Đối tượng, vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng, vật liệu và thời gian nghiên cứu
- Giống lan Hoàng thảo Vôi đỏ nhập nội từ Đài Loan và được trồng tại vườn tập đoàn các giống lan - Viện Di truyền Nông nghiệp
Cây Hoàng thảo Vôi đỏ được nhân giống từ lá non, chồi đỉnh và các đoạn thân mang mắt ngủ Môi trường khoáng nuôi cấy sử dụng là môi trường VW cải tiến, với thành phần 30g/l đường sucrose, bổ sung vitamin và một số chất điều hòa sinh trưởng, nồng độ điều chỉnh tùy theo mục đích thí nghiệm, pH duy trì ở mức 5,8.
3.1.3 Thời gian, địa điểm nghiên cứu
- Tại Viện Di truyền Nông Nghiệp.
Nội dung nghiên cứu
3.2.1 Tạo mẫu nuô cấy vô trùng
- Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng khác nhau đến hiệu quả khử trùng của mẫu nuôi cấy
+ Thí nghiệm 1.1: Nghiên cứu ảnh hưởng của Nồng độ chất khử trùng đến hiệu quả khử trùng của mẫu lá non nuôi cấy
Hóa chất Công thức mt
Tỉ lệ mẫu không đạt (%)
Môi trường hồi phục sau khử trùng: VW + 30 g/L sucrose + 10% nước dừa (ND) + 10% chuối xanh (CX) + 0,5g/L than hoạt tính (AC) + 5,5 g/L agar, pH = 5,8
+ Thí nghiệm 1.2: Nghiên cứu ảnh hưởng của Nồng độ chất khử trùng đến hiệu quả khử trùng của mẫu chồi đỉnh nuôi cấy
Hóa chất Công thức mt
Tỉ lệ mẫu không đạt (%)
Môi trường hồi phục sau khử trùng: VW + 30 g/L sucrose + 10% nước dừa (ND) + 10% chuối xanh (CX) + 0,5g/L than hoạt tính (AC) + 5,5 g/L agar, pH = 5,8
+ Thí nghiệm 1.3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng đến hiệu quả khử trùng của mẫu đoạn thân
Hóa chất Công thức mt
Tỉ lệ mẫu không đạt (%)
Môi trường hồi phục sau khử trùng: VW + 30 g/L sucrose + 10% nước dừa (ND) + 10% chuối xanh (CX) + 0,5g/L than hoạt tính (AC) + 5,5 g/L agar, pH = 5,8
- Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nguồn mẫu đến sinh trưởng của mẫu nuôi cấy
Mục đích của thí nghiệm là quan sát, so sánh và xác định nguồn mẫu tối ưu nhất từ thí nghiệm 1, nhằm phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
Nguồn mẫu Tỷ lệ sống(%) Nhận xét
Môi trường nền chung: VW + 30 g/L sucrose + 10% nước dừa (ND) + 10% chuối xanh (CX) + 0,5g/L than hoạt tính (AC) + 5,5 g/L agar, pH = 5,8
Thí nghiệm3: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng của mẫu nuôi cấy
Mục đích của thí nghiệm là xác định môi trường nuôi cấy tối ưu để hỗ trợ sự sinh trưởng của mẫu nuôi cấy, sử dụng nguồn mẫu được xác định từ thí nghiệm trước.
Thí nghiệm được nghiên cứu trong điều kiện tối ưu về nhiệt độ, pH, ánh sáng
Công thức 1 (VW): Môi trường khoáng Vacin and Went (1949)
Công thức 2 (VW1): môi trường VW tăng gấp đôi lượng KNO 3 và
Công thức 3 (VW2): môi trườngVW1 bổ sung thêm vitamin của môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962)
Công thức 4 (MS/2): môi trường MS giảm đi 1 nửa
Môi trường nền: 30 g/l Sucrose + 10% ND + 10% CX + 0,5 g/l AC + 5,5 g/l agar, pH 5,8
Môi trường nền tối ưu, được ký hiệu là NTU, sẽ được lựa chọn làm môi trường tối ưu cho các thí nghiệm tiếp theo.
Môi trường nền chung: NTU +30 g/L sucrose + 10% nước dừa (ND) + 10% chuối xanh (CX) + 0,5 g/L AC + 5,5 g/L agar, pH = 5,8
- Thí nghiệm 4:Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy
Mẫu được lựa chọn sinh trưởng trong loại môi trường được xác định là tốt nhất ở thí nghiệm 3
Bài viết này trình bày các công thức khác nhau với nồng độ 6-BA bổ sung trong môi trường nuôi cấy thực vật Cụ thể, Công thức 1 (B1) không có 6-BA, trong khi Công thức 2 (B2) bổ sung 0,5mg/l, Công thức 3 (B3) có 1mg/l, Công thức 4 (B4) là 2mg/l, Công thức 5 (B5) là 2,5mg/l, và Công thức 6 (B6) là 3mg/l Tất cả các công thức này đều sử dụng môi trường nền chung gồm NTU, 30 g/L sucrose, và 10% nước dừa.
3.2.2 Nghiên cứu phương pháp nhân nhanh thông qua protocorn ở các đ ều k ện nuô cấy khác nhau
- Thí nghiệm 5: Đánh giá ảnh hưởng của 6-BA lên khả năng nhân protocorm
Sau khi xác định môi trường để tạo protocorm, cần thu nhận protocorm có chất lượng tốt, với màu xanh khỏe mạnh, không bị thủy tinh hóa và đảm bảo độ mọng nước để tiến hành thí nghiệm.
Môi trường nền chung: NTU + 30 g/L sucrose + 10% ND + 10% CX + 0,5 g/L AC + 5,5 g/L agar, pH 5,8
- Thí nghiệm 6 : Đánh giá ảnh hưởng của 6-BA kết hợp với kinetin lên khả năng nhân protocorm
Nồng độ 6-BA tối ưu cho quá trình nhân nhanh protocorm đã được xác định qua thí nghiệm 6, sử dụng mẫu từ các thí nghiệm trước đó.
Nghiên cứu này khảo sát ảnh hưởng của nồng độ kinetin bổ sung trong môi trường, với các công thức từ 0,0 mg/l đến 0,5 mg/l Cụ thể, công thức 1 không bổ sung kinetin, trong khi các công thức 2, 3, 4, 5 và 6 lần lượt bổ sung 0,1 mg/l, 0,2 mg/l, 0,3 mg/l, 0,4 mg/l và 0,5 mg/l kinetin Sự khác biệt về nồng độ kinetin có thể ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh trưởng của thực vật trong môi trường nuôi cấy.
Môi trường nền chung: NTU + 6-BA(thí nghiệm 5) + 30 g/L sucrose + 10% ND + 10% CX + 0,5 g/L AC + 5,5 g/L agar, pH =5,8
3.2.3 Ngh ên cứu phương pháp tá s nh cây và tạo cây hoàn chỉnh
- Thí nghiệm7: Nghiên cứu môi trường tái sinh cây
Thí nghiệm 7.1 nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 6-BA đến khả năng tái sinh và nhân chồi Mẫu thu được từ các thí nghiệm tối ưu môi trường nhân nhanh protocorm sẽ được sử dụng cho các thí nghiệm trong giai đoạn này.
Môi trường nền chung: NTU + 30 g/L sucrose + 10% ND + 10% CX + 0,5 g/L AC + 5,5 g/L agar, pH 5,8
+ Thí nghiệm 7.2: Ảnh hưởng của nồng độ kết hợp 6-BA và kinetin đến khả năng tái sinh và nhân chồi
Môi trường nền chung: NTU + 6-BA (thí nghiệm 7.1) + 30 g/L sucrose + 10%
ND + 10% CX + 0,5 g/L AC + 5,5 g/L agar, pH 5,8
- Thí nghiệm 8 : Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến sinh trưởng và phát triển của cây con in vitro
Thí nghiệm 8.1 nhằm nghiên cứu tác động của GA3 đến khả năng kéo dài chồi của cây con in vitro Cây con được chọn từ thí nghiệm 7, nơi chúng đã được tái sinh, sẽ được sử dụng làm vật liệu cho thí nghiệm này.
Môi trường nền chung: NTU + 6-BA( thí nghiệm 7.1) + kinetin (thí nghiệm 7.2) + 30 g/L sucrose + 10% ND + 10% CX+ 0,5 g/L AC + 5,5 g/L agar, pH =5,8
Thí nghiệm 8.2 nghiên cứu tác động của α-NAA đối với sự hình thành rễ của cây con in vitro, sử dụng cây con có kết quả tốt nhất từ thí nghiệm 8.1 làm vật liệu cho thí nghiệm này.
Môi trường nền chung: NTU + 30 g/L sucrose + 10% ND + 10% CX + 0,5 g/L AC + 5,5 g/L agar, pH =5,8
+ Thí nghiệm 8.3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nước Dừa đến quá trình sinh trưởng của cây con in vitro
Cây con cho kết quả tốt nhất ở thí nghiệm 8.2 được sử dụng cho thí nghiệm này CT1: 0ml/l
Môi trường nền chung: NTU + α-NAA (thí nghiệm 8.2) + 30 g/L sucrose + 10%
3.2.4 Nghiên cứu phương pháp huấn luyện và đưa cây in vitro ra ngoà vườn ươm
Thí nghiệm 10: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số biện pháp huấn luyện cây in vitro trong bình trước khi ra ngôi
Cây con thu thập được khi đã đạt được các chỉ tiêu về chiều cao, lá, rễ … tiến hành cho ra vườn ươm
Công thức 1: Cây đưa từ in vitro ra ngôi ngoài vườn ươm ngay
Công thức 2: Bình cây để ở hành lang 3 ngày sau lấy ra và đưa ra vườn ươm
Công thức 3: Bình cây để ở hành lang 3 ngày sau đó mang ra nhà lưới 3 ngày trước khi ra ngôi
Công thức 4: Bình cây để ở hành lang 3 ngày sau đó mang ra nhà lưới mở nắp bình 3 ngày trước khi ra ngôi
Thí nghiệm 11: Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại giá thể khác nhau lên tỷ lệ sống sót khi ra cây trong nhà lưới
Các loại giá thể thông dụng :
Phương pháp nghiên cứu
Các thí nghiệm khởi tạo thể tiền chồi, nhân thể tiền chồi và tạo cây hoàn chỉnh từ thể tiền chồi được thực hiện trên nhiều nền môi trường khác nhau, bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật và phụ gia như nước dừa và chuối xanh Môi trường khoáng nuôi cấy bao gồm môi trường MS, VW và các môi trường phù hợp cho nuôi cấy hoa lan, với các thành phần như đường sucroza, vitamin, chuối xanh và các chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokinin và gibberelin Mẫu lá non được cấy trên đĩa petri, trong khi mẫu chồi đỉnh và đoạn thân được cấy vào ống nghiệm, và mẫu thực vật trong thí nghiệm nhân thể tiền chồi được cấy vào bình tam giác 250 ml Các mẫu được nuôi ở điều kiện 25±1 o C, với ánh sáng 10 giờ/ngày ở cường độ 2000-2500 lux hoặc trong điều kiện không chiếu sáng Các thí nghiệm tối ưu hóa môi trường được thực hiện theo nguyên tắc tối ưu một biến, lặp lại ít nhất 3 lần với 5 bình mẫu cho mỗi lần thử nghiệm Dữ liệu thu được được xử lý thống kê bằng Excel và phần mềm IRRISTAT 5.0.
3.3.1 Giai đoạn chọn và xử lý mẫu
- Lá non:chọn những mẫulá non của cây lan trưởng thành sau đó rửa sạch bằng xà phòng, lau qua cồn 70 0 rồi tiến hành khử trùng mẫu
Chồi đỉnh là phần sinh trưởng quan trọng trên cây lan trưởng thành Để thu hoạch, chọn các đỉnh sinh trưởng và cắt chúng dài khoảng 5cm Sau đó, rửa sạch bằng xà phòng, lau qua với cồn 70 độ, và tiến hành khử trùng mẫu để đảm bảo an toàn cho cây.
Để tiến hành lấy mẫu đoạn thân bánh tẻ từ cây lan trưởng thành, cần chọn đoạn dài khoảng 10cm Sau đó, rửa sạch mẫu bằng xà phòng, lau qua bằng cồn 70 độ và cắt thành từng đoạn nhỏ để tiến hành khử trùng.
3.3.2 Các hóa chất và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
- Hóa chất khử trùng : cồn, HgCl2, H2O2
- Môi trường nuôi cấy MS (Murashige& Skoog, 1962) và môi trường VW ( Vacin & Went, 1949)
- Các chất kích thích sinh trưởng: 6-BA, Kinetin, α- NAA, GA3
- Cân phân tích 10 -4 , cân kĩ thuật 10 -2
3.3.3 Phương pháp pha chế môi trường nuôi cấy in vitro
Môi trường nuôi cấy cơ bản được sử dụng bao gồm VW (Vacin & Went, 1949), với WV1 là phiên bản tăng gấp đôi lượng KNO3 và NH4SO4, và WV2 là WV1 được bổ sung vitamin từ môi trường MS và 1/2 MS Các chất điều hòa sinh trưởng như α-NAA, 6-BA, GA3 được sử dụng với nồng độ khác nhau tùy thuộc vào từng thí nghiệm Để ngăn ngừa oxi hóa và nhiễm khuẩn, Rifamicine được áp dụng.
Thành phần môi trường: WV, WV1, WV2 và 1/2 MS
Môi trường nuôi cấy bao gồm dịch quả chuối xanh, 10% nước dừa, than hoạt tính, agar 5g/l, với pH 5,8 Điều kiện nuôi cấy được duy trì ở nhiệt độ 23±2°C, với chế độ chiếu sáng 16 giờ/ngày và cường độ ánh sáng từ 2000 đến 2500 lux Trước khi sử dụng, môi trường được khử trùng trong 20 phút ở nhiệt độ 117°C.
Các chỉ tiêu theo dõi
Tỉ lệ sống: số mẫu sống/ tổng số mẫu cấy;
Tỉ lệ chết: số mẫu chết/ tổng số mẫu cấy;
Tỉ lệ phát sinh hình thái: dạng Protocorm, dạng chồi
- Giai đoạn nuôi cấy khởi động
Hệ số nhân: tổng số mẫu thu được/ tổng số mẫu ban đầu;
Số chồi/ mẫu: số chồi thu được/ số mẫu cấy
Hệ số nhân: tổng số mẫu thu được/ tổng số mẫu ban đầu;
Số chồi/ mẫu: số chồi thu được/ số mẫu cấy;
Chất lượng chồi thu được
- Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh
Tỉ lệ rễ/ chồi: tổng số tễ thu được/ tổng số chồi;
Chiều dài trung bình rễ: tổng chều dài rễ/ số rễ;
Chiều cao cây, số lá / cây, tỉ lệ ra rễ(%), và số rễ/ cây
- Giai đoạn nuôi cấy ngoài vườn ươm:
Tỷ lệ mẫu sống (%): Số mẫu sống/ Tổng số mẫu cấy;
Chiều dài lá, chiều rộng lá, số rễ, chiều dài rễ;
Xuất hiện rễ mới sau bao nhiêu ngày;
Chiều cao cây, đường kính cây;
Chiều dài rễ, đường kính rễ.