Đối tượng, vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng, vật liệu và thời gian nghiên cứu
- Giống lan Hoàng thảo Vôi đỏ nhập nội từ Đài Loan và được trồng tại vườn tập đoàn các giống lan - Viện Di truyền Nông nghiệp
Cây Hoàng thảo Vôi đỏ được nhân giống từ lá non, chồi đỉnh và các đoạn thân mang mắt ngủ Môi trường khoáng nuôi cấy sử dụng là môi trường VW cải tiến (Vacine and Went, 1949), với thành phần 30g/l đường sucrose, cùng với vitamin và các chất điều hòa sinh trưởng có nồng độ thay đổi theo mục đích thí nghiệm, đảm bảo pH đạt 5,8.
3.1.3 Thời gian, địa điểm nghiên cứu
- Tại Viện Di truyền Nông Nghiệp.
Nội dung nghiên cứu
3.2.1 Tạo mẫu nuô cấy vô trùng
- Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng khác nhau đến hiệu quả khử trùng của mẫu nuôi cấy
+ Thí nghiệm 1.1: Nghiên cứu ảnh hưởng của Nồng độ chất khử trùng đến hiệu quả khử trùng của mẫu lá non nuôi cấy
Hóa chất Công thức mt
Tỉ lệ mẫu không đạt (%)
Môi trường hồi phục sau khử trùng: VW + 30 g/L sucrose + 10% nước dừa (ND) + 10% chuối xanh (CX) + 0,5g/L than hoạt tính (AC) + 5,5 g/L agar, pH = 5,8
+ Thí nghiệm 1.2: Nghiên cứu ảnh hưởng của Nồng độ chất khử trùng đến hiệu quả khử trùng của mẫu chồi đỉnh nuôi cấy
Hóa chất Công thức mt
Tỉ lệ mẫu không đạt (%)
Môi trường hồi phục sau khử trùng: VW + 30 g/L sucrose + 10% nước dừa (ND) + 10% chuối xanh (CX) + 0,5g/L than hoạt tính (AC) + 5,5 g/L agar, pH = 5,8
+ Thí nghiệm 1.3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng đến hiệu quả khử trùng của mẫu đoạn thân
Hóa chất Công thức mt
Tỉ lệ mẫu không đạt (%)
Môi trường hồi phục sau khử trùng: VW + 30 g/L sucrose + 10% nước dừa (ND) + 10% chuối xanh (CX) + 0,5g/L than hoạt tính (AC) + 5,5 g/L agar, pH = 5,8
- Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nguồn mẫu đến sinh trưởng của mẫu nuôi cấy
Mục đích của thí nghiệm là để quan sát, so sánh và xác định nguồn mẫu tối ưu nhất từ thí nghiệm 1, nhằm phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
Nguồn mẫu Tỷ lệ sống(%) Nhận xét
Môi trường nền chung: VW + 30 g/L sucrose + 10% nước dừa (ND) + 10% chuối xanh (CX) + 0,5g/L than hoạt tính (AC) + 5,5 g/L agar, pH = 5,8
Thí nghiệm3: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng của mẫu nuôi cấy
Mục đích của thí nghiệm là xác định môi trường nuôi cấy tối ưu nhằm thúc đẩy sự sinh trưởng của mẫu nuôi cấy Thí nghiệm sử dụng nguồn mẫu đã được xác định từ các nghiên cứu trước đó.
Thí nghiệm được nghiên cứu trong điều kiện tối ưu về nhiệt độ, pH, ánh sáng
Công thức 1 (VW): Môi trường khoáng Vacin and Went (1949)
Công thức 2 (VW1): môi trường VW tăng gấp đôi lượng KNO 3 và
Công thức 3 (VW2): môi trườngVW1 bổ sung thêm vitamin của môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962)
Công thức 4 (MS/2): môi trường MS giảm đi 1 nửa
Môi trường nền: 30 g/l Sucrose + 10% ND + 10% CX + 0,5 g/l AC + 5,5 g/l agar, pH 5,8
Môi trường tối ưu sẽ được xác định và chọn làm môi trường nền tối ưu (NTU) cho các thí nghiệm tiếp theo Môi trường nền tối ưu này được ký hiệu là NTU.
Môi trường nền chung: NTU +30 g/L sucrose + 10% nước dừa (ND) + 10% chuối xanh (CX) + 0,5 g/L AC + 5,5 g/L agar, pH = 5,8
- Thí nghiệm 4:Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy
Mẫu được lựa chọn sinh trưởng trong loại môi trường được xác định là tốt nhất ở thí nghiệm 3
Trong nghiên cứu này, các công thức môi trường được thử nghiệm với nồng độ bổ sung 6-BA khác nhau để đánh giá hiệu quả phát triển Công thức 1 (B1) không có 6-BA, trong khi Công thức 2 (B2) có nồng độ 0,5mg/l Công thức 3 (B3) sử dụng 1mg/l 6-BA, tiếp theo là Công thức 4 (B4) với 2mg/l, Công thức 5 (B5) với 2,5mg/l, và cuối cùng là Công thức 6 (B6) với nồng độ 3mg/l Tất cả các công thức này đều được pha trộn trong môi trường nền chung, bao gồm NTU, 30 g/L sucrose và 10% nước dừa.
3.2.2 Nghiên cứu phương pháp nhân nhanh thông qua protocorn ở các đ ều k ện nuô cấy khác nhau
- Thí nghiệm 5: Đánh giá ảnh hưởng của 6-BA lên khả năng nhân protocorm
Sau khi xác định môi trường tạo protocorm, cần thu nhận protocorm có chất lượng tốt, với đặc điểm là màu xanh khỏe mạnh, không xuất hiện hiện tượng thủy tinh hóa và mọng nước để tiến hành thí nghiệm.
Môi trường nền chung: NTU + 30 g/L sucrose + 10% ND + 10% CX + 0,5 g/L AC + 5,5 g/L agar, pH 5,8
- Thí nghiệm 6 : Đánh giá ảnh hưởng của 6-BA kết hợp với kinetin lên khả năng nhân protocorm
Nồng độ 6-BA được xác định là tối ưu cho quá trình nhân nhanh protocorm trong thí nghiệm 6, và mẫu được sử dụng trong thí nghiệm này được lấy từ kết quả của thí nghiệm trước đó.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã thử nghiệm các công thức với nồng độ kinetin bổ sung khác nhau trong môi trường Cụ thể, Công thức 1 không bổ sung kinetin (0,0 mg/l), trong khi Công thức 2 bổ sung 0,1 mg/l, Công thức 3 là 0,2 mg/l, Công thức 4 là 0,3 mg/l, Công thức 5 là 0,4 mg/l và Công thức 6 có nồng độ 0,5 mg/l Những nồng độ này sẽ giúp đánh giá ảnh hưởng của kinetin đến sự phát triển của cây trồng trong môi trường thí nghiệm.
Môi trường nền chung: NTU + 6-BA(thí nghiệm 5) + 30 g/L sucrose + 10% ND + 10% CX + 0,5 g/L AC + 5,5 g/L agar, pH =5,8
3.2.3 Ngh ên cứu phương pháp tá s nh cây và tạo cây hoàn chỉnh
- Thí nghiệm7: Nghiên cứu môi trường tái sinh cây
Thí nghiệm 7.1 nhằm nghiên cứu tác động của nồng độ 6-BA đối với khả năng tái sinh và nhân chồi Mẫu thu được từ các thí nghiệm tối ưu môi trường nhân nhanh protocorm sẽ được áp dụng trong giai đoạn này.
Môi trường nền chung: NTU + 30 g/L sucrose + 10% ND + 10% CX + 0,5 g/L AC + 5,5 g/L agar, pH 5,8
+ Thí nghiệm 7.2: Ảnh hưởng của nồng độ kết hợp 6-BA và kinetin đến khả năng tái sinh và nhân chồi
Môi trường nền chung: NTU + 6-BA (thí nghiệm 7.1) + 30 g/L sucrose + 10%
ND + 10% CX + 0,5 g/L AC + 5,5 g/L agar, pH 5,8
- Thí nghiệm 8 : Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến sinh trưởng và phát triển của cây con in vitro
Thí nghiệm 8.1 nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của GA3 đến khả năng kéo dài chồi của cây con in vitro Cây con được sử dụng trong thí nghiệm này là những cây đã được tái sinh từ thí nghiệm 7.
Môi trường nền chung: NTU + 6-BA( thí nghiệm 7.1) + kinetin (thí nghiệm 7.2) + 30 g/L sucrose + 10% ND + 10% CX+ 0,5 g/L AC + 5,5 g/L agar, pH =5,8
Thí nghiệm 8.2 nghiên cứu tác động của α-NAA đối với sự phát triển rễ của cây con in vitro, sử dụng cây con có kết quả tốt nhất từ thí nghiệm 8.1 làm vật liệu chính cho nghiên cứu này.
Môi trường nền chung: NTU + 30 g/L sucrose + 10% ND + 10% CX + 0,5 g/L AC + 5,5 g/L agar, pH =5,8
+ Thí nghiệm 8.3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nước Dừa đến quá trình sinh trưởng của cây con in vitro
Cây con cho kết quả tốt nhất ở thí nghiệm 8.2 được sử dụng cho thí nghiệm này CT1: 0ml/l
Môi trường nền chung: NTU + α-NAA (thí nghiệm 8.2) + 30 g/L sucrose + 10%
3.2.4 Nghiên cứu phương pháp huấn luyện và đưa cây in vitro ra ngoà vườn ươm
Thí nghiệm 10: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số biện pháp huấn luyện cây in vitro trong bình trước khi ra ngôi
Cây con thu thập được khi đã đạt được các chỉ tiêu về chiều cao, lá, rễ … tiến hành cho ra vườn ươm
Công thức 1: Cây đưa từ in vitro ra ngôi ngoài vườn ươm ngay
Công thức 2: Bình cây để ở hành lang 3 ngày sau lấy ra và đưa ra vườn ươm
Công thức 3: Bình cây để ở hành lang 3 ngày sau đó mang ra nhà lưới 3 ngày trước khi ra ngôi
Công thức 4: Bình cây để ở hành lang 3 ngày sau đó mang ra nhà lưới mở nắp bình 3 ngày trước khi ra ngôi
Thí nghiệm 11: Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại giá thể khác nhau lên tỷ lệ sống sót khi ra cây trong nhà lưới
Các loại giá thể thông dụng :
Phương pháp nghiên cứu
Các thí nghiệm khởi tạo thể tiền chồi, nhân thể tiền chồi và tạo cây hoàn chỉnh từ thể tiền chồi được thực hiện trên các môi trường khác nhau, bao gồm môi trường MS, VW và các môi trường phù hợp cho hoa lan, với việc bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokinin và gibberelin, cùng với các phụ gia như nước dừa và chuối xanh Mẫu lá non được cấy trên đĩa petri, trong khi mẫu chồi đỉnh và đoạn thân được cấy vào ống nghiệm, và mẫu thực vật được nuôi trong bình tam giác 250 ml ở điều kiện 25±1 oC với ánh sáng 10 giờ/ngày Các thí nghiệm được lặp lại ít nhất 3 lần với 5 bình mẫu mỗi lần, và số liệu thu được được xử lý thống kê bằng Excel và phần mềm IRRISTAT 5.0.
3.3.1 Giai đoạn chọn và xử lý mẫu
- Lá non:chọn những mẫulá non của cây lan trưởng thành sau đó rửa sạch bằng xà phòng, lau qua cồn 70 0 rồi tiến hành khử trùng mẫu
Chồi đỉnh là phần quan trọng trong việc nhân giống cây lan trưởng thành Để thực hiện, bạn cần chọn các đỉnh sinh trưởng từ chồi, cắt mẫu dài khoảng 5cm, sau đó rửa sạch bằng xà phòng Tiếp theo, lau qua bằng cồn 70 độ để khử trùng mẫu, đảm bảo an toàn cho quá trình nhân giống.
Để lấy mẫu đoạn thân bánh tẻ mang mắt ngủ của cây lan trưởng thành, bạn cần cắt đoạn dài khoảng 10cm Sau đó, rửa sạch mẫu bằng xà phòng, lau qua với cồn 70 độ và cắt thành từng đoạn nhỏ trước khi tiến hành khử trùng.
3.3.2 Các hóa chất và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
- Hóa chất khử trùng : cồn, HgCl2, H2O2
- Môi trường nuôi cấy MS (Murashige& Skoog, 1962) và môi trường VW ( Vacin & Went, 1949)
- Các chất kích thích sinh trưởng: 6-BA, Kinetin, α- NAA, GA3
- Cân phân tích 10 -4 , cân kĩ thuật 10 -2
3.3.3 Phương pháp pha chế môi trường nuôi cấy in vitro
Môi trường cơ bản trong nuôi cấy bao gồm VW (Vacin & Went, 1949), với WV1 là phiên bản tăng gấp đôi lượng KNO3 và NH4SO4 WV2 là môi trường WV1, được bổ sung thêm vitamin từ môi trường MS và môi trường 1/2 MS (môi trường MS giảm lượng đi một nửa) Các chất điều hòa sinh trưởng như α-NAA, 6-BA, và GA3 được sử dụng với nồng độ khác nhau tùy theo từng thí nghiệm, trong khi chất chống oxi hóa và chất ngăn ngừa nhiễm được sử dụng là Rifamicine.
Thành phần môi trường: WV, WV1, WV2 và 1/2 MS
Môi trường nuôi cấy được bổ sung với dịch quả chuối xanh, 10% nước dừa, than hoạt tính, và agar 5g/l, với pH đạt 5,8 Điều kiện nuôi cấy lý tưởng là nhiệt độ 23±2°C, trong đó mẫu nuôi cấy phát triển chồi dưới ánh sáng 16 giờ mỗi ngày với cường độ 2000-2500 lux Để đảm bảo vô trùng, môi trường được khử trùng trong 20 phút ở nhiệt độ 117°C.
Các chỉ tiêu theo dõi
Tỉ lệ sống: số mẫu sống/ tổng số mẫu cấy;
Tỉ lệ chết: số mẫu chết/ tổng số mẫu cấy;
Tỉ lệ phát sinh hình thái: dạng Protocorm, dạng chồi
- Giai đoạn nuôi cấy khởi động
Hệ số nhân: tổng số mẫu thu được/ tổng số mẫu ban đầu;
Số chồi/ mẫu: số chồi thu được/ số mẫu cấy
Hệ số nhân: tổng số mẫu thu được/ tổng số mẫu ban đầu;
Số chồi/ mẫu: số chồi thu được/ số mẫu cấy;
Chất lượng chồi thu được
- Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh
Tỉ lệ rễ/ chồi: tổng số tễ thu được/ tổng số chồi;
Chiều dài trung bình rễ: tổng chều dài rễ/ số rễ;
Chiều cao cây, số lá / cây, tỉ lệ ra rễ(%), và số rễ/ cây
- Giai đoạn nuôi cấy ngoài vườn ươm:
Tỷ lệ mẫu sống (%): Số mẫu sống/ Tổng số mẫu cấy;
Chiều dài lá, chiều rộng lá, số rễ, chiều dài rễ;
Xuất hiện rễ mới sau bao nhiêu ngày;
Chiều cao cây, đường kính cây;
Chiều dài rễ, đường kính rễ.
