Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
Vòng tẩm progesterone đặt âm đạo do Việt Nam nghiên cứu sản xuất trong khuôn khổ đề tài cấp Bộ NN&PTNT
89 sữa được chẩn đoán mắc bệnh buồng trứng Địa điểm
Bộ môn Ngoại Sản, khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Học viện giáo dục Edufarm, thôn Xuân Linh, xã Thủy Xuân Tiên, huyện Chương Mỹ, Hà Nội
Viện kỹ thuật nhiệt đới, thuộc Viện Hàn lâm khoa học Việt Nam,
Bệnh viện MEDLATEC, số 42-44 Nghĩa Dũng, Phúc Xá, Ba Đình,
Hà Nội Trang trại bò của Công ty giống gia súc Hà Nội, Phù Đổng, Gia Lâm, Hà Nội Thời gian
Bắt đầu từ tháng 7 năm 2016 đến tháng 6 năm 2017.
Vật liệu nghiên cứu
Vòng CIDR do AHI Plastic Moulding Company, New Zealand sản xuất. Mẫu tẩm progesteronedo Việt Nam sản xuất thử nghiệm
Bảng 3.1 Lý lịch bò thí nghiệm
Số tai bò SL – 01Bộ
Tình trạng sinh sản Đã phối 2 lần, không có chửa Đặc điểm Lông trắng
Tính cách Dễ tiếp cận
Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Cắt buồng trứng bò thí nghiệm
Nội dung 2:Phân tích sản phẩm vòng CIDR (do AHI Plastic Moulding Company, New Zealand sản xuất)
Nội dung 3: Tạo mẫu vòng tẩm progesterone đặt âm đạo
Nội dung 4: Đánh giá khả năng thải trừ progesterone của mẫu vòng thí nghiệm trong âm đạo bò cắt buồng trứng
Nội dung 5: Đánh giá hiệu quả điều trị bệnh buồng trứng trên đàn bò thí nghiệm bằng phác đồ sử dụng vòng ProB và CIDR.
Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Phương pháp chuẩn bị bò thì nghiệm
Năm bò được đánh số tai theo mẫu SL01-SL05 của Bộ NN&PTNT, có sức khỏe tốt, không mắc các bệnh truyền nhiễm, nội khoa, ký sinh trùng và đặc biệt không có bệnh về sinh sản Kiểm tra cơ quan sinh dục cho thấy không có viêm nhiễm hay dị hình Sau khi mua về, bò được nuôi ổn định và tiến hành cắt bỏ buồng trứng.
Chuẩn bị thức ăn hàng ngày: Thức ăn được chúng tôi chuẩn bị theo hai mùa (mùa mưa và mùa khô)
Cỏ xanh được trồng cách trại 500 m, với diện tích 3000 m² Mỗi ngày, cỏ được vận chuyển về trại và sau đó được phay nhỏ bằng máy phay cỏ trước khi cho bò ăn.
Hàng ngày, bò được tắm rửa sạch sẽ, tiếp xúc thường xuyên với bác sỹ thú y để thuận tiện cho công tác lấy máy và điều trị khi cần
Phân và nước tiểu của bò được thu dọn hai lần mỗi ngày và được xử lý qua hệ thống biogas trước khi thải ra môi trường Đối với phương pháp cắt buồng trứng bò thí nghiệm, cần tạo pha thể vàng để thực hiện quy trình này.
Gây động dục ở bò thí nghiệm và xác định sự hình thành thể vàng sau 7 ngày bằng phương pháp khám lâm sàng qua trực tràng Cắt bỏ buồng trứng trên những bò có thể vàng là cần thiết để đảm bảo an toàn, do trong giai đoạn này, hoạt động mạch quản tăng mạnh, làm tăng nguy cơ nội xuất huyết khi phẫu thuật.
Ngày 1 Biểu đồ 3.1 Công thức tạo pha thể vòng trên bò thí nghiệm
Sử dụng tổ hợp hormone sinh sản để kích thích động dục ở bò, bắt đầu bằng cách đặt vòng CIDR vào âm đạo và tiêm GnRH vào ngày đầu tiên Vào ngày thứ 7, rút vòng CIDR và tiêm PGF 2α, sau đó vào ngày thứ 8 tiêm lại GnRH Quan sát các dấu hiệu động dục như bỏ ăn, dịch tiết từ cơ quan sinh dục và niêm mạc âm đạo đỏ 7-10 ngày sau khi có biểu hiện động dục, thực hiện khám lâm sàng qua trực tràng để xác định sự hình thành thể vàng trước khi tiến hành phẫu thuật cắt bỏ buồng trứng.
Phương pháp phẫu thuật cắt buồng trứng bò
Cố định bò vào gióng sắt 4 trụ chắc chắn và buộc mũi kéo về phía trước, đồng thời bịt mắt bò để giảm stress trong quá trình phẫu thuật Để dễ thao tác, buộc đuôi bò kéo về phía trước Sử dụng găng tay sản khoa đã được làm trơn bằng vaselin, tiến hành moi phân và kích thích trực tràng để làm sạch Sau đó, rửa sạch hậu môn và cơ quan sinh dục bên ngoài bằng nước và xà phòng, lau khô và sát trùng bằng cồn iod Cuối cùng, rửa âm đạo bằng dung dịch iod 0,2%.
Bác sĩ thú y tiến hành phẫu thuật bằng cách rửa tay kỹ lưỡng với xà phòng và sát trùng 6 lần bằng cồn trắng và cồn iod Để đảm bảo an toàn, dao mổ được chuẩn bị với vải gạc vô trùng quấn chặt, chỉ để hở một phần nhỏ mũi dao, nhằm hạn chế nguy hiểm cho người phẫu thuật và âm đạo bò trong quá trình thực hiện.
Thao tác trong phẫu thuật
Sử dụng ngón tay trỏ và ngón tay cái để mở mép âm môn, tay phải cầm dao mổ đã được cuốn gạc vô trùng, tiến hành rạch một đường dài khoảng 3 – 4 cm phía trên âm đạo gần cổ tử cung Sau khi rạch, dùng pank để kẹp làm thủng tương mạc tử cung, sau đó đưa tay phải vào mở rộng vết mổ và tìm buồng trứng bên phải Kéo buồng trứng vào trong âm đạo, sử dụng dụng cụ cắt buồng trứng và ra hiệu cho người phụ mổ xiết từ từ để cắt và cầm máu Khi buồng trứng bị đứt, nó sẽ rơi vào lòng bàn tay người mổ chính Tiến hành cắt buồng trứng bên trái theo phương pháp tương tự Sau khi cắt bỏ cả hai buồng trứng, dùng bông cồn tẩm iod để sát trùng vết mổ âm đạo và dùng kháng sinh trong 3 ngày để phòng ngừa nhiễm trùng Cuối cùng, bảo quản mẫu buồng trứng trong dung dịch formol và dán nhãn ghi rõ tên.
Sau phẫu thuật tiêm: Vitamin K: 8 ml/con
Hàng ngày tiêm bổ sung Amoxicillin 15%, Ketovet, quan sát tình trạng sức khỏe, đo nhiệt độ trực tràng bò thí nghiệm
3.4.3 Phương pháp phân tích vỏ silicon tẩm progesteronecủa vòng CIDR Phương pháp hóa học Soxhlet
Hình 3.1 Phương pháp hóa học Soxhlet Cấu tạo bộ Soxhlet gồm 3 bộ phận chính: Bình ngưng, cốc tràn chứa sản phẩm thử và bình chứa dung môi chiết
Để tiến hành, cắt mỏng vòng CIDR và gói vào giấy lọc, sau đó cho vào cốc tràn Tiến hành cho dung môi vào bình chứa và đun sôi Hơi nước sẽ bay lên và gặp lạnh đột ngột ở đỉnh bình ngưng, tạo ra nước chảy xuống buồng khai thác Nhiệt độ trong cốc tràn gần như đạt mức sôi, giúp tan chảy progesterone trong vòng CIDR và chảy vào ống thu Quá trình này tiếp tục cho đến khi khối lượng chất lỏng đạt giá trị cụ thể, sau đó tiến hành ly tâm dung dịch thu được Cuối cùng, cân bột mịn còn lại để xác định lượng progesterone có trong vòng CIDR.
Phương pháp ngâm trích ly
Phương pháp ngâm trích ly trong cồn 90 độ (cồn tuyệt đối) cho phép progesterone tan hoàn toàn, giúp chiết xuất hiệu quả từ vòng CIDR Sau khi ngâm trong cồn 90 độ đủ thời gian, vòng CIDR được lấy ra, cân trọng lượng và xác định lượng progesterone có trong vòng.
Phương pháp chạy quang phổ đối chiếu progesterone
Bột tẩm trong vòng CIDR được nạo ra bằng dụng cụ chuyên dụng và kết hợp với KBr, một chất mang, để thực hiện phân tích phổ trên máy quang phổ hồng ngoại.
Progesterone dự kiến tẩm vào vòng sản phẩm do Việt Nam sản xuất cũng áp dụng phương pháp tương tự
Sau đó, đối chiếu kết quả giữa hai mẫu progesterone
Phương pháp chụp silicon bằng kính hiển vi điện tử quét
Sau khi trích ly progesterone trong vòng CIDR, mẫu silicon được cho vào kính hiển vi điện tử quét để phân tích cấu trúc
3.4.4 Phương pháp định lượng progesterone trong máu bò thí nghiệm Phương pháp lấy máu bò
Buộc cao mũi bò vào gióng và sử dụng bông cồn để sát trùng tại vị trí giữa đốt thứ 2 của đuôi, nơi có tĩnh mạch đuôi Cắm kim vuông góc với đuôi cho đến khi chạm vào xương và điều chỉnh để kim nằm trong lòng mạch Mỗi lần lấy khoảng 2 ml – 3 ml máu, sau đó chuyển máu vào ống đựng mẫu và ghi rõ thông tin mẫu, thời gian và ngày lấy máu Khi sử dụng ống nghiệm để chắt huyết thanh, cần giữ ống ở tư thế nghiêng 45 độ và bảo quản lạnh trong hộp đựng mẫu, tránh ánh sáng Vận chuyển nhẹ nhàng và thực hiện định lượng càng sớm càng tốt Phương pháp đặt vòng mẫu tẩm progesterone cũng cần được chú ý.
Do mẫu vòng chưa có thiết bị hỗ trợ đặt nên các mẫu được đưa vào bằng tay.
Cố định bò vào gióng và hai chân sau, đồng thời vệ sinh sạch âm môn bằng cồn iod hoặc cồn 70 độ Sử dụng găng tay sản khoa, thoa đều vaselin và giữ các mẫu trong lòng bàn tay Nhẹ nhàng đưa tay vào âm đạo cho đến khi chạm cổ tử cung, sau đó thả mẫu bên trong âm đạo Đây là phương pháp định lượng progesterone hiệu quả.
Bằng phương pháp enzyme miễn dịch (ELISA) được thực hiện tại bệnh viện MEDLATEC
3.4.5 Phương pháp chẩn đoán bệnh buồng trứng
Bệnh thể vàng tồn lưu xảy ra khi thể vàng không bị thoái hóa và chu kỳ động dục không biểu hiện, nguyên nhân có thể do viêm tử cung, dịch nhầy trong tử cung, thai chết lưu hoặc thai gỗ Để chẩn đoán, có thể khám qua trực tràng để tìm buồng trứng, và khi dùng ngón tay cái xoa nhẹ trên bề mặt buồng trứng sẽ cảm nhận được khối nhỏ nhô lên, có kích thước tương đương hạt ngô hoặc lớn hơn, cứng và có chân đế, với ranh giới rõ ràng giữa thể vàng và bề mặt buồng trứng (Sử Thanh Long và cs., 2014).
2 Bệnh u nang buồng trứng là những nang trứng không rụng và lưu lại lâu trên buồng trứng, đường kính lớn hơn 2,5cm Bò bị u nang thường biểu hiện động dục thường xuyên và liên tục không theo chu kỳ Tiến hành sờ khám qua trực tràng thấy buồng trứng to hơn bình thường (bằng quả trứng gà), sờ trên bề mặt buồng trứng thấy có một u nang (hoặc nhiều hơn) cảm giác mềm, dễ vỡ và có vách ngăn không rõ ràng (Sử Thanh Long và cs., 2014).
3 Buồng trứng không hoạt động có hình thái dẹt, cứng, nhỏ, không cân đối
Phương pháp bố trí thí nghiệm
Trong thí nghiệm 1, chúng tôi đã sử dụng mẫu tẩm 1,9 gram progesterone để nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu bao gồm các mẫu tẩm progesterone và vòng CIDR nhập khẩu từ New Zealand được sử dụng làm đối chứng Mẫu thử đã được đặt để tiến hành thí nghiệm.
0 giờ 3 giờ ngày 1 ngày 9 ngày 13
Biểu đồ 3.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 1 sử dụng mẫu tẩm 1,9 gr progesterone
Hình 3.2 Mẫu thử nghiệm và vòng CIDR
Sau khi đặt vòng vào âm đạo bò, cần tiến hành lấy máu theo các thời điểm cụ thể: (1) sau 3 giờ từ khi đặt vòng, (2) trong 9 ngày liên tiếp sau khi đặt vòng, và (3) 4 ngày sau khi rút vòng ra khỏi âm đạo bò thí nghiệm.
Do bò Việt Nam có thể trạng nhỏ, chúng tôi đã giảm lượng progesterone tẩm trong mẫu từ 1,9 gram xuống 1,3 gram để xác định ngưỡng tẩm thấp nhất vẫn đảm bảo hiệu quả.
Thí nghiệm 2: Sử dụng mẫu tẩm 1,3 gr progesterone
Mẫu máu được lấy vào các thời điểm, gồm: (1) trước khi đặt mẫu, (2) trong thời gian 7 ngày đặt mẫu và (3) sau khi rút mẫu 24h Đặt mẫu thử
0 giờ 30 phút ngày 1 ngày 7 ngày
Biểu đồ 3.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 2 sử dụng mẫu tẩm
Thí nghiệm 3: So sánh điều trị giữa phác đồ sử dụng vòng CIDR và vòng ProB
Bò thí nghiệm được chia làm 2 nhóm, 1 nhóm áp dụng phác đồ điều trị sử dụng vòng tẩm ProB và 1 nhóm sử dụng vòng CIDR
Do số lượng bò thí nghiệm còn hạn chế, nên nghiên cứu không phân theo 3 bệnh buồng trứng và áp dụng chung 1 phác đồ điều trị
Nhóm 1: Điều trị với phác đồ sử dụng vòng CIDR Động dục PGF2α
Nhóm 2: Điều trị với phác đồ sử dụng vòng ProB Động dục PGF2α
Hiệu quả điều trị bệnh buồng trứng ở bò thí nghiệm được đánh giá qua khả năng động dục trở lại