KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: CN.Bùi Văn Thế Vinh CHƯƠNG 1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1.Đặt vấn đề: Từ ngàn xưa, con người đã biết tìm cây cỏ trong tự nhiên để chữa bệnh và tăng cường sức khỏe. Qua trải nghiệm từ cuộc sống, kho tàng cây dược liệu của con người càng ngày càng phong phú, đa dạng và trở thành một phần không thể thiếu trong cuộc sống của con người. Nước ta nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới, được sự ưu đãi của thiên nhiên nên thuận lợi cho sự phát triển của nhiều loại thảo mộc. Nếu như trước đây, những nghiên cứu trên cây thuốc chủ yếu theo hướng phân lập, tách chiết và thử nghiệm hoạt chất, thì hiện nay xu thế mới là tìm phương pháp để nâng cao hiệu quả sản xuất các hoạt chất nhằm đáp ứng nhu cầu nghiên cứu khoa học và cải thiện, nâng cao chất lượng cuộc sống và bảo vệ môi trường. Đây chính là vấn đề đặt ra cho ngành Công nghệ Sinh học thực vật. Công nghệ Sinh học thực vật ra đời đã và đang mở ra những triển vọng mới đối với việc bảo tồn và phát triển nguồn cây thuốc dồi dào của nhân loại. Thực sự là trong hơn 20 năm qua, bằng phương pháp nuôi cấy huyền phù tế bào trong các hệ thống bioreactor, hàng trăm loại hoạt chất có giá trò được tổng hợp với giá thành thấp hơn, khắc phục nhiều nhược điểm của phương pháp tổng hợp hóa học. Bằng phương pháp tái sinh cây trực tiếp hoặc gián tiếp qua mô sẹo, tế bào và phôi mà nhiều loài cây thuốc q được bảo tồn và khai thác hiệu quả, phục vụ đắc lực cho cuộc sống của con người. Cây Lược vàng (Callisia fragrans) có nguồn gốc từ Mexico và hiện nay đang được trồng nhiều ở Việt Nam, đặc biệt là ở Thanh Hóa và Hà Nội. Đây là một loại cây thuốc mới được biết đến trong thời gian gần đây và đã gây xôn xao dư luận về tính năng “thần dược” cũng như những tác dụng phụ mà nó mang lại. SVTH: Nguyễn Tấn Thònh 1 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: CN.Bùi Văn Thế Vinh Chính vì lý do đó mà việc tìm hiểu và xác đònh các hợp chất thứ cấp có trong cây Lược vàng là rất cần thiết. Được sự đồng ý của Bộ môn Công nghệ Sinh học – Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ và dưới sự hướng dẫn của thầy Bùi Văn Thế Vinh, tôi đã thực hiện khóa luận tốt nghiệp: “Tìm hiểu thành phần hợp chất thứ cấp trong cây Lược vàng (Callisia fragrans L.). SVTH: Nguyễn Tấn Thònh 2 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: CN.Bùi Văn Thế Vinh 1.2.Mục đích và yêu cầu: - Tổng quan về một số hợp chất thứ cấp có nguồn gốc từ thực vật. - Tìm hiểu thành phần các hợp chất thứ cấp có trong cây Lược Vàng. SVTH: Nguyễn Tấn Thònh 3 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: CN.Bùi Văn Thế Vinh CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN VỀ CÁC HP CHẤT THỨ CẤP CÓ NGUỒN GỐC THỰC VẬT 2.1. Khái niệm chung về các chất hoạt tính sinh học (HTSH) Về nguyên tắc chung tất cả sinh chất tùy điều kiện cụ thể điều là các chất có hoạt tính sinh học (cả theo có lợi và không có lợi). Sinh chất thường được phân loại thành nhóm chất sơ cấp và thứ cấp. Nhóm chất sơ cấp là những chất cơ bản nhất cần thiết để duy trì sự sống. Đó là protein, nucleic acid, carbonhydrat, lipid. Chúng thường là các polyme sinh học có trong lượng phân tử (MW) cao, là các polyme sinh học. Nhóm chất thứ cấp thường có MW nhỏ. Đa số chúng được tổng hợp de novo, nhưng cũng không ít chất sinh học là sản phẩm phân rã hoặc ở dạng dẫn xuất từ các chất sơ cấp hay từ những đơn vò tạo thành chất sơ cấp. Đó là nhóm chất phenol, isoprenoid, các dẫn suất chứa nitơ (trong đó alkaloid) các peptid, kháng sinh, vitamin Là những chất thể hiện hoạt tính sinh học giúp chuyển hóa vận động hoạt động sống, giúp lập quan hệ sinh thái của cơ thể sống với môi trường sống xung quanh. 2.2.Alkaloid: 2.2.1.Khái niệm: Alkaloid từ tiếng Ả rập là al-qali có nghóa là kiềm, là nhóm chất hữu cơ có hoạt tính sinh học, chủ yếu ở thực vật; Ở động vật, nấm tảo không phổ biến lắm; Không thấy có ở vi khuẩn. Có thể nói alkaloid là nghiên cứu đầu tiên của con người về hóa các hợp chất tự nhiên. Alkaloid là nhóm hợp chất tự nhiên hiện diện khá nhiều trong các họ thực vật với cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học rất đa dạng. Trên thực tế có rất nhiều loại thực vật có alkaloid nhưng ở mức độ vết hoặc tỉ lệ phần vạn. Để giới SVTH: Nguyễn Tấn Thònh 4 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: CN.Bùi Văn Thế Vinh hạn với ý nghóa thực tiễn, một cây được xem là có alkaloid phải chứa ít nhất 0,05% alkaloid so với mẫu không. (Phạm Thanh Kỳ, 2002). Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa dò vòng Nitơ, có tính bazơ. Do đó, nó là nhóm các hợp chất không thuần khiết về mặt hoá học. Hiện nay, người ta đã tìm được khoảng gần 6000 ankaloid và chủ yếu là các chất ít tan trong nước nhưng dễ tan trong các dung môi hữu cơ, nhiều chất có hoạt tính sinh học cao như: Quinin, Ephedrin, Codeine… 2.2.2.Nguồn gốc: - Alkaloid là hợp chất có chứa Nitơ nguồn gốc thực vật. Hàm lượng alkaloid có thể đạt đến 10% trong các loại rau quả thông dụng như khoai tây, chè, cà phê… - Hầu hết các alkaloid hiện diện trong cây có hoa, loại 2 lá mầm, nhưng người ta cũng thấy alkaloid trong động vật, côn trùng, sinh vật biển… 2.2.3.Phân loại: Alkaloid được phân loại theo một số cách khác nhau: Phân loại theo loài thực vật chứa alkaloid, theo bản chất hóa học tự nhiên hoặc theo tác động sinh lý của chúng. 2.2.3.1.Phân loại theo bản chất hóa học: Do cách phân loại dựa vào cấu trúc nhân cơ bản không đáp ứng được số lượng alkaloid rất nhiều và đa dạng, nên để tiện lợi, các alkaloid được chia thành ba loại: alkaloid thật, protoalkaloid và giả- alkaloid (Pseudoalkaloid): + Alkaloid thật là những hợp chất có hoạt tính sinh học, luôn có tính base, thường có chứa nguyên tử nitơ vòng dò hoàn, thường được sinh tổng hợp từ amino acid, phân bố giới hạn trong thực vật và hiện diện trong cây dưới dạng muối của SVTH: Nguyễn Tấn Thònh 5 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: CN.Bùi Văn Thế Vinh một acid hữu cơ, ngoại trừ: colchicin, acid aristolochic, alkaloid thứ cấp. Các alkaloid loại này thường được chia thành nhóm theo nguồn gốc sinh tổng hợp của chúng (ornithin, lysin, phenylalanin, tryptophan, histidin, acid antranilic…) hơn là theo vòng dò hoàn. + Các protoalkaloid được xem là những amin có hoạt tính sinh học kể cả mescalin và N, N-dimetyltryptamin. Chúng là những amin đơn giản, được tổng hợp từ các amino acid, trong đó nguyên tử nitơ không ở trong vòng dò hoàn. + Các giả-alkaloid, là những hợp chất không bắt nguồn từ những amino acid, bao gồm hai nhóm hợp chất lớn là alkaloid steroid và alkaloid terpenoid. Các alkaloid thông thường được phân loại theo đặc trưng phân tử chung của chúng, dựa trên kiểu trao đổi chất được sử dụng để tạo ra phân tử. + Khi không biết nhiều về tổng hợp sinh học của các alkaloid thì chúng được gộp nhóm theo tên gọi của các hợp chất đã biết. + Khi người ta biết nhiều hơn về một alkaloid cụ thể nào đó, thì việc gộp nhóm được thay đổi để phản ánh các kiến thức mới, thông thường lấy theo tên của amin quan trọng về mặt sinh học và nổi bậc nhất trong tiến trình tổng hợp. Các nhóm alkaloid hiện nay gồm có: - Nhóm Pyridin: Piperin, Coniin trigonellin, Avecaidin, Guvacin, Pilocarpin, Cytisin, Nicotin, Spartein, Pelletierin. - Nhóm Quinolin: Quinin, Quinidin, Dihydroquinin, Dihydroquinidin, Strychnin, Brucin, Veratrin, Cevadin. - Nhóm Isoquinolin (Các Alcaloid gốc thuốc phiện): Morphin, Codein, Thebain, Papaverin, Narcotin, Sanguinarin, Narcein, Hydrastin, Berberin. SVTH: Nguyễn Tấn Thònh 6 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: CN.Bùi Văn Thế Vinh - Nhóm Phenethylamin: Mescalin, Ephedirin, Dopamin, Amphetamin. - Nhóm Indol: + Các Tryptamin: N-metyltryptamin, Psilocybin, Serotoni. + Các Ergolin (Các alkaloid từ ngũ cốc /cỏ): Ergin, Ergotamin, Acid lysergic… + Các beta-cacbolin: Harmin, Harmalin, Gohimbin, Reserpin, Emitin. + Các alkaloid từ chi Ba gạc (Rauwolfia): Reserpin, . - Nhóm Purin: Các Xanthin: Caffein, Theobromin, Theophyllin. - Nhóm Terpenoit: + Các alkaloid Aconit: Aconitin. + Các Steroit: Solanin, Samandari (các hợp chất amoni bậc 4: Muscarin, Cholin, Neurin). + Các alkaloid từ dừa cạn (chi Vinca) và các họ hàng của nó: Vinblastin, Vincristin. Chúng là các chất chống ung thư và liên kết các nhò trùng (dime) Tubulin tự do, vì thế phá vỡ cân bằng giữa trùng hợp (polyme hóa) và phản trùng hợp vi quản, tạo ra sự kiềm hãm các tế bào trong pha giữa của quá trình phân bào. 2.2.3.2. Phân loại theo loài thực vật chứa alkaloid và theo tác động sinh lý. a) Nhóm morphin: SVTH: Nguyễn Tấn Thònh 7 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: CN.Bùi Văn Thế Vinh Morphin là alkaloid chủ yếu trong nhựa quả anh túc (Papaver somniferrum) còn xanh cùng với các chất gây nghiện khác như papaverin, Codein, tebain… Morphin ở dạng tinh sạch lần đầu thu được vào năm 1806. Cấu trúc hóa học được xác đònh vào năm 1927. Cấu trúc lập thể được xác đònh vào năm 1955. (Diệp Quỳnh Như, 2008). Morphin được tổng hợp từ tiền chất ban đầu là dimethoxy-o- naphtochinone. Hình 2.1: Cấu trúc một số chất tiêu biểu thuộc nhóm chất Morphin. Morphin có tác dụng giảm đau, gây cảm giác lâng lâng dễ chòu. Morphin tác động lên hệ thần kinh trung ương tạo thói quen sử dụng và phụ thuộc vào nó. Nó ảnh hưởng lên một số thụ thể đặc hiệu nằm trên vỏ bán cầu não lớn. Một số neuropeptide như enkephalin và endorphin cạnh tranh thụ thể trên với Morphin. Nhóm alkaloid phổ biến thứ hai là Codein-dẫn xuất methyleste của Morphin. Hàm lượng của nó trong thuốc phiện dao động từ 0,2 đến 6%. Codein có tác dụng giảm ho. SVTH: Nguyễn Tấn Thònh 8 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: CN.Bùi Văn Thế Vinh Alkaloid thứ ba là tebain không có tác động kích thích gây nghiện nhưng lại gây co giật. Một điểm thú vò là một dẫn xuất của Morphin gọi là nalorphin lại có tính kháng tác động với Morphin, và được sử dụng trong cai nghiện và cấp cứu ngộ độc ma túy. Nhóm chất gây nghiện khác Morphin về cấu tạo hóa học là papaverin có tác dụng giãn mạch làm tăng sử dụng oxy cơ tim, được sử dụng trong điều trò bệnh tim mạch. Hiện papaverin và một số dẫn suất của nó như no-spa và narcotin được sử dụng để chữa ho chủ yếu ở dạng bột tổng hợp hóa học. Hiện nay người ta cũng đã tổng hợp được nhiều chất có tác dụng giống như Morphin nhưng ít độc hơn nhiều để sử dụng trong y tế. b) Nhóm chất cocain: Là nhóm chất alkaloid có trong lá cocain (Erythroxylon coca L) hiện trồng phổ biến ở nhiều nơi, đặc biệt là khu vực các nước Nam Mỹ. Nó được tổng hợp lần đầu vào năm 1909 và được sử dụng làm thuốc giảm đau. Giống như Morphin, cocain cũng có tác dụng gây cảm giác khoan khoái (gây nghiện) và tạo thói quen sử dụng. Hiện dẫn suất cocain như novocain được sử dụng rộng rãi trong chữa trò. SVTH: Nguyễn Tấn Thònh 9 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: CN.Bùi Văn Thế Vinh Hình 2.2: Cấu trúc một số chất tiêu biểu thuộc nhóm chất Cocain. c) Nhóm chất atropin: Atropin là dẫn xuất của tropin có trong cây thuộc họ cà Solanaceae như cà độc dược Atropabelladonna hay Datura stamonium. Chúng có tác dụng an thần và được sử dụng làm thuốc giảm đau cục bộ, làm thuốc an thần. d)Nhóm quinine: Là nhóm chất alkaloid từ lâu được sử dụng làm thuốc chống sốt rét. Quinine có trong vỏ cây qiunine Cinchona officinalis có nguồn gốc ở Peru, Bolivia. Sau này cây quinine được di thực sang nhiều vùng trong đó có cả Việt Nam. Cấu trúc hóa học của quinine được xác đònh vào năm 1907 và được tổng hợp hóa học vào năm 1945. Quinine ức chế quá trình sao chép DNA và phiên mã tạo RNA ở tác nhân gây bệnh sốt rét. SVTH: Nguyễn Tấn Thònh 10 Novacain Cocain [...]... người ta còn tìm thấy các biflavonoid trong ngành rêu Đối với cây có 2 lá mầm thì gặp trong một số họ như: Anacardiaceae, Clusiaceae, Euphorbiaceae, Hypericaceae Đối với cây 1 lá mầm thì gặp trong họ Iridaceae 2.4.4.Lý tính: Các dẫn chất flavon có màu vàng rất nhạt có khi không màu (trường hợp các nhóm OH đã methyl hóa), flavonol vàng nhạt đến vàng, chalcon và auron vàng đậm đến đỏ cam Các chất thuộc... enzyme này có sẵn trong cây, có khả năng cắt bớt các đơn vò đường cuối mạch (xa aglycon) để chuyển thành các glucosid thứ cấp, ví dụ: enzyme digilanidase trong lá digital lông, digipurpidase trong lá digital tía, strophanthobiase trong hạt Strophanthus courmontii, scillarenase trong Urginea maritima Vòng lacton 5 cạnh hay 6 cạnh dễ bò mở vòng bởi tác dụng của kiềm rồi tạo thành dẫn chất iso không có... vò trí 2-3 Các dẫn chất flavon rất phổ biến trong thực vật, kết tinh không màu đến màu vàng nhạt.Chỉ kể những flavon có nhóm thế OH hoặc OCH3 thì hiện nay đã biết có 300 chất Chất flavon đơn giản nhất không có nhóm thế đã được phân lập từ cây anh thảo (Primula) Hai flavon hay gặp nhất trong cây là apigenin và luteolin Các dẫn chất của apigenin là genkwanin, scutellarein Các dẫn chất của luteolin là... homoisoflavon, isoflavonoid thường gặp trong họ Đậu – Fabaceae 2.4.3.3.Neoflavonoid: Chỉ có giới hạn trong một số loại thực vật ví dụ: chất brasilin có trong cây tô mộc-caesalpinia sappan, calophillolid trong cây mù u-calophyllum inophyllum 2.4.3.4.Biflavonoid và Triflavonoid: Những flavonoid dimer và trimer đã có nói đến trong phần flavan-3-ol và flavan-3,4 diol Những chất đó được gọi là proanthocyanidin... chất tiêu biểu thuộc nhóm chất cophein SVTH: Nguyễn Tấn Thònh 11 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: CN.Bùi Văn Thế Vinh g)Nhóm colchicin: Có mặt trong các loại cây thuộc họ cochicum Nó có tác dụng tạo cây đa bội thể, được sử dụng nhiều trong công nghiệp tạo giống cây trồng 2.2.4.Tính chất vật lý: - Phân tử lượng từ 100 đến 900 kDa - Các alkaloid không chứa các nguyên tử oxi trong cấu trúc thông thường là chất. .. scillaren A có trong cây hành biển(Urginea maritima L.) , hellebrin có trong cây Helleborus niger L 2.5.3.2 .Phần đường: Phần đường nối vào nhóm OH ở C-3 của aglycon.Cho đến nay người ta thường biết khoảng 40 loại đường khác nhau Ngoài những đường thông thường như D- Glycose, L-rhamnose, D-xylose, D-fructose có gặp trong những nhóm Glycosid khác, còn lại là những đường gặp trong Glycosid steroid Trong những... 2.4.2.Nguồn gốc: Trong thực vật Flavonoid tập trung chủ yếu vào ngành hạt kín ở lớp 2 lá mầm Ví dụ trong các chi Carthamus, Coreopsis, Dahlia, Gymnosperma, Ageratum… Động vật không tự tổng hợp được Flavonoid, nhưng có thể lấy Flavonoid qua nguồn thức ăn Hàm lượng và cả thành phần Flavonoid trong cây phụ thuộc vào nơi mọc Cây mọc ở vùng nhiệt đới và núi cao thì hàm lượng cao hơn ở nơi cây thiếu ánh sáng... dẫn chất anthocyanidin thì màu thay đổi tùy theo pH của môi trường Tuy nhiên khi các flavonoid ở trong các bộ phận của cây thì còn phụ thuộc vào hỗn hợp với các sắc tố khác Độ tan không giống nhau, thường flavonoid glycosid và flavonoid sulfat là những hợp chất phân cực nên không tan hoặc ít tan trong dung môi hữu cơ, tan được trong nước tốt nhất là là cồn nước Các aglycon flavonoid thì tan được trong. .. sự chuyển đồng phân và tính quang hoạt có thể mất Silybin, silychristin, silidiamin là những chất có trong quả của cây Silybum marianum Gaertn Hỗn hợp các chất trên gọi là “Silymarin” là những chất có tác dụng bảo vệ tế bào gan rất tốt Đây là những dẫn chất do sự kết hợp một phân tử alcol conyferilic (một dẫn chất lignan) với một flavonoid nên được gọi là flavolignan Dihydroflavanol Silybin Hình 2.13:... trong hạt của cây Dipteryx odorata Willd, thuộc họ Đậu Cây này mọc ở Brazil, có trồng ở Venezuela và còn có tên đòa phương là“Coumarou”, SVTH: Nguyễn Tấn Thònh 13 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: CN.Bùi Văn Thế Vinh do đó mà có tên coumarin Benzo α -pyron còn có trong lá cây Asperula odorata L, họ Cà phê; Trong một số cây thuộc chi Melilotus họ Đậu Chất này có mùi thơm dễ chòu, được dùng làm hương liệu Trong