy trình xác định khả năng khử của các cao chiết và BHA được thực hiện như sau: trộn 0,5 mL dung dịch cao chiết hoặc BHA với 0,5 mL đệm phosphate (0,2 M, pH=6,6) và 0,5 mL K3Fe(CN)6 1%, ủ ở 50°C trong 20 phút Sau đó, thêm 0,5 mL CCl3COOH 10% và ly tâm ở 3000 vòng/phút trong 10 phút Dịch ly tâm được rút 0,5 mL, thêm vào 0,5 mL nước và 0,1 mL FeCl3 0,1%, lắc đều trước khi đo độ hấp thu quang phổ ở bước sóng 700 nm Khả năng khử được xác định dựa vào hàm lượng chất kháng oxy hóa tương đương BHA và nồng độ cao chiết cần thiết để giảm 50% gốc tự do (EC50).

Khảo sát hiệu quả kháng oxy hóa tổng

Khả năng kháng oxy hoá tổng (Total antioxidant capacity - TAC) của các cao chiết được xác định bằng phương pháp phosphomolybdenum theo Prieto et al (1999), cho phép đánh giá cả chất kháng oxy hóa hòa tan trong nước và trong dầu (Aliyu et al., 2013) Hỗn hợp phản ứng bao gồm 0,3 mL cao chiết và 3 mL dung dịch thử (0,6 M acid sulfuric, 28 mM sodium phosphate, và 4 mM ammonium molybdate) được ủ ở 95 o C trong 90 phút Sau khi ủ, hỗn hợp được làm mát ở nhiệt độ phòng và đo độ hấp thu quang phổ tại bước sóng 695 nm, với methanol (0,3 mL) làm đối chứng âm Kết quả khả năng kháng oxy hoá tổng được biểu thị bằng hàm lượng chất kháng oxy hóa tương đương àg/mL trolox và giá trị EC 50.

3.2.4.3 Khảo sát hoạt tính kháng viêm in vitro của các cao chiết

Các cao chiết có hoạt tính kháng oxy hóa sẽ được nghiên cứu về khả năng kháng viêm in vitro Hoạt động kháng viêm của cao chiết được đánh giá thông qua khả năng ức chế sự biến tính protein, áp dụng theo phương pháp đã được điều chỉnh của Shah et al (2017) Dung dịch thử sẽ được sử dụng trong quá trình khảo sát này.