TỔNG QUAN LÝ THUYẾT
Gi ớ i thi ệ u v ề cây ổ i
1.1.1 Nguồn gốc và phân bố a) Nguồn gốc
Cây ổi, có tên khoa học là Psidium guajava L, được biết đến trong dân gian với nhiều tên gọi như phan thạch lựu, thu quả, kê thị quả, phan nhẫm, bạt tử và phan quỷ tử.
Ổi, có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới châu Mỹ, hiện nay được trồng rộng rãi và trở thành loại quả phổ biến Với hàm lượng Vitamin C cao, ổi thường được tiêu thụ tươi và ngày càng được chế biến thành các sản phẩm như mứt, sấy khô, đóng hộp và trà ổi.
Hình 1.1 Cây ổi b) Phân bố
- Cây ổi thuộc Họ Sim (Myrtaceae) có khoảng 3.000 loài, phân bố trong 130 – 150 chi Chúng phân bổ rộng khắp ở vùng nhiệt đới và ôn đới ấm áp trên thế giới.
- Cây ổi (Psidium guajava) còn gọi là cây ổi thường (Common guava) hay cây ổi táo
Quả ổi táo (Apple guava) là một trong những loại cây cho trái ngon nhất thuộc chi ổi, có nguồn gốc từ Trung Mỹ và các khu vực lân cận như Mexico, vùng vịnh Caribbean, cũng như Trung và Nam Mỹ.
Hiện nay, Việt Nam không chỉ trồng giống ổi ta truyền thống mà còn phát triển các giống ổi mới như ổi Xá lị nhập từ Trung Quốc và ổi không hạt Sự phổ biến của những giống ổi này được thúc đẩy bởi công nghệ chọn giống hiện đại.
1.1.2 Đặc điểm thực vật của cây ổi [15] a) Thân
Cây có thân phân cành nhiều, chiều cao từ 4 đến 6m, tối đa lên đến 10m, với đường kính thân đạt 30cm Các giống mới thường nhỏ và lùn hơn, trong khi thân cây chắc khỏe và ngắn nhờ sự phân cành sớm Thân cây nhẵn, ít bị sâu đục, và vỏ già có thể tróc ra từng mảng, lộ ra lớp vỏ mới nhẵn, màu xám và hơi xanh Cành non có hình dáng 4 cạnh, sau đó dần chuyển sang hình tròn khi trưởng thành.
Hình 1.2 Thân cây ổi b) Rễ cây ổi
Rễ ổi có cấu trúc rễ cọc, với các giống ổi trồng từ hạt thường phát triển bộ rễ chính sâu vào đất Bộ rễ này có khả năng thích nghi tốt với sự thay đổi đột ngột về độ ẩm trong đất.
Hình 1.3 Bộ rễ cây ổi c) Lá ổi
Lá đơn mọc đối, không có lá kèm, với phiến lá hình bầu dục, dài từ 11 đến 16 cm và rộng từ 5 đến 7 cm Đầu lá có thể có lông gai hoặc lõm, mặt trên lá có màu xanh đậm hơn so với mặt dưới.
Bìa phiến nguyên có lá non với đường viền màu hồng tía kéo dài đến cuống lá, trong khi gân lá hình lông chim với gân giữa nổi rõ ở mặt dưới Mỗi lá có từ 14 đến 17 cặp gân phụ, và cuống lá có màu xanh, hình trụ, dài từ 1 đến 1,3 cm với rãnh cạn ở mặt trên.
Hình 1.4 Lá ổi d) Hoa ổi
- Hoa to, lưỡng tính, mọc từng chùm 2 – 3 chiếc
- Cánh hoa màu trắng mỏng, dễ rụng khi hoa nở Hoa thụ phấn chéo dễ dàng nhưng cũng có thể tự thụ phấn
Hình 1.5 Hoa ổi e) Quả & hạt
Quả có hình dạng tròn, hình trứng hoặc hình quả lê, kích thước từ 3 đến 10 cm tùy thuộc vào giống Vỏ quả khi còn non có màu xanh, nhưng khi chín sẽ chuyển sang màu vàng, với thịt vỏ có màu trắng, vàng hoặc ửng đỏ Ruột quả có thể là màu trắng, vàng hoặc đỏ.
Hạt có màu vàng nâu, hình đa giác và vỏ cứng, nằm trong khối thịt quả có màu trắng, hồng, đỏ vàng Thời gian từ khi thụ phấn đến khi quả chín khoảng 100 ngày.
Hình 1.6 Quả & hạt ổi 1.1.3 Thành phần hóa học [9]
Tanin (7–10%) gồm gallotanins, axit ellagic và các chất chuyển hóa
Các axit hữu cơ gồm axit mastinic, axit aleanolic, axit oxalic, axit guaijavolic, axit guajanoic, axit crategolic, axit psidiolic, axit ursolic
Flavonoit gồm quercetin, leucocyanidin, avicularin, guajaverin
- Hoa chứa axit ellagic, guaijaverin, leucocyanidin, axit oleic, quercetin
Các đường hữu cơ (7%) như frutose, glucose, galactose, saccarose…
Các tinh dầu tạo mùi thơm thuộc các nhóm andehit và ancol như etylaxetat, butyrat, humulene, myrcene, pinene, axit cinamic
Các sắc tố loại chlorophyl, anthocyanidin
- Rễ và vỏ thân chứa axit arjunolic, axit gallic, leucocyanidin, quercetin
- Hàm lượng dinh dưỡng trung bình trong 100 gam quả ổi: 1 gam protein, 15 mg canxi,
Quả ổi chứa 1 mg sắt, 0,06 mg retinol (vitamin A), 0,05 mg thiamin (vitamin B1) và 200 mg axit ascorbic (vitamin C), với hàm lượng vitamin C cao hơn đáng kể so với cam Ngoài ra, quả ổi còn giàu pectin, mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe.
- Theo một tài liệu khác, quả ổi chứa 77,9% nước, 0,9% protein, 0,3% lipit, 15% cacbohydrat, 0,3% axit hữu cơ, 0,5% tro, 0,03 mg% vitamin B1, 0,03 mg% vitamin
B2, 0,2 mg% vitamin PP, 50 – 60 mg% vitamin C Các loại đường trong quả ổi gồm 58,9% fructoza, 35,7% glucoza, 5,3% saccaroza Các axit hữu cơ chính là axit citric và axit malic
- Theo Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ (healthaliciousness.com):
Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng trong 100g quảổi
Quảổi, tính theo 100g phần ăn được
Năng lượng 36 – 50 cal Hàm lượng nước 77 – 86 g
Carotenen (vitamin A) 200 – 400 IU Acid ascorbic (vitamin C) 200 – 400 mg Thiamin (vitamin B1) 0.046 mg Riboflavin (vitamin B2) 0.03 – 0.04 mg Niacin (vitamin B3) 0.6– 1.068 mg
1.1.5 Các hợp chất có hoạt tính sinh học của lá ổi non [1]
According to Tran Viet Hung (2006), the bioactive components of guava leaves include β-sitosterol and flavonoids such as quercetin, leucocyanidin, avicularin, and guajavarin The phenolic compounds are the primary constituents responsible for the high antioxidant activity found in guava leaves.
Nghiên cứu của Witayapan Nantitanon và cộng sự (2010) đã phân tích thành phần phenolic của lá ổi, xác định các hợp chất như acid gallic, acid ellagic, catechin, morin và quercetin Đồng thời, Hui – Yin Chen và Gow – Chin Yen (2007) cũng báo cáo rằng acid gallic và acid ferulic là hai thành phần phenolic chính trong dịch chiết lá ổi.
- Trạng thái vật lý: là chất bột màu trắng, chất sáp có mùi đặc trưng
- Khả năng hòa tan: thuộc nhóm kỵ nước, tan tốt trong rượu
- Khối lượng phân tử: 414,71 g/mol
- Nhiệt độ nóng chảy: 136 – 140 o C b) Các flavonoid
- Trạng thái vật lý: chất lỏng không màu
- Khối lượng phân tử: 290,27 g/mol
- Trạng thái vật lý: là bột tinh thể màu vàng
- Khảnăng hòa tan: không hòa tan trong nước, hòa tan trong các dung dịch nước kiểm
- Khối lượng phân tử: 302,236 g/mol
- Khối lượng phân tử: 434,35 g/mol
- Khối lượng phân tử: 306,26 g/mol
- Khối lượng phân tử: 434,35 g/mol
- Công thức cấu tạo: c) Acid phenolic
- Trạng thái vật lý: tinh thể màu trắng hoặc trắng vàng
- Khả năng hòa tan trong nước: 1,1 g/100ml nước ở 20 o C (dạng khan) và 1,5 g/100ml nước ở 20 o C (monohydrate)
- Công thức phân tử: C 6 H2(OH)3COOH
- Khối lượng phân tử: 170,12 g/mol
- Trạng thái vật lý: tinh thể trong suốt
- Khối lượng phân tử: 194,18 g/mol
- Khối lượng phân tử: 302,197 g/mol.
Ứ ng d ụ ng c ủ a cây ổ i
1.2.1 Các nghiên cứu dược học về lá ổi [16]
Lá ổi đã được công nhận qua nhiều nghiên cứu lâm sàng và dược học về tác dụng trị tiêu chảy Đặc biệt, lá ổi được ghi trong Dược điển Hòa Lan như một phương thuốc hiệu quả cho tình trạng này.
A study conducted at the Universade Federal do Rio de Janeiro in Brazil found that an extract from guava leaves, at a concentration of 8 µg/ml, exhibited a significant anti-Simian Rotavirus effect, reducing diarrhea by 82.2% (Journal of Ethnopharmacology, Issue 99 – 2005).
Trong một nghiên cứu lâm sàng về tác dụng trị tiêu chảy ở 62 trẻ em mắc siêu vi Rotavirus, thời gian hồi phục trung bình là 3 ngày (87,1%), cho thấy sự cải thiện rõ rệt so với nhóm đối chứng.
Tác d ụ ng tr ị b ệnh đườ ng ru ộ t:
Các flavonoid quercetin có trong lá có khả năng kích thích bài tiết axetylcholine trong ruột, từ đó kích thích cơ trơn ruột Hoạt động này giúp ngăn chặn các ion calcium và ức chế các enzyme liên quan đến tổng hợp prostaglandins, góp phần giảm cơn đau bụng do co thắt cơ trơn của ruột.
Lá ổi không chỉ hỗ trợ tái hấp thu nước trong ruột mà còn chứa lectins có khả năng gắn kết với vi khuẩn E.Coli, ngăn chặn chúng bám vào thành ruột và từ đó giúp phòng ngừa nhiễm trùng ruột hiệu quả.
Tác d ụ ng kháng sinh, kháng siêu và di ệ t n ấ m gây b ệ nh: Hoạt tính kháng vi trùng của lá ối được liệt kê trong Fitoterapia Số 73 – 2002
- Dịch chiết từ lá và vỏ thân có tác dụng sát trùng trên các vi khuẩn như Staphylococcus,
Shigella, Salmonella, Bacillus, E.coli, Clostridium và E.coli
- Dịch chiết từ lá bằng nước muối 1:40 có tác dụng diệt trùng trên Staphylococcus aureus
- Nước ép tươi từ lá ở nồng độ 66% có hoạt tính diệt siêu vi Tobacco mosaic
- Nước chiết từ lá ngăn chặn được sự tăng trưởng của các nấm Trichophyton rubrum,
Một nghiên cứu tại Đại học Petra, Amman, Jordan đã chỉ ra rằng dịch chiết lá ổi có khả năng ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn Propionibacterium acnes, nguyên nhân chính gây ra mụn trứng cá Hoạt tính này được so sánh với dầu tràm, doxycycline và clindamycin thông qua phương pháp đo vùng ức chế bằng đĩa tẩm hoạt chất Kết quả cho thấy vùng ức chế của dịch chiết lá ổi đạt từ 15.8 – 17.6 mm đối với P acnes và 11.3 – 15.7 mm đối với S aureus Mặc dù hiệu quả không bằng các kháng sinh doxycycline và clindamycin, dịch chiết lá ổi vẫn có thể là lựa chọn hữu ích cho những trường hợp mụn trứng cá không thể sử dụng kháng sinh.
Tác d ụ ng trên h ệ tim m ạ ch: Nghiên cứu tại ĐH Universidade Federal de Sergipe,
Nghiên cứu tại Sao Cristovao, Brazil, cho thấy dịch chiết từ lá ổi có nhiều hoạt tính tích cực đối với hệ tim mạch, có khả năng hỗ trợ điều trị tim loạn nhịp (Brazilian Journal of Medicine & Biological Research, Số 36 – 2003) Lá ổi có tác dụng kháng oxy hóa, bảo vệ tim và cải thiện chức năng tim Trong hai thử nghiệm không chọn trước đối tượng tại Viện Nghiên cứu Tim Mạch, việc tiêu thụ 450 gram ổi tươi mỗi ngày trong 12 tuần giúp hạ huyết áp trung bình 8 điểm, giảm cholesterol 9%, giảm triglycerides 8% và tăng HDL 8% Hoạt tính này được cho là do ổi chứa nhiều potassium và chất xơ hòa tan, tuy nhiên, việc duy trì chế độ ăn 450-900 gram ổi mỗi ngày để đạt hiệu quả điều trị là một thách thức.
Tác d ụ ng h ạ đườ ng trong máu:
Nghiên cứu tại Viện Nghiên cứu Sinh học và Công nghệ Sinh học Hàn Quốc (Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology) ở Daejeon đã phát hiện hoạt tính ức chế enzym protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) trong dịch chiết lá Ối Hoạt tính này cho thấy nước lá Ối có tác dụng điều trị tiểu đường loại 2, với kết quả thử nghiệm trên chuột Lepr (db) cho thấy liều 10 mg/kg giúp hạ glucose trong máu một cách rõ rệt (Journal of Ethnopharmacology, Số 96 – 2005).
Một nghiên cứu tại Đài Loan cho thấy nước ép từ quả tươi chích qua màng phúc toan với liều 1.0g/kg có tác dụng hạ đường huyết ở chuột do alloxan gây ra Mặc dù hoạt tính hạ đường này không kéo dài và yếu hơn nhiều so với chlorpropamide và metformin, việc tiêu thụ ối tươi vẫn có thể mang lại lợi ích cho người tiểu đường (American Journal of Chinese Medicine, Số 11 – 1983).
1.2.2 Một số vị thuốc dân gian sử dụng ổi [1]
Theo y học dân gian, ổi có vị chát, hơi ngọt và tính bình Các bộ phận của cây ổi như búp non, lá non, quả, vỏ rễ và vỏ thân được sử dụng làm thuốc Ổi có tác dụng thu liễu, cầm tiêu chảy, chống sưng tấy và cầm máu, do đó được dùng để điều trị đau bụng tiêu chảy do tiêu hóa yếu, sưng ruột và kiết lỵ do nhiễm trùng Ngoài ra, ổi còn có công dụng trong việc trị chấn thương và ngứa ngoài da.
- Một vài vị thuốc cụ thể:
Để chữa tiêu chảy, bạn có thể sử dụng búp ổi hoặc lá ổi non 12 – 20 g, gừng nướng 10 g, củ riềng khô 10 – 12 g và vỏ quýt khô 10 – 12 g Các nguyên liệu này cho vào ấm, sắc với 500 ml nước, sau đó cô lại còn 200 ml Chia lượng nước này thành 2 lần uống trong ngày trước bữa ăn.
Để chữa viêm dạ dày – ruột cấp tính, bạn có thể sử dụng 30 g lá ổi non đã cắt nhỏ, sao chung với một nắm gạo Sau đó, cho hỗn hợp vào 500 ml nước, đun sôi cho đến khi còn 200 ml, rồi lọc lấy nước Chia nước sắc này thành 2 lần uống trong ngày, tốt nhất là vào lúc bụng đói.
Để chữa bệnh zona (bệnh giời leo), bạn cần chuẩn bị 100g búp ổi non, 10g phèn chua và 1g muối Sau khi rửa sạch các nguyên liệu, cho vào cối và giã nhỏ Thêm một ít nước sạch để trộn đều, sau đó dùng hỗn hợp này bôi lên vùng da bị đau.
Chữa cửu lị (lị mãn tính): lấy 2 – 3 quả ổi khô thái phiến, sắc uống hoặc lá ổi tươi
Để điều trị lị trực khuẩn cấp và mãn tính, bạn có thể sử dụng 30 g lá ổi, 30 g phượng vĩ thảo và 3 g cam thảo Hãy sắc hỗn hợp này với 1 lít nước, sau đó cô lại còn 500 ml Mỗi ngày, bạn nên uống 2 lần, mỗi lần 50 ml để đạt hiệu quả tốt nhất.
Trẻ em tiêu hóa không tốt có thể sử dụng bài thuốc từ lá ổi 30 g, hồng căn thảo 30 g, hồng trà 10 – 12 g, và gạo tẻ thơm 15 – 30 g Sắc hỗn hợp này với 1 lít nước, cô lại còn 500 ml, thêm một ít đường trắng và muối ăn Trẻ em từ 1 – 6 tháng tuổi nên uống 250 ml mỗi ngày, trong khi trẻ từ 1 tuổi trở lên có thể uống 500 ml, chia thành vài lần trong ngày.
T ạ i Ấn Độ : Theo Y học Ayurvedic
- Vỏ cành ổi dùng để trị tiêu chảy, đau bụng, đau bao tử
- Lá ổi để trị ho và lỡ trong miệng
- Quả ổi sau khi bỏ hột có tác dụng nhuận trường
T ạ i Trung Hoa: Y học cổ truyền không xem ổi là vị thuốc nhưng tùy địa phương việc dùng ổi trị bệnh cũng khá phổ biến
Gi ớ i thi ệ u m ộ t s ố vi khu ẩ n
1.3.1 Nhóm vi khuẩn Gram dương (Gr + ) a) Staphylococcus aureus (tụ cầu khuẩn) [17]
Staphylococcus aureus, hay còn gọi là Tụ cầu vàng, là một loại tụ cầu khuẩn Gram dương kỵ khí tùy nghi, thường là nguyên nhân chính gây nhiễm khuẩn trong các loài tụ cầu Loài vi khuẩn này thường được phân lập từ da và màng nhầy của cả người và động vật máu nóng (Trần Linh Thước, 2006).
Nhiễm trùng do Staphylococcus aureus có thể gây ra nhiều triệu chứng khác nhau, bao gồm nhiễm trùng da, tổ chức dưới da và các cơ quan nội tạng, với biểu hiện mưng mủ đặc trưng, nhiễm trùng huyết và bại huyết Đặc biệt, Staphylococcus aureus còn có khả năng sản sinh độc tố đường ruột trong thực phẩm, gây ra các vấn đề về sức khỏe.
Staphylococcus aureus là vi khuẩn hình cầu, thường tập hợp thành cụm giống chùm nho, có đường kính từ 0,7 đến 1 micromet Vi khuẩn này bắt màu Gram dương, không có lông, không di động và không sinh nha bào Mặc dù hầu hết các chủng không có giáp mô, nhưng một số ít chủng lại có giáp mô.
Staphylococcus aureus là một loại vi khuẩn không có nha bào, do đó có sức đề kháng kém đối với nhiệt độ và hóa chất Cụ thể, ở 70 độ C, vi khuẩn này bị tiêu diệt trong 1 giờ, ở 80 độ C chết trong khoảng 10 – 30 phút, và khi đun sôi ở 100 độ C, chúng sẽ chết chỉ trong vài phút Ngoài ra, S aureus cũng dễ bị tiêu diệt bởi các loại thuốc sát trùng thông thường, như acid fenic 3 – 5% có khả năng giết vi khuẩn trong 3 – 15 phút và formol 1%.
% tiêu diệt vi khuẩn trong 1 giờ, cồn nguyên chất không có tác dụng đối với
Staphylococcus aureus nhưng cồn 70 % diệt vi khuẩn trong vài phút (Nguyễn Vĩnh
Staphylococcus aureus có khả năng sản sinh nhiều loại độc tố, bao gồm độc tố dung huyết, độc tố diệt bạch cầu, độc tố gây hoại tử da, độc tố gây chết, độc tố đường ruột và các yếu tố độc lực ngoại bào Bên cạnh đó, vi khuẩn này còn tạo ra các nhân tố gây bệnh như chất làm tan tơ huyết, men làm đông huyết tương và nhân tố khuếch tán (Trần Thị Phận, 2004).
Staphylococcus aureus là một loại vi khuẩn phổ biến gây nhiễm trùng bệnh viện và có khả năng kháng một số loại kháng sinh Mức độ kháng và loại kháng sinh mà vi khuẩn này kháng lại phụ thuộc vào điều kiện địa lý Sự kháng thuốc của Staphylococcus aureus là một vấn đề đáng chú ý trong y học hiện đại.
Staphylococcus aureus kháng lại các nhóm kháng sinh nhóm - lactams nhờ men
Một số còn kháng được methicillin gọi là methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA), do nó tạo được các protein gắn vào vị trí tác động của kháng sinh
Hiện nay, một số tụ cầu đã phát triển khả năng kháng lại các thế hệ cephalosporin Trong những trường hợp này, vancomycin được sử dụng như một phương án thay thế hiệu quả (Lê Huy Chính, 2007).
Nhiễm khuẩn ngoài da do Staphylococcus aureus gây ra có thể làm mưng mủ các vết thương và vùng da bị sây sát, dẫn đến tình trạng sưng tấy và hình thành áp xe.
Nhiễm khuẩn huyết xảy ra khi tụ cầu khuẩn từ các ổ nhiễm trùng ngoài da xâm nhập vào máu, dẫn đến tình trạng huyết nhiễm mủ và hình thành các ổ áp xe ở các cơ quan khác Tụ cầu khuẩn là nguyên nhân chính gây ra các bệnh lý như viêm xoang, viêm amygdale và viêm vú ở người (Trần Thị Phận, 2004) Ngoài ra, loại vi khuẩn này cũng gây viêm vú ở bò sữa và viêm da có mủ ở chó (Nguyễn Như Thanh và ctv, 1997; Lưu Hữu Mãnh).
Trong số các loài động vật, ngựa là loài dễ bị nhiễm bệnh nhất, tiếp theo là chó, bò, lợn và cừu Ngược lại, gà và vịt lại có sức đề kháng cao nhất đối với vi khuẩn Staphylococcus aureus.
Theo nghiên cứu của Trần Thị Phận (2004), thỏ rất nhạy cảm với vi khuẩn Staphylococcus aureus Khi tiêm vi khuẩn này vào tĩnh mạch, thỏ có thể tử vong chỉ sau 1-2 ngày do nhiễm trùng huyết, với các ổ áp xe xuất hiện ở tim, thận, xương và bắp thịt Ngoài ra, việc tiêm vi khuẩn dưới da cũng dẫn đến tình trạng áp xe dưới da ở thỏ.
Hình 1.7 Staphylococcus aureus dưới kính hiện vi điện tử 20,000x b) Bacillus cereus
Bacillus cereus là một loại vi khuẩn hiếu khí, có bào tử hình oval và khả năng sinh nha bào Loài vi khuẩn này lần đầu tiên được phát hiện trong một trường hợp ngộ độc thực phẩm vào năm 1955.
Giữa những năm 1972 và 1986, đã có 52 trường hợp ngộ độc thực phẩm do Bacillus cereus được phát hiện và báo cáo, chiếm khoảng 2% tổng số ca bệnh thực phẩm, tuy nhiên con số thực tế có thể lớn hơn rất nhiều.
Bacillus cereus là một loại vi khuẩn Gram dương ở giai đoạn chưa trưởng thành, nhưng có thể chuyển sang Gram âm khi trưởng thành Vi khuẩn này có kích thước từ 0,5 đến 1,5 x 2 đến 4 micromet, có hình dạng que và có khả năng sinh bào tử Bacillus cereus sống trong môi trường kị khí và tồn tại rộng rãi trong tự nhiên Đặc biệt, vi khuẩn này không tạo giáp mô và không có khả năng di động.
Vi khuẩn Bacillus cereus là nguyên nhân phổ biến gây ngộ độc thực phẩm, nhưng một số chủng của vi khuẩn này lại mang lại lợi ích cho hệ vi sinh vật đường ruột của động vật.
Hình 1.8 Khuẩn lạc B cereus trên đĩa thạch máu cừu
1.3.2 Nhóm vi khuẩn Gram âm (Gr-) a) Pseudomonas aeruginosa
M ộ t s ố bài báo nghiên c ứ u khoa h ọ c v ề cây ổ i
1.4.1 Bài báo nghiên cứu khoa học trong nước [1], [9], [12]
1 Nguyễn Vân Anh “So sánh hoạt tính kháng khuẩn của lá 4 nhóm ổi ruột đỏ ( Psidium Guajava L.)” Cần Thơ –năm 2012.
Bốn nhóm Ổi Ruột Đỏ (Psidium gaujava) được trồng trong cùng một điều kiện về nhiệt độ, ánh sáng và dinh dưỡng đã được chiết xuất bằng methanol thông qua phương pháp ngâm để thu được cao ổi.
Cao lá 4 nhóm ORD có hoạt tính kháng khuẩn tốt trên tất cả chủng vi khuẩn thử nghiệm và mạnh nhất trờn vi khuẩn Staphylococcus aureus (32 àg/ml ≤ MIC ≤
Vi khuẩn gây bệnh phổ biến trên gia súc gia cầm và con người, với khả năng đề kháng cao đối với các kháng sinh nhóm β-lactams, là nguyên nhân chính gây viêm vú ở bò sữa và viêm da mủ ở chó (Nguyễn Như Thanh và ctv, 1997; Lưu Hữu Mãnh, 2009).
Cao lá ORD có hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả đối với P aeruginosa với MIC 512 µg/ml, đây là loại vi khuẩn kháng cefoperazone và aminoglycoside (Hoàng Kim Tuyến và cộng sự, 2005) P aeruginosa là tác nhân gây ra nhiều bệnh lý ở động vật, bao gồm viêm teo mũi, viêm tử cung ở bò, chảy nước mũi ở chó mèo, và nhiễm trùng máu ở gà (Carter, 1978).
2 Nguyễn Thành Lộc “Báo cáo nghiên cứu dược liệu cây ổi ( Psidium Guajava L.)”
Kết quả nghiên cứu định tính cho thấy dược liệu ổi chứa nhiều thành phần quan trọng như tinh dầu, flavonoid, tannin và chất béo Qua khảo sát các hệ dung môi với tỷ lệ khác nhau, hệ dung môi chloroform – ethyl acetat – acid formic (5:5:1) đã cho kết quả tách vết sắc ký rõ ràng và đẹp nhất.
3 Nguyễn Thị Ngọc Lan “Nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hóa học các hợp chất trong lá ổi non ( Psidium Guajava L )”
Ngâm lá ổi non trong các dung môi như n-hexan, chloroform, etylaxetat và cồn tuyệt đối trong 3 ngày, sau đó pha loãng và đo phổ UV-VIS để xác định dung môi tối ưu.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, dịch chiết từ lá ổi non trong dung môi cồn tuyệt đối có màu xanh đậm và đạt mật độ quang cao nhất theo đo UV-VIS Vì vậy, cồn tuyệt đối được xác định là dung môi tối ưu để chiết xuất các hợp chất hóa học trong lá ổi non.
Bảng 1.2 Màu sắc và mật độ quang của các dịch chiết ngâm trong các dung môi khác nhau STT Tên dung môi Màu sắc Mật độ quang
4 Cồn tuyệt đối Xanh đậm 2.6128
1.4.2 Bài báo nghiên cứu khoa học ngoài nước [13],[14]
1 “Antimicrobial Activities of Leaf Extracts of Guava ( Psidium guajava L ) on Two Gram-Negative and Gram-Positive Bacteria”, International Journal of Microbiology Volume 2013
Nghiên cứu đã chứng minh tiềm năng kháng khuẩn của chiết xuất lá Psidium guajava bằng cách sử dụng các dung môi khác nhau Kết quả cho thấy ethanol và metanol hiệu quả hơn n-hexane và nước trong việc chiết xuất các đặc tính kháng khuẩn của lá ổi.
Chất chiết xuất từ lá ổi không có khả năng kháng khuẩn đối với vi khuẩn gram âm, điều này cho thấy rằng chúng không chứa các hoạt chất có khả năng chống lại các sinh vật này.
Nghiên cứu cho thấy rằng ổi chứa các hợp chất kháng khuẩn có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gram dương, cụ thể là Bacillus cereus và Staphylococcus aureus Việc chiết xuất các hợp chất này bằng metanol hoặc ethanol đã chứng minh hiệu quả trong việc ngăn chặn sự tăng trưởng của các loại vi khuẩn này.
2 “Chemical Components and Bioactivities of Psidium guajava ”, International Journal of Food Nutrition and Safety, 2014
Cây Psidium guajava, hay còn gọi là cây ổi, đã thu hút sự chú ý nhờ vào tiềm năng chất chống oxy hóa của nó Các nghiên cứu đã tiến hành đánh giá khả năng chống oxy hóa của chiết xuất từ quả ổi thông qua các xét nghiệm in vitro như ABTS, DPPH và FRAP (Martinez và cộng sự).
Chiết xuất từ vỏ trái cây Psidium guajava có khả năng giảm căng thẳng oxy hóa ở tuyến tụy của chuột mắc bệnh tiểu đường do streptozotocin gây ra với liều lượng 45 mg/kg Nghiên cứu cho thấy rằng dịch chiết nước từ vỏ trái cây này có thể làm giảm mức malondialdehyd (MDA) và protein carbonyl, đồng thời tăng cường hoạt động của superoxide dismutase (SOD) và glutathione (GSH) (Budin et al., 2013).
Ổi có tác dụng hạ đường huyết nhờ vào khả năng chống oxy hóa của nó, theo nghiên cứu của Huang và cộng sự (2011) Việc bổ sung ổi hồng có thể giảm peroxid hóa lipid và tăng cường hoạt động của các enzyme chống oxy hóa như catalase, superoxide dismutase, glutathione peroxidase và glutathione reductase trong máu của chuột bị tăng huyết áp tự phát (Nor và Yatim, 2011).
Các phương pháp kỹ thu ậ t
1.5.1 Phương pháp phân tích khối lượng
Phương pháp phân tích khối lượng là kỹ thuật phân tích định lượng, dựa vào việc cân đo khối lượng của một chất tinh khiết hoặc đơn chất có trong mẫu cần phân tích.
Chất cần phân tích được tách ra khỏi mẫu ở dạng hợp chất kết tủa
Kết tủa được lọc, rửa sạch, sấy khô đến khối lượng không đổi để chuyển thành dạng có công thức hóa học xác định (gọi là dạng cân)
Cân chính xác khối lượng dạng cân, dùng khối lượng và công thức hóa của dạng cân đểtính hàm lượng chất cần phân tích
Có độ chính xác cao (0.01%)
Đơn giản về nguyên tắc, dụng cụ phân tích thông thường
Độ đúng và độ lặp lại tốt (nếu làm cẩn thận)
- Nhược điểm: Tốn kém thời gian do phải trải qua nhiều giai đoạn
1.5.2 Một số phương pháp chiết
Chiết là phương pháp sử dụng dung môi, có thể là đơn lẻ hoặc hỗn hợp, để tách một chất hoặc nhóm chất từ hỗn hợp nghiên cứu Phương pháp này thường áp dụng để chiết xuất hoạt chất từ dung dịch nước sang dung môi hữu cơ.
- Mục đích: định tính, định lượng và xác định cấu trúc
Chiết lỏng – rắn a) Phương pháp chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm
Siêu âm là sóng cơ học được tạo ra từ sự lan truyền dao động của các phân tử trong không gian, với tần số vượt quá ngưỡng nghe của con người, thường nằm trong khoảng từ 16 đến 20 kHz.
- Siêu âm làm dung môi bị sủi bọt, đẩy tạp chất ra khỏi bề mặt mẫu Bản chất sóng siêu âm khác với sóng điện từ
Dưới tác dụng của siêu âm, dung môi trong các hốc nhỏ của dược liệu sẽ bị sủi bọt, giúp đẩy chất cần chiết ra khỏi dược liệu và hòa tan vào dung môi, từ đó thực hiện quá trình chiết xuất hiệu quả.
Thiết bị tương đối đơn giản, bảo quản và vận hành dễ dàng, không quá đắt tiền
Chiết được nhiều nhóm hoạt chất, dung môi khá đa dạng
Lượng mẫu: có thểlên đến hàng trăm gam.
Giảm được nhiệt độ và áp suất áp dụng để chiết cho các hoạt động chất không bền với nhiệt
Tăng được khối lượng dịch chiết và rút ngắn thời gian chiết làm tiết kiệm năng lượng đầu vào
Dung môi khó được làm mới trong suốt quá trình chiết xuất, vì vậy hiệu lực của nó là một hàm số phụ thuộc vào hệ số phân ly
Thời gian lọc và rửa dịch chiết kéo dài có thể dẫn đến việc tiêu tốn nhiều dung môi, làm mất một phần dịch chiết và có nguy cơ gây nhiễm bẩn cho sản phẩm.
Sự thoái hóa bề mặt của đầu dò theo thời gian sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất chiết b) Phương pháp ngâm
Phương pháp chiết xuất dược liệu bao gồm việc nghiền nhỏ dược liệu đến độ mịn phù hợp, sau đó cho tiếp xúc với dung môi trong một khoảng thời gian nhất định Sau quá trình này, dịch chiết được thu hồi thông qua các bước gạn, ép, lắng và lọc Tùy thuộc vào nhiệt độ chiết xuất, phương pháp này có thể được phân loại thành nhiều loại khác nhau.
Ngâm lạnh: ngâm ở nhiệt độ phòng, có thể khuấy trộn, thường áp dụng với những dược liệu chứa hoạt chất dễ bị phân hủy bởi nhiệt
Hãm là quá trình cho dung môi vào dược liệu đã được chia nhỏ trong một khoảng thời gian nhất định, có thể khuấy trộn Phương pháp này thường được áp dụng cho các hợp chất dễ tan trong thời gian ngắn và ở nhiệt độ cao.
Hầm là phương pháp ngâm dược liệu đã được chia nhỏ trong một bình kín với dung môi, giữ nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ sôi của dung môi nhưng cao hơn nhiệt độ phòng trong một khoảng thời gian nhất định Quá trình này thường bao gồm việc khuấy trộn định kỳ và thường áp dụng cho các chất ít tan ở nhiệt độ thường và dễ phân hủy khi nhiệt độ cao.
Sắc: đun sôi đều và nhẹ nhàng dược liệu với dung môi trong một thời gian nhất định
- Tùy theo số lần ngâm chia thành:
Ngâm một lần với toàn bộ dung môi
Ngâm nhiều lần với từng phân đoạn dung môi
- Ưu điểm: Đây là phương pháp đơn giản nhất, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, rẻ tiền
Năng suất thấp, thao tác thủ công (giai đoạn tháo bã và nạp liệu)
Nếu chỉ chiết một lần thì không chiết kiệt được hoạt chất trong dược liệu
Nếu chiết nhiều lần thì dịch chiết loãng, tốn dung môi, tốn thời gian chiết c) Phương pháp chiết soxhlet
Quá trình chiết xuất dược liệu bắt đầu bằng việc cho dược liệu vào ống giấy lọc và đặt trong ngăn chiết Dung môi sau đó được cho vào bình cầu và đun hồi lưu, khi dung môi bốc hơi sẽ được ngưng tụ xuống ngăn chiết Dung môi này sẽ chảy qua ống xi phông, mang theo các chất hòa tan từ dược liệu Tại bình cất, chất tan được giữ lại trong khi dung môi tiếp tục bốc hơi, ngưng tụ và đi qua lớp dược liệu để hòa tan các chất còn lại Quá trình này tiếp diễn cho đến khi dược liệu được chiết kiệt hoàn toàn.
Quá trình chiết xuất liên tục
Tốn ít dung môi hơn các phương pháp trên
Dịch chiết luôn ở nhiệt độ sôi của dung môi nên các chất không bền với nhiệt dễ bị phá hủy
Không thực hiện liên tục được sự khuấy trộn
Hình 1.13 Mô hình soxhlet 1.5.3 Phương pháp thử hoạt tính ức chế vi khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch
- Phương pháp thử hoạt tính ức chế vi khuẩn là phương pháp của Hadacek et al (2000)
Chủng vi khuẩn được kích hoạt từ ống chủng gốc trên môi trường LB đặc đã được cấy chuyển sang 5 ml môi trường LB lỏng và lắc qua đêm ở nhiệt độ thích hợp.
Để thực hiện thí nghiệm, tại nhiệt độ 37°C, chuẩn bị đĩa thử hoạt tính bằng cách cấy 200 μl dịch khuẩn với nồng độ 4 – 5 × 10^8 CFU/ml lên bề mặt đĩa petri chứa môi trường LB đặc Sau khi cấy, để cho đĩa khô và tạo ra 5-6 giếng có đường kính khoảng 6 mm, đảm bảo mỗi giếng cách nhau một khoảng nhất định.
Chuẩn bị dịch chiết thử bằng cách hòa tan cặn chiết methanol của mẫu thực vật trong DMSO để đạt nồng độ yêu cầu Sau đó, bổ sung 50 μL dịch chiết vào các giếng thạch trên đĩa petri và giữ ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ để dịch chiết khuếch tán ra môi trường nuôi cấy vi khuẩn Tiếp theo, đặt các đĩa vào tủ ấm ở 37°C trong 24 giờ Đối chứng dương sử dụng dung dịch kháng sinh (Ampicilin 0,1 mg/ml cho E coli và P mirabillis; Kanamycin 5 mg/ml cho S aureus và P vulgaris), trong khi đối chứng âm là DMSO.
- Hoạt tính ức chế khuẩn được đánh giá bằng cách đo bán kính (BK) vòng ức chế vi sinh vật bằng công thức:
Trong đó: D = đường kính vòng vô khuẩn (mm) d = đường kính lỗ khoan thạch (mm)
BK là vòng ức chế vi sinh vật (mm)
- Thí nghiệm được lặp lại ba lần và lấy giá trị bán kính trung bình
1.5.4 Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS)
Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) là một trong những kỹ thuật sắc ký hiện đại với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, thường được áp dụng trong nghiên cứu và phân tích GC/MS kết hợp giữa sắc ký khí và khối phổ, mang lại hiệu quả vượt trội trong việc xác định và phân tích các hợp chất.
Khí man có trong bơm khí giúp dẫn mẫu từ buồng bơm hơi vào cột tách trong buồng điều nhiệt, nơi diễn ra quá trình sắc ký.
Sau khi rời khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau, các cấu tử lần lượt đi vào detector, tại đó chúng được chuyển thành tín hiệu điện
Tín hiệu này được khuếch đại rồi chuyển sang bộ phận ghi Các tín hiệu dược xử lý ở đó rồi chuyển sang bộ phận in và lưu kết quả
Hình 1.14 Hệ thống GC/MS
Đối tượ ng, d ụ ng c ụ thi ế t b ị và hóa ch ất, phương pháp nghiên c ứ u
Nguyên liệu sử dụng để chiết dịch chiết trong nghiên cứu này là: lá ổi non tại xã Suối Nghệ, huyện Châu Đức, tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu
Hình 2.1 Lá ổi non 2.1.2 Dụng cụ - thiết bị và hóa chất a) Dụng cụ - thiết bị
Dụng cụ Số lượng Dụng cụ Số lượng
Cốc sứ 2 Phễu chiết (250ml) 3
Que cấy đầu nhọn 3 Bóp cao su 1 Đèn cồn 1 Erlen (100ml, 250ml) 6
Bình tia 1 Đũa thủy tinh 1
2ml, 1ml) 5 Ống đong (500ml,
Giá đỡ ống nghiệm 1 Que cấy đầu tròn 1
Que trang 1 Kẹp ống nghiệm 1
Thiết bị Số lượng Thiết bị Số lượng
Máy đo UV – VIS 1 Bếp điện bình cầu 1
Máy cô quay chân không 1 Máy sắc khí phổ GC/MS 1
Cân phân tích (0.0001g) 1 Tủ sấy 1
Lò nung 1 Nồi hấp khử trùng 1
Máy xay 1 Máy đo pH 1
Máy ly tâm 1 b) Hóa chất
Các chủng vi khuẩn dùng trong thí nghiệm có nguồn gốc tại trường Đại Học Công Nghiệp, Thành Phố Hồ Chí Minh
2.1.4 Các phương pháp nghiên cứu [3]
Nghiên cứu lý thuyết về lá ổi non tập trung vào việc phân tích các hợp chất tự nhiên, tổng hợp tài liệu liên quan đến đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hóa học, và những ứng dụng tiềm năng của loại lá này.
- Các phương pháp nghiên cứu thực nghiệm:
Nghiên cứu chiết tách dịch chiết bằng phương pháp soxhlet với các điều kiện khảo sát là tỉ lệ nguyên liệu/dung môi và thời gian chiết
Nghiên cứu phương pháp trọng lượng: xác định độ ẩm, hàm lượng tro của lá ổi non
Nghiên cứu thành phần hóa học chính trong cao chiết lá ổi non bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ GC/MS.
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp thử hoạt tính ức chế vi khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch.
Xử lý nguyên liệu
Cây ổi được thu hoạch toàn bộ lá non và vừa, chọn những lá tươi, không bị sâu bệnh hoặc nấm mốc Sau khi rửa sạch bụi bẩn, lá ổi được sấy khô ở nhiệt độ 60 độ C cho đến khi đạt độ giòn và khối lượng không đổi.
Đề xuất quy trình chiết cao từ lá ổi non
2.3.1 Quy trình chiết cao từlá ổi non [1]
Sơ đồ 2.1 Quy trình đề xuất chiết cao từ lá ổi non 2.3.2 Thuyết minh quy trình
Để chuẩn bị lá ổi, trước tiên cần thu hái lá ổi non và vừa, loại bỏ những lá sâu, sau đó rửa sạch để loại bỏ bụi bẩn Tiếp theo, lá ổi được sấy ở nhiệt độ 60°C cho đến khi đạt nhiệt độ ổn định Sau khi sấy khô, lá ổi được xay nhỏ với kích thước từ 0,5 đến 1 cm và cân chính xác 10 g (± 0,1 g) Cuối cùng, toàn bộ nguyên liệu đã được xử lý sẽ được cho vào túi lọc có kích thước 10 x 5 cm.
- Bướ c 2: Chuyển toàn bộ nguyên liệu đã được xử lý cho vào túi lọc (10 x 5 cm) Đong
250 ml cồn 96 cho vào bình cầu 2 cổ và lắp hệ thống chiết soxhlet Đun nguyên liệu trong 120 phút , ở nhiệt độ 78 o C
- Bướ c 3: Dịch trích sau đó được lọc, cô quay đuổi dung môi hoàn toàn, thu được cao
Cao lá ổi non được bảo quản trong lọ thủy tinh đậy kín ở 4 o C, tránh ánh sáng
Bước 4: Tiến hành phân tích cao chiết bằng phương pháp GC/MS nhằm xác định các thành phần hóa học và kiểm tra hoạt tính sinh học đối với các vi khuẩn như E Coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Salmonella spp và Pseudomonas aeruginosa.
Chiết bằng phương pháp soxhlet
Khảo sát tỷ lệ dung môi/nguyên liệu tối ưu: 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45 và 1:50 g/ml
Xác định một số chỉ tiêu hóa lý: độ ẩm, hàm lượng tro
Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết: nhiệt độ
Xác định thành phần hóa học bằng phương pháp GC/MS
Thử hoạt tính kháng khuẩn
Khảo sát thời gian chiết tối ưu: 60 phút, 90 phút, 120 phút, 150 phút, 180 phút và 210 phút Định tính Flavonoid
Các phương pháp xác định một số chỉ tiêu hóa lý
- Chuẩn bị 3 chén sứ đã đánh số, rửa sạch, tráng lại bằng nước cất, sấy khô đến khối lượng không đổi Sau đó, cân lấy trọng lượng m1 (g)
- Cân khoảng 3g lá ổi non (đã được xử lý) cho vào chén sứ đã chuẩn bị sẵn ta có m2
Đem mẫu đi sấy ở nhiệt độ 100°C và cứ sau 2 giờ, lấy ra để nguội trong bình hút ẩm rồi cân Tiếp tục quy trình này cho đến khi khối lượng mẫu và chén sứ không còn thay đổi, từ đó ghi nhận kết quả m3 (g).
- Công thức tính độ ẩm:
Độ ẩm của mỗi mẫu:
𝑛 Trong đó: m 1 : trọng lượng chén sứ (g) m2: trọng lượng lá ổi non (g) m3: trọng lượng cốc sứ và mẫu sau khi sấy (g) n: số lần xác định (%)
2.5.2 Xác định hàm lượng trobằng phương pháp tro hóa mẫu
Các mẫu lá ổi non (m3) được xác định độ ẩm sẽ được sử dụng để hóa tro Các mẫu này sẽ được nung ở nhiệt độ 600°C trong 6 giờ cho đến khi thu được tro màu xám trắng Sau khi lấy mẫu ra và làm nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm, mẫu sẽ được cân lại cho đến khi đạt khối lượng không đổi, có khối lượng m4.
- Công thức tính hàm lượng tro:
Hàm lượng tro của mỗi mẫu:
Hàm lượng tro trung bình:
𝑛 Trong đó: m 1 : khối lượng chén sứ (g) m2: khối lượng lá ổi non ban đầu (g) m3: khối lượng cốc sứ và mẫu sau khi tro hóa (g) n: số lần xác định % tro
Khảo sát điều kiện chiết
Nghiên cứu chiết tách dịch chiết từ lá ổi non bằng phương pháp chiết soxhlet cần tập trung vào tỷ lệ nguyên liệu/dung môi và thời gian chiết, vì đây là những yếu tố quyết định trực tiếp đến lượng dịch chiết thu được.
Bảng 2.3 Bảng khảo sát điều kiện chiết
STT Tên thông số Giá trị thông số
1 Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45 và 1:50 g/ml
2 Thời gian chiết 60 phút, 90 phút, 120 phút, 150 phút, 180 phút và 210 phút
Khối lượng lá ổi non khô được sử dụng trong mỗi lần thí nghiệm là 10 g Các thông số khảo sát sơ bộ đóng vai trò quan trọng trong việc xác định các thông số thích hợp Kết quả nghiên cứu sẽ được trình bày chi tiết dưới đây.
2.6.1 Khảo sát tỷ lệ nguyên liệu/dung môi a) Mục đích
Tỷ lệ dung môi là tỷ lệ giữa khối lượng nguyên liệu khô và thể tích dung môi, cần thiết để dung môi thẩm thấu hiệu quả vào nguyên liệu Việc nghiên cứu tỷ lệ dung môi giúp xác định tỉ lệ tối ưu để dịch chiết khuếch tán tốt nhất và đạt hiệu suất cao nhất.
Tỷ lệ nguyên liệu và dung môi đóng vai trò quan trọng trong hiệu suất thu dịch chiết Nếu sử dụng quá nhiều dung môi, dịch chiết sẽ bị pha loãng và chứa nhiều tạp chất Ngược lại, nếu dung môi quá ít, quá trình chiết xuất sẽ không thu được đầy đủ hoạt chất từ nguyên liệu.
Chuẩn bị 7 mẫu lá ổi non đã được xử lý, mỗi mẫu cân khoảng 10 g và cho vào túi lọc Tiến hành chiết soxhlet ở nhiệt độ 78 oC trong 4 giờ, sử dụng các thể tích cồn tuyệt đối khác nhau: 200 ml, 250 ml, 300 ml, 350 ml, 400 ml, 450 ml và 500 ml.
- Dịch chiết thu được đem đi cô quay, được sản phẩm là cao Rồi đem đi cân lấy khối lượng Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi tối ưu.
2.6.2 Khảo sát thời gian chiết a) Mục đích
Thời gian chiết càng lâu sẽ thu được nhiều dịch hơn, nhưng sau một thời gian nhất định, lượng dịch thu được sẽ không còn tăng dù thời gian chiết có kéo dài thêm.
Kéo dài thời gian chưng cất không chỉ làm giảm chất lượng dịch chiết do nguyên liệu có thể bị cháy khét, mà còn làm mất đi mùi thơm tự nhiên của cao sau khi cô quay Hơn nữa, việc này còn tiêu tốn nhiều năng lượng, dẫn đến chi phí sản xuất tăng cao và không hiệu quả về mặt kinh tế.
Chuẩn bị 5 mẫu lá ổi non đã xử lý, mỗi mẫu khoảng 10g, kết hợp với 250ml cồn tuyệt đối Tiến hành chiết xuất bằng phương pháp soxhlet ở nhiệt độ 78°C trong các khoảng thời gian khác nhau để thu được kết quả tối ưu.
60 phút, 90 phút, 120 phút, 150 phút, 180 phút và 210 phút
- Dịch chiết thu được đem đi cô quay, được sản phẩm là cao Rồi đem đi cân lấy khối lượng Thời gian chiết tối ưu.
Khảo sát yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng đến dịch chiết lá ổi
Các mẫu dịch chiết bằng dung môi cồn tuyệt đối cần được bảo quản trong các điều kiện khác nhau, bao gồm ngay sau khi chiết, ở nhiệt độ phòng và trong tủ lạnh.
- Sau 5 ngày lấy ra quan sát.
Tính hiệu suất chiết xuất cao thô
Cao lá ổi non sau khi cô quay được tính hiệu suất theo công thức sau:
%H = m cao m nguyên liệu x 100 Trong đó: %H là hiệu suất cao thô (%) mcao là khối lượng cao thu được (g) mnguyên liệu là khối lượng lá ổi non được dùng để chiết (g)
Định tính Flavonoid
Lá ổi chứa Flavonoid, một hợp chất có hoạt tính sinh học cao, đang thu hút sự chú ý trong nghiên cứu Khi tiếp xúc với FeCl3 5%, Flavonoid tạo ra dung dịch màu xanh lục đen đặc trưng, và khi gặp hơi amoniac, nó sẽ xuất hiện vết màu vàng.
Dung dịch FeCl 3 5 %: lấy khoảng 10 ml dịch chiết cho vào 2 ống nghiệm
Ống 2: thêm vài giọt FeCl 3 5 %
Để yên, quan sát và nhận xét.
Để thực hiện thí nghiệm với hơi amoniac, bạn cần lấy khoảng 10 ml amoniac cho vào ống nghiệm Sau đó, tẩm vài giọt dung dịch chiết lá ổi non lên tờ giấy lọc và hơ giấy lọc trên miệng ống nghiệm Cuối cùng, quan sát và đưa ra nhận xét về kết quả thí nghiệm.
Xác định thành phần hóa học trong cao lá ổi non bằng phương pháp GC/MS
Dịch chiết lá ổi non được thực hiện bằng cách thu hồi dung môi cho đến khi thu được chất rắn dạng cao Mẫu cao sau đó được gửi đến Chi cục Kiểm Định Hải Quan 4, địa chỉ số 10, đường Ngô Quyền, phường Thọ Quang, quận Sơn Trà, thành phố Đà Nẵng.
Thử hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp đo đường kính vòng kháng khuẩn
Để sử dụng thang độ đục chuẩn MacFarland 0,5, bạn cần trộn 0,5 ml BaCl2 0,48 M với 99,5 ml H2SO4 0,35 M trong khi khuấy liên tục để tạo huyền dịch Sau đó, chia huyền dịch thành các ống có kích thước tương đương với ống dùng để chuẩn độ vi sinh vật, mỗi ống chứa 4 – 6 ml huyền dịch và đậy nắp kín Bảo quản ở nơi tối trong tủ lạnh, huyền dịch có thể sử dụng trong vòng 6 tháng và độ đục này tương ứng với 10^8 CFU/ml.
2.11.2.Chuẩn bị chủng vi sinh vật thử nghiệm
Giống vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường TSB ở nhiệt độ 37 oC trong 12 giờ, sau đó được ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 5 phút Huyền phù vi khuẩn thu được được ly tâm để tách sinh khối, sau đó pha loãng bằng nước cất vô trùng đến độ đục tương đương 0,5 McFarland.
2.11.3.Chuẩn bị nồng độ chất thử
Cân 1.6 g cao và hòa tan vào 1 ml DMSO 5% để tạo dung dịch gốc Dung môi DMSO được tiệt trùng, sau đó pha loãng để tạo ra các nồng độ thử nghiệm trong môi trường như 1600 mg/ml, 800 mg/ml, 400 mg/ml và 200 mg/ml.
- Kháng sinh đối chứng dương gồm ampicillin và tetracylin Mẫu đối chứng âm là dung dịch DMSO 5%
Cho 25 ml môi trường MHA vô trùng (nhiệt độ khoảng 50 – 60 °C) vào mỗi đĩa petri và để môi trường đông đặc Tiếp theo, thêm 100 µl dịch vi khuẩn với mật độ 1,5 x 10^8 CFU/ml vào mỗi đĩa Mỗi đĩa petri sẽ có 1 đĩa kháng sinh dương và 6 đĩa giấy trắng vô trùng đường kính 6mm Tiến hành cho vào 5 đĩa trắng lần lượt 1 µl dịch chiết đã pha, trong khi 1 đĩa còn lại sẽ chứa 1 µl dung dịch DMSO 5% làm chứng âm Thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần và các đĩa được ủ ở nhiệt độ 32 °C.
16 – 20 giờ Đường kính vòng ức chế được đo bằng thước đo đơn vị mm
2.11.5.Đọc kết quả và ghi nhận đường kính vòng vô khuẩn Đường kính vòng vô khuẩn (D – d) được xác định bằng đường kính vòng kháng ngoài trừđi đường kính đĩa giấy
Hình 2.4 Hình ảnh minh họa đo đường kính vòng vô khuẩn
CHƯƠNG 3: KẾT QỦA VÀ THẢO LUẬN
K ế t qu ả xác d ị nh m ộ t s ố ch ỉ tiêu hóa lý c ủ a lá ổ i non
Lá ổi non đã qua xử lý được dùng để xác định độ ẩm, với 3 mẫu được lấy để thực hiện phép đo Độ ẩm chung được tính là độ ẩm trung bình của cả 3 mẫu này.
- Kết quả xác định độ ẩm trung bình của mẫu được trình bày ở bảng 3.1 và hình 3.1
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát độẩm
Hình 3.1 Mẫu sau khi được xác định độẩm
Độ ẩm trung bình của dược liệu lá ổi non là 11.388%, nằm trong giới hạn an toàn cho hầu hết các loại dược liệu Mỗi dược liệu đều chứa một lượng nước nhất định, được gọi là độ ẩm hay thủy phần Để bảo quản dược liệu hiệu quả, tránh hiện tượng mốc và giữ nguyên hoạt chất, độ ẩm lý tưởng nên duy trì trong khoảng 10 – 12%.
- Lấy 3 mẫu lá ổi non đã được xác định độ ẩm ở trên, nung trong lò nung ở nhiệt độ
600 o C để xác định hàm lượng tro
- Kết quả xác định hàm lượng tro trung bình được trình bày ở bảng 3.2 và hình 3.2
Bảng 3.2 Kết quả khảo sát độẩm
Hàm lượng tro trung bình 8,086
Hình 3.2 Mẫu sau khi được hóa tro
Hàm lượng tro trung bình từ bảng 3.2 là 8,086%, trong đó chứa các muối kim loại nặng như Fe, Cu, Pb, Hg, và Zn Những kim loại này có thể tác động đến tính chất của dịch chiết từ lá ổi non.
K ế t qu ả kh ảo sát điề u ki ệ n chi ế t lá ổ i non
3.2.1 Kết quả khảo sát tỷ lệ nguyên liệu/dung môi
Cân 10 g lá ổi non đã qua xử lý và cho vào túi lọc Tiến hành chiết xuất Soxhlet trong 4 giờ với các thể tích cồn 96 độ khác nhau: 200 ml, 250 ml, 300 ml, 350 ml và 400 ml.
Hình 3 3 Dịch chiết ở các nồng độ khác nhau
- Dịch chiết thu được đem đi cô quay, được sản phẩm là cao Rồi đem đi cân lấy khối lượng Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi tối ưu
- Kết quả mật độ quang của các mẫu được trình bày ở bảng 3.3 và biểu đồ 3.1
Bảng 3.3 Kết quả khảo sát tỷ lệ nguyên liệu/dung môi
STT Khối lượng lá ổi
Thể tích dung môi (ml)
Khối lượng cao thu được (g)
Biểu đồ 3.1 Biểu diễn kết quả khảo sát tỷ lệ nguyên liệu/dung môi tối ưu
Khi thể tích dung môi tăng đến 250 ml, khối lượng cao thu được đạt mức tối đa Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng thể tích dung môi, khối lượng cao sẽ giảm do chất đã được chiết ra gần như hoàn toàn Do đó, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi tối ưu là 1:25 g/ml.
3.2.2 Khảo sát thời gian chiết
Cân khoảng 10 g lá ổi non đã qua xử lý và cho vào túi lọc Tiến hành chiết soxhlet với 250 ml dung môi cồn 96 độ trong các khoảng thời gian khác nhau: 60 phút, 90 phút, 120 phút, 150 phút, 180 phút và 210 phút.
Khối lượng cao thu được (g)
Thể tích dung môi (ml)
- Dịch chiết thu được đem đi cô quay, được sản phẩm là cao Rồi đem đi cân lấy khối lượng Thời gian tối ưu
Hình 3.4 Dịch chiết được chiết ở thời gian khác nhau
- Kết quả mật độ quang của mẫu được trình bày ở bảng 3.4 và biểu đồ 3.2
Bảng 3.4 Kết quả khảo sát thời gian chiết
STT Khối lượng lá ổi
Khối lượng cao thu được (g)
Biểu đồ 3.2 Biểu diễn kết quả khảo sát tỷ lệ thời gian tối ưu
Khối lượng cao thu được (g)
Theo bảng 3.4 và hình 3.8, khi thời gian chiết tăng, khối lượng cao cũng tăng, đạt giá trị lớn nhất ở t = 120 phút Sau thời điểm này, việc tăng thể tích dung môi chỉ làm giảm khối lượng cao một cách không đáng kể Do đó, thời gian chiết tối ưu được xác định là 120 phút.
K ế t qu ả tính hi ệ u su ấ t cao thô
Cao lá ổi non sau khi được cô quay được tính theo công thức sau:
Trong đó: %H là hiệu suất cao thô (%) mcao là khối lượng cao thu được (g) mnguyên liệu là khối lượng lá ổi non được dùng để chiết (g)
K ế t qu ả kh ả o sát y ế u t ố nhi ệt độ ảnh hưởng đế n d ị ch chi ế t lá ổ i non
Mẫu dịch chiết được bảo quản ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau như vừa mới chiết, nhiệt độ phòng và trong tủ lạnh Sau 5 ngày, tiến hành quan sát màu sắc của các dịch chiết để đánh giá sự thay đổi.
- Kết quả quan sát được trình bày ở bảng 3.5 và hình 3.5
Hình 3.5 Màu sắc của dịch chiết trước và sau khi bảo quản ở các t o khác nhau
(2) Để ở nhi ệt độ phòng
Bảng 3.5 Kết quả màu sắc của dịch chiết bảo quản ở các nhiệt độ khác nhau
Mẫu Điều kiện bảo quản Hiện tượng
1 Vừa mới chiết Màu xanh đậm, trong
2 Để trong tủ lạnh Màu ít thay đổi, trong
3 Để ở nhiệt độ phòng Màu ít thay đổi, trong
Kết quả trên cho thấy nhiệt độ hầu như không ảnh hưởng đến dịch chiết từ lá ổi non khi chiết với dung môi cồn 96.
K ế t qu ả đị nh tính Flavonoid
- Dung d ị ch FeCl 3 : Lấy khoảng 10ml dịch chiết lá ổi non
Ống 2: Thêm vài giọt FeCl 3 5 % Dịch chiết chuyển từ màu xanh đậm sang màu xanh lục đen Điều này chứng tỏ trong dịch chiết thu được có Flavonoid (Hình 3.8)
Hình 3.6 Kết quảđịnh tính bằng dung dịch FeCl 3
(2) M ẫ u sau khi th ử v ớ i dung d ị ch FeCl 3
Để kiểm tra sự hiện diện của hơi amoniac, cho khoảng 10 ml amoniac vào ống nghiệm Nhỏ vài giọt dịch chiết từ lá ổi non lên tờ giấy lọc, sau đó hơ tờ giấy trên miệng ống nghiệm Nếu tờ giấy lọc chuyển từ không màu sang màu vàng, điều này chứng tỏ trong dịch chiết có chứa hợp chất cần tìm.
Hình 3.7 Kết quảđịnh tính bằng hơi amoniac
(1) Gi ấ y l ọ c t ẩ m d ị ch chi ế t lá ổ i non
(2) Gi ấ y l ọc có hơi amoniac
K ế t qu ả đị nh danh thành ph ầ n hóa h ọ c trong d ị ch chi ế t lá ổ i non
Quá trình dịch chiết lá ổi non bao gồm việc thu hồi dung môi cho đến khi thu được chất rắn dạng cao Sau đó, mẫu cao này được gửi đến Chi Cục Kiểm Định Hải Quan 4, địa chỉ số 10, đường Ngô Quyền, phường Thọ Quang, quận Sơn Trà, Thành phố Đà Nẵng.
Hình 3.8 Mẫu cao lá ổi non đem đi phân tích
- Kết quả phổ GC/MS được thể hiện ở hình 3.9, 3.10, 3.11 và 3.12
Hình 3.9 Khối phổ GC/MS trong thời gian lưu 5 – 10 min
Hình 3.10 Khối phổ GC/MS trong thời gian lưu 10 – 12.6 min
Hình 3.11 Khối phổ GC/MS trong thời gian lưu 12.6 – 14 min
Hình 3.12 Khối phổ GC/MS trong thời gian lưu 14 – 18 min
Qua việc phân tích phổ đồ GC/MS và tham khảo thư viện phổ chuẩn, chúng tôi đã xác định được 28 hợp chất có trong cao chiết lá ổi non Kết quả này được trình bày chi tiết trong bảng 3.6.
Bảng 3.6 Thành phần hóa học các hợp chất có trong cao lá ổi non
1H- Cycloprop[e]azulene, decahydro-1,1,7- trimethyl-4- methylene- ,(1ar,4as,7r,7ar,7bs)-
Naphthalene, 1,2,3,5,6,8a- hexahydro-4,7- dimethyl-1-(1- methylethyl)-, (1S- cis)-
Bicyclo[3.1.1]hept-2- ene, 2,6-dimethyl-6- (4-methyl-3- pentenyl)-
Bicyclo[4.4.0]dec-2- ene-4-ol, 2-methyl-9- (prop-1-en-3-ol-2-yl)-
Kết quả trên cho thấy Caryophyllene có hàm lượng cao nhất (39.22%), 1H-
[1aR - (1aα,7α,7aα)] có hàm lượng thấp nhất (0.01%)
- So sánh kết quả GC/MS về thành phần hóa học có trong cao lá ổi non tại TP.Vũng
Tại Tàu và TP Đà Nẵng, cao lá ổi non cho thấy thành phần Caryophyllene đạt mức cao nhất, một hợp chất mang lại mùi thơm đặc trưng cho hạt tiêu đen và có khả năng kháng khuẩn mạnh mẽ Kết quả chi tiết được thể hiện trong bảng 3.7.
Bảng 3.7 So sánh thành phần hóa học có trong cao lá ổi non tại TP.Vũng Tàu
TP.Vũng Tàu TP Đà Nẵng
1,1,7-trimethyl-4-methylene- ,(1ar,4as,7r,7ar,7bs)-
3.7 Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp đo đường kính vòng kháng khuẩn
Khả năng kháng khuẩn được đánh giá dựa trên khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn, được thể hiện qua các vòng kháng khuẩn trên đĩa thạch, như trình bày trong bảng 3.8 và các hình 3.13, 3.14, 3.15, và 3.16.
Bảng 3.8 Đường kính vòng kháng khuẩn của cao lá ổi non (mm)
Stt N ồng độ Salmonella spp Bacilus cereus
Hình 3.13 Khảnăng kháng Salmonella spp của cao lá ổi non
Hình 3.14 Khảnăng kháng Bacilus cereus của cao lá ổi non
Hình 3.15 Khảnăng kháng E.Coli của cao lá ổi non
Hình 3.16 Khảnăng kháng Staphylococcus aureus của cao lá ổi non
Hình 3.17 Khảnăng kháng Pseudomonas aeruginosa của cao lá ổi non
(1) 1600 mg/ml; (2) 800mg/ml; (3) 400mg/ml; (4) 200mg/ml
Kết quả nghiên cứu cho thấy cao lá ổi non có khả năng ức chế sự phát triển của cả
Nghiên cứu đã thử nghiệm 5 chủng vi khuẩn, cho thấy mức độ kháng phụ thuộc vào nồng độ của dịch chiết sử dụng Hiệu quả kháng tốt nhất được ghi nhận trên Bacillus cereus, trong khi hiệu quả kháng thấp nhất là đối với Salmonella spp Ở nồng độ 1600 mg/ml, hiệu quả kháng của dịch chiết thấp hơn so với tetracycline.
30 g và cao hơn 10 g ampicilin Nồng độ 200 mg/ml, vòng kháng khuẩn 5 mm.
