Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
Callus cà gai leo (Solanum hainanense Hance) được hình thành từ cây cà gai leo được nuôi cấy in vitro Cây cà gai leo giống này có nguồn gốc từ Yên Bái và hiện đang được trồng tại khu nhà lưới của Viện Sinh học Nông Nghiệp, với độ tuổi khoảng 2 năm.
Mẫu nghiên cứu bao gồm các đoạn thân và mảnh lá dài 1 cm được thu thập từ cây cà gai leo nuôi cấy in vitro cũng như từ cây cà gai leo trồng ngoài tự nhiên.
3.1.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Địa điểm nghiên cứu: Phòng công nghệ Sinh học Thực vật – Viện Sinh học Nông nghiệp - Học viện Nông nghiệp Việt Nam
- Địa điểm phân tích HTCO: Phòng thí nghiệm Trung tâm nghiên cứu và phát triển Công nghệ Hóa sinh
Nội dung nghiên cứu
3.2.1 Xác định môi trường thích hợp nhất cảm ứng tạo callus cà gai leo
- Loại mẫu: mô thân và mô lá cây nuôi cấy in vitro 4 tuần tuổi
- Môi trường nuôi cấy nền: môi trường MS cơ bản (Đ/C)
- Các công thức thí nghiệm: môi trường MS bổ sung thêm các chất điều tiết sinh trưởng với nồng độ tương ứng theo các bảng sau:
Thí nghiệm 1 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến khả năng tạo callus
Công thức Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ α-NAA (mg/l)
Thí nghiệm 2 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4-D đến khả năng tạo callus
Công thức Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ 2,4-D (mg/l)
Thí nghiệm 3 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4-D đến khả năng tạo callus
Công thức Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ 2,4-D (mg/l)
- Loại mẫu:callus từ mô thân và mô lá cây nuôi cấy in vitro
Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân sinh khối callus
Chọn 2 môi trường tạo callus tốt nhất ở các thí nghiệm 1, 2 và 3 để nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân sinh khối callus ( môi trường A1 và A2)
Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến khả năng nhân sinh khối callus
Công thức Chế độ chiếu sáng
Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của chiếu sáng đèn LED đến khả năng nhân sinh khối callus
A2 Tỉ lệ B/R: 30/70 ĐC (A1/A2) Đèn huỳnh quang T8
Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của acid salisylic đến nhân sinh khối callus trên 2 môi trường A1 và A2
Công thức Nồng độ acid salisylic
Công thức Nồng độ acid salisylic
Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của chất chiết nấm men đến nhân sinh khối callus trên 2 môi trường A1 và A2
Công thức Nồng độ Nấm men (g/l) ĐC (A1) 0
Công thức Nồng độ Nấm men (g/l) ĐC (A2) 0
3.2.3 Đánh giá sự tích lũy các hoạt chất thứ cấp thông qua thử nghiệm hoạt tính sinh học dịch chiết callus, dịch chiết cây cà gai leo tự nhiên
- Loại mẫu: Dịch chiết callus cà gai leo, dịch chiết cây cà gai leo tự nhiên
Thí nghiệm 9: Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết cây cà gai leo tự nhiên trên tế bào gan chuột
Cây cà gai leo, khi trồng ngoài tự nhiên và đạt khoảng 2 năm tuổi, được chiết xuất bằng dung môi cồn 70 độ Hoạt tính chống oxy hóa của chiết xuất này được đánh giá thông qua quá trình peroxy hóa lipid trong tế bào gan chuột.
Công thức Nồng độ cà gai leo
Thí nghiệm 10: Đánh giá ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết callus trên tế bào gan chuột
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã so sánh hai môi trường A1 và A2 để xác định môi trường tối ưu cho việc nhân sinh khối callus Callus được chiết xuất trong dung môi cồn 70 độ, và hoạt tính chống oxy hóa của chiết xuất này được đánh giá thông qua quá trình peroxy hóa lipid trong tế bào gan chuột.
Thí nghiệm 11 nhằm đánh giá tác động của môi trường nuôi cấy có bổ sung chất chiết nấm men đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết callus trên tế bào gan chuột Nghiên cứu này có thể cung cấp những hiểu biết quan trọng về khả năng cải thiện sức khỏe gan thông qua các biện pháp nuôi cấy tế bào hiệu quả Kết quả từ thí nghiệm sẽ góp phần vào việc phát triển các phương pháp điều trị mới cho các bệnh liên quan đến oxy hóa trong gan.
- Chọn môi trường nuôi cấy có bổ sung chất chiết nấm men với nồng độ thích hợp nhất tới khả năng nhân sinh khối callus
Nhân callus được chiết xuất từ môi trường trên bằng dung môi cồn 70 độ, và hoạt tính chống oxy hóa của nó được đánh giá thông qua quá trình peroxy hóa lipid tế bào gan chuột.
Công thức Nồng độ callus
Thí nghiệm 12 nhằm đánh giá tác động của môi trường nuôi cấy có bổ sung acid salicylic đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết callus từ tế bào gan chuột Nghiên cứu này sẽ giúp làm rõ vai trò của acid salicylic trong việc cải thiện khả năng chống oxy hóa, từ đó cung cấp thông tin quý giá cho các ứng dụng trong y học và sinh học.
- Chọn môi trường nuôi cấy có bổ sung acid salisylic với nồng độ thích hợp nhất tới khả năng nhân sinh khối callus
Nhân callus được chiết xuất từ môi trường trên bằng dung môi cồn 70 độ Hoạt tính chống oxy hóa của nó được đánh giá thông qua quá trình peroxy hóa lipid trong tế bào gan chuột.
Công thức Nồng độ callus (mg/100ml)
Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phương pháp nuôi cấy in vitro
Phương pháp nuôi cấy in vitro được thực hiện trên môi trường cơ bản MS (Murashige & Skoog, 1962), với thành phần gồm 6g/l saccarose và 100 mg/l inositol, pH môi trường được điều chỉnh ở mức 5,8 Thể tích dung dịch trong mỗi bình nuôi cấy là 40 - 50ml.
- Môi trường nuôi cấy hấp khử trùng ở 121 0 C trong 20 phút ở áp suất 1,0 at
- Điều kiện thí nghiệm: Các thí nghiệm tiến hành trong điều kiện nhân tạo, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm luôn được giữ ổn định:
+ Cường độ ánh sáng: 2500 - 2800 Lux
+ Thời gian chiếu sáng: 16h sáng/8h tối
3.3.2 Nuôi cấy cây in vitro
Hạt cà gai leo được làm sạch bằng xà phòng dưới vòi nước chảy trong 5 phút và sau đó làm khô Tiếp theo, hạt được đưa vào box cấy vô trùng, rửa bằng cồn 70 độ trong 1-2 phút, rồi rửa lại bằng nước cất vô trùng 1-2 lần, mỗi lần 1 phút Sau đó, mẫu được ngâm trong dung dịch NaDCC (Sodium dichloroisocyanurate) nồng độ 5g/l trong 10 phút và rửa lại 3 lần bằng nước cất vô trùng, mỗi lần 1 phút Cuối cùng, mẫu được cấy vào môi trường MS + 25 g/l saccarose + 4,3 g/l agar, pH= 5,8 và đưa vào ủ tối để hạt nảy mầm và loại nhiễm.
Cây in vitro sau khi nảy mầm sẽ được chuyển sang môi trường nền để phát triển Đồng thời, các đoạn thân có mắt lá của cây in vitro cũng được cấy trên môi trường nền nhằm nhân giống cây và tạo nguyên liệu.
3.3.3 Nuôi cấy callus, nhân sinh khối callus
Các bộ phận khác nhau của cây cà gai leo, bao gồm cuống lá, mảnh lá và đoạn thân dài khoảng 1cm, được nuôi cấy trong môi trường nền có bổ sung chất điều tiết sinh trưởng để đánh giá khả năng tạo callus Sau 4 tuần, callus được cắt thành các khối nhỏ khoảng 250 mg để nhân sinh khối, đồng thời theo dõi ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy, điều kiện chiếu sáng và các chất kích thích đến khả năng nhân sinh khối callus.
Callus được nhân sinh khối sau 3 tuần tuổi được theo dõi các chỉ tiêu như: khối lượng tươi, khối lượng khô, hình thái callus
Khối lượng tươi trung bình 1 mẫu callus (mg) = Khối lượng tươi trung bình callus của 1 bình (mg) / số mẫu 1 bình (mg)
Khối lượng khô trung bình 1 mẫu callus (mg) = Khối lượng khô trung bình callus của 1 bình (mg) / số mẫu 1 bình (mg)
3.3.4 Đánh giá hoạt tính sinh học dịch chiết callus
Sau 3 tuần tuổi, callus nhân sinh khối được nuôi trên môi trường A1 hoặc A2, trong đó có bổ sung chất chiết nấm men và acid salisylic Callus này sau đó được sấy khô và chiết xuất trong dung môi phù hợp.
3.3.4.1 Phương pháp chiết callus cà gai leo nuôi cấy in vitro và chiết cây cà gai leo trồng ngoài tự nhiên
Callus được thu thập từ các công thức thí nghiệm và mô của thân, lá cây trồng tự nhiên (2 năm tuổi) sau khi được sấy khô đến khối lượng không đổi và nghiền mịn.
- Cân 1g nguyên liệu và chiết siêu âm trong 10 ml cồn 70 0
- Lọc lấy dịch chiết, chiết tiếp lần 2 trong dung môi cồn 70 0 ở 60-70 0 C
- Dịch chiết thu được đem cô đặc ở nhiệt độ 70 0 C trong 10 phút và cân chính xác khối lượng thu được
- Cao cô đặc thu được lên thể tích 2 ml bằng cồn 50 0 , được sử dụng để pha thành các dung dịch có nồng độ khác nhau dùng trong nghiên cứu
3.3.4.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học dịch chiết callus
Xác định hoạt tính chống oxy hóa in vitro thông qua quá trình peroxy hóa lipit tế bào gan chuột theo phương pháp của Blagodorov (1987)
-Nguyên liệu động vật: Gan tươi của chuột nhắt trắng chủng Swiss khoẻ mạnh, nặng 22 ± 2 g
Trong nghiên cứu này, các hoá chất được sử dụng bao gồm đệm Tris, FeSO4, axit ascorbic, TCA và axit thiobacbituric Quy trình tiến hành bao gồm việc mổ lấy gan chuột nhắt, sau đó cân chính xác 100mg gan và tiến hành homogennat trong cối sứ ở điều kiện 4 độ C với 5 ml đệm Tris 0,04 M, pH = 7,4.
10 ml H2O Ly tâm ở 600 vòng / phút trong 10 phút Sau đó lấy 3 ml dịch ly tâm cho vào hỗn hợp gồm: 0,4 ml FeSO4 10 -3 M; 0,4 ml dung dịch axit ascorbic 10 -2
M và dịch chiết callus, cùng với dịch chiết cà gai leo tự nhiên, được sử dụng với nồng độ khác nhau tùy theo công thức của từng thí nghiệm Hỗn hợp được ủ ở nhiệt độ 37 độ C trong 1 giờ, sau đó lấy ra và thêm 2 ml dung dịch axit thiobacbituric 0,25% Tiến hành đun sôi cách thuỷ trong khoảng 15 phút, rồi để nguội và đo màu ở bước sóng 532 nm.
Lượng DAM được tính theo công thức:
C: số mol DAM D: mật độ quang học l: chiều dày cuvet ε: hệ số tắt mol = 1,56.10 -5 M cm -1 3.3.5 Xử lý số liệu
Các số liệu được xử lý thống kê theo chương trình Microsoft Excel (2003;2007 và 2010) và SAS 9.1
Các công thức so sánh được thực hiện thông qua phương pháp kiểm tra sự sai khác giữa các giá trị trung bình bằng phép ước lượng và tiêu chuẩn LSD với độ tin cậy 95% Độ biến động của thí nghiệm được thể hiện qua chỉ số tiêu chuẩn CV (%).
