Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
Vòng tẩm progesterone đặt âm đạo do Việt Nam nghiên cứu sản xuất trong khuôn khổ đề tài cấp Bộ NN&PTNT
89 sữa được chẩn đoán mắc bệnh buồng trứng Địa điểm
Bộ môn Ngoại Sản, khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Học viện giáo dục Edufarm, thôn Xuân Linh, xã Thủy Xuân Tiên, huyện Chương Mỹ, Hà Nội
Viện kỹ thuật nhiệt đới, thuộc Viện Hàn lâm khoa học Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt
Bệnh viện MEDLATEC tọa lạc tại số 42-44 Nghĩa Dũng, Phúc Xá, Ba Đình, Hà Nội, là địa chỉ uy tín trong lĩnh vực y tế Ngoài ra, trang trại bò của Công ty giống gia súc Hà Nội nằm ở Phù Đổng, Gia Lâm, Hà Nội, cung cấp nguồn giống chất lượng cao Thời gian phục vụ của cả hai địa điểm đều được thông báo rõ ràng để khách hàng dễ dàng tiếp cận dịch vụ.
Bắt đầu từ tháng 7 năm 2016 đến tháng 6 năm 2017.
Vật liệu nghiên cứu
Vòng CIDR do AHI Plastic Moulding Company, New Zealand sản xuất Mẫu tẩm progesteronedo Việt Nam sản xuất thử nghiệm
Bảng 3.1 Lý lịch bò thí nghiệm
Mã số cũ DAG61807 DAG61645 DAG56008 Không có mã Không có mã
Số tai bò SL – 01Bộ
SL – 02 Bộ NN&PTNT SL – 03 Bộ NN&PTNT SL – 04 Bộ
NN&PTNT SL – 05 Bộ NN&PTNT Phẩm giống F3 (75%HF) F3 (75%HF) F3 (75%HF) F3 (75% Sind) F1 (50%HF)
Lứa đẻ Lứa 3 Lứa 1 40 tháng tuổi Lứa 3 Lứa 4
Tình trạng sinh sản Đã phối 2 lần, không có chửa
Chưa động dục lại sau đẻ
Thiểu năng buồng trứng, chưa có chửa lần nào
Chưa chửa, đã đi giống 2 lần
Chưa chửa, đã đi giống
2 lần sau đẻ Đặc điểm Lông trắng
Lông đen trắng Hơi gầy
Tính cách Dễ tiếp cận Ì bò Dễ tiếp cận Hơi nhát bò Khó tiếp cận
Khối lượng 500 kg 380 kg 350 kg 310 kg 520 kg
Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Cắt buồng trứng bò thí nghiệm
Nội dung 2:Phân tích sản phẩm vòng CIDR (do AHI Plastic Moulding Company, New Zealand sản xuất)
Nội dung 3: Tạo mẫu vòng tẩm progesterone đặt âm đạo
Nội dung 4: Đánh giá khả năng thải trừ progesterone của mẫu vòng thí nghiệm trong âm đạo bò cắt buồng trứng
Nội dung 5: Đánh giá hiệu quả điều trị bệnh buồng trứng trên đàn bò thí nghiệm bằng phác đồ sử dụng vòng ProB và CIDR.
Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Phương pháp chuẩn bị bò thì nghiệm
Năm bò đã được bấm số tai theo mẫu: SL01-SL05 thuộc Bộ NN&PTNT
Bò cần có sức khỏe tốt, không mắc bệnh truyền nhiễm, bệnh nội khoa, hay ký sinh trùng, đặc biệt là không có vấn đề về sinh sản Cần kiểm tra cơ quan sinh dục để đảm bảo không viêm nhiễm và không dị hình Sau khi mua về, bò thí nghiệm sẽ được nuôi ổn định trước khi tiến hành cắt bỏ buồng trứng.
Chuẩn bị thức ăn hàng ngày: Thức ăn được chúng tôi chuẩn bị theo hai mùa (mùa mưa và mùa khô)
Bảng 3.2 Thức ăn mùa mưa
Loại thức ăn Khối lượng
Cỏ xanh ≈ 35kg/con/ngày
Cám hỗn hợp ≈ 1,5kg/con/ngày
Bảng 3.3 Thức ăn mùa khô
Loại thức ăn Khối lượng Ủ chua ≈10-15kg/con/ngày
Cám hỗn hợp ≈1,5kg/con/ngày
Cỏ xanh (nếu có) ≈15kg/con/ngày
Cỏ xanh được trồng cách trại 500 m, với tổng diện tích 3000 m² Mỗi ngày, cỏ được thu hoạch và vận chuyển về trại, sau đó được xay nhỏ bằng máy phay cỏ trước khi cho bò ăn.
Hàng ngày, bò được tắm rửa sạch sẽ, tiếp xúc thường xuyên với bác sỹ thú y để thuận tiện cho công tác lấy máy và điều trị khi cần
Phân và nước tiểu của bò được thu gom hai lần mỗi ngày và được xử lý qua hệ thống biogas trước khi thải ra môi trường.
3.4.2 Phương pháp cắt buồng trứng bò thí nghiệm
Tạo pha thể vàng để cắt buồng trứng bò thí nghiệm
Sau khi gây động dục ở bò thí nghiệm, việc xác định sự hình thành của thể vàng được thực hiện sau 7 ngày qua phương pháp khám lâm sàng trực tràng Để đảm bảo an toàn, tiến hành cắt bỏ buồng trứng trên những bò có thể vàng, vì trong giai đoạn này, hoạt động mạch quản tăng mạnh, dẫn đến nguy cơ nội xuất huyết cao khi phẫu thuật.
Biểu đồ 3.1 Công thức tạo pha thể vòng trên bò thí nghiệm
Sử dụng tổ hợp hormone sinh sản để kích thích động dục ở bò, bắt đầu bằng cách đặt vòng CIDR vào âm đạo vào ngày đầu tiên bằng applicator, đồng thời tiêm GnRH.
Trong quy trình quản lý sinh sản, tiến hành rút vòng CIDR và tiêm PGF 2α, sau đó vào ngày thứ 8 tiêm nhắc lại GnRH Cần quan sát các biểu hiện động dục như bỏ ăn, dịch tiết từ cơ quan sinh dục và niêm mạc âm đạo đỏ Khoảng 7 - 10 ngày sau khi bò có biểu hiện động dục, thực hiện khám lâm sàng qua trực tràng để xác định sự hình thành của thể vàng trước khi tiến hành phẫu thuật cắt bỏ buồng trứng.
Phương pháp phẫu thuật cắt buồng trứng bò
Cố định bò vào gióng sắt 4 trụ chắc chắn, buộc mũi kéo về phía trước và bịt mắt bò trong quá trình phẫu thuật Tiến hành buộc đuôi kéo về phía trước để dễ dàng thao tác Sử dụng găng tay sản khoa đã được làm trơn bằng vaselin để moi phân và kích thích trực tràng, giúp bò đi phân hết Rửa sạch hậu môn và cơ quan sinh dục bên ngoài bằng nước và xà phòng, sau đó lau khô và sát trùng bằng cồn iod Cuối cùng, rửa âm đạo bằng dung dịch iod 0,2%.
CIDR Phẫu thuật cắt buồng trứng Động dục
Tay bác sĩ thú y thực hiện phẫu thuật rửa kỹ bằng xà phòng, sát trùng tay
Trước khi tiến hành phẫu thuật, cần khử trùng dao mổ bằng cách sử dụng cồn trắng ba lần và cồn iod ba lần Sau đó, hãy quấn chặt đầu và cán dao mổ bằng vải gạc vô trùng, chỉ để hở một phần nhỏ mũi dao nhằm giảm thiểu nguy cơ cho người phẫu thuật và âm đạo bò trong quá trình thực hiện.
Thao tác trong phẫu thuật
Sử dụng ngón tay trỏ và ngón tay cái để mở mép âm môn, tay phải cầm dao mổ đã được bọc vải gạc vô trùng, sau đó rạch một đường dài khoảng 3-4 cm phía trên âm đạo, cách cổ tử cung 2 cm Tiếp theo, dùng pank để kẹp và tạo lỗ thủng tương mạc tử cung, sau đó đưa tay phải vào vết mổ để xé rộng và tìm buồng trứng bên phải, kéo buồng trứng vào trong âm đạo Tay trái sẽ đưa dụng cụ cắt buồng trứng vào, trong khi tay phải đưa buồng trứng vào thòng lọng của dụng cụ cắt và ra hiệu cho người phụ mổ bắt đầu xiết Khi buồng trứng bị cắt đứt, nó sẽ rơi vào lòng bàn tay phải của người mổ chính Sau khi cắt xong buồng trứng bên phải, tiến hành cắt buồng trứng bên trái tương tự Cuối cùng, sát trùng vết mổ âm đạo bằng bông cồn tẩm iod và sử dụng kháng sinh trong 3 ngày để phòng nhiễm trùng Mẫu buồng trứng được bảo quản trong dung dịch formol và dán nhãn ghi rõ tên.
Sau phẫu thuật tiêm: Vitamin K: 8 ml/con
Hàng ngày tiêm bổ sung Amoxicillin 15%, Ketovet, quan sát tình trạng sức khỏe, đo nhiệt độ trực tràng bò thí nghiệm
3.4.3 Phương pháp phân tích vỏ silicon tẩm progesteronecủa vòng CIDR Phương pháp hóa học Soxhlet
Hình 3.1 Phương pháp hóa học Soxhlet Cấu tạo bộ Soxhlet gồm 3 bộ phận chính: Bình ngưng, cốc tràn chứa sản phẩm thử và bình chứa dung môi chiết
Để chiết xuất progesterone từ vòng CIDR, trước tiên cắt mỏng vòng CIDR và gói vào giấy lọc, sau đó cho vào cốc tràn Tiếp theo, cho dung môi vào bình chứa và đun sôi Hơi nước sẽ bay lên và gặp lạnh ở đỉnh bình ngưng, tạo ra nước chảy xuống buồng khai thác Nhiệt độ trong cốc tràn sẽ cao, giúp tan chảy progesterone trong vòng CIDR và chảy vào ống thu nước xuống bình sôi Quá trình bay hơi tiếp tục cho đến khi đạt khối lượng chất lỏng cụ thể, sau đó tiến hành ly tâm dung dịch thu được Cuối cùng, cân trọng lượng bột mịn còn lại để xác định lượng progesterone trong vòng CIDR.
Phương pháp ngâm trích ly
Phương pháp ngâm trích ly vòng CIDR trong cồn 90° (cồn tuyệt đối) dựa trên khả năng hòa tan hoàn toàn của progesterone trong cồn này Quá trình ngâm diễn ra trong một khoảng thời gian đủ để progesterone tan hết Sau khi hoàn tất, vòng CIDR được lấy ra, cân trọng lượng và xác định lượng progesterone có trong vòng.
Phương pháp chạy quang phổ đối chiếu progesterone
Bột tẩm trong vòng CIDR được nạo ra từ bề mặt bằng dụng cụ chuyên dụng và kết hợp với KBr, một chất mang, để phân tích bằng máy quang phổ hồng ngoại.
Progesterone dự kiến tẩm vào vòng sản phẩm do Việt Nam sản xuất cũng áp dụng phương pháp tương tự
Sau đó, đối chiếu kết quả giữa hai mẫu progesterone
Phương pháp chụp silicon bằng kính hiển vi điện tử quét
Sau khi trích ly progesterone trong vòng CIDR, mẫu silicon được cho vào kính hiển vi điện tử quét để phân tích cấu trúc
3.4.4 Phương pháp định lượng progesterone trong máu bò thí nghiệm
Phương pháp lấy máu bò
Buộc cao mũi bò vào gióng và sử dụng bông cồn để sát trùng vị trí giữa đốt thứ hai của đuôi, nơi có tĩnh mạch đuôi chạy qua Cắm kim vuông góc với đuôi cho đến khi chạm vào xương đuôi, sau đó rút nhẹ mũi kim và điều chỉnh để kim nằm trong lòng mạch Mỗi lần lấy khoảng 2 ml – 3 ml máu, sau đó tháo kim khỏi xylanh và cho máu vào ống đựng mẫu, lắc nhẹ và ghi rõ tên mẫu, giờ lấy máu và ngày tháng Khi sử dụng ống nghiệm để chắt huyết thanh, cần giữ ống nghiệm ở tư thế nghiêng 45 độ so với mặt đất để đảm bảo an toàn và chính xác.
Bảo quản lạnh trong hộp đựng mẫu, tránh ánh sáng và vận chuyển nhẹ nhàng và cần tiến hành định lượng càng sớm càng tốt
Phương pháp đặt vòng mẫu tẩm progesterone
Do mẫu vòng chưa có thiết bị hỗ trợ đặt nên các mẫu được đưa vào bằng tay
Cố định bò vào gióng và hai chân sau, sau đó vệ sinh âm môn sạch sẽ bằng cồn iod hoặc cồn 70 độ Sử dụng găng tay sản khoa, xoa đều vaselin và cầm các mẫu gọn trong lòng bàn tay Nhẹ nhàng đưa tay vào âm đạo cho đến khi chạm vào cổ tử cung và thả mẫu bên trong.
Phương pháp định lượng progesterone
Bằng phương pháp enzyme miễn dịch (ELISA) được thực hiện tại bệnh viện MEDLATEC
3.4.5 Phương pháp chẩn đoán bệnh buồng trứng
1 Bệnh thể vàng tồn lưu là thể vàng không bị thoái hóa và chu kỳ động dục không được biểu hiện Nguyên nhân có thể do nhiều yếu tố gồm tử cung viêm tích mủ, dịch nhầy trong tử cung, thai chết lưu (phù thai), thai gỗ… Khám qua trực tràng tìm buồng trứng, dùng ngón tay cái xoa nhẹ trên bề mặt buồng trứng thấy có 1 khối nhỏ (bằng hạt ngô, đậu tương, hạt lạc hoặc to hơn) nhô lên khỏi bề mặt buồng trứng, cứng, có chân đế, ranh giới giữa thể vàng và bề mặt buồng trứng rõ (Sử Thanh Long và cs., 2014)
Phương pháp bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1: Sử dụng mẫu tẩm 1,9 gr progesterone Đối tượng nghiên cứu là các mẫu tẩm khoảng 1,9 gr progesterone và vòng
CIDR nhập New Zealand làm đối chứng
Biểu đồ 3.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 1 sử dụng mẫu tẩm 1,9 gr progesterone
Hình 3.2 Mẫu thử nghiệm và vòng CIDR
0 giờ 3 giờ ngày 1 ngày 9 ngày 13
Lấy máu sau mỗi 24h Đặt mẫu thử
Sau khi đặt vòng vào âm đạo bò, cần lấy máu theo các thời điểm cụ thể: (1) sau 3 giờ đặt vòng, (2) liên tiếp trong 9 ngày sau khi đặt vòng, và (3) 4 ngày sau khi rút mẫu vòng ra khỏi âm đạo bò thí nghiệm.
Do bò Việt Nam có thể trạng nhỏ, chúng tôi đã giảm lượng progesterone tẩm trong mẫu từ 1,9 gram xuống còn 1,3 gram để xác định ngưỡng tẩm thấp nhất vẫn đảm bảo hiệu quả.
Thí nghiệm 2: Sử dụng mẫu tẩm 1,3 gr progesterone
Mẫu máu được lấy vào các thời điểm, gồm: (1) trước khi đặt mẫu, (2) trong thời gian 7 ngày đặt mẫu và (3) sau khi rút mẫu 24h
Biểu đồ 3.3 trình bày phương pháp bố trí thí nghiệm 2 với mẫu tẩm 1,3 gram progesterone Thí nghiệm 3 nhằm so sánh hiệu quả điều trị giữa phác đồ sử dụng vòng CIDR và vòng ProB.
Bò thí nghiệm được chia làm 2 nhóm, 1 nhóm áp dụng phác đồ điều trị sử dụng vòng tẩm ProB và 1 nhóm sử dụng vòng CIDR
Do số lượng bò thí nghiệm còn hạn chế, nên nghiên cứu không phân theo 3 bệnh buồng trứng và áp dụng chung 1 phác đồ điều trị
0 giờ 30 phút ngày 1 ngày 7 ngày
Lấy máu sau mỗi 24h Đặt mẫu thử
Nhóm 1: Điều trị với phác đồ sử dụng vòng CIDR
Nhóm 2: Điều trị với phác đồ sử dụng vòng ProB
Hiệu quả điều trị bệnh buồng trứng ở bò thí nghiệm được đánh giá qua khả năng động dục trở lại
